KR20000071029A - 멜라닌에 의한 시토킨의 매개방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 동물 및 사람의 질병을 치료하기 위해 정제된 멜라닌을 사용하는 방법 및 조성물에 관한 것으로서,
과잉 시토킨 생성과 관련된 질병을 치료하고, 예방하거나 또는 개선하기 위해 정제된 멜라닌 조성물을 사용하는 방법 및 조성물이 제공되며, 특히 시토킨 TNF-α의 세포내 생성 및 방출 및 그와 연관된 유해 질병을 감소시키는데 유용한 방법 및 조성물이 제공되는 것을 특징으로 한다.
Description
종양괴사인자-α(TNF-α)는 대식구에 의해 일차적으로 방출되는 17-kd 폴리펩티드이다. 일반적으로, TNF-α는 건강한 성인의 혈청내에 측정가능한 양으로 존재하지 않지만; 면역촉진물질에 대해 신속하게 반응하는 것으로 나타난다(Beutler and Cerami, Adv. Immunol. 42:213-232, 1988). 생리농도에서, TNF-α는 침습성 병원체의 성장 및 확산을 제한한다. 그러나, 상기 시토킨의 과도한, 또는 비제어형 생성은 여러 질병조건의 발병기전에 기여한다.
단독으로 및/또는 다른 매개체와 협력하여 작용하는 TNF-α는 비가역적인 심혈관허탈(쇼크) 및 결정장기 파괴의 잠재적으로 치명적인 증후군을 유발한다(Beutler, Science 229:869-871, 1985; Tracy 외 다수 , Nature 330:662-664, 1987; Waag 외 다수, Lancet 1:355-357, 1987). 부가적으로, 인터류킨 IL-1 및 IL-6과 협력하거나 상승작용하는 TNF-α는 소모성 증후군(악액질)의 발병에 기여한다(Grunfeld 외 다수, Am. J. Clin. Nutr. 55:455-460, 1992; Grunfeld and Feingold, N. Engl. J. Med. 327:329-337, 1992).
예를 들면, 내독소-자극성 대식구로부터의 상층액의 실험적 투여는 설치류에 있어서 심각한 체중손실을 초래한다(Cerami 외 다수, Immunol. Lett. 11:173-177, 1985). 게다가, TNF-α(Rouzer and Cerami, Mol. Biochem. Parasitol. 2:31-38, 1980) 또는 IL-6(Black 외 다수, Endocrinology 128:2657-2659, 1991)중 하나가 분비되는 유전공학처리된 종양세포가 이식된 무모마우스는 점차적으로 식욕이 감퇴되어 쇠약해진다. TNF-α, IL-1 및 L-6을 투여하면 지방산/트리글리세리드의 무익회로를 일으키는 간지방생성 및 극저밀도 지방단백질 생성을 증가시켜 결국은 쇠약해져 설치류내 혈장 트리글리세리드를 증가시킨다(Feingold and Grundfeld, J. Clin, Invest. 80:184-190, 1987; Grunfeld 외 다수, Cancer Res. 50:4233-4238, 1990; Feingold 외 다수, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 11:495-500, 1991).
시토킨은 또한 중요한 대사호르몬의 수준을 증가시키며; 글루코스 및 아미노산대사를 변경시키며; 및 음식물섭취시 심각한 영향을 미친다. 실험용 동물에서, TNF-α는 위운동을 감소시켜, 결과적으로 음식물을 보존하며(Patten 외 다수, J. Clin. Invest. 80:1587-1596, 1987), IL-1은 시상하부의 식욕중추에 직접 영향을 미침으로써 연속적인 식욕부진을 유도한다(Hellerstein 외 다수, J. Clin. Invest. 84:228-235, 1989). 사람에서, 소모성 증후군은 결핵 및 AIDS를 포함하는 않는 여러 전염병 및 암과 종종 관련되어 있지만, 여기에 제한되지는 않는다.
진행성 체중감소에 더해, 많은 환자들은 식욕부진(식욕감퇴), 구역질, 근육약화 및 빈혈을 경험한다(Lawson 외 다수, Lancet 2:1-5, 1982; Grunfeld and Feingold, New Engl. J. Med. 237:329-337, 1992). 악액질이 식욕부진을 포함해도, 보통 암 및 전염병과 관련된 악액질에서 손실된 제지방체중 정도는 감소된 칼로리 섭취에 의해 설명될 수 없다(Spiegelman and Hotamisligil, Cell 73:625-627, 1993).
악액질은 환자의 생존에 직접 영향을 미치는 것외에, 진행성 체중손실 및 빈혈은 적극적인 요법에 내성이 있는 악액질 환자의 능력을 보통 제한하기 때문에, 장해 종말점으로서 간주된다(Dewy 외 다수, Am. J. Med. 69:491-497, 1980).
악액질의 우세로 인해 상기 증후군은 상당한 의료문제를 일으킨다. 종합하면, 상기 결과는 환자에 있어서 소모를 조절하기 위해, IL-1, IL-6 및 TNF-α의 합성/방출을 방해하는 제제인 멜라닌을 사용하는 기계론적 기반을 제공한다.
TNF-α는 또한 사람에 있어서, 그람-음성 패혈증의 심각한 결과인 성인 호흡곤란증후군(ARDS)을 유도할 수 있다(Shaby 외 다수, In:Pathophysiology of Endotoxin, J.B. Hinshaw, ed. Amsterdam: Elsevier, pp. 105-128, 1985). 12,000pg/㎖ 이상의 TNF-α 농도는 ARDS 환자에게서 흡인한 폐에서 검출한다(Millar 외 다수, Lancet 2:712-714, 1989). 상기 시토킨은 또한 내피세포에 대한 다형핵백혈구의 점착성을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Gamble 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:8667-8671, 1985). 폐의 미세맥관계 및 상부호흡기도내 활성화 과립백혈구의 증가된 점착성은 ARDS에서 폐혈관 손상의 주요 원인중 하나이다. 특히, 내피세포상의 내피백혈구 점착분자(ELAM) 및 세포내 점착분자(ICAM)의 발현은 세포결합을 증가시키는 현상인 TNF-α 또는 IL-1(Munre 외 다수, Am. J. Pathol. 135:121-132, 1989)과 같은 시토킨에 의해 유도되거나 또는 강화된다.
TNF-α, IL-1 및 IL-6은 류마티스양관절염의 병리에 중요한 역할을 한다(Saklatvala, Nature 322:547-549, 1986; Miossec. Clin. Rheumatol. 5:305-308, 1987; Lupia 외 다수, Eur. J. Immunol., 26:1690-1694, 1996). 류마티스양관절염 환자의 윤활액은 TNF-α(Saxne 외 다수, Arthritis Rheumatism 31:1041-1132, 1989) 및 IL-6(Guerne 외 다수, J. Clin. Invest. 83:585-592, 1989)을 함유한다. 현재의 증거는 면역복합체가 단핵세포를 자극하여 TNF-α(Visser 외 다수, Am. J. Pathol. 134:1-6, 1989) 및 IL-1(Chantry 외 다수, Eur. J. Immunol. 19:189-192, 1989)을 분비한다는 것을 제시해준다. TNF-α 및 IL-1은 활막세포(synoviocyte)에 의한 프로테아제 및 프로스타글란딘의 생성 및 파골세포에 의한 골흡수를 차례로 자극한다(Miossec, Clin. Rheumatol. 5:305-308, 1987; Dayer 외 다수, J. Exp. Med. 162:2163-2168, 1985; Saklatvala, Nature 322:547-549, 1986). 게다가, 류마티스성 관절내에 TNF-α 및 IL-1이 존재함으로써 혈장세포의 바로 가까이에서 발견된다면 자기항체를 생성시키는 IL-6 합성을 자극하여 활막염을 지속시키기 위해 함께 작용한다. IL-6은 활막세포에 의해 자발적으로 생성되며, 높은 수준의 IL-6은 염증성 관절증 환자의 윤활액내에 존재한다(Guerne 외 다수, J. Clin. Invest. 83:585-592, 1989).
뇌말라리아는 임계수준의 혈청 TNF-α와 관련된 일부 말라리아 환자의 치명적인 초급성 신경계 증후군 및 예후이다(Grau 외 다수, Science 237:1210-1212, 1987; Clark 외 다수, Am. J. Pathol., 129:192-199, 1987; Grau 외 다수, New Engl. J. Med 320:1586-1591, 1989; Kwiatkowski 외 다수, Lancet 336:1201-1204, 1990; McGuire 외 다수, Nature 371-510, 1994). 비슷하게, 이식편대 숙주반응에서 TNF-α 농도의 증가는 주요 합병증과 관련되어 있다(Holler 외 다수, Blood 75:1011-1016, 1990).
TNF-α 단독, 또는 IL-1 또는 IL-6과의 상승작용은 잠복감염된 T 세포 및 단핵세포에서 HIV-1의 복제를 증가시킨다(Folks 외 다수, Science 238:800-802, 1987; Folk 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2365-2368, 1989; Poli 외 다수, J. Exp. Med. 172:151-158, 1990; Poli 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:108-112, 1994). TNF-α는 HIV에 의해 사용된 전사인자인 NF-kβ의 강한 유도물질이다(Nobel and Baltimore, N. Engl. J. Med. 234:308-317, 1987; Duh 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5974-5978, 1989). 게다가, TNF-α, IL-1 및 IL-6의 합성은 HIV 감염의 결과 상향조절된다(Folks 외 다수, Science 238:800-802, 1987; Nakajima 외 다수, J. Immunol. 142:531-536, 1989). AIDS 환자의 혈청 및 뇌척수액은 증가된 수준의 TNF-α, IL-1 및 IL-6을 함유한다(Lahdevirta 외 다수, Am. J. Med. 85:289-291, 1988; Emille 외 다수, J. Clin. Invest. 86:148-159, 1990; Breen 외 다수, J. Immunol. 144:480-484, 1990).
HIV-1 뇌염에서 일어나는 세포자멸식 뉴론손실(apoptotic neuronal loss)은 TNF-α와 관련되어 있다(DeSimone 외 다수, Immunol. Today 17:256-258, 1996). 게다가, TNF-α는 AIDS 관련 악액질과 깊이 관련되어 있다(Wright 외 다수, J. Immunol. 141:99-104, 1988). 그러므로, 단핵세포에 의한 비정상적인 시토킨생성의 하향조절 및, 특히 TNF-α의 하향조절은 HIV 감염의 진행을 방해하고, 악액질 환자에 대해 지지적 보호를 제공하는 것으로 기대된다.
IL-6은 AIDS 환자의 카포시육종(KS) 상처에서 얻은 세포에 대한 오토크린(autocrine) 성장인자이다(Miles 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:4068-4072, 1990). 다초점성 맥관병변인 KS는 또한 신장 또는 심장 이식조직을 이식받은 환자에서와 같은 다른 면역억제상황에서 보여진다(Gang and Jones, Clin. Exp. Dermatol. 3:135-146, 1978; Greenfield 외 다수, J. Rheumatol. 13:637-640, 1986). AIDS-KS-유도성 세포선은 실질량의 IL-6을 함유하고 분비하며, tat 단백질의 AIDS-KS 성장증진효과는 증가된 IL-6 생성에 의해 매개된다. 상기 세포에 IL-6 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드를 가하면 IL-6 생성이 감소될 뿐만 아니라 그들의 성장이 두드러지게 억제된다(Miles 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:4068-4072, 1990).
AIDS-KS 유도 세포는 IL-1을 포함하는 다른 시토킨들을 생성한다(Marx, Science 248:442-443, 1990). KS 세포선에 안티-IL-1 항체를 가하면 세포증식이 감소된다. 증가된 수준의 혈청 IL-6 및 다중클론 B세포 활성화는 AIDS 환자에서 보여지는 B세포 악성종양의 증가된 빈도와 관련되어 있다(Akira and Kishimoto, Immunol. Rev. 127:26-50, 1992).
KS와 같이, IL-6-IL-6-수용체 오토크린 루프의 존재는 다발성 골수종의 발병기전과 깊은 관련이 있다(Kawano 외 다수, Nature 332:83-85, 1988). 상승된 수준의 IL-6은 혈관간 증식성 사구체신염(Horii 외 다수, J. Immunol. 143:3949-3955, 1989) 및 건선(Grossman 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:6367-6371, 1989)과 같은 다른 병리상태에서 관찰되었다.
시토킨의 생명-위협 측면 및 염증을 퇴치하는데 여러 제제가 사용되어 왔다. 안티-TNF-α 항체, TNF-α 수용체, 안티-IL-6 및 IL-1 수용체 길항물질(IL-1Ra) 치료법은 실험용 동물에서 급성 조직독성(예를 들어, 패혈증 쇼크)후 사망을 감소시키는 것으로 나타났다(Beutler 외 다수, Science 229:869-871, 1985; Tracy 외 다수, Nature 330:662-664, 1987; Ohlsson 외 다수, Nature 348:550-552, 1990; Starnes 외 다수, J. Immunol. 145:4185-4191, 1990; Ashenazi 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539, 1991; Lesslaner 외 다수, Eur. J. Immunol. 21:2883-2886, 1991). 그러나, 상기 시토킨 차단제에 대한 반응은 제제의 예방투여 또는 감염위치에 의존한다(Bagby 외 다수, J. Infect. Dis. 163:83-88, 1991). 게다가, 여러 연구에서 안티-시토킨 항체는 동물들을 일부만 보호한다(Feingold 외 다수, J. Clin. Invest. 83:1116-1121, 1989).
여러 연구데이터는 안티-TNF-α(Elliott 외 다수, Arthritis Rheum. 36:1681-1690, 1993; Elliott 외 다수, Lancet 344:1105-1110, 1994) 또는 안티-IL-6(Wendling 외 다수, J. Rheumatol. 20:259-262) 단일클론 항체 뿐만 아니라 가용성 TNF-α 수용체(Moreland 외 다수, Arthritis Rheum. 37:S295, 1994) 또는 가용성 IL-1 수용체(Drevlow 외 다수, Arthritis Rheum. 37:S339, 1994)의 주입에 의해 시토킨의 차단제는 류마티스양관절염을 치료하는데 효과적이라는 것을 보여준다. 그러나, 단일 인자에 대한 항체 또는 가용성 시토킨 수용체의 용도는 염증조건의 증상발현에 참여하는 여러 시토킨의 존재에 의해 억제된다. 게다가, 안티시토킨 항체로 실시하는 대규모 치료는 유전형 항체를 생성시킨다.
덱사메타존(Luce 외 다수, Am. Rev. Respir. Dis. 138:62-68, 1988), 펜톡시필린(pentoxifylline)(Netea 외 다수, J. Infect. Dis. 171:393-399, 1995), 탈리도미드(thalidomide)(Klausner 외 다수, J. Acquir. Immun. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 11:247-257, 1996), 수라민(Strassman 외 다수, J. Clin. Invest 92:2152-2159, 1993) 또는 α-멜라닌세포자극 호르몬(α-MSH)(Chio 외 다수, J. Clin. Invest. 97:2038-2044, 1996)과 같은 제제는 또한 전염증성 시토킨의 합성을 제한하는데 사용되어 왔다. α-MSH를 제외하고, 상기 제제들은 감염(덱사메타존 및 펜톡시필린)후 제공될때 비효과적이고, 목표 여러 시토킨이 아니거나, 또는 여러 부작용을 가지기 때문에 임상용도로는 제한된다.
탈리도미드 및 펜톡시필린은 TNF-α의 생성을 억제하지만, IL-1β 또는 IL-6의 생성은 억제하지 않는다(Sampaio 외 다수, J. Exp. Med. 173:699-703, 1991). 여러 시토킨은 염증성 질병의 발병기전에 기여하기 때문에, 단일 시토킨의 억제는 질병의 진행을 반전시키거나, 방해하지 않는다. 탈리도미드는 최기형이며, 진정제 및 진토제로서 과거에 사용되었으며, 수라민은 상당한 독성을 가진다(Stein, Cancer Res. 53:2239-2248, 1993).
메인스테이(mainstay) 소염제인 코르티코스테로이드는 감염에 대한 감수성, 시상하부-뇌하수체-부신 축의 억제 및 쿠싱모양 특징과 같은 역효과를 분명히 보여준다. 시클로스포린 A가 사용되면 고혈압 및 신독성을 일으킨다.
멜라닌 자체는 숙주방어기작으로부터 유기체를 보호함으로써 박테리아 독력인자로서 작용하는 유리 라디칼 제거제이다(Wang and Casadevail, Infect. Immun. 62:3004, 1994). 추가의 연구는 박테리아에 의한 멜라닌 발현이 박테리아 병원체가 숙주내에서 T세포-매개 면역반응의 구심성 단계를 피하는 것을 도와주는 독력인자라는 것을 보여주었다(Huffnagle 외 다수, J. Immunol. 155:3507-3516, 1995).
발명의 요약
본 발명은 사람을 포함한 동물에 치료제로서 멜라닌을 사용하는 것에 관한 것이다. 바람직한 치료방법은 질병 또는 질환의 유해증상을 경감하거나 또는 예방하기에 충분한 양으로 정제된 멜라닌 또는 생합성 멜라닌을 동물에 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 목적은 환자에게 치료적으로 유익하기에 충분한 양으로 환자에게 멜라닌을 투여하는 것으로 구성된, 환자의 병을 치료하거나 또는 예방하기 위해 정제된 멜라닌을 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 정제된 멜라닌은 환자의 면역반응을 조절하는데 충분한 양으로 투여됨으로써 치료적으로 유익하다. 특히 바람직한 구체예에서, 정제된 멜라닌은 숙주 시토킨, 특히 TNF-α, IL-1 및 IL-6 생성을 감소시키는 것과 관련되기에 충분한 양으로 투여된다. 일반적으로, 시토킨 생성의 감소는 정제된 멜라닌의 투여와 관련된 이로운 임상 징후의 효과 또는 원인이다.
본 발명에 사용된 정제된 멜라닌은 약학적으로 유용한 여러 담체 또는 부형제와 조합하여 투여된다. 따라서, 본 발명의 추가의 구체예에서 TNF-α 생성을 감소시키기 위해, 또는 환자에게 치료적으로 이로움을 주기 위해, 정제된 멜라닌으로 구성된 약학적 조성물을 사용한다.
본 발명의 추가의 구체예에서는 실제로 균일한 구조를 가지고, 혼입된 오염 아미노산 또는 그의 유도체가 실제로 유리된 고도로 정제된 멜라닌을 사용한다.
정제된 멜라닌의 치료적 용도는 특히 악액질, 객담, 급성 호흡질환증후군, 뇌염 말라리아, 류마티스양관절염, 피부 및 맹장의 상피괴사(특히 염증성 장 질병-궤양성 대장염, 크론병 등) 또는 높은 수준의 TNF-α 또는 다른 시토킨 발현과 관련된 질병 또는 그와 연관된 유해증상을 치료하는데 유용한 것으로 생각된다.
특히, 이식편 거부반응은 염증반응과 종종 연관되며, 본 발명의 추가의 구체예에서는 이식된 기관 및 이식편의 거부반응을 감소시키거나 또는 예방하기 위해 정제된 멜라닌 또는 정제된 합성멜라닌을 사용한다. 정제된 멜라닌은 또한, 이식편대 숙주병을 치료하고 예방하는데 유용한 것으로 생각된다.
상기 관점에서, 본 발명의 추가의 구체예는 동물세포에 의한 시토킨 생성을 조절하는데 충분한 양으로 상기 동물세포에 정제된 멜라닌을 투여함으로써 동물세포에 의한 시토킨 생성을 조절하는 방법이다. 바람직한 구체예에서, 정제된 멜라닌은 정제된 멜라닌을 포함하는 조성물이 포유동물 또는 다른 동물세포에 의한 시토킨 발현을 조절할 수 있는 특성을 가진다는 점을 입증하기 위해 생체외에서 실험될 것이다.
본 발명은 동물 및 사람의 질병을 치료하기 위해 정제된 멜라닌을 사용하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 멜라닌 조성물은 생체외 및 생체내에서 모두 포유동물 및 사람세포에 의해 시토킨 생성을 조절하는데 특히 유용하다.
도 1은 멜라닌이 LPS-유도성 TNF-α 생성을 억제한다는 것을 보여준다. 흰색 원은 1ng/㎖ LPS로 자극하기 전에 여러 농도의 멜라닌 AHM 8과 함께 37℃에서 40분동안 배양한 단핵세포(1×106세포/㎖)에 의한 TNF-α 생성/방출을 나타낸다. TNF-α 생성은 ELISA에 의한 세포유리 배양 상층액에서 측정되었다. TNF-α 농도는 또한 멜라닌의 부재하에서 LPS(3,230pg/106세포/㎖)로 자극된 단핵세포에서 수집된 상층액, 또는 배지내에 단독(36pg/106세포/㎖)으로 보유되어 있는 단핵세포에서 수집된 상층액으로부터 측정했다.
흑색 원은 멜라닌-처리 세포에 의한 단백질의 구조합성에 멜라닌이 미치는 영향을 나타낸다. 96-웰 플레이트에 심은 단핵세포(10% 투석 사람AB혈청으로 채운 0.2㎖ 류신-유리 배지당 1×105)를 지시된 농도의 멜라닌 AHM 8과 함께 37℃에서 5시간동안 배양하였다. 대조군 세포는 배양동안 배지내에 단독으로 넣어 놓았다. 결과를 보기 4시간전에, 세포를 [3H]-류신의 웰마다 5μCi로 펄스시켰다. 배지내에 단독으로 배양된 단핵세포에 의한 [3H]-류신의 평균(±SEM) 도입은 28,737±712cpm이었다.
도 2(A-D)는 멜라닌이 GM-CSF(도 2D)는 제외하고, 사람 말초혈액 단핵세포에 의한 TNF-α(도-2A), IL-1β(도-2B) 및 IL-6(도-2C)의 생성을 상당히 억제한다는 것을 보여준다. 단핵세포는 LPS 1ng/㎖로 자극하기 전에 지시된 농도의 멜라닌 AHM 8(0㎍/㎖, 흰색 막대; 50㎍/㎖, 빗금친 막대; 100㎍/㎖, 흑색 막대)로 전처리되었다. 대조군은 (1)LPS로 자극한 멜라닌-무처리 세포, (2)멜라닌-처리, LPS-무자극 단핵세포, 및 (3)첨가제의 부재하 완전배지내에서 배양된 단핵세포를 포함한다.
TNF-α의 양(pg)의 변화율(△)=(시토킨(pg)/106LPS-자극 단핵세포/㎖)-(시토킨(pg)/106LPS-무자극 단핵세포/㎖). 멜라닌 0㎍/㎖, 50㎍/㎖ 또는 100㎍/㎖의 존재하에서 배양된 106LPS-무자극 단핵세포에서 수집된 상층액내 평균 (±SEM) 시토킨함량은 각각 TNF-α에 대해 ≤108±5pg/㎖; IL-1β에 대해 ≤75±53pg/㎖; IL-6에 대해 ≤598±238pg/㎖; 및 GM-CSF에 대해 ≤168±124pg/㎖이었다.
도 3(A & B)은 TNF-α 생성의 멜라닌-매개 억제의 관찰되는 반전은 시간-의존성이라는 것을 나타내는 중복실험을 보여준다. 사람 말초혈액 단핵세포는 멜라닌 AHM 8 100㎍/㎖과 함께 37℃에서 배양하였다. 1시간 배양후, 유리 멜라닌을 제거하기 위해 세포를 세척하고, 새 배지에 현탁하고, 지정된 시간지점에서 LPS 1ng/㎖로 자극하였다. LPS 첨가하고 24시간후 수집된 배양 상층액내 TNF-α의 농도는 ELISA에 의해 측정하고, TNF-α 생성의 억제율을 나타냈다.
도 4는 멜라닌 처리가 LPS 자극후 가할경우, TNF-α 생성을 억제한다는 것을 나타낸다. 지정량의 멜라닌(각각, 50㎍ 또는 100㎍)을 가하고 1시간후(흰색 박스), 가함과 동시에(빗금친 박스) 또는 가하기 1시간전에(흑색 박스) LPS 1ng/㎖로 멜라닌을 자극하였다.
대조군 단핵세포는 멜라닌의 부재 또는 존재하에서 LPS 없이 배양하였다(도시되지 않음). LPS로 자극하고 24시간후, 배양 상층액내 TNF-α의 수준은 ELISA에 의해 측정하였다. 두 농도에서, 관찰된 TNF-α의 억제량은 세포를 멜라닌으로 전처리한 경우, 멜라닌 및 LPS로 동시에 세포를 처리한 경우, LPS 자극후 세포를 처리한 경우순으로 컸다(LPS로 자극하기 전에 멜라닌으로 1시간동안 처리한 단핵세포에 의한 TNF-α 생성에 비해 p<0.05).
도 5(A-D)는 AHM 8은 자극과 무관하게 TNF-α 생성을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 단핵세포를 박테리아:단핵세포의 비율이 10:1이 되도록 배양하여 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium, MAC, 도 5A) 균주 101(serovar 1), 또는 M. 튜베르큘로시스(M. tuberculosis)(MTB, 도 5B)의 비병원성 (H37Ra) 균주로 감염시켰다. 37℃에서 4시간 배양한후, 세포외 박테리아를 제거하기 위해 단핵세포는 저속 원심분리에 의해 완전히 세척되었다. 선택적으로, 단핵세포는 PPD(50㎍/㎖, 도 5C) 또는 LPS(1ng/㎖, 도 5D)로 자극하였다. AHM 8 100㎍/㎖의 존재하에서 24시간 배양후, MAC 또는 MTB로 감염되거나, 또는 PPD 또는 LPS로 자극받은 단핵세포에 의한 TNF-α의 방출은 45-55% 감소하였다. 각 배양액내 TNF-α의 수준은 ELISA에 의해 측정되었다. TNF-α 양(pg)의 변화율(△)/106세포/㎖=[AHM 8의 처리 및 자극받은 단핵세포의 상층액내 TNF-α의 pg/㎖]-[AHM 8의 처리 및 무자극 단핵세포의 상층액내 TNF-α(pg)/㎖].
도 6은 LPS 1ng/㎖로 자극하기 전에 1시간동안 AHM 0㎍/㎖, 50㎍/㎖ 또는 100㎍/㎖로 처리(각각, 레인 1, 2 및 3)한후, 비점착성 상태에서 배양된 사람 단핵세포에 의해 생성된 TNF-α mRNA의 상대량을 나타낸다. 전체세포 RNA는 구아니디늄 티오시아네이트 방법으로 추출하고, 포름알데히드/아가로스 겔 전기영동(RNA 10㎍/레인, 대조군으로서 28S를 사용하여 노르말화함)으로 크기분류하고, 섬모 블롯팅(Chomczynski 및 Sacchi, Anal. Biochem., 162:156-159, 1987)에 의해 나일론막상으로 이동시켰다. 상기 블롯은 플라스미드 pE4(American Type Culture Collection, Rockville, MD)의 Pst I 소화에 의해 얻어진 TNF-α의 1.1kb32P-표시된 cDNA 단편으로 잡종화되었다. 상기 데이터는 100㎍/㎖로 처리함으로써 세포에 의해 생성되는 TNF-α mRNA의 양을 감소시킬 수 있었다는 것을 나타낸다(레인 3).
도 7은 LPS 1ng/㎖ 및 AHM 8 100㎍/㎖로 동시에 처리된 단핵세포를 사용하여 실시한 노던 블롯을 나타낸다. 대조군 단핵세포는 AHM 8의 부재하에서 LPS로 자극하였다. LPS 자극하고 1시간 및 3시간후 추출된 전체 RNA는 사람 TNF-α(도 7, 패널 A) 또는 IL-6(도 7, 패널 B)의 cDNA 단편으로 프로브처리하였다. 단핵세포를 배지내에 단독으로, 또는 AHM 8 100㎍/㎖ 존재하에서(각각 레인 1 및 2) 1시간동안; LPS 1ng/㎖ 존재하에서(각각 레인 3 및 4) 2 또는 3시간동안; 또는 LPS 1ng/㎖ 및 AHM 8 100㎍/㎖의 존재하에서(각각 레인 5 및 6) 2 또는 3시간동안 배양하였다. 전체 세포RNA는 (E.coli BL21(DE3)의 pT7.7/hhIL-6에서의 1.5kb Bgl Ⅱ/Bam HI 단편인 ATCC 68636을 사용하여)TNF-α(패널 A) 또는 IL-6(패널 B)에 대해 특이적인32P-표시된 cDNA 프로브로 프로브처리하였다.
도 8은 AHM-8이 TNF-α mRNA의 안정성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 단핵세포는 LPS 1ng/㎖로 자극하고 30분후 악티노마이신 D 10㎍/㎖로 처리하였다(시간 0)). 단핵세포의 평형 배양액은 악티노마이신 D 및 AHM 8 100㎍/㎖로 동시에 처리하였다. TNF-α mRNA의 파괴는 악티노마이신 D를 첨가하고 30분, 60분, 및 180분후 노던블롯 분석에 의해 분석되었다. 흰색 원 및 흑색 원은 각각 LPS 또는 LPS 및 AHM 8과 함께 배양된 세포를 나타낸다.
도 9(A-C)는 멜라닌이 BALB/c 마우스내에서 TNF-α 반응을 강하게 억제한다는 것을 나타낸다. TNF-α의 순환하는 혈장농도는 LPS를 정맥내주입하고 90분후에 ELISA에 의해 측정하였다. AHM 8(50㎎/㎏, 빗금친 막대)은 LPS 주입하기 60분전에(마우스 19마리); 동시에(마우스 40마리); 또는 15분후(마우스 18마리) 주입되었다. 멜라닌 처리군 및 비처리 대조군(흰색 막대)에서 TNF-α의 농도는 INSTAT2.03 프로그램을 사용하여 두개의 tailed Mann-Whitney 시험에 의해 비교하였다. 그 결과는 평균±SEM이다.
본 발명은 광범위하게 사람을 포함한 동물에서 질병을 치료하는데 멜라닌이 유용하다는 발견에 관한 것이다.
한 구체예에서, 본 발명에 사용된 멜라닌은 실제로 순수하다. 일반적으로, "실제로 순수한" 멜라닌이라는 용어는 원하는 멜라닌의 적어도 약 75중량%, 특히 적어도 약 85중량%, 더 바람직하게 적어도 약 90중량% 및 바람직하게 적어도 약 95중량%를 포함하는 멜라닌 제조물을 의미한다.
정상적인 멜라닌 생성의 결과로서, 다양한 단백질 및 아미노산 오염물질은 보통 자연적으로 발생하는 멜라닌으로 혼입된다. 추가적으로, 생체내에서 정상적인 멜라닌 생성동안 보통 유용한 여러 기질 및 오염물질은 비결정질의 조성물과 함께 멜라닌을 생성시킨다. 마찬가지로, 멜라닌을 제조하는 효소인 티로시아나제를 상업적으로 유용하게 제조하는데 있어서, 보통 발견되는 여러 오염물질들은 시험관내에서 생성된 멜라닌으로 종종 혼입된다.
멜라닌의 약학적인 용도가 예상되는 곳에서, 예상가능한 조성물 및 구조적인 특징을 갖는 멜라닌 생성물이 매우 바람직하며, 필요하다. 부가적으로, 자연적으로 일어나거나 또는 상기된 멜라닌으로 종종 혼입되는 오염 단백질 및 그 안에 함유된 아미노산은 또한 숙주에서 면역원성이다. 따라서, 생체내에 투여되는 멜라닌 제조물은 오염 단백질, 아미노산, 및 특히 미생물원의 독소(예를 들어, 박테리아 내독소 등)가 실제로 유리되어 있는 것이 바람직하다.
"생합성" 멜라닌이라는 용어는 멜라닌 생성을 위한 기질을 함유하는 재조합발현 및/또는 정제된 티로시나아제 단백질에 의해 생성된 멜라닌을 의미한다. 정해진 기질과 결합하여 높은 특이활성의 티로시나아제를 사용하여 멜라닌을 제조함으로써, 본래 발견되는 멜라닌보다 실제로 균일한 구조를 갖는 멜라닌이 생성된다. 적당한 합성방법으로, 얻어지는 "생합성" 멜라닌은 또한 실제로 순수하게 되거나, 또는 실제로 순수한 생합성 멜라닌 제조물을 생성하기 위해 더 처리된다. 대부분의 경우, 적당하게 처리된 생합성 멜라닌은 상기 구체예에서 자연적으로 발생한 멜라닌을 대신한다.
본 발명에 사용된 정제된 또는 생합성 멜라닌은 오염 아미노산 함유물을 실제로 유리시킴으로써 선택적으로 특징화된다. 본 발명의 목적을 위해, "실제로 아미노산이 유리되어 있다"는 용어는 아미노산 함량 약 10중량% 이하, 바람직하게 아미노산 함량 약 7.5중량% 이하, 더 바람직하게 아미노산 함량 약 5중량% 이하, 및 특히 아미노산 함량 약 2.5중량% 이하를 함유하는 멜라닌 제조물을 의미한다. 게다가, 정제된 생합성 멜라닌으로 구성된 조성물은 일반적으로 여기에 제한되는 것은 아니지만 세균내독소(특히, 그람음성 내독소) 및 세균외독소와 같은 세균원의 잠재독성 오염물이 실제로 유리되어 있다.
본 발명의 정제된 멜라닌을 치료적으로 사용하는에 있어서, 정제된 멜라닌은 경구, 비강내, 직장, 국소적, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하(subcutaneous), 피하(subdermal), 경피, 척수강내, 또는 두개골내 방법 등을 통해 약학적으로 허용가능한 담체내에 바람직하게 투여된다. 보통, 정제된 멜라닌을 위한 바람직한 배합물은 숙주필요치료영역에 따라 다양할 것이다.
예를 들어, 국소면역반응은 국소 용도로 제조된 멜라닌 배합물에 의해 처리되거나, 또는 방해되는 반면에 조직반응은 비경구 투여용으로 배합된 조성물을 투여함으로써 처리되거나 또는 방해된다. 부가적으로, 폐조직의 면역-매개 질병은 점안치료법에 의해 호흡기관에 치료적 멜라닌 조성물을 직접 가함으로써 비경구적으로 처리될 수 있다. 또한, 관절염 또는 염증성 관절 등과 같은 국소 면역반응은 정제된 멜라닌 조성물을 활액캡슐로 국소주입함으로써 치료될 수 있다. 선택적으로 정제된 멜라닌 조성물의 상기 국소투여는 코르티코스테로이드와 결합하여 실시된다.
부가적으로, 정제된 멜라닌은 정제된 멜라닌의 약학적 특징을 향상시키는 지질-관련 구조(예를 들어, 리포좀 또는 다른 지질 복합체)로 공급된다. 지질-멜라닌 복합체는 적당한 목표 제제(예를 들어, 특이항체 또는 수용체)를 멜라닌/지질 복합체에 혼입시킴으로써 특정의 표적세포를 연속해서 목표로 삼는다. 선택적으로, 정제된 멜라닌은 표적세포와 직접 복합체를 형성하여 바람직한 효과를 낸다.
소화관(digestive tract) 및 소화관(alimentary canal)의 염증성 질병을 멜라닌-매개 치료방법으로 치료하는 곳에서, 정제된 멜라닌을 포함하는 지질 배합물(예를 들어, 유탁액, 미세유탁액, 리포좀 등)은 소화과정으로부터 멜라닌을 상당히 보호한다. 따라서, 경구로 투여되는 멜라닌 배합물이 사용된다. 가해지는 보호에 대해 부가의 장보호가 요구되는 정도까지 장-보호 또는 달리 보호된 형태로 본 발명에 따른 고체 또는 액체 배합물을 배합할 수 있다. 액체 배합물의 경우, 이들은 중간사슬 트리글리세리드의 액체 혼합물과 같은 보호물과 혼합되거나, 또는 간단하게 동시투여될 수 있으며, 또는 선택적으로 장용인 장용성 캡슐(예를 들어, 연질 또는 경질의 젤라틴)에 채워질 수 있다. 선택적으로, 멜라닌을 포함하는 고체 배합물은 보다 융통성있게 처리될 수 있다. 이들은 정제를 형성하기 위해 장용성 물질로 코팅되거나 또는 장용성 캡슐에 채워질 수 있다.
장용정 또는 장용성 캡슐의 두께는 예를 들어, 0.5 내지 4미크론이 될 수 있으며, 당업자에 의해 정확한 두께가 측정될 것이다. 장용성 과립(입자크기 0.5㎜)은 코팅용 정제로 혼합되지 않고 코팅될 수 있다. 마찬가지로, 마이크로캡슐이 장용으로 코팅될 수 있다. 장용 코팅은 경구투여용 약학적 배합물에 종래에 사용된 장용물질을 포함한다. 적당한 장용 물질은 예를 들어 "Remington's Pharmaceutical Science", 제15판, pp.1614-1615(1975); 제2판, pp.116-117, 371-374(1976); 및 "Hagars Handbuch der Pharmazeutischen Praxie", 제4판, 7a권(Springer Verlag), p.739-742 및 776-778(1971)에 공지되어 있다.
적당한 장용 물질의 예로는 셀룰로스 아세틸프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로스-프탈레이트(HPMC-P), 벤조페닐 살리실레이트, 셀룰로스 아세토숙시네이트, 스티렌과 말레산의 공중합체, 배합된 젤라틴, 케라틴, 스테아르산, 미리스트산, 폴리에틸렌 글리콜, 셀락, 글루텐, 아크릴산 수지 및 메트아크릴산 수지 및 말레산과 프탈산 유도체의 공중합체가 있다. 장용 물질은 디클로로메탄, 에탄올 및 물, 셀룰로스 프탈레이트 또는 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트와 같은 용매내에 용해될 수 있다. 장용으로서 HPMC-P, 폴리에틸렌 글리콜 6000 또는 셀락을 사용하는 것이 바람직하다. 사람 유문에서 직면하는 pH 5.5에서 용해 또는 분해하기 위한 HPMC-P의 소유 제조물은 HP5-5라는 상표명으로 사용가능하며, 특히 바람직하다.
부가적으로, 여러 안정화제는 상기 멜라닌 조성물과 결합되어 사용될 수 있다. 멜라닌 자체가 산화방지제로 기능을 하여도, 멜라닌 또는 상기 조성물의 다른 성분의 산화는 실질적으로 비활성대기, 가령 질소대기하에서 본 발명에 따른 배합물을 제조함으로써 감소되며, 이는 다소 불편하고, 비싼 공정이며, 그래서 종종 화학 산화방지제를 가하는 것이 바람직하다. 적당한 약학적으로 허용가능한 산화방지제는 프로필 갈레이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 아스코르브산 또는 아스코르브산 나트륨, DL- 또는 D-α-토코페롤 및 DL- 또는 D-α-토코페릴 아세테이트를 포함한다. 산화방지제는 예를 들어, 0.1%(w/v) 이하, 바람직하게 0.0001 내지 0.05% 이하의 양으로 부형제 조립전, 조립동안, 또는 조립후에 폴리뉴클레오티드 운반 부형제에 조합하여 또는 단독으로 가해질 수 있다.
정제된 멜라닌을 포함하는 배합물은 이에 제한되는 것은 아니지만, 냉동, 냉장 및 동결건조를 포함한 여러 기존 방법에 의해 저장 및 포장에 대해 안정화될 수 있다. 멜라닌 조성물을 냉동 또는 동결건조시킴으로써 장기간 안정성을 증대시키기 위해, 냉동시키기 전에 적당한 부형제가 멜라닌포함 제조물에 가해진다. 상기 안정화 부형제의 예로는 단당류 또는 이당류(예를 들어, 글루코스, 수크로스 등), 다당류, 또는 공지된 여러 제제(예를 들어, 글리세롤, 검, 덱스트란 등)가 있다.
당업자는 의학견습자 또는 환자의 예상으로부터, 실제로 바람직하지 못한 증상(예를 들어, 체내 면역매개질병과 관련된 증상)의 경감 또는 예방이 바람직하다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 "치료", "치료적 용도" 또는 "의학적 용도"라는 용어는 질병상태 또는 증상을 치료하고, 또는 질병 또는 다른 바람직하지 못한 증상의 진행을 예방하고, 지연시키고, 방해하거나, 반전시키기 위해 상기 정제된 멜라닌 조성물을 사용하는 모든 방법을 의미한다. 마찬가지로, 멜라닌의 "치료적으로 유효한 양"은 질병상태 또는 증상을 치료하고, 또는 질병 또는 다른 바람직하지 못한 증상의 진행을 예방하고, 지연시키고, 방해하거나, 반전시키는데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 과잉 예비염증(proinflammatory) 시토킨(예를 들어, TNF-α, 및 IL-1 및 IL-6을 포함하고, 이에 제한되지 않는 인터류킨) 생성과 연관된 유해질병결과에 대해, 정제된 멜라닌은 내재하는 질병 또는 감염에 대해 유효한 숙주면역반응을 하거나 또는 용이하게 하는 반면에, TNF-α의 과잉생성을 감소시키거나 저해하는 투여량으로 사용된다.
바람직하게, 본 발명에 의해 치료되는 동물은 무척추동물, 척추동물, 조류, 포유동물, 가령 돼지, 염소, 양, 젖소, 개, 고양이 및 특히 사람을 포함하며, 여기에 제한되지는 않는다.
질병을 치료적으로 처리하는데 사용할때, 정제된 멜라닌 또는 그의 변형물의 적당한 투여량은 여러 잘 정립된 방법론에 의해 결정된다. 예를 들면, 동물연구는 보통 ㎏중량당 생물활성물질의 최대 허용 투여량 또는 MTD를 측정하는데 사용된다. 일반적으로, 시험되는 동물종중 적어도 하나는 포유동물이다. 당업자들은 사람을 포함한 다른 종에 대한 효능 및 회피독성을 위한 투여량을 완전히 외삽한다. 효능의 사람연구가 실시되기 전에, 정상의 대상에 있어서의 I단계 임상연구는 안전한 투여량을 정하는데 도움을 준다. 부가적으로, 치료적 투여량은 또한, 감염의 심각성, 및 숙주의 크기 또는 종류와 같은 요소에 따라 변경된다.
특히, 생체내에 사용하는데 있어서, 본 발명을 이루는데 사용되는 여러 생화학 성분들은 고순도인 것이 바람직하며, 잠재적으로 유해한 오염물(예를 들어, 적어도 National Food(NF) 등급, 일반적으로, 적어도 분석등급 및 바람직하게 적어도 약학적 등급)이 실제로 유리되어 있다. 주어진 화합물을 사용하기 전에 합성해야 하는 정도까지, 상기 합성 또는 연속 정제로 인해 실질적으로 내재 독소, 특히, 내독소가 유리되어 있는 생성물이 얻어지는 것이 바람직하며, 이는 합성 또는 정제과정동안 사용되어 왔거나, 현재 사용되고 있다.
본 명세서에 기술된 정제된 멜라닌은 또한 그들의 생체내 특징을 향상시키는 분자와 혼합된다. 상기 분자의 예로는 카르보히드레이트, 폴리아민, 아미노산, 펩티드, 이온(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 망간 등) 및 지질이 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 정제된 멜라닌은 멜라닌의 생체내 안정성을 향상시키거나, 또는 그의 약리학적 특징(예를 들어, 생체내 반감기를 증가시키며, 독성을 감소시키고, 용해도 또는 흡수도를 향상시키는 등)을 향상시키기 위한 구조 또는 잘 형성된 여러 화합물과 혼합된다. 상기 변형의 예로는 설페이트, 글루코네이트, 시트레이트, 인산 등의 생성이 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
정제된 멜라닌 또는 그의 유도체를 진단용, 치료용 또는 의료용으로 사용하는데 있어서, 멜라닌은 보통 미생물 오염 위험을 최소화하거나 또는 피하는 멸균조건하에서 제조되어 유지된다. 상대적으로 작은 크기 및 정제된 멜라닌의 고유 안정성때문에, 멜라닌을 포함한 조성물은 사용하기 전에 또한 멸균여과된다. 상기 멸균제조 및 여과멸균법에 더해, 항생제가 또한 멜라닌 조성물에 가해진다. 전체 배합물의 약 3% w/v 이하, 바람직하게 약 0.5 내지 2.5% w/v 이하의 양으로 사용되는 항생제는 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 페놀, 디히드로아세트산, 페닐에틸 알콜, 벤조산 나트륨, 소르브산, 티몰, 티메로살, 디히드로아세트산 나트륨, 벤질 알콜, 크레졸, p-클로로-m-크레졸, 클로로부탄올, 페닐수은 아세트산, 페닐수은 붕산, 페닐수은 질산 및 염화벤질알코늄을 포함하지만, 여기에 제한되지는 않는다. 바람직하게, 항생 첨가제는 멜라닌의 생화학 특성을 향상시킬 것이거나 또는 관련 멜라닌 활성을 갖는 비활성이 될 것이다. 주어진 항생제가 멜라닌 활성에 해로운 것으로 입증된 정도로, 더 낮은 정도로 멜라닌의 바람직한 기능을 하는 다른 제제가 대체된다.
본 발명의 방법의 한 구체예는 면역계를 조절하기 위해 정제된 멜라닌을 사용하는 것에 관한 것이다. 상기 조절은 생체내 또는 시험관내에서 시토킨 발현 또는 활성에 직접 또는 간접적으로 영향을 미치는 멜라닌의 능력의 기능인 것으로 간주된다. 바람직한 구체예에서, 멜라닌을 치료적으로 사용하여 시토킨 발현을 하향조절할 것이다. 시토킨 발현을 하향조절하는 멜라닌의 능력은 또한 주어진 치료제와 관련된 역 면역-관련 반응의 심각성을 감소시키기 위해 치료제와 함께 멜라닌을 사용하여 이용될 수 있다. 예를 들면, IL-2 치료는 종종 투여량의존성의 역 체계적 결과와 관련되어 왔다. 역 면역반응을 조절하는 멜라닌의 능력때문에, 높은 조직농도의 시토킨을 임상으로 사용하기 위해 시토킨과 결합하여 멜라닌을 사용한다. 따라서, 본 발명의 추가의 구체예는 치료제의 독성 부작용을 감소시키기 위해 정제된 멜라닌을 사용한다.
질병 부작용결과는 과잉 TNF-α 생성과 연관되어 있으며, 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 기본 질병 또는 감염에 대해 유효한 숙주면역반응을 하거나 또는 용이하게 하는 반면 TNF-α의 과잉생성을 감소시키거나 또는 억제하는 투여량으로 정제된 멜라닌이 사용된다.
본 발명의 목적을 위해, "시토킨" 또는 "그의 문법적 동등량"이라는 용어는 면역계의 세포, 림포킨 및 모노킨 모두 등과 연관된 호르몬을 보통 의미한다. 상기 정의는 혈액내에서 국소적으로 작용하고, 순환하며, 본 발명에 따라 사용될때 각 면역반응을 변형시킬 호르몬을 포함하여 의미하며, 이에 제한되지 않는다. 시토킨이라는 용어는 IL-1(α 또는 β), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, LIF, LT, TGF-β, γ-IFN(또는 α 또는 β-IFN), TNF-α 및 BCGF를 의미하며, 이에 제한되지 않는다. 상기 시토킨 뿐만 아니라 다른 사용가능한 면역조절물질은 이후에 참고문헌으로 통합되는 "Cytokines and Cytokine Receptors", A.S.Hamblin, 1993, (D. Male, ed., 옥스포드대 출판부, 뉴욕, NY) 또는 "Guidebook to Cytokines and Their Receptors", 1995, N.A. Nicola, ed.(옥스포드대 출판부, 뉴욕, NY)에 기술되어 있다.
멜라닌은 후천성 면역결핍증(AIDS) 또는 암과 관련된 소모성 증후군을 치료하는데 유용하며, 본 방법은 또한 AIDS 또는 암을 치료하는데 광범위하게 사용가능한 것으로 간주된다.
본 발명의 추가의 구체예에서는 알레르기 관련 항민감성 반응을 치료하기 위해 정제된 멜라닌을 사용한다. 약물반응, 곤충자상, 피부염, 음식 알레르기 등과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 알레르기 반응의 역효과에 감염되기 쉬운 개인을 예방하여 치료하기 위해 정제된 멜라닌을 사용한다. 그리고, 알레르기 반응의 유해증상을 제거하거나 또는 감소시키기 위해 정제된 멜라닌을 매개사용한다.
멜라닌은 여러 감염제제의 병의발생에 기여하는 독성 인자이다. 특정 병원균의 특징인 멜라닌이 확립되는 정도로, 본 발명은 멜라닌 생성 병원균의 확산 및 진행을 막기 위한 백신으로서 정제된 멜라닌, 또는 일부 또는 그의 유사체를 사용하는 것을 더 청구한다.
마찬가지로, 암 백신, 또는 종양-특이 면역자극물질로서 종양특이 멜라닌, 또는 그의 단편 또는 유사체를 사용하는 것으로 구성된 암 치료법의 추가적인 형태를 제공하기 위해 멜라노마 관련 또는 특정 멜라닌을 확인 및 사용한다.
부가적으로, 병원균 또는 종양특이 멜라닌의 확인은 병원균 또는 종양특이 멜라닌에 특이적으로 결합하는 수용체, 리간드 또는 다중클론 또는 단일클론 항체를 확인 및 생성하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 추가의 구체예는 병원균 또는 종양특이 멜라닌 또는 세포성 수용체를 목표로 하는 수용체, 리간드, 또는 항체-계 진단제 또는 치료제이다.
하기 실시예는 본 발명을 이루고, 사용하는 방법을 보다 상세히 기술하며, 본 발명의 여러 측면을 실시하기 위해 사용된 최선의 방법을 설정하기 위해 제공된다. 상기 실시예는 본 발명의 실제 범주를 제한하지 않으면서 본 발명의 목적을 나타내는 것으로 이해된다.
실시예 1. 수용성 멜라닌의 합성
수용성 멜라닌은 이후에 참고문헌으로 통합되는 미국특허 제5,340,734호; 제5,466,592호; 제5,486,351호; 제5,210,076호 및 제5,057,325호에 기술되어 있는 바와 같이 사용하기 위해 생성제조되었다. 상기 방법을 사용하여 제조된 멜라닌은 @pH 1.5의 진한 HCl을 가함으로써 산 침전에 의해 더 정제하였다. 침전된 멜라닌은 원심분리에 의해 회수되었다.
순도분석시, 얻어진 멜라닌(AHM 8로 나타냄)은 최종생성물의 약 96중량%를 포함한다는 것을 알았다. 멜라닌 AHM 8의 아미노산 함량은 4.2% 이하였다. 전체 아미노산은 4.38%가 tyr+gly인 8.4중량%였다. 요소분석으로 %C=51.01; %H=3.74; %N=9.5; %S=0; 및 %O=33.85를 얻었다.
멜라닌 AHM 8의 내독소 함량은 색소생산성 리뮬러스 아메바성 세포의 융해물(CLAL) 시험 킷(BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD)을 사용하여 측정하였다. AHM 8이 CLAL 시험에 직접 비활성 영향을 미치는지를 측정하기 위해, 예비 실험에서 0.25 내독소 단위(EU)/㎖를 함유하는 분취량의 내독소 스탠다드를 50㎍/㎖ AHM 8(단핵세포처리에 사용되는 양과 유사한 투여량)로 스파이크하였다. "혼합물"중 내독소 함량은 제조사의 지시에 따라 CLAL 시험을 사용하여 측정하였다. 멜라닌-함유 스탠다드 제조물의 내독소 함량에 있어서의 감소율은 하기 식에 따라 계산하였다.
억제율(%) = {1-[(스탠다드의 내독소 함량)-(AHM 8-함유 스탠다드의 내독소 함량)]/[스탠다드의 내독소 함량]} × 100
상기 실험결과는 AHM 8이 CLAL 분석을 두드러지게 저해하지 않는다는 것을 보여준다. 50㎍/㎖ AHM 8을 가함으로써 내독소 스탠다드의 활성은 22% 감소하였다. 표 1에 나타난 바와 같이, 50㎍/㎖에서 멜라닌 AHM 8의 내독소 함량은 단지 0.069 내독소 단위(EU)/㎖이었다. 상기 실험조건하에서, 사람 말초혈액 단핵세포에 의한 TNF-α의 생성은 LPS 1.6EU/㎖(즉, 0.1ng LPS/㎖)를 필요로 했다.
| 실험 제제 | 내독소 농도(EU/㎖) | |
| PBS | 0 | |
| LPS(0.05ng/㎖) | 1.50 | |
| Mel AHM 8(50㎍/㎖) | 0.069 |
a각 제제의 내독소 함량은 상업용으로 이용가능한 킷을 사용하여 CLAL 시험에 의해 측정하였다.
TNF-α 생성을 유도하기 위한 능력을 시험하는 경우, 50㎍/㎖에서 AHM 8은 사람 말초혈액 단핵세포내에서 강한 TNF-α 반응을 유도하지 않았다(123pg TNF-α/106세포/㎖)(표 2).
본 실험 뿐만 아니라 다음 기술되는 실험에 사용된 말초혈액 단핵세포는 Ficoll-Paque의 순차적 구배원심분리 및 Percoll 구배에 의해 백혈구농축물로부터 분리하였다(Markowicz 및 Engleman, J. Clin, Invest. 85:955, 1990). 백혈구 농축물은 스탠포드 대학 혈액센터(Palo alto, CA)에서 구입했다. Percoll 구배는 5% 열-비활성된 사람 혈청을 함유하는 Dulbecco의 칼슘-유리 및 마그네슘-유리 인산염 완충식염수(PBS)내 Percoll의 스톡 등-장성 용액(1.128g/㎖)(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)의 75%, 51.4%, 40% 및 30% 희석액의 연속층으로 구성되어 있다. 보다 농축시키기 위해, 저밀도의 세포, 대부분 단핵세포를 제2 Percoll 구배상으로 재부유시켰다. 단핵세포풍부 개체군은 1% 열-비활성된 사람 AB 혈청, 2mM 글루타민, 100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)으로 보충된 대식구 혈청-유리 배지(GIBCO, Grand Island, NY)(이하 완전배지라고 함)내 1×106세포/㎖에서 재현탁하였다. 단핵세포는 플라스틱에 부착하는 시토킨을 생성하도록 촉진시키기 때문에, 폴리프로필렌 튜브는 상기 세포배양실험에 사용되었다.
| 배양 상층액의 TNF-α 함량 | ||
| 배양된 세포 | (TNF-α(pg)/106세포/㎖) | |
| 배지단독 | 44 | |
| AHM 8(50㎍/㎖) | 123 | |
| LPS(0.1ng/㎖) | 1,013 |
a단핵세포는 폴리프로필렌 튜브에서 AHM 8 또는 LPS와 함께 배양되었다. 그후, 37℃에서 24시간 배양하고, 배양 상층액을 수집하고, TNF-α 방출을 ELISA(Biosource International, Camarillo, CA)에 의해 측정하였다. 값은 두개의 측정치의 평균이다.
실시예 2. 멜라닌 전처리는 LPS-유도성 TNF-α 생성을 억제한다.
생체외 TNF-α 생성에 생합성 멜라닌이 미치는 효과는 LPS 자극후 멜라닌-처리된 단핵세포와 비처리군 단핵세포의 배양 상층액에 있어서 TNF-α 수준을 비교함으로써 평가하였다. 상기 실험에서, 단핵세포(1×106/㎖)는 5% CO2를 함유하는 습화 대기하 37℃에서 여러 투여량의 멜라닌과 함께 배양하였다. 30-60분 배양후, 멜라닌의 연속존재하에서 멜라닌을 LPS로 자극하였다. 대조군은 (1)LPS 자극, 멜라닌-무처리 세포; (2)멜라닌-처리, LPS-무자극 단핵세포; 및 (3)첨가제의 부재하에서 완전배지내에서 배양된 단핵세포를 포함한다. LPS로 자극하고 24시간후, 배양 상층액내 TNF-α의 수준을 ELISA(Biosource International, Camarillo, CA)로 두번 측정하였다. TNF-α에 대한 작업가능범위는 15.6-1,000pg/㎖이었다. TNF-α 반응의 억제율(%)은 하기 식에 따라 계산하였다:
억제율(%) = [1-(TNF-α(pg)/106AHM 8-처리, LPS-자극 단핵세포) - (TNF-α(pg)/106AHM 8-처리 단핵세포)/(TNF-α(pg)/106AHM 8-무처리, LPS-자극 단핵세포)-(TNF-α(pg)/배지내에 단독으로 남아 있는 /106단핵세포)] × 100
도 1에 나타나 있는 바와 같이, 멜라닌 AHM 8로 단핵세포를 처리하면, LPS-유도성 TNF-α 생성이 투여량에 의존하여 억제된다.
배양 상층액내 멜라닌의 존재가 분석(ELISA)을 방해하는지를 확인하기 위해, 멜라닌-처리된 단핵세포에서 수집된 상층액내 TNF-α 농도는 두개의 기본 곡선에서 측정하였다. "대조군 기본곡선"을 형성하기 위해, TNF-α 스탠다드는 완전배양배지내에서 단독으로 희석되었다. "멜라닌-함유 기본곡선"은 37℃에서 24시간동안 멜라닌 0-50㎍/㎖와 함께 배양된 완전배지내에서 희석된 TNF-α 기본(0 내지 1,000pg/㎖ 범위)으로부터 얻은 광학밀도(O.D.)값을 플로팅하여 얻었다. 평형분석에서, LPS로 자극하기 전에 멜라닌 0-50㎍/㎖로 처리된 단핵세포에서 수집된 배양 상층액(이하, 시험샘플이라고 함)의 TNF-α 함량은 각 기본곡선에 대한 그들의 O.D.를 읽어 측정하였다. 다른 기본 곡선에서 측정한 각 시험샘플의 TNF-α 함량은 LPS-처리 단핵세포로부터의 상층액(㎖)당 106세포당 생성된 TNF-α의 양(pg)을 LPS-무처리 단핵세포로부터의 상층액(㎖)당 106세포당 생성된 TNF-α(pg)의 양으로 나누어 자극지수(Stimulation Index, SI)를 계산함으로써 비교하였다.
표 3에 나타나 바와 같이, 멜라닌-전처리된 단핵세포에서 수집된 상층액의 SI값은 멜라닌에 노출되지 않은 세포로부터 수집된 상층액의 SI값보다 일관되게 낮았다. 상기 데이터는 멜라닌이 사람 단핵세포에 의한 LPS-유도성 TNF-α 합성/방출을 억제하고, 상기 변화는 분석시스템상에 미치는 멜라닌의 억제효과의 결과가 아니라는 것을 보여준다.
| TNF-α 기본의멜라닌 함량 | AHM 8로 처리된 세포로부터의배양 상층액중 TNF-α함량 | |||||||
| (㎍/㎖) | 0 | 10 | 25 | 50 | ||||
| (자극지수) | ||||||||
| 0 | 78 | 39 | 17 | 7 | ||||
| 10 | 69 | 35 | 16 | 7 | ||||
| 25 | 82 | 40 | 17 | 7 | ||||
| 50 | 75 | 37 | 17 | 7 |
a기본곡선을 형성하기 위해, AHM 8 0 내지 50㎍/㎖를 함유하는 완전배지를 0-1,000 pg/㎖ 범위이상의 TNF-α 스탠다드를 희석하는데 사용하였다. 플레이트 해독기는 색원체 및 스톱 용액으로 조성된 블랭크에 대해 영점조준해 놓았다.
실시예 3. 사람 말초혈액 단핵세포에 의한 단백질 합성에 멜라닌이 미치는 영향
멜라닌이 LPS-유도성 시토킨의 생성을 선택적으로 억제하는지를 측정하기 위해, 사람 단핵세포에 의한 구조단백질 합성에 멜라닌 AHM 8이 미치는 효과를 측정하였다. 단백질 합성은 [3H]류신을 도입함으로써 측정하였다. 멜라닌 AHM 8 100㎍/㎖의 존재하에서 5시간 배양후 단핵세포 단백질합성은 멜라닌처리되지 않은 대조군 세포에 의해 나타낸 것에 크게 비교되었다(23% 낮음). 평형실험조건하에서 시클로헥스이미드 20㎍/㎖와 함께 단핵세포를 배양하면, [3H]-류신 도입을 완전히 억제한다(대조군 단핵세포내에서 1,219±51cpm 대 28,737±712cpm). 요약하자면, AHM 8 100㎍/㎖로 단핵세포를 전처리하여 TNF-α 합성을 90% 억제하여도, 전체 단백질 합성은 23%까지만 유도되었다.
AHM 8 100㎍/㎖의 존재하에서 20시간동안 배양된 단핵세포내에 [3H]-류신을 도입하는 수준은 또한 멜라닌 처리되지 않은 세포수준과 대조되었다 (32,775±1,977cpm 대 29,713±856cpm).
실시예 4. 멜라닌은 사람 단핵세포에 의한 시토킨 생성을 선택억제한다.
멜라닌이 다른 LPS-유도성 시토킨의 생성 및 방출을 억제하는지를 측정하기 위해, 멜라닌처리후 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 과립백혈구/대식구-콜로니 자극요소(GM-CSF)를 생성하는 능력에 대해 말초혈액 단핵세포를 시험하였다(상기 기술된 바와 같이). 배양 상층액내 TNF-α, IL-1β 및 GM-CSF의 수준은 Biosource International(Camarillo, CA)제 ELISA 킷을 사용하여 두번 측정하였다. IL-6을 측정하는데 사용된 ELISA 킷은 R&D Systems(Minneapolis, MN)에서 구입하였다. 시토킨의 작동가능한 범위는 TNF-α, 15.6-1,000pg/㎖; IL-1β, 3.9-250pg/㎖; IL-6, 3.12-300pg/㎖; 및 GM-CSF, 15.6-1,000pg/㎖이었다. 배양 상층액내 AHM 8의 존재가 분석을 방해하지 않는다는 것을 확인하기 위해, AHM 8-처리된 단핵세포에서 수집된 상층액내 시토킨 농도는 37℃에서 24시간동안 AHM 8 50㎍/㎖와 함께 배양된 완전배지내에서 희석된 스탠다드에서 얻은 O.D.값을 플로팅하여 형성된 기본곡선에서 측정하였다. 그러나, AHM 8-처리되지 않은 단핵세포에서 수집된 상층액의 시토킨 함량은 "대조군 기본곡선"에서 측정하였다. "대조군 기본곡선"을 형성하기 위해, 각 스탠다드를 완전배지내에서 단독으로 희석하였다.
상기 실험결과는 표 2에 요약되어 있다. AHM 8로 전처리된 단핵세포는 그들의 각 대조군에 비해 낮은 수준(p<0.05)의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6을 상당히 생성했다. 평형조건하에서, 멜라닌은 LPS 자극된 단핵세포에 의한 GM-CSF의 생성 또는 방출을 억제하지 않았다. 반대로, AHM 8 100㎍/㎖로 전처리된 단핵세포는 LPS로 자극후 높은 수준의 GM-CSF(p<0.01)를 생성했다. 이는 AHM 8이 LPS 시그널링을 억제하지 않는다는 것을 보여준다. 멜라닌이 GM-CSF를 억제하지 않는다는 발견은 특히 관심을 끄는 것이다. GM-CSF는 AZT 및 스타뷰딘(stavudine)의 활성을 증가시키는, 단핵세포 및 대식구내 뉴클레오시드 유사체의 세포내 인산화에 영향을 미친다(De Simone외 다수, Immunology Today 17:256-258, 1996).
실시예 5. 멜라닌은 TNF-α 생성을 억제하는데 계속해서 요구되지 않는다.
TNF-α 생성을 억제하는데 멜라닌을 연속해서 필요로 하는지를 측정하기 위해, 새로 분리한 사람 단핵세포(완전배지 1×106세포/㎖)를 멜라닌 AHM 8의 저해농도로 처리하였다. 37℃에서 1시간 배양후, 제1 세트의 배양액내의 단핵세포를 멜라닌의 연속존재하에서 LPS로 자극하였다. 제2 세트의 배양액내의 단핵세포는 LPS로 자극하기 전에 저속의 원심분리에 의해 1회 세척하였다. 대조군은 (1)LPS로 자극, 멜라닌-무처리 세포; (2)멜라닌-처리, LPS-무처리 단핵세포; 및 (3)첨가제의 부재하 완전배지내에서 배양된 단핵세포를 포함한다. LPS로 자극하고 24시간후, 배양 상층액내 TNF-α의 수준은 ELISA에 의해 중복측정하였다. TNF-α 생성을 억제하는데는 멜라닌이 연속으로 존재할 필요가 없다. 실제로, TNF-α 생성은 멜라닌이 LPS로 자극하기 전 바로 배양액 밖으로 세척된후 63%까지 억제되었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 6. TNF-α 생성의 멜라닌-매개 억제는 가역적이다.
회수시간을 고려하기 위해, 저해농도의 멜라닌 AHM 8로 전처리된 단핵세포를 LPS로 자극하기 전에 완전배지내에서 2-18시간동안 배양하였다. 각 시간지점에 대해, 하기 배양액을 대조군으로 제공하였다: (1)멜라닌-무처리, LPS-자극 단핵세포; (2)멜라닌-무처리, LPS-무자극 단핵세포; 및 (3)멜라닌-처리, LPS-무자극 단핵세포. 배양 상층액내 TNF-α의 농도는 LPS를 첨가하고 24시간후에 측정하였다.
표 3(A&B)에 나타낸 두 실험데이터는 TNF-α의 멜라닌-매개 억제는 적어도 7시간동안 지속된다는 것을 입증한다. 멜라닌의 억제효과는 단기간 배양시 반전되었다. 멜라닌 제거하고 18시간후 LPS로 자극된 단핵세포는 보다 높은 TNF-α 반응(TNF-α 방출에 있어서의 44-47% 감소 대 7시간의 AHM 8 세척기간후 74-88% 감소)을 나타냈다. 상기 데이터는 멜라닌 AHM 8 100㎍/㎖로 처리된 단핵세포가 상기 실험조건하에서 죽지 않았다는 것과, 멜라닌-매개 억제로부터의 회수는 시간의존성이라는 것을 입증한다.
실시예 7. 멜라닌은 활성화 단핵세포에 의한 TNF-α 생성을 억제한다.
진행영역에 나타난 데이터는 단핵세포가 LPS 자극전에 멜라닌 AHM 8로 전처리된 실험에서 얻어졌다. 멜라닌이 LPS-자극후 투여되는 경우에도 TNF-α 생성을 억제하는지를 측정하기 위해서, 단핵세포를 LPS로 자극하고 1시간후, 동시에 또는 1시간전에 멜라닌으로 처리하였다. 예상했던바와 같이, LPS 자극 1시간전에 가한 멜라닌이 LPS-유도성 TNF-α 생성을 억제하였다(100㎍/㎖에서 84±4% 억제)(도 4). LPS 자극하고 1시간후에 멜라닌을 가한 경우, TNF-α 반응의 일부억제가 관찰되었다(100㎍/㎖에서 45±13% 억제, p=0.05). LPS 자극후 초기에 멜라닌을 가하면 강한 억제효과를 발휘하지 않았다. LPS 자극하고, 7.5분 또는 60분후 멜라닌 100㎍/㎖으로 단핵세포를 처리하면 TNF-α 생성을 각각 50% 및 52% 감소시켰다(도시되지 않음). 상기 데이터는 멜라닌이 중화효과 뿐만 아니라 예방효과를 제공한다는 것을 보여주며, 또한 적어도 두개의 분리된 기작이 멜라닌에 대한 노출후 보여진 TNF-α 생성에 있어서의 전체감소를 초래한다는 것을 보여준다.
활성화 단핵세포에 의한 TNF-α 분비를 억제하는데 있어서 멜라닌이 덜 효과적이라는 발견은 상기 시토킨이 면역반응에 필수적인 매개체이기 때문에 특히 관심의 대상이 된다. 상기 발견은 멜라닌이 감염과 싸울 수 있는 환자의 능력을 없애지 않고도 소모성 증후군 환자에 있어서 TNF-α의 평형수준 또는 보통수준을 재정립하는데 사용될 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 8. 추가의 자극에 의해 유도된 TNF-α 생성에 미치는 멜라닌이 효과
AHM 8이 LPS 이외의 자극에 의해 활성화된 세포에 의한 TNF-α 생성을 조절할 수 있는 능력을 갖는지를 시험하기 위해, 사용된 자극제제의 투여량이 각 제제에 대한 적당하게 맞춰진 것을 제외하면 상기와 같이 실험을 변형하는데 추가의 작극이 사용된다. 상기 분석에 사용된 제제는 미코박테리아, 알레르겐(초민감성 반응과 관련된 화합물을 포함) 및 렉틴을 포함하지만, 여기에 제한되지는 않는다.
AHM 8이 자극과 무관하게, 사람 단핵세포에 의한 TNF-α 생성에 영향을 미치는지를 측정하기 위해, 미코박테리움 아비움 복합체(MAC)[균주 101(serovar 1)]; 또는 미코박테리움 튜버큘로시스(MTB)의 비병원성(H37Ra) 균주로 감염되거나; 또는 MTB의 정제된 단백질 유도체(PPD)로 자극된 단핵세포는 AHM 8의 저해농도로 처리되었다. MTB의 오토클레이브된 배양액 여과물로부터 제조된 단핵세포 TNF-α 합성 및 방출의 공지된 작용물질인 PPD는 Connaught Laboratories Limited(Willowdale, Ontario, Canada)에서 구입하였다. 도 5(A-D)에 요약되어 있는 상기 실험결과는 AHM 8이 TNF-α 생성/방출에 미치는 억제효과는 자극과 무관하다는 것을 명확하게 입증한다. AHM 8의 존재하에서 배양하고 24시간후, TNF-α의 방출은 MAC 또는 MTB로 감염되거나 또는 PPD 또는 LPS로 자극된 단핵세포에 의해 45-55%까지 감소했다.
LPS와 달리, PPD는 세포표면단백질 CD14와의 상호반응에 의해 단핵세포내 TNF-α 합성을 자극하지 않는다(Wright 외 다수, Science, 249:1431-1433, 1990; Zhang 외 다수, J. Clin, Invest. 91:2076-2083, 1993). TNF-α 생성에 있어서의 볼 수 있는 감소는 AHM 8처리된 단핵세포의 감소된 생존능력 또는 보다 높은 세균성 잠입물의 결과가 아니었다. 트리판 블루를 제외시킨 것은 AHM 8 100㎍/㎖와 함께 또는 없이 배양된 세포에 대해 비교가능했다(93% 대 98%). 세 실험에서, 항산성 세균이 함유된 AHM 8 100㎍/㎖과 함께 배양된 48±17%에 대해 배지내에서 단독으로 배양된 감염된 단핵세포의 51±23%가 비교되었다. AHM 8 100㎍/㎖의 존재하에서 24시간 배양후, 단핵세포에서 회수된 활성 세포내 세균수는 또한 배지내에서 단독으로 유지된 단핵세포에 의해 얻은 수와 유사하다(각각, 세포당 MAC를 형성하는 콜로니 24±9 대 24±4, n=3).
단핵세포에 의한 TNF-α 생성을 자극하는 LPS를 함유하지 않고 살아 있는 미코박테리아 뿐만 아니라 PPD를 확인하기 위해, 미코박테리아 현탁액 또는 그의 생성물(PPD)을 단핵세포 제조물내에 첨가하기 전에 폴리믹신 B(PMB)로 30분동안 전처리했다. PMB는 LPS-유도성 시토킨 생성을 억제한다. 대조군에 있어서, 단핵세포의 분취량은 PMB와 함께 예비배양된 LPS와 함께 배양했다. 예상했던 바와 같이, PMB-처리 LPS와 함께 배양된 단핵세포는 TNF-α를 생성하는데 실패했다(PMB-처리되지 않은 LPS로 자극된 단핵세포에 비해 시토킨 방출을 93% 억제함). 종래연구의 데이터(Hirsch 외 다수, J. Immunol. 152:743-753, 1994)와 같이, MAC, MTB 또는 PPD와 PMB와의 예비배양은 그들의 TNF-α-유도능력에 영향을 미치지 않았다(도시되지 않음).
실시예 9. TNF-α mRNA의 발현에 멜라닌이 미치는 효과
노던 블롯 잡종화(Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159, 1987; Waleh 외 다수, Cancer Res. 54:838-843, 1994)는 LPS로 자극된 단핵세포내에서 TNF-α mRNA 발현에 AHM 8이 미치는 효과를 조사하는데 사용하였다. mRNA 및 단백질 수준의 조절이 협력하여 일어나지만, 이는 종종 일어나는 경우가 아니다. 예를 들어, mRNA 생성에 있어서 증가한다고 해서 mRNA가 불안정하면 단백질의 양에 있어서 증가하는 것은 아니다. 선택적으로, 번역 억제 또는 mRNA 프로세싱 방해는 단백질 생성/방출에 있어서 증가하는 것을 방해한다. TNF-α 합성은 번역 활성화에 거의 의존한다(Han 외 다수, J. Exp. Med. 171:465-475, 1990).
처음에, 사람 단핵세포에 의한 TNF-α mRNA의 축적에 AHM 8 전처리가 미치는 효과를 시험하였다. 비점착성 조건하에서 배양된 사람 단핵세포는 LPS 1ng/㎖로 자극하기 전에 1시간동안 AHM 8 0, 50 또는 100㎍/㎖로 처리하였다(도 6에서, 각각 레인 1, 2 및 3으로 나타냄). AHM 8의 지시된 비세포독성 투여량으로 단핵세포를 전처리하면 LPS-유도성 TNF-α 생성/방출을 강하게(66-83%) 억제한다(도 1 참조). LPS로 자극하고 1시간후, 단핵세포를 수집하고, mRNA 발현연구를 위해 분해하였다. 종래연구의 데이터(도시되지 않음)는 단핵세포에서 TNF-α mRNA 발현이 LPS 자극후 1시간내에 피크를 이루고, 그후에 쇠퇴한다는 것을 보여준다.
도 6에 나타난 바와 같이, 50㎍/㎖에서 AHM 8이 LPS-유도성 TNF-α mRNA 발현에 대한 억제효과를 가지지 않았다(레인 1 및 2 비교). 그러나, TNF-α mRNA 발현은 AHM 8 100㎍/㎖와 반응하여 감소하였다(레인 1 및 3 비교). 비디오 밀도계를 사용하여 평가한 mRNA의 수준은 AHM 8의 부재하에서 LPS로 자극한 단핵세포에 의해 발현된 것보다 26% 낮았다.
다음 연구에서, 노던블롯분석은 LPS 1n/㎖ 및 AHM 8 100㎍/㎖로 동시에 처리된 단핵세포를 사용하여 실시하였다. 대조군 단핵세포는 AHM 8의 부재하에서 LPS로 자극되었다. 배지내에서 단독으로 또는 AHM 8 100㎍/㎖의 존재하에서 배양한 단핵세포를 추가의 대조군으로서 제공하였다. LPS 자극하고 1시간 및 3시간후 추출한 전체 RNA를 사람 TNF-α(도 7, 패널 A) 또는 IL-6(도 7, 패널 B)의 cDNA 단편으로 프로브하였다. TNF-α 방출을 측정하기 위해, 제2 세트의 배양액내 단핵세포를 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 배양 상층액내 TNF-α의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
LPS와 함께 가할 경우, 나타난 바와 같이 AHM 8은 TNF-α 뿐만 아니라 IL-6 mRNA의 축적을 감소시켰다. 상기 실험에서, 두 시토킨에 대한 mRNA 수준은 25%까지 감소했고; 그러나 TNF-α 합성/분비는 68%까지 감소했다. AHM 8 단독은 TNF-α mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으며(레인 2); AHM 8 처리된 세포내에 존재하는 mRNA의 양은 바탕의 양과 비교될 수 있었다(배지내에 단독으로 유지되는 세포)(레인 1).
AHM 8이 TNF-α mRNA 안정성에 영향을 미치지 못하게 하기 위해, LPS-자극된 단핵세포내 mRNA의 분해를 악티노마이신 D 10㎍/㎖의 존재하에서 평가하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 악티노마이신 D 및 AHM 8 100㎍/㎖의 조합 또는 악티노마이신 D 단독으로 처리한 LPS-자극 단핵세포로부터 추출된 TNF-α mRNA는 유사한 분해프로필을 가지며, 이는 AHM 8이 TNF-α mRNA 안정성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
상기 발견들은 AHM 8이 다른 기작을 통해 그의 조절효과를 얻는다는 것을 보여준다. 100㎍/㎖에서, AHM 8은 TNF-α 유전자 전사를 적당하게 억제하지만, 50㎍/㎖에서도 번역 또는 프로세싱에 강한 억제효과를 발휘한다.
실시예 10. 생체내 TNF-α 생성에 멜라닌이 미치는 효과
멜라닌이 생체내에서 시토킨 생성을 감소시키는지 측정하기 위해, TNF-α의 순환하는 농도를 LPS로 자극하기 전, 또는 동시에, 또는 자극후 AHM 8이 주입된 마우스내에서 측정하였다. TNF-α를 포함한 전구염증성 시토킨의 방출은 염증성 질병의 경우에 점착분자(세포내 점착분자-1 및 E-셀렉틴을 포함)의 발현 및 이차 염증성 매개체의 생성(예를 들어, 프로스타글란딘)을 포함한 다중세포성및 분자성 결과를 유발한다(Mizel 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:2474-2477, 1981; Dayer 외 다수, J. Exp. Med. 162:2163-2168, 1985). 프로스타글란딘은 세포내 프로테아제의 생성을 촉진한다(Baracos 외 다수, N. Engl. J. Med. 308:553-555, 1983). TNF-α는 급성 염증동안 생성되는 초기 인자중 하나이며(즉, 엔도톡세미아(endotoxemia))(Michalek 외 다수, J. Infect. Dis. 141:55-63, 1980; Beutler 외 다수, J. Immunol. 135:3972-3977, 1985; Freudenberg 외 다수, Infect. Immun. 51:891-895, 1986; 및 Fong 외 다수, J. Exp. Med. 170:1627-1633), 상기 시토킨의 수준은 내독소 쇼크시 결과의 전조가 되는 지표가 된다(Waage 외 다수, Lancet 8529:355-357, 1987). 그러므로, LPS에 대한 생체내 TNF-α 반응은 멜라닌의 시토킨 조절효과를 측정하기 위한 모델로서 사용하였다.
상기 연구에서, 암컷 BALB/c 마우스에 예정량의 LPS(0.625㎎/㎏) 및 AHM 8/㎏ 체중 50㎎을 정맥내주사(i.v.)하였다(급성 독성 연구는 단일 정맥투여량인 5g/㎏의 멜라닌이 Sprague Dawley 생쥐에 의해 내성이 있다는 것을 보여주었다). 대조군 마우스에는 각각 LPS, AHM 8 또는 PBS가 주입되었다. 전체 주입수 뿐만 아니라 10㎖/㎏의 정맥내 유액 부하를 평형시키기 위해 대조군내 각 마우스에 PBS 위조주입하였다. 90분후, 상기 혈액을 EDTA 0.750㎍(마이크로테이너 튜브 #5973; Becton Dickinson) 및 아프로티닌 50㎍(Sigma Chemical Co.)을 함유하는 0.5㎖ 튜브내에 수집하였다. 4℃에서 원심분리에 의해 혈액수집 3-5분내에 혈장을 분리하고, 분석될때까지 70℃에서 7일 이하동안 저장하였다. 각 혈장샘플을 1회 해동하였다. 예비시간과정 연구는 BALB/c 마우스에서 피크 TNF-α 반응이 LPS 자극하고 90분후 일어났다는 것을 보여준다. 각 혈장샘플내 TNF-α 함량은 ELISA(Biosource International)에 의해 중복측정하였다. (1)정상 마우스가 내독소에 대한 여러 민감도를 나타내므로 그들의 TNF-α 반응에 있어서 고도의 다양성이 있고; (2)TNF-α가 혈장내에서 반감기(마우스내에서 약 6-7분)를 가지고(Beutler 외 다수, J. Immunol. 135:3972-3977, 1985); 및 (3)가용성 TNF-α 수용체가 시토킨 측정을 방해하기 때문에(Adeka 외 다수, Cancer Res. 51:5602-5607, 1991), 최소 10마리의 마우스를 각 군에 포함시켰다. 확인을 위해, 각 실험을 2-4회 반복하였다.
2회의 연속실험결과는 LPS로 자극하기 60분전에 멜라닌 50㎎/㎏이 주입된 마우스내 혈장 TNF-α 수준이 LPS만 주입된 마우스내 혈장 TNF-α 수준보다 77% 낮다는 것을 보여준다(도 9A, p<0.001). 멜라닌만 또는 PBS(부형제)가 제공된 10마리의 마우스의 혈장내 TNF-α의 농도는 각각 33±16pg/㎖ 및 45±17pg/㎖이었다.
마우스에 LPS와 AHM 8 50㎎/㎏이 함께 주입된 경우, TNF-α 생성/방출에 있어서의 LPS-자극성 증가는 62%(n=40)까지 감소되었다(도 9B, p<0.0001). 멜라닌은 또한 25㎎/㎏에서 억제하였다. LPS 0.625㎎/㎏ 및 AHM 8 25㎎/㎏이 함께 주입된 12마리의 마우스내 혈장 TNF-α 농도는 LPS만 주입된 동물에서보다 62% 낮았다(1,702±345pg/㎖ 대 4,473±1,913pg/㎖, p=0.05). AHM 8에 의해 발휘된 억제효과는 상기 실험에서 마우스의 꼬리정맥내에 LPS를 주입하고, 바로 두번째 꼬리정맥에 AHM 8을 주입하였기 때문에 멜라닌과 LPS와의 직접적인 상호작용으로 기인하지 않았다.
멜라닌은 또한 LPS 자극하고 15분후 투여되었을 경우 효과적이었다. 도 9C에 나타난 바와 같이, LPS 투여하고 15분후 멜라닌이 주입된 마우스내에서 순환하는 TNF-α의 수준은 LPS만 주입한 대조군에 비해 상당히 낮았다(p=0.008). 그러나, 멜라닌은 LPS 주입하고 30분후 주입된 경우, TNF-α 생성/방출을 하향조절할 수 없었다(데이터는 나타내지 않음). 상기 결과는 마우스내에서 순환하는 TNF-α의 비교적 일시적인(60-90분) 피크와 일치되었으며(Garina 외 다수, J. Exp. Med. 173:1305-1310, 1991), TNF-α 생합성의 후전사단계가 완수되면, 멜라닌은 과정을 하향조절할 수 없다는 것을 제시한다.
이와 함께, 상기 데이터는 급성염증조건하에서 멜라닌이 TNF-α 생성/방출을 상당히 감소시키고, 멜라닌의 보호효과를 얻기 위해, 동물을 전처리할 필요가 없다는 것을 보여준다.
마우스가 상기 생체내 연구에서 특히 예시화되어도, 보통 수용가능한 동물모델은 생체내 시토킨 발현을 조절할 수 있는 정제된 멜라닌의 능력을 측정하는데 사용하였다. 추가적으로, 실험프로토콜 및 조건은 시험되는 미토겐 및 주입방법에 의존하여 사용할 수 있을때 조정될 필요가 있을 것이다. 따라서, 하기 기술은 멜라닌 전처리가 내독소 자극에 대한 예방보호를 제공하는 생체내 연구의 실시예를 제공한다. 하기 실시예는 예시화를 목적으로 하여 단독으로 제공되며, 어떤 방법으로도 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
통상의 동물실험은 제공된 실험관찰의 통계적 재생을 적당하게 증명하기 위해 각 처리군내에 최소 약 5-8마리의 동물을 포함한다. 적어도 약 10마리의 시험동물을 사용하여, 혹자는 동물의 반복취급 및 주입에 의해 도입된 변이체 및 제공된 동물내 미생물의 다른 민감도와 같은 변수에 대해 보상할 수 있다.
정제된 멜라닌(AHM 8)은 보통 정맥내주사되며, 보통 약 10 내지 약 200㎎/㎏ 체중, 바람직하게 약 25 내지 75㎎/㎏ 체중, 및 특히 약 50㎎/㎏ 체중의 농도에서 시험동물에 주입된다. 대조군 대상에는 상응하는 부피의 완충식염수를 주입하였다.
멜라닌 처리후, 여러 대조군 및 시험 대상에 여러 아치사 선량의 미토겐 및 치사량의 미토겐(LPS 또는 조직패혈증 또는 쇼크 증상을 자극하는데 유용한 다른 제제)을 주입하였다. 혈류내에 존재하는 시토킨 및 정제된 멜라닌의 양을 정량화하기 위해, 주사후 적당한 시간간격으로 혈액샘플을 채취하였다. 선택적으로, 치사량의 미토겐이 사용되는 곳에서 멜라닌이 시험동물에 보호를 제공하는 정도가 측정된다.
본 발명의 범주를 벗어나지 않고 본 실시예에 기술된 바와 같이 본 발명이 다양하게 변형될 수 있다는 것은 당업자에게 이해될 것이다. 많은 변형요소 및 그의 변형은 당 분야에 보통의 기술을 가진 자에게 명백할 것이며, 본 명세서에 기술된 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고 실시될 수 있다. 본 명세서에 참조된 모든 특허 및 공보는 이후에 참고문헌으로 전문통합된다.
Claims (18)
- 동물세포에 의해 시토킨 생성을 조절하기에 충분한 양으로 동물세포에 정제된 멜라닌을 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 동물세포에 의한 시토킨 생성의 조절방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 시토킨은 인터류킨, TNF-α 및 GM-CSF로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,상기 시토킨은 TNF-α인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,상기 시토킨은 IL-1인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,상기 시토킨은 IL-6인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,상기 시토킨은 인터류킨인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,상기 조절은 실험관내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
- 시토킨 발현과 관련된 질병의 유해 증상을 경감시키거나 또는 감소시키기에 충분한 양으로 동물에 정제된 멜라닌을 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 동물에 의한 시토킨 생성의 조절방법.
- 제 8 항에 있어서,상기 동물은 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서,상기 포유동물은 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서,상기 질병은 악액질, 관절염, 건염, 염증성 장 질병, 패혈증, 쇼크, AIDS 및 알레르기로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서,상기 질병은 악액질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서,상기 질병은 관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서,상기 질병은 염증성 장 질병인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서,상기 질병은 알레르기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서,상기 질병은 이식편거부질병인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서,상기 질병은 이식편대 숙주질병인 것을 특징으로 하는 방법.
- 치료제와 관련된 유해 증상을 감소시키거나 경감시키기에 충분한 양으로 각각에 정제된 멜라닌을 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 치료제의 조직독성을 감소시키는 방법.
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