WO2014208354A1 - 炎症性疾患を治療又は予防するための医薬組成物 - Google Patents

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WO2014208354A1
WO2014208354A1 PCT/JP2014/065663 JP2014065663W WO2014208354A1 WO 2014208354 A1 WO2014208354 A1 WO 2014208354A1 JP 2014065663 W JP2014065663 W JP 2014065663W WO 2014208354 A1 WO2014208354 A1 WO 2014208354A1
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hydrogen atom
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bendamustine
linear
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PCT/JP2014/065663
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竹内　勤
秀人 亀田
桂子 吉本
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Takeuchi Tsutomu
Kameda Hideto
Yoshimoto Keiko
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing inflammatory diseases.
  • Inflammatory disease Inflammatory disease
  • Inflammatory disease is a general term for diseases based on systemic or organ-specific inflammatory reactions.
  • autoimmune diseases self-reactive lymphocytes play a central role in the pathology.
  • systemic lupus erythematosus SLE
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • RA rheumatoid arthritis
  • cell infiltration centering on autoreactive CD4-positive T cells causes synovitis. Therefore, immunosuppressive therapy is the main treatment for these autoimmune diseases.
  • Bendamustine (4- ⁇ 5- [bis (2-chloroethyl) amino] -1-methyl-1H-benzimidazol-2-yl ⁇ butanoic acid) is an alkylating agent developed in East Germany in 1963, It is a drug approved by the US Food and Drug Administration (FDA) for low-grade B-cell non-Hodgkin lymphoma and chronic lymphocytic leukemia in 2008 (2010 approval in Japan). It is composed of a nitrogen mustard group, a purine analog-like skeleton (benzimidazole group), and a carboxylic acid group, and is said to contribute to alkylation action, antimetabolite action, and water solubility, respectively.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • NHS non-Hodgkin lymphoma
  • multiple myeloma etc.
  • Bendamustine hydrochloride for injection is a trade name of Treanda (registered trademark) (Cephalon, Inc., West Chester, PA) in the United States, and a product name of Ribomustin (registered trademark) (Asterlas Pharma GmbH, Munchen) in Germany. In Japan, it is available under the trade name Treakisym (registered trademark) (Eisai Co., Ltd., Tokyo).
  • Interleukin 10 protects rice from lethal endotoxemia. J Exp Med. 1993 Apr 1; 177 (4): 1205-8. Shinhei Kasakura and Tsunaharu Matsushima. Everything from cytokines to chemokines from the basics to the latest information. Japan Medical Museum. 2004. p. 180-183
  • an object of the present invention is to provide a drug that is effective for treatment or prevention of inflammatory diseases and has few side effects.
  • R 1 is a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group, or a hydrogen atom
  • R 2 is a hydrogen atom, a hydroxyl group or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 3 is a hydrogen atom, a hydroxyl group or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 4 is a hydrogen atom or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 5 is a halogen atom, a hydroxyl group or hydrogen
  • R 6 is a halogen atom, a hydroxyl group or hydrogen
  • R 7 is a halogen atom, a hydroxyl group or hydrogen
  • n is 0, 1 or 2
  • m is 0, 1 or 2
  • l is 0, 1 or 2
  • A is a 6-membered heterocyclic ring selected from a thiazine ring, a pyrazine ring and
  • R 1 is a methyl group or a hydrogen atom
  • R 2 is a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R 3 is a hydrogen atom
  • R 4 is a hydrogen atom or an ethyl group
  • R 5 is chlorine, hydroxyl group or hydrogen
  • R 6 is chlorine, hydroxyl group or hydrogen
  • R 7 is chlorine, hydroxyl group or hydrogen
  • n, m and l are each independently 0 or 2
  • A is a thiazine ring.
  • composition according to aspect 1 or 2 wherein the compound is selected from compounds having the following structural formula.
  • Embodiment 1 wherein the inflammatory disease is a disease that is treated or prevented by enhancing production of interleukin-10 (IL-10) and / or suppressing production of immunoglobulin M (IgM) in the subject 4.
  • IL-10 interleukin-10
  • IgM immunoglobulin M
  • Inflammatory diseases include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, antiphospholipid antibody syndrome, polymyositis, dermatomyositis, scleroderma, Sjogren's syndrome, IgG4-related diseases, vasculitis syndrome, mixed connective tissue disease, adult Still's disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, Guillain-Barre syndrome, rapidly progressive glomerulonephritis, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic
  • the pharmaceutical composition according to any one of aspects 1-4, selected from the group consisting of thrombocytopenic purpura (immune thrombocytopenia), Graves' disease, Harada disease, pemphigus, and pemphigoid. [Aspect 6]
  • R 1 is a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group, or a hydrogen atom
  • R 2 is a hydrogen atom, a hydroxyl group or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 3 is a hydrogen atom, a hydroxyl group or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 4 is a hydrogen atom or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 5 is a halogen atom or a hydroxyl group
  • R 6 is a halogen atom or a hydroxyl group
  • R 7 is a halogen atom or a hydroxyl group
  • A is a 6-membered heterocyclic ring selected from a thiazine ring, a pyrazine ring and a pyridine ring containing a nitrogen atom.
  • interleukin-10 including a compound selected from the group consisting of a compound having a structure represented by the following: a multimer of the compound, or a salt thereof, and / or A pharmaceutical composition for inhibiting the production of immunoglobulin M (IgM).
  • R 1 is a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group, or a hydrogen atom
  • R 2 is a hydrogen atom, a hydroxyl group or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 3 is a hydrogen atom, a hydroxyl group or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 4 is a hydrogen atom or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 5 is a halogen atom or a hydroxyl group
  • R 6 is a halogen atom or a hydroxyl group
  • R 7 is a halogen atom or a hydroxyl group
  • A is a 6-membered heterocyclic ring selected from a thiazine ring, a pyrazine ring and a pyridine ring containing a nitrogen atom.
  • interleukin-10 interleukin-10
  • IL-10 interleukin-10
  • FIG. 1 shows the results obtained by examining cell proliferation when bendamustine was administered to Ramos cells using an XTT assay.
  • FIG. 2 shows the results of examining the cell proliferation when bendamustine and anti-IgM antibody were administered to Ramos cells using an XTT assay.
  • FIG. 3 shows the results of examining cell proliferation using bendamustine, anti-IgM antibody and BAFF to Ramos cells using an XTT assay.
  • FIG. 4 shows the results obtained by examining the IgM concentration when Ramos cells were administered with bendamustine and anti-IgM antibody or BAFF using the ELISA method.
  • FIG. 1 shows the results obtained by examining cell proliferation when bendamustine was administered to Ramos cells using an XTT assay.
  • FIG. 2 shows the results of examining the cell proliferation when bendamustine and anti-IgM antibody were administered to Ramos cells using an XTT assay.
  • FIG. 3 shows the results of examining cell proliferation using bendamustine,
  • FIG. 5 shows the results of examining the IL-10 concentration using the ELISA method when bendamustine and anti-IgM antibody or BAFF were administered to Ramos cells.
  • FIG. 6 shows the results of Western blot analysis of the effect of bendamustine administration on the expression of pSTAT3, pSyk, and ⁇ -actin.
  • FIG. 7 shows the results of Western blot analysis of the effects of administration of bendamustine and BAFF on the expression of pSTAT3, pSyk, and ⁇ -actin.
  • FIG. 8 shows the results of measuring the anti-dsDNA antibody titer when bendamustine was administered to MRL / lpr mice 0.04 mg / kg three times a week.
  • FIG. 9 shows the results of measuring the anti-dsDNA antibody titer when bendamustine was administered to MRL / lpr mice at 1.00 mg / kg three times a week.
  • the horizontal axis represents the week after the start of bendamustine administration, and the vertical axis represents the antibody titer ( ⁇ 10 3 units / ml).
  • FIG. 10 shows the results of measuring the anti-dsDNA antibody titer when MRL / lpr mice were administered physiological saline three times a week as a control.
  • FIG. 11 shows a tissue section of the submandibular gland 9 weeks after the start of bendamustine administration (18 weeks of mice) when bendamustine was administered to MRL / lpr mice three times a week at 0.04 mg / kg. The results of staining with CD3 antibody and anti-B220 antibody are shown.
  • FIG. 12 shows a tissue section of the submandibular gland 9 weeks after the start of administration of bendamustine when physiological saline was administered to MRL / lpr mice as a control three times a week (anti-CD3 antibody).
  • FIG. 13 shows a tissue section of the lacrimal gland after 9 weeks from the start of bendamustine administration (when mice were 18 weeks old) when bendamustine was administered to MRL / lpr mice three times a week at 0.04 mg / kg.
  • the results of staining with anti-B220 antibody are shown.
  • FIG. 14 shows a tissue section of lacrimal gland after 9 weeks from the start of administration of bendamustine (mouse 18 weeks old) when physiological saline was administered to MRL / lpr mice three times a week as a control.
  • the result of staining with B220 antibody is shown.
  • FIG. 15 shows the results of examining the IL-10 concentration (FIG.
  • FIG. 16 shows the results of examining the IL-10 concentration (FIG. 16A) and the IgM concentration (FIG. 16B) when the bendamustine-like compound NP1 was administered to Ramos cells using the ELISA method.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing inflammatory diseases. Alternatively, it relates to a method for treating or preventing inflammatory diseases.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for enhancing production of interleukin-10 (IL-10) and / or suppressing production of immunoglobulin M (IgM).
  • the present invention relates to a method for enhancing production of interleukin-10 (IL-10) from cells and / or suppressing production of immunoglobulin M (IgM).
  • Bendamustine (4- ⁇ 5- [bis (2-chloroethyl) amino] -1-methyl-1H-benzimidazol-2-yl ⁇ butanoic acid) used as an active ingredient in the pharmaceutical composition or method of the present invention and These are similar compounds (hereinafter sometimes referred to as “bendamustine etc.”). Bendamustine has the following formula:
  • bendamustine and similar compounds used as the active ingredient of the present invention are represented by the following formula I:
  • R 1 is a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group, or a hydrogen atom
  • R 2 is a hydrogen atom, a hydroxyl group or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 3 is a hydrogen atom, a hydroxyl group or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 4 is a hydrogen atom or a C 1 -C 5 linear or branched alkyl group
  • R 5 is a halogen atom, a hydroxyl group or hydrogen
  • R 6 is a halogen atom, a hydroxyl group or hydrogen
  • R 7 is a halogen atom, a hydroxyl group or hydrogen
  • n is 0, 1 or 2
  • m is 0, 1 or 2
  • l is 0, 1 or 2
  • A is a 6-membered heterocyclic ring selected from a thiazine ring, a pyrazine ring and
  • Halogen represents chlorine, fluorine, bromine or iodine. More preferably, in Formulas I and II: R 1 is a methyl group or a hydrogen atom; R 2 is a hydrogen atom or a hydroxyl group; R 3 is a hydrogen atom; R 4 is a hydrogen atom or an ethyl group; R 5 is chlorine, hydroxyl group or hydrogen; R 6 is chlorine, hydroxyl group or hydrogen; R 7 is chlorine, hydroxyl group or hydrogen; n, m and l are each independently 0 or 2; And A is a thiazine ring.
  • R 4 in formulas I and II can be combined with R 5 , R 6 or R 7 to form a multimer comprising two or more compounds of formula I or II. It is understood that multimers have similar effects as compounds of formula I or II.
  • the multimer is preferably a dimer, trimer, tetramer or pentamer. More preferred is a dimer.
  • Salt in the present specification is not particularly limited.
  • acids that can be used for salt formation of pharmaceutically acceptable salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid, and organic acids such as acetic acid, Examples include maleic acid, fumaric acid, citric acid, oxalic acid, succinic acid, tartaric acid, malic acid, lactic acid, methylsulfonic acid, and p-toluenesulfonic acid.
  • Ammonium salts derived from pharmaceutically acceptable salts of bendamustine from inorganic or organic bases alkali metal salts (lithium, sodium, potassium, etc.), alkaline earth metal salts such as calcium or magnesium, aluminum salts, lower alkyl amines Salts such as methylamine or ethylamine salts, lower alkyldiamine salts such as ethylenediamine salts, ethanolamine, N, N-dialkyleneethanolamine, triethanolamine, and glucamine salts, and basic salts of amino acids can be obtained.
  • Acid salts prepared from hydrochloric acid, hydrobromic acid, and hydroiodic acid are particularly preferred, but the hydrochloride is the most preferred pharmaceutically acceptable salt such as bendamustine of the present invention.
  • Pharmaceutically acceptable salts are made by conventional methods well known in the art.
  • the compound is selected from compounds having the following structural formula:
  • M3, M4, BM1-DIMER, BM1-DCE, HP1, HP2, BM1-EE and NP1 The general names, CAS registration numbers, compound structures and origins of bendamustine analogues M3, M4, BM1-DIMER, BM1-DCE, HP1, HP2, BM1-EE and NP1 that can be used in the present invention are summarized in Table 1 below. did. M3, M4, HP1 and HP2 are degradation products found in plasma when bendamustine is administered in blood.
  • JP 2012-505224A discloses a safer preparation method of bendamustine, particularly a hydrochloride, which has fewer synthesis steps.
  • Bendamustine hydrochloride for injection is a trade name of Treanda (registered trademark) (Cephalon, Inc., West Chester, PA) in the United States, and Ribomustin (registered trademark) (Asterellas Pharma GmbH, Munchen) in Germany. It is available under the trade name and in Japan under the trade name Treakisym (registered trademark) (Eisai Co., Ltd., Tokyo). Bendamustine, which can be obtained as these pharmaceuticals, can also be used in the present invention.
  • Treanda registered trademark
  • Ribomustin registered trademark
  • Treakisym registered trademark
  • Bendamustine which can be obtained as these pharmaceuticals, can also be used in the present invention.
  • the bendamustine-like compound has a benzimidazole structure, a carboxylic acid structure, and a structure containing a nitrogen atom, preferably a nitrogen mustard group, similar to bendamustine.
  • BM1-EE and NP1 have an IL-10 production enhancement effect and an IgM production suppression effect similarly to bendamustine. It is understood that other bendamustine-like compounds have the same effect as bendamustine.
  • Inflammation is a symptom in which an immune response is activated when a living body receives some harmful stimulus, thereby appearing in the living body.
  • Inflammatory disease is a general term for diseases caused by the result of an immune response.
  • B cells are a type of lymphocyte cell derived from bone marrow, and are cells that proliferate in response to the entry of antigen and differentiate into cells that produce antibodies.
  • Interleukin-10 is a cytokine produced mainly from type 2 helper T cells (Th2), and is also produced from activated B cells, monocytes, mast cells or keratinocytes. Its biological activity is diverse, but it is characterized by a strong immunosuppressive action. That is, IL-10 mainly acts on mononuclear cells to suppress immune functions including the production of inflammatory cytokines, and also indirectly to lymphocytes via monocyte cells. Shows an inhibitory action.
  • IgM Immunoglobulin M
  • the inventors of the present invention have clarified the effect of bendamustine-added culture on cell activation and cytokine production by focusing on IgM and IL-10 produced by B cells and conceived the present invention. .
  • bendamustine As a result, it was found that the action of bendamustine is cell growth rate, suppression of IgM production and enhancement of IL-10 production. It was also found that the expression of pSTAT3 decreases with increasing bendamustine concentration. In this way, bendamustine has the opposite effect on the production of two different substances, so it is not a non-specific cell disorder but a drug that acts on various functions of cells and changes their activities. It was suggested.
  • interleukin-10 interleukin-10
  • IgM immunoglobulin M
  • B cells producing IL-10 are also referred to as regulatory B cells and have been reported to have a function of suppressing an excessive immune response.
  • regulatory B cells having IL-10 production ability are decreased in the peripheral blood of patients with autoimmune diseases, and there is an excessive immune response to drugs that enhance IL-10 production from B cells. That is, an effect of suppressing the inflammatory reaction can be expected.
  • bendamustine that acts to enhance production of interleukin-10 (IL-10) and / or suppress production of immunoglobulin M (IgM) in a subject is used for treating or preventing inflammatory diseases. It is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition.
  • IL-10 interleukin-10
  • IgM immunoglobulin M
  • inflammatory diseases There are many known “inflammatory diseases”. Many inflammatory diseases are autoimmune diseases, i.e., the immune system that plays a role in recognizing and eliminating foreign substances reacts excessively and attacks its own normal cells and tissues. It is a disease that will come. Autoimmune diseases can be divided into two types: systemic autoimmune diseases that affect the whole body and organ-specific autoimmune diseases that affect only specific organs. Systemic autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, antiphospholipid antibody syndrome, polymyositis, dermatomyositis, scleroderma, Sjogren's syndrome, IgG4-related disease, vasculitis syndrome, mixed connective tissue disease, adult Still's disease is included.
  • Organ-specific autoimmune diseases include Crohn's disease, ulcerative colitis, autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, Guillain-Barre syndrome, rapidly progressive glomerulonephritis, Includes autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenic purpura (immune thrombocytopenia), Graves' disease, Harada disease, pemphigus and pemphigoid. Furthermore, as inflammatory diseases other than autoimmune diseases, there are inflammations caused by bacterial infections and viral infections such as pneumonia and gastroenteritis.
  • Examples 5 and 6 suppression of the inflammatory reaction in vivo was observed by administration of bendamustine to MRL / lpr mice, which are disease model animals of collagen disease in which autoimmune phenomena occur frequently. It was further supported that bendamustine and its analogs are useful as therapeutic agents for inflammatory diseases. In particular, staining of tissue sections of submandibular gland and lacrimal gland with anti-CD3 antibody and anti-B220 antibody revealed suppression of inflammatory action in the tissue.
  • the disease used as the aspect of this invention includes Sjogren's syndrome and Mikulitz disease which are the autoimmune diseases regarding the submandibular gland and the lacrimal gland among the above-mentioned autoimmune diseases.
  • compositions of the present invention include, but are not limited to, additional active ingredients, pharmaceutically acceptable carriers, or combinations thereof.
  • additional active ingredients include: steroidal agents such as prednisolone; immunosuppressive agents such as infliximab and etanercept; natural antibacterial agents such as ⁇ -lactams, macrolides and tetracyclines; quinolones, new quinolones, oxazolidinones Synthetic antibacterial agents; including, but not limited to, antifibrotic agents such as pirfenidone.
  • steroidal agents such as prednisolone
  • immunosuppressive agents such as infliximab and etanercept
  • natural antibacterial agents such as ⁇ -lactams, macrolides and tetracyclines
  • quinolones new quinolones, oxazolidinones
  • Synthetic antibacterial agents including, but not limited to, antifibrotic agents such as pirfenidone.
  • One or more of these active ingredients may be incorporated into the pharmaceutical composition of the present invention depending on the individual indication of the subject.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include buffers that are not harmful to the subject of administration and that do not impair the biological activity and properties of bendamustine or its analogs and additional active ingredients that are active ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention, Includes, but is not limited to, excipients, diluents, stabilizers, antioxidants, preservatives, flavoring agents or combinations thereof.
  • buffering agents include phosphates, citrates, and other organic acids.
  • excipients include calcium salts such as calcium carbonate and calcium phosphate; sugars such as sucrose, lactose, starch and corn starch; cellulose derivatives such as hydroxypropylcellulose and hydroxypropylmethylcellulose; gelatin.
  • diluent examples include aqueous solvents such as purified water and physiological saline; alcohols such as ethanol, glycerol, propylene glycol and polyethylene glycol; vegetable oils such as sesame oil, cottonseed oil and corn oil.
  • stabilizers include chelating agents such as EDTA; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides such as glucose and mannose, disaccharides such as trehalose, dextran, pectin, guar gum, and xanthan gum And polysaccharides such as carrageenan.
  • antioxidants include ascorbic acid; tocopherols, tocotrienols; carotenoids such as carotenes and xanthophylls; polyphenols such as flavonoids; amino acids such as methionine; synthetic anti-antibodies such as tert-butylhydroquinone and butylated hydroxytoluene.
  • preservatives include alkyl parabens such as octadecyldimethylbenzylammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, phenol, butyl or benzyl alcohol, methyl or propylparaben.
  • flavoring agents include sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; sodium saccharin; aspartame; acesulfame potassium; thaumatin; stevia extract; l-menthol; limonene; peppermint oil, lemon oil, orange oil, sage oil, rosemary oil, cinnamon Essential oils such as oil, eucalyptus oil and clove oil are included.
  • sugar alcohols such as mannitol and sorbitol
  • sodium saccharin such aspartame; acesulfame potassium; thaumatin; stevia extract; l-menthol; limonene
  • peppermint oil lemon oil, orange oil, sage oil, rosemary oil, cinnamon Essential oils such as oil, eucalyptus oil and clove oil are included.
  • the form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and is, for example, a solid form such as a powder, a granule, or a tablet; a liquid such as a solution, an emulsion, or a dispersion; or a paste It can be prepared in any form such as a semi-solid form.
  • Specific examples of the dosage form include powders, granules, fine granules, tablets, pills, troches, capsules (including soft capsules and hard capsules), chewable agents, and solutions.
  • the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention can be selected appropriately depending on the patient's symptoms, age, etc., but pulmonary administration, nasal administration, oral administration, intravenous administration or local administration is preferred. It is.
  • the dose of the active ingredient in the pharmaceutical composition is easily determined by those skilled in the art depending on the patient's condition, gender, body weight, body surface area, or age, in particular, depending on the patient's body weight and body surface area, and is 10-1000 mg. It is a range. It is preferred that the daily dosage range from about 50 to about 1000 mg, preferably from about 100 to about 500 mg of the active ingredient. From the results of administration to the mice of Examples 5 and 6, it is considered that the dose of bendamustine of the present invention is preferably about 1/3 of that of methotrexate known as an antirheumatic drug, for example.
  • the daily dosage may be taken as a single dose or multiple doses such as twice or three times a day, most preferably as a single daily dose. Daily doses may be taken once a week or several times a week.
  • the dosage form may contain a single daily dose or a portion thereof. It is preferred that the dosage forms of the present invention contain about 10 to about 1000 mg, preferably about 25 to about 600 mg, more preferably about 50 to about 200 mg, most preferably about 100 mg of active ingredient.
  • the present invention further relates to a method for treating or preventing an inflammatory disease comprising administering bendamustine or an analog thereof to a subject.
  • the present invention also includes a compound selected from the group consisting of a compound having a structure represented by Formula I (as described above) or Formula II (as described above), a dimer of the compound, or a salt thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for enhancing production of interleukin-10 (IL-10) and / or suppressing production of immunoglobulin M (IgM).
  • IL-10 interleukin-10
  • IgM immunoglobulin M
  • the present invention also administers a compound selected from the group consisting of a compound having a structure represented by Formula I (as described above) or Formula II (as described above), a dimer of the compound, or a salt thereof.
  • the present invention relates to a method for enhancing interleukin-10 (IL-10) production from cells and / or suppressing production of immunoglobulin M (IgM).
  • IL-10 interleukin-10
  • IgM immunoglobulin M
  • a method for enhancing interleukin-10 (IL-10) production from cells of the present invention and / or suppressing production of immunoglobulin M (IgM) comprises administering a compound to a cell in vitro.
  • IL-10 interleukin-10
  • IgM immunoglobulin M
  • the cell type is not particularly limited. Preferred are immune cells, epithelial cells, vascular endothelial cells, mesenchymal cells and the like.
  • the patient of the present invention is not particularly limited. Preferably, it may include humans and other mammals such as dogs, cats, pigs, monkeys, mice, rats and the like.
  • IL-10 production is 1.5 times or more, 2 times or more, 3 times or more, 5 times or more depending on the concentration of bendamustine by administration of benthamstin as compared to the case of no administration. Increased 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more.
  • IgM production is suppressed to 4/5 or less, 2/3 or less, 1/2 or less, or 1/3 or less depending on the concentration of bendamustine administered.
  • FIGS. 4 and 5 the effect of stimulation with anti-IgM antibody and / or BAFF or with no stimulation was examined, as shown in FIGS. 4 and 5. A greater effect is observed with bendamustine in terms of increased production of interleukin-10 (IL-10) and / or suppression of immunoglobulin M (IgM) production under certain conditions than without stimulation. It was done.
  • IL-10 interleukin-10
  • IgM immunoglobulin M
  • a human Burkitt lymphoma cell line (Ramos) was cultured.
  • cells were prepared to 5 ⁇ 10 5 / ml, and the following eight conditions (1) to (8) were set according to the presence or absence of recombinant BAFF (rBAFF) added at a final concentration of 2 ⁇ g / ml and the concentration of bendamustine. Furthermore, the cells were further cultured under a total of 16 conditions, which were divided into two patterns each in the case where 10 ⁇ g / ml anti-IgM antibody was immobilized on the bottom of the culture plate in advance and not.
  • rBAFF recombinant BAFF
  • BAFF B cell activating factor of TNF
  • TNF TNF superfamily produced from dendritic cells, macrophages, activated T cells, etc., and is secreted after being trimerized by protease.
  • Example 2 Ramos XTT Assay
  • bendamustine was added at four levels (final concentrations 0, 11.1, 33.3, 100 ⁇ M) under three types of stimulation conditions (anti-IgM antibody, BAFF, anti-IgM antibody + BAFF) by the XTT method.
  • a proliferation test of Ramos cells was conducted for 4 days.
  • XTT assay Cell Proliferation Kit II (XTT) manufactured by Roche Applied Science was used.
  • IL-10 and IgM concentrations were measured by ELISA.
  • the IL-10 concentration and the IgM concentration in the culture supernatant were measured by sandwich ELISA using two kinds of specific antibodies, respectively.
  • the sample for IgM measurement was diluted from the initial 200-fold dilution to a standard product for preparing a standard curve. Started from the initial 10 ng / ml for both IL-10 and IgM.
  • the IL-10 expression level was significantly increased by anti-IgM antibody stimulation and BAFF stimulation, and the rate of increase when two types of stimulation were added was higher than when either single stimulation was given. .
  • the IgM concentration was expected to take a low value because the class switch from IgM to IgG or IgE was induced by the addition of BAFF, but it was clarified that this example does not have much influence.
  • activation stimulation to Ramos by anti-IgM antibody or reverse apoptosis induction did not change IgM production by itself, and no significant change was observed even when two stimulations were performed simultaneously. From the above, it is suggested that, at least in the Ramos cell line, the production amount of IgM is not easily changed by one environmental change, and even if a plurality of factors are involved, it does not necessarily change.
  • BAFF and bendamustine increased the IL-10 concentration and acted additively and synergistically.
  • bendamustine has an extremely high ability to induce IL-10 production, and is understood to have clinical significance.
  • bendamustine has the opposite effect on the production of two different substances, so it is not a nonspecific cytotoxicity, but a drug that acts on various functions of Ramos cells and changes their activities.
  • Example 4 Examination of pSTAT3, pSyk, ⁇ -actin expression by Western blot analysis
  • the MRL / lpr mouse is a disease animal model of collagen disease in which autoimmune phenomenon occurs frequently, which efficiently develops nephritis, vasculitis, and arthritis together with lymph node tumors.
  • autoantibodies detected in the serum of MRL / lpr mice include IgG rheumatoid factor (RF), IgM rheumatoid factor (RF), anti-dsDNA antibody, and anti-ssDNA antibody.
  • anti-dsDNA in MRL / lpr mice administered with bendamustine using “Levis anti-dsDNA-mouse ELISA KIT” (which may be referred to as “kit” in this example) (hereinafter referred to as “kit”).
  • kit Levis anti-dsDNA-mouse ELISA KIT
  • the antibody titer of the antibody was measured.
  • Bendamustine was administered to MRL / lpr mice from 9 weeks of age, 0.04 mg / kg or 1.00 mg / kg, 3 times a week for 8 weeks (up to 17 weeks of age).
  • physiological saline without bendamustine was administered to MRL / lpr mice.
  • Five animals of 0.04 mg / kg, 1.00 mg / kg, and physiological saline (control) were used.
  • Serum was collected from the mice at 0, 2, 4, 6 and 8 weeks after the start of administration, and diluted to a measurable range using a standard curve prepared with a standard substance in the buffer for dilution. Things were used as specimens.
  • the antigen-immobilized plate in the kit was washed 3 times with the washing solution attached to the kit. Diluted specimen and standard anti-mouse dsDN antibody solution were added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with the washing solution, a labeled antibody (peroxidase-conjugated anti-mouse IgG antibody) was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing with the washing solution three times, a color developing solution (TMB solution) was added to cause color development. A reaction stop solution (1M H 2 SO 4 ) was added to stop the reaction, and OD 450 nm was measured.
  • TMB solution color developing solution
  • mice administered with bendamustine at 0.04 mg / kg or 1.00 mg / kg have anti-dsDNA antibody titers that are different from those administered with physiological saline. In comparison, it decreased significantly.
  • Example 6 Staining of mouse tissue sections with anti-CD3 antibody and anti-B220 antibody
  • tissue sections of MRL / lpr mice administered with 0.04 mg / kg of bendamustine and MRL / lpr mice administered with control saline in Example 5 were stained with anti-CD3 antibody and anti-B220 antibody. Then, the inflammatory reaction in each tissue was examined.
  • the mouse No. 5 in FIG. 8 was used as the 0.04 mg / kg-administered mouse, and the mouse No. 4 in FIG. 10 was used as the physiological saline-administered mouse.
  • Tissue staining was performed according to the following procedure. -Tissue (submandibular gland, lacrimal gland) is sliced with a cryostat (LEICA CM 1920), applied to a slide glass, and dried. -Stain with ethanol / formalin / acetic acid fixative (HE staining). -After washing with water, soak in New Hematoxylin Type G (Muto Chemical). -After washing with water, soak in New Eosin Solution Type A (Muto Chemical).
  • FIGS. 11-14 show the results of bendamustine 0.04 mg / kg, submandibular gland tissue section.
  • FIG. 12 shows the results of tissue sections of control saline and submandibular glands.
  • FIG. 13 shows the results of bendamustine 0.04 mg / kg, lacrimal gland tissue section.
  • FIG. 14 shows the results of tissue sections of control saline and lacrimal glands.
  • IL-10 and IgM concentrations were measured by ELISA using bendamustine-like compounds BM1-EE and NP1 instead of bendamustine.
  • the experimental procedure was performed according to the method described in Example 3.
  • BM1-EE and NP1 were used at concentrations of 6.25 ⁇ M, 12.5 ⁇ M, 25 ⁇ M, 50 ⁇ M and 100 ⁇ M. No BAFF or anti-IgM antibody was added.
  • bendamustine and its similar compounds have an action of suppressing IgM production of human B cells and enhancing IL-10 production.
  • IL-10 is an anti-inflammatory cytokine and is useful as a therapeutic agent for inflammatory diseases.
  • serum IL-10 in patients with inflammatory bowel disease (IBD) is significantly lower than that in healthy subjects, and improvement of the pathological condition can be expected by enhancing the IL-10 expression of bendamustine.
  • bendamustine administration in MRL / lpr mice, which are model animals of collagen disease in which autoimmune phenomena occur frequently. It was further supported that bendamustine and its analogy Aizu are useful as therapeutic agents for inflammatory diseases.

Abstract

　本発明は、炎症性疾患を治療又は予防するための医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、以下の式Ｉ（式Ｉは本明細書に定義した通り）又は式ＩＩ（式ＩＩは本明細書に定義した通り）で表される構造を有する化合物、当該化合物の多量体、あるいはその塩、からなる群から選択される化合物を有効成分として含む。

Description

炎症性疾患を治療又は予防するための医薬組成物
　本出願は、２０１３年６月２５日に提出された日本国出願　特願２０１３−１３２８５２に基づく優先権を主張し、その全内容は本明細書中に取り込まれる。
　本発明は、炎症性疾患を治療又は予防するための医薬組成物に関する。
炎症性疾患
　炎症性疾患は、全身性の又は臓器特異的な炎症反応に基づく疾患の総称である。自己免疫疾患は、自己反応性のリンパ球が病態の中心的役割を果たす。例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、核抗原とそれに対する抗核抗体による免疫複合体が組織に沈着することで、血管炎・関節炎・腎炎などをもたらすことが知られている。また、関節リウマチ（ＲＡ）では、自己反応性のＣＤ４陽性Ｔ細胞を中心とした細胞浸潤が関節滑膜炎を生じる。従って、これらの自己免疫疾患に対する治療は免疫抑制療法が主体となる。しかしながら、副腎皮質ホルモンなど既存の治療薬の場合、易感染性、骨粗鬆症、耐糖機能異常などの副作用が大きいという問題がある。よって、治療に有効で副作用の少ない、即ち、リスクベネフィットバランスの優れた薬剤が望まれている。
ベンダムスチン
　ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）（４−｛５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル｝ブタン酸）は１９６３年に東ドイツで開発されたアルキル化剤で、２００８年に低悪性度Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫と慢性リンパ性白血病に対しアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）が認可した薬剤である（日本での承認は２０１０年）。ナイトロジェンマスタード基、プリンアナログ様骨格（ベンズイミダゾール基）、カルボン酸基から構成され、各々アルキル化作用、代謝拮抗作用、水溶性に寄与するとされている。他のアルキル化剤と同様にＤＮＡの塩基間に架橋構造を作り、複製を阻害することにより、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫等に対する抗癌剤として機能することが知られている。抗癌剤として最もよく用いられているシクロフォスファミドと比較すると、ＤＮＡ傷害が広範かつ長時間にわたり効果があるとする報告がある。
　注射用のベンダムスチン塩酸塩は、米国において、Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標）（Ｃｅｐｈａｌｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）という商品名で、ドイツにおいて、Ｒｉｂｏｍｕｓｔｉｎ（登録商標）（Ａｓｔｅｌｌａｓ　Ｐｈａｒｍａ　ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｃｈｅｎ）という商品名で、また日本において、Ｔｒｅａｋｉｓｙｍ（登録商標）（エーザイ株式会社、東京）という商品名で入手可能である。
特表２００８−５１９０４７ 特表２００８−５２６９９１ 特表２０１２−５０５２２４ 特表２０１２−５１０４８３
Ｌｅｏｎｉ　ＬＭ，Ｂａｉｌｅｙ　Ｂ，Ｒｅｉｆｅｒｔ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ（Ｔｒｅａｎｄａ）ｄｉｓｐｌａｙｓ　ａ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｕｎｉｑｕｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．２００８　Ｊａｎ　１；１４（１）：３０９−１７ Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ　Ｄ，Ｈａｒｓｔｒｉｃｋ　Ａ，Ｄｏｌｌ　Ｋ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ　Ｂ，Ｓｅｅｂｅｒ　Ｓ．Ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇｓ．１９９６　Ｊｕｎ；７（４）：４１５−２１ Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ　ＪＷ，Ｃｏｈｅｎ　Ｐ，Ｃｈｅｎ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｒｉｔｕｘｉｍａｂ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｉｎｄｏｌｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｐｈａｓｅ　ＩＩ　ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ，ｓｉｎｇｌｅ−ａｇｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ．２００８　Ｊａｎ　１０；２６（２）：２０４−１０． 矢田純一．医系免疫学．改訂１１版．中外医学社，２００９，ｐ．７２６ Ｌｉｎ　ＣＫ，Ｚｏｕ　ＨＹ，Ｋａｐｔｅｉｎ　ＪＳ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎｔｉ−ＩｇＭ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｒｅ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｏｆ　ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｉｎ　Ｒａｍｏｓ　ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．１９９７　Ｎｏｖ　２５；２３７（１）：２３１−４１ Ｓｕｚｕｋｉ　Ａ，Ｈａｎａｄａ　Ｔ，Ｍｉｔｓｕｙａｍａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．ＣＩＳ３／ＳＯＣＳ３／ＳＳＩ３　ｐｌａｙｓ　ａ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ＳＴＡＴ３　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．２００１　Ｆｅｂ　１９；１９３（４）：４７１−８１ Ｈｏｗａｒｄ　Ｍ，Ｍｕｃｈａｍｕｅｌ　Ｔ，Ａｎｄｒａｄｅ　Ｓ，Ｍｅｎｏｎ　Ｓ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　１０　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｍｉｃｅ　ｆｒｏｍ　ｌｅｔｈａｌ　ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．１９９３　Ａｐｒ　１；１７７（４）：１２０５−８． 笠倉新平，松島綱治．　サイトカイン・ケモカインのすべて　基礎から最新情報まで．　日本医学館．２００４．ｐ．１８０−１８３
　本発明者らは、上記問題の解決のために鋭意研究に努めた結果、従来抗癌剤として知られていたベンダムスチン及びその類似化合物が、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を亢進する、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生を抑制するという効果を奏することを見出した。さらに、同一個体内で種々の自己免疫現象が多発的に起こる膠原病の疾患モデル動物である、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにベンダムスチンを投与したところ、インビボにおける炎症反応の抑制が観察された。本発明は、炎症性疾患に関する治療又は予防に有効で、かつ副作用の少ない薬剤を提供することを目的とする。
　限定されるわけではないが、本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［態様１］
　以下の式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 又は
　式ＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　［式Ｉ及びＩＩ中、
　Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基、又は水素原子であり；
　Ｒ２は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ３は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ４は、水素原子又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ５は、ハロゲン原子、水酸基又は水素であり；
　Ｒ６は、ハロゲン原子、水酸基又は水素であり；
　Ｒ７は、ハロゲン原子、水酸基又は水素であり；
　ｎは、０、１又は２であり；
　ｍは、０、１又は２であり；
　ｌは、０、１又は２であり；そして、
　Ａは、窒素原子を含む、チアジン環、ピラジン環及びピリジン環から選択される、６員の複素環である］
で表される構造を有する化合物、当該化合物の多量体、あるいはその塩、からなる群から選択される化合物を有効成分として含む、炎症性疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
［態様２］
　式Ｉ及びＩＩにおいて、
　Ｒ１は、メチル基又は水素原子であり；
　Ｒ２は、水素原子又は水酸基であり；
　Ｒ３は、水素原子であり；
　Ｒ４は、水素原子又はエチル基であり；
　Ｒ５は、塩素、水酸基又は水素であり；
　Ｒ６は、塩素、水酸基又は水素であり；
　Ｒ７は、塩素、水酸基又は水素であり；
　ｎ、ｍ及びｌは、各々独立に０又は２であり；
そして、
　Ａは、チアジン環である
態様１に記載の医薬組成物。
［態様３］
　化合物が、以下の構造式を有する化合物から選択される、態様１又は２に記載の医薬組成物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［態様４］
　炎症性疾患が、対象中のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生の亢進、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生の抑制によって、治療又は予防される疾患である、態様１−３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［態様５］
　炎症性疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、ＩｇＧ４関連疾患、血管炎症候群、混合性結合組織病、成人スティル病、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、急速進行性糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病（免疫性血小板減少症）、バセドウ病、原田病、天疱瘡、及び類天疱瘡からなる群から選択される、態様１−４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［態様６］
　以下の式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 又は
　式ＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　［式Ｉ及びＩＩ中、
　Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基、又は水素原子であり；
　Ｒ２は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ３は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ４は、水素原子又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ５は、ハロゲン原子又は水酸基であり；
　Ｒ６は、ハロゲン原子又は水酸基であり；
　Ｒ７は、ハロゲン原子又は水酸基であり；そして、
　Ａは、窒素原子を含む、チアジン環、ピラジン環及びピリジン環から選択される、６員の複素環である］
で表される構造を有する化合物、当該化合物の多量体、あるいはその塩、からなる群から選択される化合物を含む、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を亢進するための、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生を抑制するための、医薬組成物。
［態様７］
　以下の式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 又は
　式ＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　［式Ｉ及びＩＩ中、
　Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基、又は水素原子であり；
　Ｒ２は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ３は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ４は、水素原子又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ５は、ハロゲン原子又は水酸基であり；
　Ｒ６は、ハロゲン原子又は水酸基であり；
　Ｒ７は、ハロゲン原子又は水酸基であり；そして、
　Ａは、窒素原子を含む、チアジン環、ピラジン環及びピリジン環から選択される、６員の複素環である］
で表される構造を有する化合物、当該化合物の多量体、あるいはその塩、からなる群から選択される化合物を投与することによる、細胞からのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を亢進するための、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生を抑制するための方法。
図１は、Ｒａｍｏｓ細胞にベンダムスチンを投与した場合の細胞増殖を、ＸＴＴアッセイを用いて調べた結果を示す。 図２は、Ｒａｍｏｓ細胞にベンダムスチン及び抗ＩｇＭ抗体を投与した場合の細胞増殖を、ＸＴＴアッセイを用いて調べた結果を示す。 図３は、Ｒａｍｏｓ細胞にベンダムスチン、抗ＩｇＭ抗体及びＢＡＦＦを投与した場合の細胞増殖を、ＸＴＴアッセイを用いて調べた結果を示す。 図４は、Ｒａｍｏｓ細胞にベンダムスチン及び抗ＩｇＭ抗体若しくはＢＡＦＦを投与した場合のＩｇＭ濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて調べた結果を示す。 図５は、Ｒａｍｏｓ細胞にベンダムスチン及び抗ＩｇＭ抗体若しくはＢＡＦＦを投与した場合ＩＬ−１０濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて調べた結果を示す。 図６は、ベンダムスチンの投与によるｐＳＴＡＴ３、ｐＳｙｋ、β−アクチンの発現への影響をウェスタンブロット分析によって調べた結果を示す。 図７は、ベンダムスチン及びＢＡＦＦの投与によるｐＳＴＡＴ３、ｐＳｙｋ、β−アクチンの発現への影響をウェスタンブロット分析によって調べた結果を示す。 図８は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに、ベンダムスチンを０．０４ｍｇ／ｋｇ、週３回投与した場合に、抗ｄｓＤＮＡ抗体価を測定した結果を示す。横軸はベンダムスチン投与開始後の週を、縦軸は抗体価（×１０３単位／ｍｌ）を示す。 図９は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに、ベンダムスチンを１．００ｍｇ／ｋｇ、週３回投与した場合に、抗ｄｓＤＮＡ抗体価を測定した結果を示す。横軸はベンダムスチン投与開始後の週を、縦軸は抗体価（×１０３単位／ｍｌ）を示す。 図１０は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに、対照として生理食塩水を週３回投与した場合に、抗ｄｓＤＮＡ抗体価を測定した結果を示す。横軸はベンダムスチン投与開始後の週を、縦軸は抗体価（×１０３単位／ｍｌ）を示す。 図１１は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに、ベンダムスチンを０．０４ｍｇ／ｋｇ、週３回投与した場合の、ベンダムスチン投与開始から９週間経過後（マウス１８週齢）の顎下腺の組織切片を、抗ＣＤ３抗体及び抗Ｂ２２０抗体で染色した結果を示す。 図１２は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに、対照として生理食塩水を週３回投与した場合の、ベンダムスチン投与開始から９週間経過後（マウス１８週齢）の顎下腺の組織切片を、抗ＣＤ３抗体及び抗Ｂ２２０抗体で染色した結果を示す。 図１３は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに、ベンダムスチンを０．０４ｍｇ／ｋｇ、週３回投与した場合の、ベンダムスチン投与開始から９週間経過後（マウス１８週齢）の涙腺の組織切片を、抗ＣＤ３抗体及び抗Ｂ２２０抗体で染色した結果を示す。 図１４は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに、対照として生理食塩水を週３回投与した場合の、ベンダムスチン投与開始から９週間経過後（マウス１８週齢）の涙腺の組織切片を、抗ＣＤ３抗体及び抗Ｂ２２０抗体で染色した結果を示す。 図１５は、Ｒａｍｏｓ細胞にベンダムスチン類似化合物ＢＭ１−ＥＥを投与した場合のＩＬ−１０濃度（図１５Ａ）及びＩｇＭの濃度（図１５Ｂ）を、ＥＬＩＳＡ法を用いて調べた結果を示す。 図１６は、Ｒａｍｏｓ細胞にベンダムスチン類似化合物ＮＰ１を投与した場合のＩＬ−１０濃度（図１６Ａ）及びＩｇＭの濃度（図１６Ｂ）を、ＥＬＩＳＡ法を用いて調べた結果を示す。
ベンダムスチン及びその類似化合物
　本発明は、炎症性疾患を治療又は予防するための医薬組成物に関する。あるいは、炎症性疾患を治療又は予防するための方法に関する。
　本発明はまた、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を亢進するための、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生を抑制するための、医薬組成物に関する。あるいは、細胞からのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を亢進するための、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生を抑制するための方法に関する。
　本発明の医薬組成物又は方法に、有効成分として用いるのはベンダムスチン（４−｛５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル｝ブタン酸）及びその類似化合物（以下、「ベンダムスチン等」と呼称する場合がある。）である。ベンダムスチンは、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 の構造を有する。
　好ましくは、本発明の有効成分とし用いるベンダムスチン及びその類似化合物は、以下の式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 又は
　式ＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 　［式Ｉ及びＩＩ中、
　Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基、又は水素原子であり；
　Ｒ２は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ３は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ４は、水素原子又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
　Ｒ５は、ハロゲン原子、水酸基又は水素であり；
　Ｒ６は、ハロゲン原子、水酸基又は水素であり；
　Ｒ７は、ハロゲン原子、水酸基又は水素であり；
　ｎは、０、１又は２であり；
　ｍは、０、１又は２であり；
　ｌは、０、１又は２であり；そして、
　Ａは、窒素原子を含む、チアジン環、ピラジン環及びピリジン環から選択される、６員の複素環である］
で表される構造を有する化合物、当該化合物の多量体、あるいはその塩、からなる群から
選択される。
　「ハロゲン」は、塩素、フッ素、臭素又はヨウ素を表す。
　より好ましくは、式Ｉ及びＩＩにおいて、
　Ｒ１は、メチル基又は水素原子であり；
　Ｒ２は、水素原子又は水酸基であり；
　Ｒ３は、水素原子であり；
　Ｒ４は、水素原子又はエチル基であり；
　Ｒ５は、塩素、水酸基又は水素であり；
　Ｒ６は、塩素、水酸基又は水素であり；
　Ｒ７は、塩素、水酸基又は水素であり；
　ｎ、ｍ及びｌは、各々独立に０又は２であり；
そして、
　Ａは、チアジン環である。
　式Ｉ及びＩＩにおけるＲ４と、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７が結合して、式Ｉ又はＩＩの化合物を２個以上含む多量体を形成することが可能である。多量体も式Ｉ又はＩＩの化合物と同様の効果を奏すると理解される。多量体は、好ましくは二量体、三量体、四量体又は五量体である。より好ましくは二量体である。
　本明細書における「塩」は、特に限定されない。医薬的に許容できる塩の塩形成に使用できる酸の例としては、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、及びリン酸など、並びに有機酸、例えば酢酸、マレイン酸、フマル酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、メチルスルホン酸及びｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられる。ベンダムスチンの医薬的に許容できる塩を無機又は有機塩基から誘導してアンモニウム塩；アルカリ金属塩（リチウム、ナトリウム、カリウム等）、カルシウム若しくはマグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、アルミニウム塩、低級アルキルアミン塩、例えばメチルアミン若しくはエチルアミン塩、低級アルキルジアミン塩、例えばエチレンジアミン塩、エタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミン、及びグルカミン塩、並びにアミノ酸の塩基性塩を得ることができる。塩酸、臭化水素酸、及びヨウ化水素酸から調製された酸性塩が特に好ましいが、塩酸塩が本発明のベンダムスチン等の最も好まし医薬的に許容できる塩である。医薬的に許容できる塩は、技術上周知の従来法によって作られる。
　より好ましくは、化合物は、以下の構造式を有する化合物から選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　本発明に利用しうるベンダムスチンの類似化合物Ｍ３、Ｍ４、ＢＭ１−ＤＩＭＥＲ、ＢＭ１−ＤＣＥ、ＨＰ１、ＨＰ２、ＢＭ１−ＥＥ及びＮＰ１の一般名、ＣＡＳ登録番号、化合構造及び由来を下記の表１に整理した。Ｍ３、Ｍ４、ＨＰ１及びＨＰ２は、ベンダムスチンを血中投与した場合に血漿中に確認される分解生成物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　これらの化合物は公知であり、公知の任意の方法を用いて製造が可能である。限定されるわけではないが、例えば、特表２０１２−５０５２２４には、ベンダムスチンの特に塩酸塩の調製方法であって、合成工程が少なく、かつより安全な調製方法が開示されている。
　なお、注射用のベンダムスチン塩酸塩は、米国において、Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標）（Ｃｅｐｈａｌｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）という商品名で、ドイツにおいて、Ｒｉｂｏｍｕｓｔｉｎ（登録商標）（Ａｓｔｅｌｌａｓ　Ｐｈａｒｍａ　ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｃｈｅｎ）という商品名で、また日本において、Ｔｒｅａｋｉｓｙｍ（登録商標）（エーザイ株式会社、東京）という商品名で入手可能である。これらの医薬品として入手可能なベンダムスチンを本発明に利用することも可能である。
　ベンダムスチン類似化合物は、ベンダムスチンと同様のベンゾイミダゾール構造、カルボン酸構造、並びに、窒素原子含む構造、好ましくは、ナイトロジェンマスタード基を有している。実施例７において、ＢＭ１−ＥＥ及びＮＰ１がベンダムスチンと同様にＩＬ−１０産生亢進効果及びＩｇＭ産生抑制効果を有することが示された。その他のベンダムスチン類似化合物も、ベンダムスチンと同様の効果を奏すると解される。
炎症性疾患を治療又は予防するための医薬組成物
　炎症とは、生体が何らかの有害な刺激を受けたときに免疫応答が働き、それによって生体に出現した症候である。炎症性疾患は、免疫応答の結果によって生じる疾患の総称である。
　Ｂ細胞は、骨髄由来のリンパ球細胞の一種で、抗原の進入に応答して増殖し、抗体を産生する細胞への分化する細胞である。インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、主に２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）より産生されるサイトカインであり、活性化Ｂ細胞、単球、肥満細胞あるいは角化細胞からも産生される。その生物活性は多岐にわたるが、強力な免疫抑制作用を主な特徴とする。即ち、ＩＬ−１０は主に単核系細胞に作用して炎症性サイトカインの産生を始めとする免疫機能を抑制的に制御する他、リンパ球に対しても単球系細胞を介して間接的に抑制作用を示す。ＩＬ−１０は、潰瘍性大腸炎、クローン病、脳性マラリアなどの炎症性疾患の患者において、血清中濃度が低下していた、との報告がある。全身性自己免疫疾患でも特に強皮症の活性ＩＬ−１０は有意に低値である、ことが知られている。免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）は、Ｂ細胞に存在する抗体である。ＩｇＭ抗体は、病原体の感染の初期に発現し、症状が進むと再び発現するようになる。この性質によって感染症の診断に用いられることもある。
　本発明者らは、Ｂ細胞の産生するＩｇＭやＩＬ−１０に注目することで、細胞の活性化やサイトカイン産生に及ぼすベンダムスチン添加培養の効果とその作用機序を明らかにし、本願発明を想到した。
　具体的には、ヒトバーキットリンパ腫細胞株（Ｒａｍｏｓ）に対して抗ＩｇＭ、ＢＡＦＦ（Ｂ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　ＴＮＦ）という２種の刺激を加え、そこにベンダムスチンを共存させ、その効果と作用機序を調べた。細胞数そのものの変化を知るためにＸＴＴ　ａｓｓａｙによる細胞増殖試験を行う一方、細胞の機能活性を測る指標として、産生されるＩｇＭおよびＩＬ−１０の濃度をＥＬＩＳＡ法で調べた。またウェスタンブロット分析でｐＳＴＡＴ３やｐＳｙｋの発現を調べることにより、ベンダムスチンの細胞内での作用機序を検討した。
　その結果、ベンダムスチンの作用としては、細胞増殖速度ならびにＩｇＭ産生の抑制とＩＬ−１０産生の亢進であることが判明した。また、ベンダムスチンの濃度上昇によりｐＳＴＡＴ３の発現が低下することも分かった。このように、ベンダムスチンは異なる２つの物質の産生に真逆の影響を与えていることから、非特異的細胞障害ではなく、細胞の各種機能に働きかけてそれぞれの活性を変化させる薬剤であることが示唆された。
　インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生の亢進、並びに、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生の抑制は、生体内の炎症反応を緩和させることが知られている。特に、ＩＬ−１０を産生するＢ細胞は制御性Ｂ細胞とも言われ過剰な免疫反応を抑制する機能を有することが報告されている。さらに自己免疫性疾患患者末梢血においてＩＬ−１０産生能を有する制御性Ｂ細胞が減少していることも報告されており、Ｂ細胞からのＩＬ−１０産生を亢進する薬剤には過剰な免疫反応すなわち炎症反応を抑制する効果が期待できる。よって、対象中のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生の亢進、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生の抑制の作用を奏するベンダムスチンは、炎症性疾患を治療又は予防するための医薬組成物の有効成分として有用である。
　「炎症性疾患」には多くのものが知られている。炎症性疾患の多くは自己免疫疾患、即ち、異物を認識し排除するための役割を持つ免疫系が自分自身の正常な細胞や組織に対して過剰に反応し攻撃を加えてしまうことで症状を来す疾患、である。自己免疫疾患には、全身にわたり影響が及ぶ全身性自己免疫疾患と、特定の臓器だけが影響を受ける臓器特異性自己免疫疾患の２種類にわけることができる。全身性自己免疫疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、ＩｇＧ４関連疾患、血管炎症候群、混合性結合組織病、成人スティル病等が含まれる。臓器特異性自己免疫疾患には、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、急速進行性糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病（免疫性血小板減少症）、バセドウ病、原田病、天疱瘡及び類天疱瘡が含まれる。さらに、自己免疫疾患以外の炎症性疾患として、細菌感染やウイルス感染による炎症、例えば、肺炎や胃腸炎などがある。
　さらに、実施例５及び６において、自己免疫現象が多発的に起こる膠原病の疾患モデル動物であるＭＲＬ／ｌｐｒマウスへのベンダムスチンの投与により、インビボにおける炎症反応の抑制が観察された。ベンダムスチン及びその類似化合物が炎症性疾患の治療薬として有用であることがさらに裏付けられた。特に顎下腺と涙腺の組織切片における抗ＣＤ３抗体及び抗Ｂ２２０抗体による染色によって、当該組織における炎症作用の抑制が明らかになった。限定されるわけではないが、本発明の態様となる疾患は、上述した自己免疫疾患のうち顎下腺並びに涙腺に関する自己免疫疾患であるシェーグレン症候群、ミクリッツ病を含む。
　本発明の医薬組成物に配合することができる他の構成成分には、限定されないが、追加の有効成分、薬学的に受容可能なキャリヤー、又はこれらの組み合わせが含まれる。
　追加の有効成分の例としては、プレドニゾロン等のステロイド剤；インフリキシマブ、エタネルセプト等の免疫抑制剤；β−ラクタム系、マクロライド系、テトラサイクリン系等の天然抗菌薬；キノロン系、ニューキノロン系、オキサゾリジノン系等の合成抗菌薬；ピルフェニドン等の抗線維化薬が挙げられるがこれらに限定されない。これらの有効成分は、対象の個々の適応症に応じて１種類以上を本発明の医薬組成物に配合してよい。
　薬学的に受容可能なキャリヤーには、投与の対象に有害でなく、本発明の医薬組成物の有効成分であるベンダムスチンまたはその類似化合物および追加の有効成分の生物活性および特性を損なわない緩衝剤、賦形剤、希釈剤、安定剤、抗酸化剤、保存剤、香味剤またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。緩衝剤の例には、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸が含まれる。賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩；白糖、乳糖、デンプン、コーンスターチ等の糖類；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース誘導体；ゼラチンが含まれる。希釈剤の例には精製水、生理食塩水等の水性溶媒；エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール；ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油等の植物油が含まれる。安定剤の例にはＥＤＴＡ等のキレート剤；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸類；グルコース、マンノース等の単糖類、トレハロース等の二糖類、デキストラン、ペクチン、グアーガム、キサンタンガム、カラギーナン等の多糖類が含まれる。抗酸化剤の例にはアスコルビン酸；トコフェロール類、トコトリエノール類；カロテン類、キサントフィル類等のカロテノイド；フラボノイド類等のポリフェノール類；メチオニン等のアミノ酸；ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシトルエン等の合成抗酸化物質が含まれる。保存剤の例にはオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン類が含まれる。香味剤の例には、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール；サッカリンナトリウム；アスパルテーム；アセスルファムカリウム；ソーマチン；ステビアエキス；ｌ−メントール；リモネン；ペパーミント油、レモン油、オレンジ油、セージ油、ローズマリー油、桂皮油、ユーカリ油、チョウジ油等の精油が含まれる。
　本発明の医薬組成物は、その形態は特に制限されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体状；溶液状、乳液状、分散液状等の液状；またはペースト状等の半固体状等の、任意の形態に調製することができる。具体的な剤形としては、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤を含む）、チュアブル剤、溶液剤などが例示できる。
　本発明の医薬組成物の投与方法は、患者の症状や年齢等に応じて適切なものを選択することができるが、経肺投与、経鼻投与、経口投与、静脈内投与又は局所投与が好適である。
　医薬組成物中の活性成分の用量は、患者の状態、性別、体重、体表面積、又は年齢に応じて、特に患者の体重及び体表面積に応じて当業者によって容易に決定され、１０~１０００ｍｇの範囲である。１日の投薬量が約５０~約１０００ｍｇ、好ましくは約１００~約５００ｍｇの活性成分の範囲であることが好ましい。実施例５、６のマウスへの投与の結果から本願発明のベンダムスチンの投与量は、例えば抗リウマチ薬として公知のメトトレキセートの１／３程度の量が望ましい、と考えられる。
　１日の投薬量を単回用量又は１日に２回若しくは３回などの複数回用量として摂取してよく、最も好ましくは単回１日用量として摂取する。１日用量を１週間に１回又は１週間に数回摂取してよい。剤形は、単回１日用量又はその一部の量を含有し得る。本発明の剤形が約１０~約１０００ｍｇ、好ましくは約２５~約６００ｍｇ、さらに好ましくは約５０~約２００ｍｇ、最も好ましくは約１００ｍｇの活性成分を含むことが好ましい。
　本発明はさらに、ベンダムスチンまたはその類似化合物を対象に投与することを含む、炎症性疾患を治療又は予防するための方法に関する。
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を亢進するための、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生を抑制するための、医薬組成物
　本発明はまた、式Ｉ（上述した通り）又は式ＩＩ（上述した通り）で表される構造を有する化合物、当該化合物の二量体、あるいはその塩、からなる群から選択される化合物を含む、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を亢進するための、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生を抑制するための、医薬組成物に関する。
　本発明はまた、式Ｉ（上述した通り）又は式ＩＩ（上述した通り）で表される構造を有する化合物、当該化合物の二量体、あるいはその塩、からなる群から選択される化合物を投与することによる、細胞からのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を亢進するための、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生を抑制するための方法に関する。
　本発明の細胞からのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を亢進するための、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生を抑制するための方法は、化合物をインビトロで細胞に投与して細胞を処理する方法、患者に化合物を投与して処置する方法のいずれも含む。
　細胞の種類は特に限定されない。好ましくは免疫細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、間葉系細胞等である。本発明の患者は、特に限定されない。好ましくは、ヒト、その他の哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、サル、マウス、ラット等を含み得る。
　限定されるわけではないが、ベンタムスチンの投与により、未投与の場合と比較して
ＩＬ−１０の産生はベンダムスチンの濃度依存的に１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上亢進する。一方ＩｇＭの産生は、投与されたベンダムスチンの濃度依存的に４／５以下、２／３以下、１／２以下、又は１／３以下に抑制される。本願明細書の実施例３では、抗ＩｇＭ抗体及び／又はＢＡＦＦでの刺激の有る条件下、あるいは刺激の無い条件下での効果を調べた、図４及び図５に示したように、刺激の有る条件下の方が刺激のない場合よりも、ベンダムスチンのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生亢進、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生の抑制、に関し、より大きな効果が観察された。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１　Ｒａｍｏｓ細胞の培養
　本実施例において、ヒトバーキットリンパ腫細胞株（Ｒａｍｏｓ）の培養を行った。
　まず細胞を５×１０５／ｍｌに調製し、最終濃度が２μｇ／ｍｌ　の組換え体ＢＡＦＦ（ｒＢＡＦＦ）添加の有無とベンダムスチン濃度により設定した以下の（１）−（８）の８つの条件について、更にそれぞれ予め１０μｇ／ｍｌ　抗ＩｇＭ抗体の培養プレート底面への固相化を行った場合と行わない場合の２パターンに分けた計１６条件で培養した。
　なお、ＢＡＦＦ（Ｂ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　ＴＮＦ）は、樹状細胞、マクロファージ、活性化Ｔ細胞などから産生されるＴＮＦスーパーファミリーに属する細胞膜貫通蛋白で、三量体形成後プロテアーゼにより切断されて分泌される。Ｂ細胞の生存維持のためには、３種類存在するＢＡＦＦレセプターへのＢＡＦＦ結合によるＴＲＡＦ分子を介したＮＦ−κＢの活性化が必要であるとされ、同時に辺縁帯Ｂ細胞への分化やＩｇＭからＩｇＧやＩｇＥへのクラススイッチが誘導される。
　（１）Ｒａｍｏｓ　１ｍｌ　＋　ＲＰＭＩ１６４０　１ｍｌ
　（２）Ｒａｍｏｓ　１ｍｌ　＋　ＲＰＭＩ１６４０　０．５ｍｌ　＋　ベンダムスチン（最終濃度１１．１μＭ）　０．５ｍｌ
　（３）Ｒａｍｏｓ　１ｍｌ　＋　ＲＰＭＩ１６４０　０．５ｍｌ　＋　ベンダムスチン（最終濃度３３．３μＭ）　０．５ｍｌ
　（４）Ｒａｍｏｓ　１ｍｌ　＋　ＲＰＭＩ１６４０　０．５ｍｌ　＋　ベンダムスチン（最終濃度１００μＭ）　０．５ｍｌ
　（５）Ｒａｍｏｓ　１ｍｌ　＋　ＢＡＦＦ　０．５ｍｌ　＋　ＲＰＭＩ１６４０　０．５ｍｌ
　（６）Ｒａｍｏｓ　１ｍｌ　＋　ＢＡＦＦ　０．５ｍｌ　＋　ベンダムスチン（最終濃度１１．１μＭ）　０．５ｍｌ
　（７）Ｒａｍｏｓ　１ｍｌ　＋　ＢＡＦＦ　０．５ｍｌ　＋　ベンダムスチン（最終濃度３３．３μＭ）　０．５ｍｌ
　（８）Ｒａｍｏｓ　１ｍｌ　＋　ＢＡＦＦ　０．５ｍｌ　＋　ベンダムスチン（最終濃度１００μＭ）　０．５ｍｌ
　４日後、培養細胞と培養上清を回収し、実施例２以降の解析に用いた。培地として１０％ＦＢＳを添加したＲｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）を用いた。
実施例２　Ｒａｍｏｓ　ＸＴＴアッセイ
　本実施例において、Ｒａｍｏｓ　ＸＴＴ　アッセイを行った。
　具体的には、ＸＴＴ法により、３種類の刺激条件（抗ＩｇＭ抗体、ＢＡＦＦ、抗ＩｇＭ抗体＋ＢＡＦＦ）において４段階の濃度（最終濃度０、１１．１、３３．３、１００μＭ）のベンダムスチンを加え、４日間に渡りＲａｍｏｓ細胞の増殖試験を行った。ＸＴＴアッセイには、Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製のＣｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＩＩ（ＸＴＴ）を使用した。
　ベンダムスチンの添加により、特に高濃度の添加により増殖速度が緩やかになった。さらに、３３．３μＭでは３日目を境に細胞数が減少に転じ、１００μＭでは増殖が一貫してほぼ完全に抑制された（図１）。この傾向は、ベンダムスチンに加えて抗ＩｇＭや抗ＩｇＭ＋ＢＡＦＦによる刺激を加えた場合も同じであり、抗ＩｇＭやＢＡＦＦを加えたことによる細胞数の大きな変化は見られなかった（図２及び図３）。
実施例３　ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−１０およびＩｇＭ濃度の測定
　本実施例では、ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−１０およびＩｇＭ濃度の測定を行った。
　実施例１述べた１６条件の各々について、培養上清中のＩＬ−１０濃度及びＩｇＭ濃度をそれぞれ２種類の特異的抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。事前に行った予備実験において、ＩｇＭ濃度を正確に測定するには試料を希釈する必要があることが判明していたため、ＩｇＭ測定用の試料は初期２００倍希釈から、標準曲線作製用の標準品はＩＬ−１０、ＩｇＭともに初期１０ｎｇ／ｍｌから開始した。
　ＥＬＩＳＡ法によるＩｇＭ濃度測定の結果を図４に示した。どの刺激条件においても、ベンダムスチンは濃度依存性にＩｇＭ産生を抑える効果があることが分かった。逆に、同じベンダムスチン濃度であれば刺激条件が変わってもＩｇＭ産生量に大きな差異はなかった。
　また、ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−１０濃度測定の結果を図５に示した。ＩｇＭの場合とは逆に、ベンダムスチン濃度依存性にＩＬ−１０発現を亢進させる効果があったが、どの刺激条件でも３３．３μＭと１００μＭでの発現量に大きな違いがないことから、ＩＬ−１０発現亢進作用に関しては３３．３μＭで平衡に達していると考えられた。
　また、抗ＩｇＭ抗体刺激やＢＡＦＦ刺激によってもＩＬ−１０発現量は有意に増加した上、２種の刺激を加えた場合の増加率は、どちらか単一の刺激を与えた場合よりも高かった。
　ＩｇＭ濃度については、ＢＡＦＦ添加によりＩｇＭからＩｇＧやＩｇＥへのクラススイッチが誘導されるために低い値をとることが予想されたが、本実施例によりあまり影響を及ぼさないことが明らかになった。また、抗ＩｇＭ抗体によるＲａｍｏｓへの活性化刺激あるいは逆のアポトーシス誘導も、それだけではＩｇＭ産生を明らかには変化させず、更に２つの刺激を同時に行っても著明な変化は見られなかった。以上より、少なくともＲａｍｏｓ細胞株においては、ＩｇＭの産生量が１つの環境変化で容易に変わるものではなく、また複数の要素が絡んだとしても、必ずしも変化するわけではないことが示唆される。細胞増殖試験の結果を見ても、２つの刺激を同時に加えた時に細胞数そのものは変わっておらず、これらの刺激が直ちに細胞増殖や抗体産生機能に変化をもたらさなかった。それに対し、ベンダムスチンは低濃度でもＩｇＭ産生抑制作用があることが示唆される。
　また、ＢＡＦＦ、ベンダムスチンは共にＩＬ−１０濃度を上昇させ、相加・相乗的に作用した。特にベンダムスチンによるＩＬ−１０産生誘導能は極めて高く、臨床的意義を有すると解される。
　本発明において、ベンダムスチンがＲａｍｏｓ細胞に与える効果として、増殖速度ならびにＩｇＭ産生の抑制、そしてＩＬ−１０産生の亢進が明らかになった。このように、ベンダムスチンは異なる２つの物質の産生に真逆の影響を与えていることから、非特異的細胞障害ではなく、Ｒａｍｏｓ細胞の各種機能に働きかけてそれぞれの活性を変化させる薬剤であることが示唆された。
実施例４　ウェスタンブロット分析によるｐＳＴＡＴ３、ｐＳｙｋ、β−アクチンの発現の検討
　本実施例では、ウェスタンブロット分析によるｐＳＴＡＴ３、ｐＳｙｋ、β−アクチンの発現の検討を行った。
　ベンダムスチンがどのような機序で作用するかを調べるため、実施例１に記載した１６条件の各試料においてｐＳＴＡＴ３およびｐＳｙｋの検出を行った。前提実験としてＰｉｅｒｃｅ（登録商標）　ＢＣＡＴＭ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて１６試料全てのタンパク定量を行った。同一の蛋白量を用いてウェスタンブロット分析を行った。同一の膜を用いて、リブロットしてβ−アクチンの検出も行った。
　ｐＳＴＡＴ３に関してはＢＡＦＦ刺激によって発現増加、すなわちＳＴＡＴ３の活性化が見られたが、Ｓｙｋでは明らかな活性化は見られなかった。また抗ＩｇＭ抗体による刺激はいずれの活性にも変化を与えなかった（図６及び図７）。ベンダムスチンの添加により、濃度依存性にＳＴＡＴ３の活性化が阻害されることが分かった。それに対し、Ｓｙｋの活性化に明らかな変化は見られなかった。
　ウェスタンブロット分析の結果より、ベンダムスチン濃度とＢＡＦＦはＳＴＡＴ３の活性化に影響を及ぼすことが明らかになった。これは即ち、この２つによる作用がＢ細胞内のシグナル伝達カスケードの一部を共有していることを示唆する。高濃度ベンダムスチンがＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害して発現を下げ、ＢＡＦＦの存在はｐＳＴＡＴ３の発現を低下はさせないことを考えると、ＢＡＦＦとベンダムスチンではＩＬ−１０産生亢進の分子機序が異なっており、少なくともＢＡＦＦによるＩＬ−１０産生のカスケードにＳＴＡＴ３が関与している可能性は低いと言える。
実施例５　マウス抗ｄｓＤＮＡ抗体の測定
　ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、リンパ節腫瘍とともに腎炎、血管炎、関節炎を効率で発症する、自己免疫現象が多発的に起こる膠原病の疾患モデル動物である。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの血清中の検出される自己抗体にはＩｇＧ型リウマチ因子（ＲＦ）、ＩｇＭ型リウマチ因子（ＲＦ）、抗ｄｓＤＮＡ抗体、抗ｓｓＤＮＡ抗体などがある。
　本実施例では、「レビス　抗ｄｓＤＮＡ−マウス　ＥＬＩＳＡ　ＫＩＴ」（シバヤギ社製）（以下、本実施例において「キット」と呼称する場合がある）を用い、ベンダムスチンを投与したＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける抗ｄｓＤＮＡ抗体の抗体価を測定した。
　ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに９週齢より、ベンダムスチンを０．０４ｍｇ／ｋｇ又は１．００ｍｇ／ｋｇ、週３回、８週間（１７週齢まで）投与した。対照としては、ベンダムスチンを含まない生理食塩水をＭＲＬ／ｌｐｒマウスに投与した。０．０４ｍｇ／ｋｇ、１．００ｍｇ／ｋｇ、生理食塩水（対照）の各群を５匹行った。投与開始から０週、２週、４週、６週及び８週後にそれぞれマウスから血清を採取し、キット添付希釈用緩衝液で標準物質を用いて作成した検量線により測定可能な範囲に希釈したものを検体として用いた。
　キット中の抗原固相化プレートをキット添付洗浄液で３回洗浄した。希釈検体と標準抗マウスｄｓＤＮ抗体溶液を添加し、室温で２時間静置した。洗浄液で３回洗浄後、標識抗体（ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体）を添加し、室温で２時間静置した。洗浄液で３回洗浄後、発色液（ＴＭＢ溶液）を添加し、発色させた。反応停止液（１Ｍ　Ｈ２ＳＯ４）を添加して反応を停止し、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。
　ベンダムスチン０．０４ｍｇ／ｋｇ投与、１．００ｍｇ／ｋｇ投与、対照の生理食塩水投与の結果を各々図８−１０に示す。図８−１０の結果から理解されるように、個体差はあるが、ベンダムスチンを０．０４ｍｇ／ｋｇ又は１．００ｍｇ／ｋｇ投与したマウスは抗ｄｓＤＮＡ抗体価が、生理食塩水を投与したマウスと比較して顕著に減少した。
実施例６　マウス組織切片の抗ＣＤ３抗体及び抗Ｂ２２０抗体による染色
　本実施例では、実施例５でベンダムスチンを０．０４ｍｇ／ｋｇ投与したＭＲＬ／ｌｐｒマウス、及び対照の生理食塩水を投与したＭＲＬ／ｌｐｒマウスの組織切片を、抗ＣＤ３抗体及び抗Ｂ２２０抗体で染色して、各組織における炎症反応を調べた。０．０４ｍｇ／ｋｇ投与マウスとしては図８の５番のマウスを、生理食塩水投与マウスとしては図１０の４番のマウスを用いた。これらは本実施例の組織観察時（１８週齢）に各群の５匹のマウスのうち１番体重の重かったマウスである。
　マウスを解剖後、顎下腺及び涙腺の各組織を摘出し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社製）を用いて急速冷凍包埋した。組織染色は以下の手順で行った。
　−組織（顎下腺、涙腺）をクライオスタット（ＬＥＩＣＡ　ＣＭ　１９２０）にて薄切後、スライドガラスに塗布後、乾燥させる。
　−エタノール・ホルマリン・酢酸固定液で染色する（ＨＥ染色）。
　−水で洗浄後、Ｎｅｗヘマトキシリン液ＴｙｐｅＧ（武藤化学）に浸ける。
　−水で洗浄後、Ｎｅｗエオシン液ＴｙｐｅＡ（武藤化学）に浸ける。
　−８０％エタノールで脱水する。
　−キシレンで透徹する。
　−マリノール（武藤化学）で封入する。
　−切片プレパラートにおいて、ＤＡＢ染色によりＣＤ３抗体、及びＢ２２０抗体を染色する。
　−アセトンにより切片を固定後、ＰＢＳで洗浄する。
　−０．３％過酸化水素水で内因性のペルオキシダーゼを賦活化する。
　−洗浄後、抗マウスＣＤ３抗体（ＢＤ５５５２７３、ベクトン・ディッキンソン社製）又は抗マウスＢ２２０抗体（ＢＤ５５０２８６、ベクトン・ディッキンソン社製）を添加する。
　−ＰＢＳで洗浄後、シンプルステインマウスＭＡＸ−ＰＯ（ｒａｔ）（ニチレイバイオサイエンス社製）を添加する。
　−洗浄後、ヒストファイン　ＳＡＢ−ＰＯ（Ｍ）キット（ＤＡＢ）を添加する。
　−洗浄後、ヘマトキシリンで核染色する。
　−洗浄後、脱水、透徹、封入を行う。
　上記染色工程後、倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ８３　カラー／モノクロイメージングシステム（オリンパス　ＩＸ８３ＰＩ−３４ＦＬ／ＤＩＣ−ＤＰ８０ＤＩＳＳ）を用いて、組織折半を観察撮影した。結果を図１１−１４に示す。図１１は、ベンダムスチン０．０４ｍｇ／ｋｇ、顎下腺の組織切片の結果である。図１２は、対照の生理食塩水、顎下腺の組織切片の結果である。図１３は、ベンダムスチン０．０４ｍｇ／ｋｇ、涙腺の組織切片の結果である。図１４は、対照の生理食塩水、涙腺の組織切片の結果である。生理食塩水のみの投与の場合にはＭＲＬ／ｌｐｒマウスの顎下腺及び涙腺の組織においてＣＤ３及びＢ２２０が強く発現していることが観察された（図１２、図１４）。これに対し、ベンダムスチンを投与した場合、ＣＤ３及びＢ２２０の発現が著しく抑制されることが明らかになった（図１１、図１３）。これは、インビボの実験においてベンダムスチンの投与により炎症反応が抑制されたことを示すものである。
実施例７　ベンダムスチン類似化合物を用いた場合のＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−１０およびＩｇＭ濃度の測定
　本実施例では、ベンダムスチンの代わりにベンダムスチン類似化合物のＢＭ１−ＥＥ及びＮＰ１を用いて、ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−１０およびＩｇＭ濃度の測定を行った。実験の手法は実施例３に記載の方法に準じて行った。ＢＭ１−ＥＥ及びＮＰ１は、６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ及び１００μＭの濃度を用いた。ＢＡＦＦや抗ＩｇＭ抗体は添加しなかった。
　結果を図１５及び１６に示す。ＢＡ１−ＥＥ及びＮＰ１は共に、ベンダムスチンと同様にＩＬ−１０発現を亢進させる効果を示すことが明らかになった。なお、ＮＰ１を１００μＭの濃度で使用した場合のＩＬ−１０発現が０なのは、高濃度のＮＰ１の使用により細胞自体が死んでしまったことに因ると考えられる。ＩｇＭについても、ＢＡ１−ＥＥ及びＮＰ１は共に、ベンダムスチンと同様に、ほぼ濃度依存性にＩｇＭ産生を抑える効果があることが判明した。以上より、ベンダムスチンと同様の骨格構造を有する類似化合物もベンダムスチンと同様のＩＬ−１０発現亢進効果及びＩｇＭ産生抑制効果を有することが示された。
　本発明において、ベンダムスチン及びその類似化合物には、ヒトＢ細胞のＩｇＭ産生を抑制し、ＩＬ−１０産生を亢進させる作用があることが見出された。ＩＬ−１０は抗炎症性サイトカインであり、炎症性疾患の治療薬として有用である。炎症性腸炎（ＩＢＤ）患者の血清中ＩＬ−１０は健常者と比べて有意に低下しているという報告などもあり、ベンダムスチンのＩＬ−１０発現亢進作用により病態の改善が期待できる。
　さらに、自己免疫現象が多発的に起こる膠原病の疾患モデル動物であるＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて、ベンダムスチンの投与により、インビボにおける炎症反応の抑制が観察された。ベンダムスチン及びその類似化合津が炎症性疾患の治療薬として有用であることがさらに裏付けられた。

Claims (7)

  1. 　以下の式Ｉ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     又は
    　式ＩＩ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　［式Ｉ及びＩＩ中、
    　Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基、又は水素原子であり；
    　Ｒ２は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
    　Ｒ３は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
    　Ｒ４は、水素原子又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
    　Ｒ５は、ハロゲン原子、水酸基又は水素であり；
    　Ｒ６は、ハロゲン原子、水酸基又は水素であり；
    　Ｒ７は、ハロゲン原子、水酸基又は水素であり；
    　ｎは、０、１又は２であり；
    　ｍは、０、１又は２であり；
    　ｌは、０、１又は２であり；そして、
    　Ａは、窒素原子を含む、チアジン環、ピラジン環及びピリジン環から選択される、６員の複素環である］
    で表される構造を有する化合物、当該化合物の多量体、あるいはその塩、からなる群から選択される化合物を有効成分として含む、炎症性疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
  2. 　式Ｉ及びＩＩにおいて、
    　Ｒ１は、メチル基又は水素原子であり；
    　Ｒ２は、水素原子又は水酸基であり；
    　Ｒ３は、水素原子であり；
    　Ｒ４は、水素原子又はエチル基であり；
    　Ｒ５は、塩素、水酸基又は水素であり；
    　Ｒ６は、塩素、水酸基又は水素であり；
    　Ｒ７は、塩素、水酸基又は水素であり；
    　ｎ、ｍ及びｌは、各々独立に０又は２であり；
    そして、
    　Ａは、チアジン環である
    請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　化合物が、以下の構造式を有する化合物から選択される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  4. 　炎症性疾患が、対象中のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生の亢進、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生の抑制によって、治療又は予防される疾患である、請求項１−３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 　炎症性疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、シェーグレン症候群、ＩｇＧ４関連疾患、血管炎症候群、混合性結合組織病、成人スティル病、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、急速進行性糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病（免疫性血小板減少症）、バセドウ病、原田病、天疱瘡、及び類天疱瘡からなる群から選択される、請求項１−４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 　以下の式Ｉ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     又は
    　式ＩＩ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     　［式Ｉ及びＩＩ中、
    　Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基、又は水素原子であり；
    　Ｒ２は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
    　Ｒ３は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
    　Ｒ４は、水素原子又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
    　Ｒ５は、ハロゲン原子又は水酸基であり；
    　Ｒ６は、ハロゲン原子又は水酸基であり；
    　Ｒ７は、ハロゲン原子又は水酸基であり；そして、
    　Ａは、窒素原子を含む、チアジン環、ピラジン環及びピリジン環から選択される、６員の複素環である］
    で表される構造を有する化合物、当該化合物の多量体、あるいはその塩、からなる群から選択される化合物を含む、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を亢進するための、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生を抑制するための、医薬組成物。
  7. 　以下の式Ｉ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     又は
    　式ＩＩ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     　［式Ｉ及びＩＩ中、
    　Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基、又は水素原子であり；
    　Ｒ２は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
    　Ｒ３は、水素原子、水酸基又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
    　Ｒ４は、水素原子又はＣ１−Ｃ５の直鎖状の若しくは分岐しているアルキル基であり；
    　Ｒ５は、ハロゲン原子又は水酸基であり；
    　Ｒ６は、ハロゲン原子又は水酸基であり；
    　Ｒ７は、ハロゲン原子又は水酸基であり；そして、
    　Ａは、窒素原子を含む、チアジン環、ピラジン環及びピリジン環から選択される、６員の複素環である］
    で表される構造を有する化合物、当該化合物の多量体、あるいはその塩、からなる群から選択される化合物を投与することによる、細胞からのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生を亢進するための、及び／又は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の産生を抑制するための方法。
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