【発明の詳細な説明】
メラニンによるサイトカインの調整
１．０ 発明の分野
動物及び人間の疾患を治療するために、精製したメラニンを使用する方法及び
その組成物を記載する。本開示のメラニン組成物は、哺乳類及び人間におけるサ
イトカイン生産のインビトロ及びインビボ調節のために特に有用である。
２．０ 発明の背景
腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)は、主にマクロファージから放出される17kDa
のポリペプチドである。一般に、健常者の血清中には、測定できるほどの量のTN
F−αは存在しないが、これは免疫刺激因子に反応して急速に出現する（Beutler
and Cerami，Adv．Immunol.42:213-232，1988）。生理的な濃度では、TNF−α
は、浸襲性病原体の増殖及び拡散を制限する。しかし、このサイトカインの過剰
または未制御な生産は、多数の病症状の発病に寄与する。
TNF−αは、単独で及び／又は他の仲介因子と協調して、不可逆的な心臓血管
系の虚脱（ショック）及び決定的な臓器不全から成る致命的な症候群を引き起こ
す(Beutler，Science 229:869-871，1985;Tracy et al.，Nature 330:662-664，
1987;Waag et al.，Lancet 1:355-357，1987)。更に、TNF−αは、インターロイ
キンIL−１及びIL−６と協調して、または相乗的に、るいそう症候群（悪液質）
の発症に寄与する(Grunfeld，et al.，Am.J.Clin.Nutr.55:455-460，1992;Grunf
eld and Feingold，N.Engl.J.Med.327:329-337，1992)。
例えば、内毒素で刺激したマクロファージからの上清を実験的に齧類に投与す
ることで、体重の重度の減少が起こった（Cerami et al.，Immunol.Lett.11:173
-177，1985）。更に、TNF−α（Rouzer and Cerami，Mol.Biochem.Parasitol.2:
31-38，1980）またはIL-6(Black et al.，Endocrinology 128:2657-2659，1991
）のいずれかを分泌する様に遺伝子工学的に操作した腫瘍細胞を移植したヌード
マウスは、進行性に食欲不振に落ち入り、そしてやせて行った。齧歯類では、TN
F−α，IL−１及びIL−６を投与すると、肝臓での脂質生成及び超低密度リポタ
ンパク質の生成が促進することによって、血漿中トリグリセリドが増加し、その
ためムダな脂肪酸／トリグリセリド循環に至り、最後にはやせる(Feingold and
Grunfeld，J.Clin.Invest.80:184-190，1987;Grunfeld et al.，Cancer Res.50:
4233-4238，1990;Feingold，et al.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.11:495-5
00，1991)。
サイトカインは、カギとなる代謝性ホルモンレベルも上げ；グルコースとアミ
ノ酸の代謝を変え；そして食物採取に深刻な影響を与える。実験動物では、TNF
−αは、胃の運動性を下げ、その結果食物が滞留し（Patten et al.，J.Clin.In
vest.80:1587-1596，1987）、一方IL−１は、視床下部の食欲中枢に間接的に影
響を与えて、継続的な食欲不振を誘導する（Hellerstein et al.，J.Clin.Inves
t.84:228-235，1989）。人間では、るいそう症候群は、しばしばガン並びに様々
の感染症、例えば結核症及びAIDSに関連して認められる。進行性の体重減少に加
えて、多くの患者は、食欲不振（食欲減少）、悪心、筋肉減弱及び貧血になる(L
awson et al.，Lancet 2:1-5，1982;Grunfeld and Feingold，New Engl.J.Med.2 37
:329-337，1992)。悪液質は、食欲不振を伴うが、普通、ガン及び感染症に伴
う悪液質で失われる体重量の程度は、カロリー採取の減少で説明でき
ない（Spiegelman and Hotamisligil，Cell 73:625-627，1993）。
患者の生存に直接影響することはないが、進行性の体重減少と貧血のために、
普通、悪液質の患者は、積極的治療に耐えることができなくなることから、悪液
質は、最終的に有害であるとみなされる（Dewy et al.，Am.J.Med.69:491-497，
1980）。
悪液質の有病率から、この症候群は、医療上有意に問題である。総合すると、
以上の結果から、患者のるいそうを制御するために、IL−１，IL−６及びTNF−
αの合成／分泌を阻害する因子、メラニンを使用することを考慮する機構的な理
由が提供される。
TNF−αは、成人性呼吸困難症候群（ARDS）も誘導するが、これは、グラム陰
性菌による敗血症を原因とする(Shaby et al.，In:Pathophysiology of Endotox
in，J.B.Hinshaw，ed.Amsterdam:Elsevier，pp.105-128，1985)。ARDS患者の肺
からの吸引液中には、12000pg／mlを超える濃度のTNF−αが検出された(Millar
et al.，Lancet 2:712-714，1989)。このサイトカインは、多形核白血球の内皮
細胞への接着を増加させることも知られている（Gamble et al.，Proc.Natl.Aca
d.Sci.，USA 82:8667-8671，1985）。肺の微小血管構造及び気管上部における活
性化顆粒球の接着増加は、ARDSにおける肺性血管障害の主要な原因の１つである
。注目することに、細胞内接着分子（ICAM）及び内皮細胞上の内皮性白血球接着
因子（ELAM）の発現が、TNF−αまたはIL−１などのサイトカインによって誘発
または増強され(Munre et al.，Am.J.Pathol.135:121-132，1989)、この現象に
よって細胞接着が増加する。
TNF−α，IL−１及びIL−６はまた、リウマチ様関節炎の病態においても主要
な働きを示す(Saklatvala.，Nature 322:547-549，1986;Miossec.Clin.Rheumato
l.5:305-308，1987;Lupia et al.Eur.J.Immunol.，26:1690-1694，1996)。リウ
マチ様関節炎の患者の滑液
には、TNF−α(Saxne et al.，Arthritis Rheumatism 31:1041-1132，1989)及び
IL−６(Guerne et al.，J.Clin.Invest.83:585-592，1989)が含まれる。最近の
研究から、免疫複合体が単球からのTNF−α（Visser et al.，Am.J.Pathol.134:
1-6，1989）及びIL−１（Chantry et al.，Eur.J.Immunol.19:189-192，1989）
の分泌を刺激することが示唆されている。次にTNF−α及びIL−１は、滑膜細胞
（synoviocytes）でのプロテアーゼ及びプロスタグランジンの生産、並びに破骨
細胞での骨吸収を刺激する（Miossec，Clin.Rheumatol.5;305-308，1987;Dayer
et al.，J.Exp.Med.162:2163-2168，1985;Saklatvala，Nature 322:547-549，19
86）。更に、リウマチ様関節中に存在するTNF−α及びIL−１は、共同で作用し
てIL−６合成を刺激することで、滑膜炎を永続化させ、更にこれが形質細胞の極
近傍で起これば、自己抗体が生産されるかもしれない。IL−６は、滑膜細胞によ
って自発的に生産され、炎症性の関節炎を有する患者の滑液中には、高レベルの
IL−６が存在する(Guerne et al.，J.Clin.Invest.83:585-592，1989)。
大脳マラリアは、致死的な超急性の神経学的症候群であり、いく人かのマラリ
ア患者の予後は、血清中の閾値レベルのTNF−αに関係していた（Grau et al.，
Science 237:1210-1212，1987;Clark et al.Am.J.Pathol.，129:192-199，1987;
Grau et al.，New Engl.J.Med 320:1586-1591，1989;Kwiatkowski et al.，Lanc
et 336:1201-1204，1990;McGuire et al.Nature 371-510，1994）。同様に、移
植片対宿主反応においては、TNF−α濃度の増加が、主要な合併症と関連してい
た(Holler et al.，Blood 75:1011-1016，1990)。
TNF−αは、単独でまたはIL−１もしくはIL−６のいずれかと共同で、潜在的
に感染しているＴ細胞及び単球内でHIV−１の複製を促進する（Folks et al.，S
cience 238:800-802，1987;Folk et al
.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2365-2368，1989;Poli et al.，J.Exp.Med.172:
151-158，1990;Poli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:108-112，1994）。TN
F−αは、HIVによって利用される転写因子NK−κＢを強く誘発する(Nobel and B
altimore，N.Engl.J.Med.234:308-317，1987;Duh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 86:5974-5978，1989)。更に、HIV感染の結果として、TNF−α，IL−１及びI
L−６の合成が促進的に調節される（Folks et al.，Science 238:800-802，1987
;Nakajima et al.，J.Immunol.142:531-536，1989）。AIDS患者の血清及び脳脊
髄液には、高レベルのTNF−α，IL−１及びIL−６が含まれる（Lahdevirta et a
l.，Am.J.Med.85:289-291，1988;Emille et al.，J.Clin.Invest.86:148-159，1
990;Breen et al.，J.Immunol.144:480-484，1990）。
HIV−１性脳炎で発症するアポプトーシス性の神経細胞欠損は、TNF−αと関係
している(DeSimone et al.，Immunol.Today 17:256-258，1996)。更に、TNF−α
は、AIDSに伴う悪液質に関係している(Wright et al.，J.Immunol.141:99-104，
1988)。従って、単球による異常なサイトカイン生産の抑制的調節、特にTNF−α
の抑制的調節によって、HIV感染の進行を遅らせること、及び悪液質患者の体力
を保たせることが期待される。
IL−６は、AIDS患者のカポジ肉腫（KS）の病巣の細胞では、自己分泌型の増殖
因子でもある(Miles et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87:4068-4072，1990)。多病
巣性の血管病変であるKSは、他の免疫抑制された病態、例えば腎臓または心臓移
植を受けた患者においても見られる(Gang and Jones，Clin.Exp.Dermatol.3:135
-146，1978;Greenfield et al.，J.Rheumatol.13:637-640，1986)。AIDS患者のK
S(AIDS-KS)に由来する細胞株は、実質的な量のIL−６を含有し、そして分泌する
。tatタンパク質によるAIDS-KSの成長促進効果は
、増加したIL−６によって仲介される。実際、IL−６のアンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドを前記細胞に添加したところ、IL−６生産の減少、並びに細胞
増殖の著しい抑制が起きた(Miles et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87:4068-4072，
1990)。
AIDS-KS由来細胞は、IL−１を含む他のサイトカインを生産する(Marx，Scienc
e 248.442-443，1990)。抗IL−１抗体をKS細胞株に添加しても、細胞増殖の減少
が起きた。血清中のIL−６レベルの増加及び多クローン性Ｂ細胞の活性化は、AI
DS患者に見られるＢ細胞の悪性化の頻度の増加に相関するかもしれない（Akira
and Kishimoto，Immunol.Rev.127:26-50，1992)。
KSの場合と同様に、多発性骨髄腫の病因にも、IL−６−IL−６受容体自己分泌
循環が関係している(Kawano et al.，Nature 332:83-85，1988)。その他の病症
状、例えば、メサンギウム増殖性糸球体腎炎(Horii et al.，J.Immunol.143:394
9-3955，1989)、及び乾せん（Grossman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.86:6367-6
371，1989）においても、IL−６レベルの増加が見られる。
多様な薬剤が、炎症及びサイトカインの生命を脅かす側面に対抗するために用
いられている。実験動物では、急性全身性中毒（例えば敗血症ショック）後の死
亡数を減らすために、抗TNF−α抗体、TNF−α受容体、抗IL−６、及びIL−１受
容体アンタゴニスト(IL−1Ra)による治療が行なわれている（Beutler et al.，S
cience 229:869-871，1985;Tracy et al.，Nature 330:662-664，1987;Ohlsson
et al.，Nature 348:550-552，1990;Starnes et al.，J.ImmunoI.145:4185-4191
，1990;Ashenazi，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539，1991;Les
slaner et al.，Eur.J.Immunol.21:2883-2886，1991）。しかし、これらのサイ
トカイン遮断薬に対する応答は、薬剤の予防的投与、または感染部位に依存する
（Bagby et
al.，J.Infect.Dis.163:83-88，1991）。更に、いくつかの研究では、抗サイト
カイン抗体が、部分的にではあるが、動物で予防作用を示した（Feingold et al
.，J.Clin.Invest.83:1116-1121，1989)。
いくつかの研究データから、リウマチ様関節炎の治療において、抗TNF−α(El
liott et al.，Arthritis Rheum.36:1681-1690，1993;Elliott et al.，Lancet 344
:1105-1110，1994)または抗IL−６(Wendling et al.，J.Rheumatol.20:259-2
62)モノクローナル抗体、並びに可溶性TNF−α受容体（Moreland et al.，Arthr
itis Rheum.37:S295，1994）または可溶性IL−１受容体(Drevlow et al.，Arthr
itis Rheum.37:S339，1994)のいずれかを注入することによるサイトカインの遮
断が有効であることが示された。しかし、可溶性のサイトカイン受容体または単
一因子に対する抗体の使用は、炎症症状の発症に寄与するサイトカインが多数存
在することから、制限されてしまう。更に、抗サイトカイン抗体の多量適用によ
って、抗イディオタイプ抗体が生じる可能性がある。
デキサメサゾン（Luce et al.，Am.Rev.Respir.Dis.138:62-68，1988）、ペン
トキシフィリン（Netea et al.，J.Infect.Dis.171:393-399，1995）、サリドマ
イド(Klausner et al.，J.Acquir.Immun.Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.11:247-2
57，1996)、スラミン（Strassman et al.，J.Clin.Invest 92:2152-2159，1993
）、またはα−メラノサイト刺激ホルモン(α−MSH)(Chio et al.，J.Clin.Inve
st.97:2038-2044，1996)などの薬剤が、前炎症性サイトカインの合成を抑えるた
めに用いられている。α−MSH以外のこれらの薬剤では、適用された後（デキサ
メサゾンとぺントキシフィリン）に効果が見られず、複数のサイトカインを標的
にすることができず、また複数の副作用があるので、それらの臨床適用性は低い
。
サリドマイド及びペントキシフィリンは、TNF−αの生産を阻害するが、IL−
１βまたはIL−６の生産を阻害しない(Sampaio et al.，J.Exp.Med.173:699-703
，1991)。複数のサイトカインが炎症疾患の発症に寄与しているので、単一のサ
イトカインを阻害しても疾患の進行を回復または抑制することはできないだろう
。サリドマイドは催奇性を有し、過去には鎮静剤及び制吐剤に用いられていたし
、スラミンの毒性は高い（Stein，Cancer Res.53:2239-2248，1993）。
主要な抗炎症剤であるコルチコステロイドは、感染感受性に対する逆作用、視
床下部−下垂体アドレナリン系の抑制、及びクッシング様徴候を示す。
サイクロスポリンＡの使用は、高血圧及び腎毒性を誘発する可能性がある。
メラニンは、特に、フリーラジカルのスカベンジャーであり、いくつかの宿主
防御機構から細菌を保護することによって、細菌の病毒性因子として作用する(W
ang and Casadevail，Infect.Immun.62:3004，1994)。
別の研究からは、細菌によって発現されたメラニンは、宿主細胞において病原
性細菌がＴ細胞仲介性免疫応答から逃れることを促進する病毒性因子であるかも
しれない(Huffnagle et al.，J.Immunol.155:3507-3516，1995)。
３．０ 発明の要約
本発明は、人間を含む動物における治療剤としてメラニンを使用することに関
する。好ましい治療方法は、疾患または病気の有害症状を軽減または抑制するた
めに十分な量の精製されたメラニン、または生合成したメラニンを動物に投与す
ることを含んで成る。従っ
て、本発明の対象は、患者に治療上の利益を提供するために十分な量のメラニン
を患者に投与することを含んで成る、患者の病気を治療または抑制するために精
製メラニンを使用する方法である。
本発明の好ましい態様では、患者の免疫応答を調節するために十分な量の精製
メラニンを投与することで、治療上の利益を生み出す。特に好ましい態様では、
個体のサイトカイン、特にTNF−α、IL−１及びIL−６の生産減少に至るために
十分な量の精製メラニンを投与する。一般には、サイトカイン生産の減少は、精
製メラニンの投与に伴う臨床上有益な徴候の原因または効果のいずれかである。
本発明に用いられる精製メラニンを、多様な有用な担体または賦形剤と組合せ
て投与することができる。従って、本発明の別の態様は、TNF−α生産を減少さ
せるために、または患者に治療上の利益を提供するために、精製メラニンを含ん
でいる医薬組成物を使用することである。
本発明の別の態様は、実質的に均質な構造体を有し、且つ混入した汚染物であ
るアミノ酸を実質的に含まない高度に精製されたメラニン、またはその誘導体を
使用することである。
精製メラニンの治療上の使用は、悪液質、敗血症、急性呼吸困難症候群、大脳
マラリア、リウマチ様関節炎、皮膚及び消化管の上皮性潰瘍（特に炎症性腸疾患
、潰瘍性大腸炎、クローン病など）、あるいは、TNF−αまたは他のサイトカイ
ンの高レベル発現を伴う疾患または有害な症状を治療するために有用であると特
に考えられる。
特に、移植片拒絶は、しばしば炎症反応を伴うので、本発明の別の態様は、移
植された臓器及び移植片の拒絶を低下または抑制するために、精製メラニンまた
は精製した合成メラニンを使用することである。同様に、精製メラニンは、移植
片対宿主病の治療及び予防
においても有用であると考えられる。
前記載から考えると、本発明の別の態様は、動物細胞によるサイトカイン生産
を調節するために十分な量の精製メラニンをその細胞に投与することによって、
動物細胞によるサイトカイン生産を調節する方法である。好ましい態様では、精
製メラニンを含んでいる組成物が、哺乳類または他の動物の細胞によるサイトカ
イン発現を調節できるかどうかを確かめるために、その精製メラニンをインビト
ロで検査する。
４．０ 図の説明
図１は、メラニンがLPS誘導性のTNF−α生産を阻害することを示す。白丸は、
１ng／ml LPSで刺激する前に種々の濃度のメラニンAHM8と共に37℃で40分間放置
した単球におけるTNF−αの生産／放出を示す。細胞が含まれていない培養上清
を用いて、TNF−αの生産をELISAで測定した。メラニン非存在下にLPSで刺激し
た単球から集めた上清（3230pg／106細胞／ml）、及び、単独培地中で培養した
単球から集めた上清（36pg／106細胞／ml）においても、そのTNF−α濃度を決定
した。
黒丸は、メラニン処理細胞における構成的なタンパク質合成に対するメラニン
の効果を示す。96ウエルプレートにまいた単球（透析済みヒトAB血清10％を補充
したロイシンフリー培地0.2mlあたり１×105細胞）を、指示した濃度のメラニン
AHM8と共に37℃で５時間培養した。コントロール細胞は、単独培地中で培養期間
中維持された。採取前４時間の時点で、ウエルあたり５μCiの〔3Ｈ〕ロイシン
で細胞をパルス標識した。単独培地中で培養した単球による〔3Ｈ〕ロイシンの
平均取り込み量(±SEM)は28737±712cpmであった。
図２（Ａ−Ｄ）は、ヒト末梢血単球において、メラニンが、TNF−α（図２Ａ
）、IL−１β（図２Ｂ）、及びIL−６（図２Ｃ）の生産を有意に阻害するが、GM
-CSF（図２Ｄ）の生産は阻害しないことを示す。１ng／ml LPSによって刺激する
前に、指示した濃度のメラニンAHM8（白棒０μｇ／ml；影棒50μｇ／ml；黒棒10
0μｇ／ml）で単球を前処理した。コントロールとして、（１）LPS刺激したメラ
ニン未処理の単球、（２）メラニン処理したLPS未刺激の単球、そして（３）添
加物が含まれていない完全培地中で培養した単球を用いた。
サイトカインの生産量変化（Δ）は、〔pgサイトカイン／106LPS刺激単球／ml
〕−〔pgサイトカイン／106LPS未刺激単球／ml〕に等しい。0，50または100μｇ
／mlメラニン存在下に培養したLPS未刺激の106個の単球から集めた上清中のサイ
トカインの平均含有量(±SEM)は、TNF−αの場合≦108±５pg／ml；IL−１βの
場合≦75±53pg／ml；IL−６の場合≦598±238pg／ml；そしてGM-CSFの場合≦16
8±124pg／mlであった。
図３（ＡとＢ）は、メラニンによるTNF−α生産の抑制が、時間依存的に回復
することを示した２回の実験を示す。ヒト末梢血単球を100μｇ／mlメラニンAHM
8と共に37℃で放置した。１時間放置後、遊離メラニンを除くために、細胞を洗
浄し、新しい培地中に懸濁し、指示した時点で１ng／ml LPSで刺激した。LPS添
加24時間後に集めた培養上清中のTNF−α濃度をELISAで測定した。TNF−α生産
の阻害率％を示す。
図４は、LPS刺激後に添加した場合でも、メラニン処理はTNF−α生産を抑制す
ることを示す。指示した量のメラニン（50または100μｇ）の添加１時間後に（
白棒）、添加と同時に（影棒）または添加１時間前に（黒棒）、単球を１ng／ml
LPSで刺激した。
コントロール単球では、メラニン存在下または非存在下にLPS刺激しないで放
置した（データ未記載）。LPS刺激24時間後、培養上清中のTNF−αレベルをELIS
Aで測定した。両方のメラニン濃度において、TNF−α生産阻害は、メラニンで前
処理した場合に最も顕著で、次は、メラニンとLPSで同時に処理した場合で、そ
の次はLPS刺激後にメラニン処理した場合(LPS刺激前にメラニン処理した場合のT
NF−α生産と比較した場合ｐ＜0.05)であった。
図５（Ａ−Ｄ）は、AHM8は、刺激とは関係なく、TNF−α生産を阻害すること
を示す。単球を、Mycobacterium avium（MAC、図５Ａ）菌体101（serovar １）
、またはM.tuberculosis(MTB、図５Ｂ)無病毒性菌体(H37Ra)のいずれかと感染さ
せ、細菌対単球比約10対１で放置した。４時間37℃で放置した後、低速遠心で単
球を洗浄し、完全に細菌を取り除いた。あるいは、単球をPPD(50μｇ／ml、図５
Ｃ）またはLPS(１ng／ml、図５Ｄ)のいずれかで刺激した。100μｇ／ml AHM8の
存在下で24時間放置した後には、MACまたはMTBで感染させた単球、あるいはPPD
またはLPSで刺激した単球から放出されたTNF−αは、45−55％減少した。各培養
のTNF−αレベルはELISAで測定した。pg TNF−α／106細胞／mlの生産量変化（
Δ）は、〔AHM8処理して刺激した単球におけるpg TNF−α／ml〕−〔AHM8処理し
た未刺激の単球におけるpg TNF−α／ml〕に等しい。
図６は、0，50または100μｇ／ml AHM8で１時間処理した後に、１ng／ml LPS
で刺激して、接着しない条件下で培養したヒト単球中で生産されたTNF−αmRNA
の相対量を示す（各々レーン１，２及び３）。全細胞RNAを、グアニジウムチオ
シアネート法で抽出し、ホルムアルデヒド／アガロースゲル電気泳動でサイズ分
画し（10μｇ RNA／レーン、コントロールとして28S RNAを用いて標準化した）
、そしてキャピラリーブロッティングによってナイロン膜に転写
した(Chomczynski and Sacchi，Anal．Biochem.，162:156-159，1987)。プラス
ミドpE4(ATCC，Rockville，MD)をPstI切断して得たTNF−αのcDNA断片1.1kbの32
Ｐ標識物を、前記ブロットとハイブリダイズさせた。その結果、100μｇ／ml AH
M8処理によって細胞で生産されるTNF−αのmRNA量を減少させることができた（
レーン３）。
図７は、１ng／ml LPSと100μｇ／ml AHM8とで同時に処理した単球を用いたノ
ーザンブロットを示す。コントロール単球では、AHM8非存在下でLPS刺激した。L
PS刺激１または３時間後に抽出した全RNAを、ヒトTNF−α（図７Ａ）またはIL−
６（図７Ｂ）のcDNA断片で探索した。単球を次の条件で放置した：培地単独また
は100μｇ／ml AHM8のみ存在下で１時間（各々レーン１と２）；１ng／ml LPSの
み存在下で２または３時間（各々レーン３と４）；あるいは、１ng／ml LPS及び
100μｇ／ml AHM8の存在下で２または３時間（各々レーン５と６）。全細胞RNA
を、TNF−α（Ａ）またはIL−６(Ｂ)(大腸菌BL21（DE3）ATCC68636中のpT7.7／h
hIL−６からのBgLII／BamHI断片1.5kb)特異的な32Ｐ標識cDNAプローブで探索し
た。
図８は、AHM8が、TNF−α mRNAの安定性に影響を与えないことを示す。１ng／
ml LPSの刺激30分後に10μｇ／mlアクチノマイシンＤを加えた（時間０分）。こ
れと平行して、アクチノマイシンＤと100μｇ／ml AHM8とを同時に単球に加えた
。TNF−α mRNAの減少を、アクチノマイシンＤ添加30，60及び180分後にノーザ
ンブロット法で分析した。白丸及び黒丸は、各々、LPSのみ、または、LPSとAHM8
存在下に培養した細胞を表す。
図９（Ａ−Ｃ）は、BALB／ｃマウスにおいて、メラニンがTNF−α応答を強く
阻害することを示す。LPSを静脈内に注入して90分後
に、循環血漿中のTNF−α濃度をELISAで測定した。LPS注入の60分前に（19匹）
；注入と同時に（40匹）；または注入15分後に（18匹）、AHM8（50mg／kg）を注
入した（影棒）。メラニン処理群と未
03プログラムを用いてMann-Whitneyの両側検定で比較した。結果を平均±SEMで
示す。
５．０ 発明の詳細な説明
本発明は、人間を含む動物における疾患の医学的治療にメラニンが有用である
という発見に関係する。
１つの態様として、本発明に用いられるメラニンは実質的に純粋である。一般
に、用語「実質的に純粋な」メラニンとは、希望するメラニンを、少くとも約75
％、特には少くとも約85％、より特別には少くとも約90％、そして好ましくは少
くとも約95％の重量で含んでいるメラニン調製物を指す。
正常なメラニン生産の結果として、典型的には、多様なタンパク質およびアミ
ノ酸が、汚染物として天然メラニン中に混入する。更に、インビボでの正常なメ
ラニン生産中に典型的に存在する多様な物質及び汚染物のために、無定形な組成
を有するメラニンが生産されるかもしれない。同様に、メラニン合成酵素である
チロシナーゼの市販調製品中に典型的に存在する多様な汚染物が、しばしばイン
ビトロで作成されたメラニンに混入する。
メラニンの医薬上の適用を考えた場合、規定された予測できる組成及び構造的
特徴を有するメラニン産物が強く望まれ、そして必要とされる。さらに、天然の
メラニンまたは前記載のメラニン中にしばしば混入する汚染物タンパク質及びそ
こに含まれるアミノ酸は、個体において免疫原性を呈することが示されている。
従って、イン
ビボで投与されるメラニン調製物は、汚染物であるタンパク質、アミノ酸、そし
て特に微生物毒素（すなわち細菌の内毒素など）を実質的に含まないことが好ま
しい。
用語「生合成」メラニンとは、組換え的に発現され、及び／又は精製されたチ
ロシナーゼタンパク質によって、メラニン生成の基質を与えて、生産されたメラ
ニンを指す。比活性が高いチロシナーゼと一定の基質とを用いてメラニンを作る
ことによって、典型的に天然に存在するメラニンに比べて実質的に均一な構造と
組成を有するメラニンが生産される。適当な合成方法を用いれば、できた「生合
成」メラニンは、実質的に純粋であるか、または、これを更に加工処理して、実
質的に純粋である生合成メラニン調製物が作られる。本明細書に記載された態様
において、多くの場合、天然メラニンの代りに、適当に加工処理された生合成メ
ラニンを使うことができる。
本発明で用いられる精製された、または生合成されたメラニンは、場合によっ
ては、汚染物であるアミノ酸内容物を実質的に含まないことを特徴とする。
本開示では、用語「実質的にアミノ酸を含まない」とは、重量で、一般には約
10％未満、好ましくは約7.5％未満、より好ましくは約５％、そして特には2.5％
未満のアミノ酸内容物を含んでいるメラニン調製物を指す。さらに、精製された
生合成メラニンを含んでいる組成物は、一般に、細菌に由来する潜在的に毒性の
汚染物、限定しないが例えば、細菌の内毒素（特にグラム陰性菌の内毒素）及び
外毒素を、実質的には含まない。
本記載の精製メラニンを治療上使用する場合、好ましくは、精製メラニンを、
医薬に適する担体と組み合わせて、経口、鼻内、直腸内、局所的、腹腔内、静脈
内、筋肉内、皮下、経皮、鞘内、または
頭蓋内などの経路で投与する。典型的には、精製メラニンの好ましい調合は、治
療を必要とする個体の部位に応じて変る。
例えば、局所的な免疫反応は、好ましくは、局所適用用に設計されたメラニン
調合剤によって治療または予防される。一方、全身性の反応は、好ましくは、腸
管外用に調合された組成物を投与することによって治療または予防される。さら
に、肺の免疫仲介性の疾患は、腸管外投与によって、及び、呼吸器へメラニン医
薬組成物を吸入法によって直接適用することによって治療される。さらに、局所
的免疫反応、すなわち関節炎などは、滑膜内に、精製メラニン組成物を局所的に
注入することによって治療される。場合によっては、その様な精製メラニン組成
物の局所的投与を、コルチコステロイドと共に行うことができる。
さらに、精製メラニンを脂質結合構造物（すなわちリポソームまたは他の脂質
複合体）中に入れることができ、それによって精製メラニンの医薬特性を強化す
ることができる。この脂質−メラニン複合体は、次に、適当な標的到達因子（す
なわち特異抗体または受容体）を組込むことによって、特異的な標的細胞に到達
させることができる。場合によっては、希望する効果を発揮させるために、精製
メラニンを標的到達因子に直接結合することができる。
消化管の炎症性疾患をメラニンを用いて治療する場合、精製メラニンを含んで
いる脂質調合剤（例えば乳剤、微小乳剤、リポソームなど）では、そのメラニン
が消化過程から有意に防護されるだろう。従って、経口投与されるメラニン調合
剤が考えられる。さらに腸内での防護を望む場合には、腸溶性被覆形または他の
防護形に、本発明の固体または液体調合剤を変えることができる。液体調合剤の
場合には、これを、防護剤、例えば中鎖トリグリセリドの混合液などに混合する
か、または単に一緒に投与することができ、あるいは
、これを、腸溶性カプセル（例えば軟または硬ゼラチンカプセルで、更に腸溶性
に被覆することもできる）に詰めることができる。あるいは、メラニンを含んで
いる固形調合剤をより柔軟に加工することができる。これを、腸溶性物質で被覆
して錠剤にすることも、または、腸溶性カプセルに詰めることもできる。
錠剤またはカプセル上の腸溶性被覆の厚さは、例えば0.5〜４ミクロンであり
、当業者によって正確な厚さが決定されるだろう。腸溶性被覆顆粒（粒子サイズ
が例えば0.5〜mmであるもの）を、混合して錠剤にすることなく、それ自身を被
覆することができる。同様に、マイクロカプセルを腸溶性物質で被覆することも
できる。腸溶性被膜は、経口投与できる医薬調合剤中に通常用いられる任意の腸
溶性物質を含んでいる。適当な腸溶性被膜物質は、例えば、“Remington's Phar
maceutical Sciences”，15th Edition，pp.1614-16 15（1975）；2nd Edition
，pp.116-117，371-374（1976）；and“Hagars Handbuch der Pharmazeutischen
Praxie”，4th Edition，Volume 7a（Springer Verlag，pages 739 to 742 and
776 to 778（1971）に記載されている。
適当な腸溶性被膜物質の例には、セルロースアセチルフタレート、ヒドロキシ
プロピルメチルセルロース−フタレート（HPMC−Ｐ）、ベンゾフェニルサリチレ
ート、セルロースアセトスクシネート、スチレンとマレイン酸とのコポリマー、
配合されたゼラチン、ケラチン、ステアリン酸、ミリスチン酸、ポリエチレング
リコール、セラック、グルテン、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、及び、マレイ
ン酸とフタル酸誘導体とのコポリマーがある。この腸溶性被膜物質を、溶媒、例
えばジクロロメタン、エタノール及び水、セルロースフタレート、またはポリビ
ニルアセテートフタレートに溶解することができる。腸溶性被膜としては、HPMC
−Ｐ、ポリエチレングリコ
ール6000またはセラックが好ましい。ヒトの幽門で見られるpH5.5で溶解または
分散される様にしたHPMC−Ｐの登録された市販の調製品HP5-5が特に好ましい。
さらに、前記メラニン組成物と一緒に、種々の安定化剤を用いることができる
。メラニン自身は、抗酸化剤として機能するが、メラニンまたは記載した組成物
中の他の成分の酸化を、不活性ガス、例えば窒素ガス下で本発明の組成物を調製
することで、実質的に減らすことができる。この方法はいくらか不便で、しかも
費用がかかるので、多くの場合、抗酸化化合物を加えることが好ましい。医薬に
適する適当な抗酸化剤には、プロピルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール
、ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビン酸もしくはアスコルビン酸ナトリ
ウム、DL−もしくはＤ−α−トコフェノール、及びDL−もしくはＤ−α−トコフ
ェノールアセテートがあるる。抗酸化剤を加える場合、これを、単独または組合
せで、配達媒体に、媒体形成前に、中に、または後に、例えば0.1％（ｗ／ｖ）
までの、好ましくは0.0001〜0.05％の量で加えることができる。
精製メラニンを含んでいる調合剤を、保存または出荷のために、種々の確立さ
れた方法、限定しないが例えば、凍結、冷却及び凍結乾燥によって安定化するこ
ともできる。メラニン組成物を凍結または凍結乾燥することによって長期間の安
定性を高めようとする場合、適当な賦形剤を、凍結前に、メラニンを含んでいる
調製物に加えることができる。この様な安定化用賦形剤の例には、単糖もしくは
二糖（例えばグルコース、スクロースなど）、多糖、または周知の種々の物質（
例えばグリセロール、ゴム、デキストランなど）がある。
医療従事者または患者にとって、望ましくない症状（例えば、身体における免
疫介在性の疾患に関係する症状）の何らかの軽減また
は予防が事実上望まれる。従って、本開示では用語「治療」「治療上の使用」ま
たは「医薬としての使用」は、疾患状態または症状を治療するために、あるいは
、疾患またはその他の望ましくない症状の進行を任意の方法で予防、抑制、遅延
または回復するために、前記の精製メラニン組成物を用いる任意の方法を指す。
同様に、メラニンの「治療上有効な量」とは、疾患状態または症状を治療するた
めに、あるいは、疾患またはその他の望ましくない症状の進行を、任意の方法で
予防、抑制、遅延または回復するために十分な量を指す。
有害な疾患が、過剰な前炎症性のサイトカイン（すなわちTNF−α、並びにイ
ンターロイキン、限定しないが例えばIL−１及びIL−６など）の生産に結びつい
て起こる場合には、本発明の特に好ましい態様として、TNF−αの過剰生産を低
下または抑制するが、依然として、根本の疾患または感染に対する有効な宿主免
疫応答を誘発または促進する様な投与量で、精製メラニンが用いられる。
本発明で治療することができる動物は、限定しないが、好ましくは、無脊椎動
物、脊椎動物、鳥類、哺乳類、例えばブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、
そして特に人間である。
疾患を治療する際に用いる場合、いくつかの確立した方法論によって、精製メ
ラニンまたはその修飾体の適当な投与量を決めることができる。例えば、普通は
動物実験から、体重kgあたりの生物活性物質の最大許容投与量MTDを決定する。
一般には、試験動物の少くとも１種類は哺乳類である。当業者によって、人間を
含む他の種に対して、有効で、且つ毒性を回避することができる投与量が、規則
的に推定される。人間に対する有効性の試験を行う前に、健常人による第１相臨
床試験によって安全な投与量を確立する。更に、治療上の投与量は、感染の重症
度、及び個体の大きさまたは種類などの
因子に応じても変更される。
特にインビボで用いる場合、本発明を調合するために用いられる種々の生化学
成分は、高純度で、しかも潜在的に有害な汚染物を実質的に含まないもの（例え
ば、少くとも国内食品等級、一般には少くとも分析等級、そして好ましくは少く
とも医薬品等級）であることが好ましい。
本記載の精製メラニンを、インビボでの特性を増強する分子と化学結合しても
よい。その様な分子の例には、限定しないが、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸
、ペプチド、イオン（すなわちナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、マンガンなど）、及び脂質がある。
さらに、精製メラニンを、例えば、メラニンのインビボでの安定性または医薬
特性を増強する（例えば、インビボでの半減期の増加、毒性の低下、溶解性また
は取込みの促進）種々の確立した化合物または構造物と化学結合してもよい。こ
の様な修飾の例には、限定しないが、スルフェート、グルコネート、シトレート
及びホスフェートなどの生成がある。
精製メラニンまたはその誘導体を、診断上、治療上または医薬上用いる場合、
一般には、これを、微生物汚染の危険を最小にするか、または無くす様な無菌条
件下で調製及び維持する。精製メラニンは、比較的に小さく、そして本質的に安
定であるので、メラニンを含む組成物を、使用前に濾過滅菌することもできる。
無菌的調製及び濾過滅菌の他に、メラニン組成物に抗微生物剤を加えることもで
きる。使用する抗微生物剤は、一般に、調合剤あたり約３％（ｗ／ｖ）まで、好
ましくは約0.5〜2.5％の量で用いられ、これには、限定しないが、メチルパラベ
ン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、フェノール、ジヒド
ロ酢酸、フェニルエチル
アルコール、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、チモール、チメロサール、ジヒ
ドロ酢酸ナトリウム、ベンジルアルコール、クレゾール、ｐ−クロロ−ｍ−クレ
ゾール、クロロブタノール、酢酸フェニル銀、ホウ酸フェニル銀、硝酸フェニル
銀及び塩化ベンジルアルコニウムがある。抗微生物添加剤がメラニンの生化学特
性を促進するか、またはメラニンの活性に対して不活性であることが好ましい。
ある抗微生物剤がメラニン活性に対して有害である場合、メラニンの希望する機
能に対する影響がより少ない別の抗微生物剤を用いる。
本開示で請求する方法の態様の１つは、免疫系を調節するために精製メラニン
を使用することに関する。この調節は、メラニンの１つの機能であり、直接また
は間接的に、インビボまたはインヒドロで、サイトカインの発現または活性に影
響を与えることである。好ましい態様では、メラニンを治療的に使用することで
、サイトカインの発現が抑制的に調節される。サイトカインの発現を抑制的に調
節するメラニン活性は、ある治療法に伴う有害な免疫性反応の程度を軽減するた
めに、確立した治療法と組み合わせてメラニンを用いることにおいても、活用さ
れる。例えば、IL−２による治療は、しばしば用量依存的に、有害な全身性の症
状を伴う。有害な免疫応答を制御する活性がメラニンにあるので、サイトカイン
と組み合わせてメラニンを用いることによって、臨床においてそのサイトカイン
をより高い濃度で全身性に使用することが可能となる。従って、本発明の別の態
様は、治療薬剤の毒性副作用を減らすためにメラニンを使用することである。
有害な疾患の発症が、過剰なTNF−αの生産に依る場合、本発明の特に好まし
い態様として、TNF−αの過剰生産を低下または減少させるが、根本の疾患また
は感染に対する有効な個体の免疫応答を
依然として誘発または促進する投与量で、精製メラニンを使用する。
本開示では、用語「サイトカイン」または文法的な意味でのその相当物とは、
一般に、免疫系細胞に関係するホルモン、すなわちリンホカイン及びモノカイン
などを指す。この定義は、限定しないが、局所的に作用し、そして血液中で循環
するもので、さらに本開示においては、個体の免疫応答を変化させる様な前記ホ
ルモンを含んで意味する。用語「サイトカイン」は、限定しないが、IL−１（α
またはβ），IL−２，IL−３，IL−４，IL−５，IL−６，IL−７，IL−８，IL−
９，IL−10，IL−11，IL−12，GM-CSF，M-CSF，G-CSF，LIF，LT，TGF−β，γ−
IFN（またはαまたはβ−IFN)，TNF−α、及びBCGFを指す。前記サイトカインお
よびその他の免疫調節物質は、“Cytokines and Cytokine Receptors”，A.S.Ha
mblin，1993，（D.Male，ed.，Oxford Universlty Press，New York，NY），ort
he“Guidebook to Cytokines and Their Receptors”，1995，N.A.Nicola，ed．
（Oxford University Press，New York，NY）に記載されており、この記載を引
用して本明細書に組み込む。
メラニンが、しばしば後天性免疫不全症候群（AIDS）またはガンに伴われるる
いそう症候群の治療に有効であるとすれば、本記載の方法は、広い意味でAIDS及
びガンの治療に有効であるとも言える。
本発明の別の態様は、アレルギーに関連した過敏性反応を治療するために精製
メラニンを使用することである。有害なアレルギー反応、限定しないが例えば、
薬剤に対する反応、虫さされによる反応、皮膚炎、食物アレルギーなどを発症し
やすい個体を予防的に治療するために精製メラニンを使用することが、特に考え
られる。さらに、アレルギー反応の有害な症状を軽減するために精製メラニンを
使用することも考えられる。
メラニンは、種々の感染病原体の病原性に寄与する病毒性因子である。特定の
病原体に特有であるメラニンが同定された場合、本発明の別の態様は、メラニン
生成病原体の進行と拡散を防ぐワクチンとして、その精製メラニンまたはその部
分もしくは類似物を使用することである。
同様に、メラノーマに関連する、またはそれに特異的なメラニンを同定して使
用することが考えられ、そのために、腫瘍特異的メラニン、またはその断片また
は類似物を、ガンに対するワクチン、または腫瘍特異的免疫刺激剤として使用す
ることを含んでいる別の形のガン治療法が提供される。
さらに、病原体または腫瘍特異的メラニンの同定は、病原体または腫瘍特異的
メラニンに特異的に結合する受容体、リガンド、またはポリクローナルもしくは
モノクローナル抗体を同定または生産するために有用である。従って、本発明の
別の態様は、診断または治療の基となる、病原体または腫瘍特異的メラニンを標
的とする受容体、リガンドまたは抗体、あるいは、細胞内受容体である。
前記載の発明をより十分に記載し、本発明の最良と考えられる態様を示すため
に、次の実施例を提供する。これらは、説明するためのものであり、発明を限定
するためのものではない。
６．０ 実施例
６．１ 水溶性メラニンの合成。
米国特許5,340,734;5,466,592;5,486,351;5,210,076及び5,057,325に記載され
た方法に本質的に従って、水溶性メラニンを調製した。その記載内容を引用して
本明細書に組込む。前記方法で作成したメラニンを、濃塩酸pH1.5の添加によっ
て酸析出させて、更に精製した。析出したメラニンを遠心で回収した。
純度を分析したところ、できたメラニン（AHM8と称する）は、重
量で、最終産物の約96％を占めた。メラニンAHM8のアミノ酸含有量は4.2％未満
であった。総アミノ酸は重量で8.4％であり、その内4.38％はチロシンとグリシ
ンであった。元素分析の結果は以下の通りであった：％Ｃ＝51.01；％Ｈ＝3.74
；％Ｎ＝9.5；％Ｓ＝０；及び％Ｏ＝33.85。
発色性Limulus変形細胞抽出液（CLAL）テストキット（BioWhittaker，Inc.，W
alkersville，MD）を用いて、メラニンAHM8中の内毒素含有量を推定した。AHM8
が、CLALテストに対して直接的な不活性化作用を有するかどうか決定するために
、予備実験において、0.25内毒素単位（EU）／mlを含んでいる基準内毒素を、50
μｇ／ml AHM8(単球処理時に用いられるのと同程度の投与量)と一緒に加えた。
取扱説明書通りにCLALテストを行い、前記「混合液」中の内毒素含有量を決定し
た。メラニン含有基準調製液中の内毒素含有量の減少率％を以下の様に計算した
：
％阻害率＝｛１−〔（基準液の内毒素含有量）−（AHM8含有基準液の内毒素含
有量）〕／〔基準液の内毒素含有量〕｝×100
この実験の結果は、AHM8がCLAL検査を著しく妨害することを示す。50μｇ／ml
AHM8の添加によって、基準内毒素の活性は22％減少した。表１に示す様に、メ
ラニンAHM8 50μｇ／mlを含有した場合の内毒素含有量は、0.069内毒素単位（EU
）／mlを示しただけであった。この実験条件下では、ヒト末梢血単球によるTNF
−α生産には、1.6EU／ml LPS（すなわち0.1ng LPS／ml）を必要とした。
表１
AHM8中の内毒素含有量
＊各薬剤中の内毒素含有量を、市販のCLAL
テストキットによって推定した。
TNF−α生産を誘導する能力を検査したところ、ヒト末梢血単球において、50
μｇ／mlのAHM8は、TNF−α生産を強く誘導することはなかった(123pg TNF−α
／106細胞／ml)(表２)。
この実験及び次の章の実験に用いた末梢血単球は、フィコールPaqueの連続密
度勾配遠心及びパーコール勾配遠心によって白血球濃縮液から単離した（Markow
icz and Engleman，J．Clin．Invest．85:955，1990）。この白血球濃縮液は、S
tanford University Blood Center(Palo Alto，CA)から購入した。パーコール勾
配は、熱非働化したヒト血清５％を含んだダルベッコのカルシウム及びマグネシ
ウム非含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)によって、浸透圧等張の保存パーコール
溶液(1.128ｇ／ml)(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)を希釈した75％、51.
4％、40％及び30％の連続層から成る。更に純度を高めるために、ほとんどが単
球からなる低密度細胞を、再びパーコール勾配にかけた。単球の割合が高い分画
を、１％熱非働化ヒトAB血清、２mMグルタミン、100Ｕ／mlペニシリン及び100μ
ｇ／mlストレプトマイシンを補充したマクロファージ用の血清非含有培地(GIBCO
，Grand Island，NY)中に、１×106細胞／mlの濃度で再懸濁した（この培地を以
降、完全培地と称する）。プラス
ティックへの接着によって単球が刺激されてサイトカインを生産するので、これ
らの細胞培養実験では、ポリプロピレンチューブを用いた。
表２
メラニン存在下に放置したヒト末梢血単球によるTNF−αの生産a ａ：ポリプロピレンチューブ中で、単球をAHM8またはLPSとインキュベーション
した。37℃24時間インキュベーション後、培養上清を採取し、TNF−αの放出をE
LISA(Biosource International，Camarillo，CA)で測定した。２回の測定値の平
均値を示す。
６．２ メラニン前処理によるLPS誘導性TNF−α生産の抑制。
インビトロTNF−α生産に対する生合成メラニンの効果を評価した。そのため
に、メラニン処理及び未処理後にLPS刺激した単球の培養上清中のTNF−αレベル
を比較した。この実験では、単球（１×106／ml）を、種々のメラニン投与量で
、保湿５％CO2ガス中でインキュベーションした。30−60分インキュベーション
後に、メラニンの継続存在下にLPSで単球を刺激した。コントロールは、（１）
メラニン未処理、LPS刺激単球；（２）メラニン処理、LPS未刺激単球；および（
３）添加物を含まない完全培地中でインキュベーションした単球、である。LPS
刺激24時間後、培養上清中のTNF−αレベルを、２回の実験から、ELISA(Biosour
ce International，Camarillo，CA)で測定した。TNF−αの測定可能範囲は15.6
−1000
pg／mlであった。TNF−α応答の阻害率％は以下の通り計算した：
阻害率％＝〔１−（pg TNF−α／106AHM8処理、LPS刺激単球）−（pg TNF−α
／106AHM8処理単球）／（pg TNF−α／106AHM8未処理、LPS刺激単球）−（pg TN
F−α／106培地単独中の単球）〕×100。
図１の通り、単球をメラニンAHM8で処理することによって、濃度依存的に、LP
S誘導性TNF−α生産が阻害された。
培養上清中に存在するメラニンが、ELISA測定を妨害しないことを確かめるた
めに、メラニン処理した単球から集めた上清中のTNF−α濃度を、２つの標準曲
線から決定した。「コントロール標準曲線」を作成するために、TNF−α基準量
を単独の完全培地中に希釈した。「メラニン含有標準曲線」は、０−50μｇ／ml
メラニンを37℃で24時間含んだ完全培地によって希釈したTNF−α基準量（０〜1
000pg／ml）から得た吸光度(O.D.)をプロットして作成した。同時に、０−50μ
ｇ／mlメラニン処理してからLPS刺激した単球から集めた培養上清中のTNF−α含
有量（以降テストサンプルと称する）を、各標準曲線においてそれらのO.D.測定
値からの読み取りで決定した。各テストサンプル中のTNF−α含有量を異なった
標準曲線から決定し、その刺激指標（SI）を計算して、比較した。SIは、（TNF
−α量（pg）／106細胞／mlのLPS刺激単球からの上清）を(TNF−α量（pg）／106
細胞／mlのLPS未刺激単球からの上清)で割ることによって得られた。
表３で示す様に、メラニン前処理単球から集めた上清のSI値は、メラニン未処
理単球から集めた上清のSI値よりも一貫して低かった。従って、これらの結果は
、メラニンが、ヒト単球によるLPS誘導性TNF−α生産／放出を抑制すること、そ
してこの低下が、この検査系に対するメラニンによる妨害作用の結果ではないこ
とを示す。
表３
TNF−α特異的ELISAに対するメラニンの影響a ａ：標準曲線を作成するために、０〜50μｇ／ml AHM8を含んでいる完全培地を
用いて、TNF−α標準液０〜1000pg／mlを希釈作成した。プレートリーダーでは
、発色原及び停止液から成るブランクを０に設定した。
６．３ ヒト末梢血単球によるタンパク質合成に対するメラニンの影響。
メラニンがLPS誘導性サイトカイン生産を選択的に阻害するかどうか決定する
ために、ヒト単球による構成タンパク質の合成に対するメラニンAHM8の効果を測
定した。〔3Ｈ〕ロイシンの取込みから、タンパク質合成を測定した。100μｇ／
mlメラニンAHM8の存在下に５時間インキュベーションした後の単球のタンパク質
合成は、メラニン未処理コントロール細胞の場合と、ほぼ等しかった（23％低下
）。同様の実験条件下で、単球を20μｇ／mlのシクロヘキシイミドとインキュベ
ーションすると、〔3Ｈ〕ロイシンの取込みは完全に阻害された（コントロール
単球では28737±712cpmであったのに対して、1219±51cpmであった）。要約する
と、100μｇ／ml AHM
8で前処理した単球では、TNF−α合成は90％抑制されたが、正味のタンパク質合
成は23％だけ抑制された。
100μｇ／ml AHM8存在下に20時間インキュベーションした単球の〔3Ｈ〕ロイ
シン取込みレベルも、メラニン未処理単球の場合と、ほぼ等しかった（32775±1
977cpm対29713±856cpm）。
６．４ ヒト単球によるサイトカイン生産のメラニンによる選択的抑制。
メラニンが、LPS誘導性の他のサイトカイン生産及び放出を抑制するかどうか
決定するために、メラニン処理後のTNF−α、IL−１β、IL−６及び顆粒球／マ
クロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)生産能に関して、（本質的に前記通り
に）末梢血単球を調べた。培養上清中のTNF−α、IL−１β、及びGM−CSFレベル
を、２回の実験からELISAキット（Biosource International，Camarillo，CA）
を用いて測定した。IL−６測定用のELISAキットは、R & D Systems（Minneapoli
s，MN）から購入した。サイトカインの測定可能な範囲は、TNF−α、15.6−1,00
0pg／ml；IL−１β、3.9−250pg／ml；IL−６、3.12−300pg／ml；and GM−CSF
、15.6−1,000pg／mlであった。培養上清中に存在するAHM8による測定に対する
影響を除くために、AHM8処理単球から集めた上清中のサイトカイン濃度を、37℃
で24時間50μｇ／ml AHM8とインキュベーションした完全培地によって希釈した
標準液から得たO.D.をプロットして作成した標準曲線から決定した。しかし、AH
M8未処理単球から集めた上清中のサイトカイン含有量は、「コントロール標準曲
線」から決定した。「コントロール標準曲線」を作成するために、単独の完全培
地によって各標準液を希釈した。
これらの実験の結果を図２に示す。AHM8前処理した単球では、各コントロール
に比べて、TNF−α、IL−１β及びIL−６のレベルは
有意に低下した。同様の条件下で、メラニンは、LPS刺激単球でのGM−CSF生産ま
たは放出を阻害しなかった。逆に、100μｇ／ml AHM8前処理した単球では、LPS
刺激後のGM−CSFのレベルは有意に高くなった（ｐ＜0.01）。このことは、AHM8
はLPSによるシグナル伝達を阻害しないことを示す。メラニンがGM−CSF分泌を抑
制しないという事実は、特に重要である。GM−CSFは、単球及びマクロファージ
においてヌクレオシドアナログの細胞内リン酸化に作用するので、結果としてAZ
T及びスタブジン活性が増強する（De Simone et al.，Immunology Today 17:256
-258,1996）。
６．５ TNF−α生産の抑制には、メラニンの継続的な存在は必要でない。
TNF−α生産の抑制に、メラニンが継続的に存在する必要があるかどうか決定
するために、新しく単離したヒト単球（１×106細胞／ml完全培地）を、阻害的
濃度のメラニンAHM8で処理した。37℃で１時間インキュベーションした後に、１
つ目の培養単球を、メラニンの継続存在下にLPSで刺激した。２つ目の培養単球
を、低速遠心で一度洗浄した後に、LPSで刺激した。コントロールは、（１）メ
ラニン未処理、LPS刺激単球；（２）メラニン処理、LPS未刺激単球；および（３
）添加物を含まない完全培地中でインキュベーションした単球、である。LPS刺
激24時間後、培養上清中のTNF−αレベルを、２回の実験から、ELISAで測定した
。TNF−α生産の抑制には、メラニンの継続的な存在は必要でなかった。実際、
培地からメラニンを洗い出してすぐにLPS刺激した場合でも、TNF−α生産は63％
抑制された（データ未表示）。
６．６ メラニンによるTNF−α生産の抑制は可逆的である。
回復時間を与えるために、阻害的濃度のメラニンAHM8で処理した単球を、LPS
刺激する前に、完全培地中で2〜18時間インキュベー
ションした。各時点で、以下の培養をコントロールとして用いた：
（１）メラニン未処理、LPS刺激単球；（２）メラニン未処理、LPS未刺激単球；
および（３）メラニン処理、LPS未刺激単球。LPS添加24時間後、培養上清中のTN
F−α濃度を測定した。
図３（ＡとＢ）に示した２回の実験データから、メラニンによるTNF−αの抑
制は少くとも７時間継続した。メラニンによる抑制作用は、短期間の培養後に回
復した。メラニン除去18時間後にLPS刺激した単球は、高いTNF−α応答を示した
(AHM除去７時間後ではTNF−α放出減少は74〜88％であったのに対して、この場
合44〜47％であった)。これらの結果は、100μｇ／mlメラニンAHM8で処理した単
球は、この実験条件下で死滅することがなく、メラニンによる抑制の回復は、時
間依存的であることを示す。
６．７ メラニンは、活性化された単球のTNF−α生産を抑制する。
ここまで示したデータは、LPS刺激前にAHM8で前処理した単球を用いた実験か
ら得られた。LPS刺激後にメラニンを投与した場合に、TNF−αの生産が抑制され
るかどうか調べるために、LPS刺激の１時間後に、それと同時に、または１時間
前に、単球をメラニン処理した。予想通り、LPS刺激１時間前にメラニン投与す
ると、LPS誘導性のTNF−α生産は顕著に阻害された(100μｇ／mlメラニンによっ
て84±４％抑制された)(図４)。LPS刺激１時間後にメラニンを投与すると、TNF
−α生産は部分的に抑制された(100μｇ／mlメラニンによって45±13％抑制され
た、Ｐ＝0.05)。LPS刺激後より早い時点でメラニンを投与しても、より強い抑制
効果は見られなかった。LPS刺激後7.5分または60分で、100μｇ／mlメラニンで
単球を処理した場合、TNF−α生産は各々50％及び52％低下した（データ未表示
）。これらの結果は、メラニンは、予防効果と共に、補
正効果を発揮すること、そして少くとも２つの別の機構が、メラニン添加後に見
られるTNF−α生産の正味の減少に関わっていることを示す。
メラニンは、活性化された単球におけるTNF−α分泌を効率よく抑制しないと
いう事実は特に重要である。なぜならこのサイトカインは免疫反応の重要なメデ
ィエーターであるからである。この事実から、るいそう症候群の患者において、
感染に対抗する能力を損うことなく、TNF−αの均衡または正常レベルを回復す
るために、メラニンを使用することが示唆される。
６．８ 他の刺激物によって誘導されるTNF−α生産に対するメラニンの影響。
AHM8が、LPS以外の刺激物によって活性化された細胞によるTNF−α生産を調節
することができるかどうか調べるために、前記と同様な実験において、他の刺激
物を用いた。ただし、各刺激物において、適切な投与量を調整して用いた。この
測定に用いた刺激物は、限定ではないが、Mycobacterium、アレルゲン（過敏性
反応を伴う化合物を含む）、及びレクチンである。
刺激物に関係なく、AHM8がヒト単球によるTNF−α生産に影響するかどうか決
定するために、Mycobacterium avium複合体(MAC)〔菌株101(serovar 1)〕；また
はM.tuberculosis(MTB)の無病毒性株（H37Ra）でインビトロ感染させた単球、あ
るいは、MTBから精製したタンパク質誘導体(PPD)で刺激した単球を、阻害濃度の
AHM8で処理した。PPDは、単球におけるTNF−α合成及び放出を誘導するアゴニス
トとして知られていて、MTBのオートクレーブした培養濾過液から調製され、こ
れをConnaught Laboratories Limited（Willowdale，Ontario，Canada）から購
入した。図５（Ａ−Ｄ）で示した様に、これらの実験結果は、TNF−α生産／放
出に対するAHM8の阻
害効果は、刺激物に依存しないことを示す。AHM8存在下に24時間インキュベーシ
ョンした後に、MACもしくはMTBに感染した単球、またはPPDもしくはLPSで刺激し
た単球によるTNF−α放出は45−55％低下した。
LPSの場合と異なり、単球におけるPPDによるTNF−α合成の刺激は、細胞表面
タンパク質CD14との相互作用を介さない（Wright，et al.，Science，249:1431-
1433，1990；Zhang et al.，J．Clin．Invest．91:2076-2083，1993）。TNF−α
生産の観察された減少は、AHM8処理した単球における活動性の低下または細菌に
よる高負荷の結果ではなかった。トリパンブルーの排除性は、AHM8存在または非
存在下にインキュベーションした細胞において、ほぼ等しかった（93％対98％）
。３回の実験で、100μｇ／ml AHM8とインキュベーションした単球の48±17％が
、この抗酸桿菌を含んでいて、一方培地単独でインキュベーションした感染単球
の51±23％がそれを含んでいた。100μｇ／ml AHM8存在下に24時間インキュベー
ションした後に、単球から回収した生存している細胞内細菌数は、培地単独中に
維持した単球から回収した数とほぼ同程度であった（各々24±９対24±４コロニ
ー形成単位／細胞、ｎ＝３）。
混入したLPSではなく、生存マイコバクテリア及びPPDが、単球によるTNF−α
生産を刺激したことを確かめるために、単球に添加する前に、マイコバクテリア
懸濁液またはその生産物(PPD)をポリミキシンＢ(PMB)で30分間前処理した。PMB
は、LPSによるサイトカイン生産の誘導を阻害する。コントロールとして、単球
を、PMBで前処理したLPSとインキュベーションした。予想通り、PMBで処理したL
PSとインキュベーションした単球は、TNF−αを生産しなかった(PMB未処理LPSで
刺激した単球と比べた場合、サイトカイン放出は93％阻害された)。以前の研究
データ(Hirsch et al.，J．
Immunol．152:743-753，1994)と一致して、PMBによるMAC，MTBまたはPPDの前処
理は、各々のTNF−α誘導活性に対して何も影響を与えなかった（データ未表示
）。
６．９ TNF−αのmRNA発現に対するメラニンの影響。
LPS刺激した単球におけるTNF−αmRNAの発現に対するAHM8の影響を調べるため
に、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行った（Chomczynski and Sacc
hi，Anal．Biochem．162:156-159，1987;Waleh et al.，Cancer Res．54:838-84
3，1994）。mRNAとタンパク質レベルの調節は、連係して起きるが、この様な場
合は、それほど多くない。例えば、mRNAの生産増加は、このmRNAが不安定である
場合、タンパク質量の増加に至らないかもしれない。あるいは、翻訳またはmRNA
プロセシングの妨害によって、対応するタンパク質の生産／放出の増加が抑制さ
れるかもしれない。TNF−αの合成は、翻訳の抑制解除に大きく依存している（H
an et al．J．Exp．Med．171:465-475，1990）。
最初に、ヒト単球におけるTNF−αmRNAの集積に対するAHM8前処理の効果を調
べた。非接着条件下に培養したヒト単球を、０，50または100μｇ／ml AHM8で１
時間処理してから、１ng／ml LPSで刺激した（各々図６のレーン１，２または３
）。指示した非毒性の投与量のAHM8で単球を前処理することで、LPS誘導性のTNF
−α生産／放出が強く阻害される(66−83％)(図１参照)。LPS刺激１時間後に、m
RNA発現を調べるために、単球を集め、溶解した。以前の研究データ（未表示）
から、単球におけるTNF−αのmRNA発現は、LPS刺激１時間以内にピークとなり、
その後減少することが判っていた。
図６で示した通り、50μｇ／mlのAHM8は、LPS誘導性のTNF−αmRNA発現に対し
て阻害的効果を示さなかった（レーン１と２を比べ
る）。しかし、100μｇ／ml AHM8に反応して、TNF−αmRNAの発現は低下した（
レーン１と３を比べる）。ビデオデンシトメーターを用いて測定したところ、こ
の時のmRNAのレベルは、AHM8非存在下にLPSで刺激した単球での発現に比べて26
％低下した。
次の実験で、１ng／ml LPSと100ng／ml AHM8とで同時に処理した単球を用いて
、ノーザンブロット分析を行った。コントロールの単球は、AHM8非存在下でLPS
刺激した。その他のコントロールとして、培地単独または100μｇ／ml AHM8存在
下でインキュベーションした単球を用いた。LPS刺激後１及び３時間で抽出した
総RNAを、ヒトTNF−α（図７Ａ）またはIL−６（図７Ｂ）のcDNA断片で探索した
。TNF−α放出を測定するために、別の１組の単球を37℃で24時間培養した。培
養上清中のTNF−αレベルをELISAで測定した。
明らかに、LPSで同時に刺激した場合、AHM8は、TNF−α及びIL−６のmRNAの集
積を減少させた。この実験では、両サイトカインのmRNAレベルは、25％減少した
が、TNF−αの合成／分泌は68％減少した。AHM8単独では、TNF−αのmRNA発現に
対する刺激効果はなかった（レーン２）；AHM8処理した細胞中に存在するmRNAの
量は、コントロール（培地だけで維持した細胞）のもの（レーン１）とほぼ等し
かった。
AHM8がTNF−αのmRNAの安定性に影響する可能性を排除するために、LPS刺激し
た単球におけるmRNAの分解を、10μｇ／mlのアクチノマイシンＤ存在下で評価し
た。図８で示した通り、アクチノマイシンＤと100μｇ／ml AHMとの組合せ、ま
たはアクチノマイシンＤ単独で処理したLPS刺激単球から抽出したTNF−αmRNAで
は、同様な分解経過を示すことから、AHM8は、TNF−αmRNAの安定性に影響しな
いことが判る。
総合すると、これらの事実は、AHM8が、異なる機構を介して調節効果を発揮す
ることを示す。AHM8は、100μｇ／mlの濃度で、TNF−α遺伝子の転写を適度に阻
害するが、一方、50μｇ／mlの濃度でも、翻訳またはプロセシングに対しては強
い阻害効果を示す。
６．１０ インビボでのTNF−α生産に対するメラニンの影響。
インビボにおいてメラニンがサイトカイン生産を減少させるかどうかを調べる
ために、LPS注入前、同時、または後にAHM8を注入したマウスにおいて、循環血
中のTNF−α濃度を測定した。放出されたTNF−αなどの前炎症性サイトカインは
、複数の細胞内分子機構、例えば接着分子（例えば細胞間接着分子１及びＥ−セ
レクチン）の発現、炎症性疾患の経過における２次性炎症メディエーター（例え
ばプロスタグランジン）の生産を惹起する（Mizel et al.，Proc．Natl．Acad．
Sci．USA．78:2474-2477，1981;Dayer et al.，J．Exp．Med．162:2163-2168，1
985）。プロスタグランジンは、細胞内プロテアーゼの生産を刺激する(Baracos
et al.，N．Engl．J．Med．308:553-555，1983)。TNF−αは、急性炎症（すなわ
ち内毒素血症）中に生産される最初の因子の１つであり（Michalek，et al.，J
．Infect．Dis．141:55-63，1980；Beutler et al.，J．Immunol．135:3972-397
7，1985;Freudenberg et al.，Infect．Immun．51:891-895，1986;and Fong et
al.，J．Exp．Med．170:1627-1633）、このサイトカインのレベルは、内毒素シ
ョックの発症を予測する指標となる（Waage et al.，Lancet 8529:355-357，198
7）。従って、インビボでのLPSによるTNF−α応答を、メラニンのサイトカイン
調節作用を決定するためのモデルとして用いた。
この実験では、メスBALB／ｃマウスに、予め決定した量のLPS（0.625mg／kg体
重）及びAHM8（50mg／kg体重）を静脈内注射した（急性毒性研究から、Spraque
Dawley系ラットでは、メラニンの単一静
脈注射量として５ｇ／kgは十分に許容されることが示された）。コントロールマ
ウスには、LPS，AHM8またはPBSのいずれかを注射した。コントロール群では、マ
ウスに、同じ注射回数と注入量10ml／kgで、PBSを静脈注射した。90分後、0.750
μｇEDTA及び50μｇアプロチニン（Sigma Chemical Co.）を含んだ0.5ml容量チ
ューブ(Microtainer tubes #5973;Becton Dickinson)に血液を採取した。血液採
取後３−５分以内に４℃で遠心して血漿を分離し、検査まで７日間以内−70℃で
保存した。各血漿サンプルは一度だけ解凍した。予備的な時間経過の実験から、
BALB／ｃマウスにおいて、LPS投与90分後にTNF−α応答のピークが来ることが判
った。各血漿サンプル中のTNF−α含有量を、２回の実験から、ELISA（BioSourc
e International）で測定した。各群において最低10匹のマウスを用いた。なぜ
なら（１）正常マウスの内毒素感受性は多様であるので、TNF−α応答も非常に
多様であり；（２）血漿中のTNF−αの半減期は短かく(約６−７分)(Beutler et
al.，J．Immunol．135:3972-3977，1985);そして（３）可溶性TNF−α受容体が
サイトカイン測定を妨害する（Aderka et al.，Cancer Res．51：5602-5607，19
91）からである。確認のために、各実験を２−４回繰り返した。
次の２つの実験の結果は、LPS刺激60分前に50mg／kgメラニンを注射したマウ
スの血漿中のTNF−αレベルは、LPS単独を注射した場合よりも77％低かった(図
９Ａ，ｐ＜0.001)ことを示す。メラニン単独またはPBS(媒体)を注射したマウス1
0匹の血漿中のTNF−α濃度は、各々33±16及び45±17pg／mlであった。
LPSと50mg／kg AHM8とを同時にマウスに注射した場合、LPS刺激によるTNF−α
生産／放出の増加は62％減少した(ｎ＝40)(図９Ｂ，ｐ＜0.0001)メラニンは、25
mg／kgでも阻害性を示した。0.625mg／kgLPSと25mg／kg AHM8とを同時に注射し
た12匹のマウスの
血漿中TNF−α濃度は、LPS単独を注射したマウスの場合と比べて62％低下した(1
,702±345pg／ml対4,473±1,913pg／ml，p=0.05)。AHM8による阻害効果は、メラ
ニンとLPSとの直接的相互作用のせいではない。なぜなら、この実験では、最初
にLPSを尾の１つ目の静脈に注射し、そしてすぐにAHM8を尾の２つ目の静脈に注
射したからである。
LPS刺激15分後に投与した場合もメラニンは有効であった。図９Ｃで示した通
り、LPS投与15分後にメラニンを注射したマウスの血漿中TNF−αレベルは、LPS
単独を注射したコントロールマウスに比べて有意に低かった(ｐ＜0.008)。しか
し、LPS刺激30分後に注射した場合、メラニンは、TNF−α生産／放出を抑制でき
なかった（データ未表示）。この結果は、マウス血中のTNF−αは比較的短期間
（６０−９０分）のピークを有することと一致し(Garina et al．J．Exp．Med．173
:1305-1310，1991)、そして転写後のTNF−α生合成相が一端完了すると、メ
ラニンはこの過程を抑制調節できないことを示唆する。
総合すると、これらのデータは、メラニンが、急性炎症症状下のTNF−α生産
／放出を有意に低下させること、メラニンによる防護効果を得るために動物を前
処理する必要がないことを示す。
前記のインビボの研究では特にマウスを用いたが、典型的には任意の許容範囲
の動物モデルを、インビボにおける精製メラニンによるサイトカイン発現調節能
を調べるために用いることができる。更に、テストに用いるマイトジェン及び注
入方法に応じて、できる限り、実験方法及び条件を調整する必要がある。次に、
メラニンによる前処理が、内毒素刺激に対する予防効果を生じることを示すイン
ビトロ研究の例を開示する。次の実施例は、単なる例であって、本発明を限定す
るものではない。
典型的な動物試験では、実験データの統計的再現性を証明するために、各処理
群に最低約５−８匹の動物を用いる。少くとも約10匹の試験動物を用いることに
よって、動物における微生物感受性の相異などの変動性、及び動物の取扱い及び
注射を繰り返すことによって生じる変動性を補償することができる。
精製メラニン（AHM8）は、普通静脈注射によって、一般的には約10〜約200mg
／kg体重、好ましくは約25〜約75mg／kg体重、特には約50mg／kg体重の濃度で、
試験動物に適用される。コントロール動物には、相当する量の緩衝生理食塩水を
注射する。
メラニン処理後に、種々の致死量未満の量及び致死量のマイトジェン(LPS、ま
たは全身性の敗血症またはショックの症状を誘発するために有効な他の薬剤)を
、コントロール動物及び試験動物に注射する。注射後適当な時間間隔で血液サン
プルを集め、血液中に存在する精製メラニン及びサイトカインの量を定量する。
あるいは、致死量のマイトジェンを用いる場合、メラニンによる試験動物の防護
の程度を決定する。
前記実施例で示した通り、本発明の範囲内で、本発明に関する多様な改修が当
業者において明らかに可能である。本明細書中で参照した全ての特許及び文献を
引用して、本明細書に組み込む。
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１１月５日（１９９９．１１．５）
【補正内容】
(1) 明細書１頁19行目「Waag」を『Waage』に補正する。
(2) 明細書２頁18行目「Patten」を『Patton』に補正する。
(3) 明細書２頁24〜25行目「Lancet 2:1-5，1982」を『Ann Rev.Nutr.2:277-
3
01(1982)』に補正する。
(4) 明細書２頁25行目「237」を『327』に補正する。
(5) 明細書３頁５行目「Dewy」を『Dewys』に補正する。
(6) 明細書３頁11行目「Shaby」を『Shasby』に補正する。
(7) 明細書３頁12〜13行目「Elseiver」を『Elseiver Science Publishers』
に補正する。
(8) 明細書４頁２行目「1989」を『1988』に補正する。
(9) 明細書４頁４行目「Vissier」を『Vissiers』に補正する。
(10) 明細書４頁22行目「371-510」を『371:508-510』に補正する。
(11) 明細書５頁24行目「Gang」を『Gange』に補正する。
(12) 明細書６頁10行目「26-50」を『25-50』に補正する。
(13) 明細書６頁24行目「Ashenazi」を『Ashkenazi』に補正する。
(14) 請求の範囲を別紙の通り補正する。
請求の範囲
1. 動物細胞によるサイトカイン生産を調節するための、精製されたメラニン
を含んで成る医薬製剤。
2. 前記サイトカインがインターロイキン、TNF−α及びGM−CSFの群中から選
択される、請求項１の医薬製剤。
3. 前記サイトカインがTNF−αである、請求項２の医薬製剤。
4. 前記サイトカインがIL−１である、請求項２の医薬製剤。
5. 前記サイトカインがIL−６である、請求項２の医薬製剤。
6. 前記サイトカインがインターロイキンである、請求項２の医薬製剤。
7. 前記調節をインビトロで行う、請求項２の医薬製剤。
8. 動物によるサイトカイン生産を調節することによって、その動物における
サイトカイン発現が関与する疾患の有害な症状を軽減するための、精製されたメ
ラニンを含んで成る医薬製剤。
9. 前記動物が哺乳類である、請求項８の医薬製剤。
10．前記動物が人間である、請求項９の医薬製剤。
11．前記疾患が悪液質、関節炎、腱炎、炎症性腸疾患、敗血症、ショック、AI
DS及びアレルギーの群中から選択される、請求項８の医薬製剤。
12．前記疾患が悪液質である、請求項11の医薬製剤。
13．前記疾患が関節炎である、請求項11の医薬製剤。
14．前記疾患が炎症性腸疾患である、請求項11の医薬製剤。
15．前記疾患がアレルギーである、請求項11の医薬製剤。
16．前記疾患が移植片拒絶である、請求項８の医薬製剤。
17．前記疾患が移植片対宿主病である、請求項８の医薬製剤。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１
// Ｃ０７Ｄ 487/06 Ｃ０７Ｄ 487/06