KR0185226B1

KR0185226B1 - 이식 조직의 거부반응 억제제 및 il-1 생산 억제제

Info

Publication number: KR0185226B1
Application number: KR1019940703913A
Authority: KR
Inventors: 아끼라 마쓰모리
Original assignee: 오오쓰까 아끼히꼬; 오오쓰까세이야꾸 가부시키가이샤; 아끼라 마쓰모리
Priority date: 1993-03-02
Filing date: 1994-02-28
Publication date: 1999-05-01
Also published as: WO1994020107A1; US5521185A; AU672288B2; CA2134880A1; JP3054743B2; EP0638311A4; JPH11228415A; AU6116094A; KR950701222A; EP0638311A1

Abstract

본 발명은 하기 일반식(1)의 카르보스티릴 유도체 또는 그 염을 유효성분으로서 포함하는 이식조직 거부반응 억제제 조성물과 일반식(1)의 카르보스티릴 유도체 또는 그 염을 유효성분으로서 포함하는 IL - 1 생산억제제 조성물에 관한 것이다.

[식중, R은 그의 페닐환이 저급 알콕시기에 의해 치환될 수도 있는 벤조일기이고, 카르보스티릴 핵의 3 - 탄소와 4 - 탄소원자간 결합이 단일결합 또는 이중결합이다.]

본 발명의 이식조직 거부반응 억제제 조성물은 이식조직 거부반응을 억제시키고, 이식조직 생존율을 증대시킬 수 있으며, 각종 기관 및 조직의 이식시 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명의 IL - 1 생산 억제제 조성물은 과다한 IL - 1 생산으로부터 야기될 수 있는 질병, 예컨대, 염증, 골다공증, 골수구성 백혈병 등의 예방 및 치료에 효과적이다.

Description

[발명의 명칭]

이식조직의 거부반응 억제제 및 IL-1 생산 억제제

[기술분야]

본 발명은 정의된 카르보스티릴 유도체를 유효성분으로서 각각 포함하는 이식 조직의 거부반응 억제제 및 IL-1 생산 억제제에 관한 것이다.

[배경기술]

오늘날 행해지는 기관 이식은, 심장, 폐, 간, 췌장, 소장, 신장, 각막, 피부, 결합 심폐 및 골수이식을 포함하여 광범위한 범위의 조직을 포함한다. 그동안, 이와같은 기관이식에 대한 필수 약제로서, 시클로스포린, 아지티오프린, 미조리빈, 모노클론 항체인 OKT3, 스테로이드, 항임파구 글로불린 등의 면역 억제제들을 기관 이식수술시 예방 또는 치료의 면역억제용으로 사용하고 있다. 이들 약제의 출현은 이식성공률의 현저한 향상을 가져왔지만, 이들 약제를 다량으로 지속 투여할 경우, 심한 골수 억제현상을 초래하여 신독성으로 인한 신부전증, 빈혈증, 혈소팔 감소증, 백혈구 감소증 등의 부작용은 물론 감염, 빈혈증, 출혈성향에 대한 감수성 증대 등 위독한 합병증의 위험이 있기도 하다.

따라서, 이와같은 약제의 양이 제한 되어야 하는 경우가 많다.

최근 이식 성공률을 보다 향상시키고, 부작용을 경감시키기 위하여, FK506, RS61443, 15-데옥시스페르구알린(DSG), 유착 분자 항체 등에 대한 연구개발 노력을 하였지만, 항체 생산은 비정형 단백질의 투여 때문에 장기간 투여를 필요로 하는 유지 요법용으로는 적절하지 못한 단점을 가지고 있다. 또한 상술한 약제를 사용하는 결합 요법을 동종 성형시 골수 이식을 악화사키는 독특한 병인 GVHD(이식조직 대 숙주 질병)에서 실시하였지만, 치료 효과가 반드시 만족스러운 것은 아니었다. 따라서 상술한 기관 이식의 경우 부작용의 위험이 감소된 급성 및 만성 거부반응 모두의 양성억제용으로 장기간 동안 유지요법을 사용할 수 있고, 이식조직 거부반응 억제제라고 칭할 수 있는 신규 약제의 연구개발에 대한 산업상 요구가 있어왔다.

그러는 동안, 면역반응, 염증반응, 조혈 등 각종 생리 기능의 발현을 저해하는 단백질 인자로서 그 구조와 작용이 점진적으로 알려지기 시작한 다수의 시토킨이 발견되었고, 이들 시토킨의 작용은 면역계로만 한정되는 것이 아니라 각종 생물학적 기능으로 확장되어, 신체의 발생, 분화, 항상성 및 병태 생리와 밀접하게 관련이 있다는 것이 점점 명확해 졌다.

상기 시토킨중, IL-1은 주로 단핵세포와 대식세포로부터 생산되는 단백질 인자로서, 분자량이 약 120000 ∼ 18000인 폴리펩티드이다[S. B Mizel 등, Immunol. Rev. 63, 51 - 71, 1982]. 이 IL-1은 각종 세포에 작용하여 다양한 생물학적 활성을 나타내며, 따라서 면역, 염증, 조혈, 내분비계와 뇌신경계 등 생명 유지에 필요한 거의 모든 반응에서 중용한 역할을 한다. IL-1은 등전점, 즉 pI5와 PI7에 의해 분류되었을 때 두가지의 독특한 분자형태를 나타내며, 전자는 IL-1α, 후자는 IL-β라고 알려져 있다 [Oppenheim, J. J. 등, Immunol. Today, 7, 45, 1986 : Dinarello, C. A., Adv. Immuno., 44, 153, 1988]. 각 분자 형태중 아미노산 서열의 동질성은 서로 다른 동물 중에서도 60∼70%로 높지만, 두 분자형태는 동일한 동물 종에서도 겨우 25%밖에 안되는 낮은 동질성을 나타낸다. 더군다나, IL-1α와 IL-1β는 모두 세포막상의 동일 수용체에 결합된다고 한다 [Lowenthal, K. 등, J. Exp. Med., 164, 1060, 1986]. 또한 IL-1은 각종 암세포에 대해 직접 생장 저해 및 세포파괴작용을 가지므로 [Onozaki, K. 등, J. Immunol., 135, 3962,1985] 항암 효과를 발생한다 [Nakamura, S. 등, Jpn. J. Cancer Res., 77, 767, 1986 ; North, R, J. 등, J. Exp. Med., 168, 2031, 1988]. 또한, 이 IL-1에 관하여, 상술한 항암 효과 뿐만 아니라, 발열유도, 활액 세포증식, 연골 조직파괴, 골 파괴, 골흡수 증진, 혈관 내피세포의 손상, 메산쥼 세포증식의 촉진, 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)생산의 유도, 수정 난세포 발생의 저해, PGE₂와 PGE_2α생산의 유도, 과립화 증진, IL-1관련 오토크린 백혈병 세포증식의 증진, 결정형 요소에 의해 국부 유도된 IL-1관련 염증 등의 효과가 있고, 또 면역계에 대하여는 분화 촉진 및 T, B와 NK 세포활성의 증대, PGE 생산의 유도, IL-2, IL-6, TNF, GM-CSF, G-CSF등 시토킨 생산의 유도, 섬유아세포로부터 NGF유도, 수면유도, 통각 과민과 식욕부진, ACTH 생산의 유도효과 및 당질코르티코이드를 상승시키는 작용이 있는 것으로 보고되어 있다 [Onozaki, K., Biomedicine Therapeutics, 24 (1), 27 - 31, 1990].

상술한 바와같이 IL-1이 면역반응, 염증반응, 조혈의 발현 등 생물학적 기능 저해에 중요한 역할을 할 지라도, 체내 IL-1의 과다한 생산은 염증을 수반하는 각종 질병을 일으킬 수 있다. 더군다나, IL-1의 생물학적 활성 면에서, 그의 체내 과다 생산은 류마티스성 관절염, 라임병, 골다공증, 가와사끼병, 중독충격증세, 통풍, 사구체신염, 자궁내막염, 미숙분만, 유산, 육아종, 급성 골수구성 백혈병 등 중병의 발발을 일으킬 수 있다. 이와같은 질병의 예방 및 치료를 위해서는, 체내 IL-1의 과다생산을 저해할 수 있는 약제가 유효하지만, 이런작용을 가진 약제는 전혀 개발되지 않았다. 따라서, 산업상 이 분야에서 신규 약제 연구 및 개발에 관한 강력한 요구가 존재하고 있다.

[발명의 개시]

본 발명의 목적은 상술한 산업상 요구를 충족시켜줄 신규의 이식조직 거부반응 억제제를 제공하는 것이고, 구체적으로는 심장을 이식할 때 이식조직 생존을 더 연장시키는데 기여할 신규의 이식조직 거부반응 억제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 IL-1의 비정상적인 생산을 억제하고, 이러한 비정상적인 IL-1 생산으로부터 발생하는 각종 질병의 적절한 치료를 행할 수 있도록 하는 신규 IL-1 생산 억제제에 관한 것이다.

본 발명자는 상기의 목적을 염두에 두고, 많은 연구를 하였으며, 그 결과 그의 염을 포함하는 하기 일반식(Ⅰ)의 카르보스티릴 유도체를 유효강심성 물질로서 최초 개발하였고, 이 물질이 이식조직 거부반응 억제효과 및 이식조직 생존 연장효과를 가지며, 따라서 상술한 목적을 만족시킨다는 사실을 발견하였다. 또한 본 발명자는 이 화합물이 신규 작용메카니즘을 통해 그 효능을 발휘하는 효과적인 IL-1 생산 억제제란 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 따라, 하기 일반식(Ⅰ)의 카르보스티릴 유도체 및/또는 그 염을 유효성분으로서 포함하는 이식조직 거부반응 억제제 조성물을 제공한다.

[식중, R은 그의 페닐환이 저급 알콕시기에 의해 치환될 수도 있는 벤조일기를 나타내고, 카르보스티릴 핵중 3 - 탄소와 4 - 탄소간 결합은 단일 결합 또는 이중결합이다].

구체적으로, 본 발명에는 카르보스티릴 유도체가 6 - [4 -(3,4 - 디메톡시벤조일) - 피페라지닐] - 3,4 - 디히드로카르보스티릴 및/또는 그 염인 이식조직 거부반응 억제제 조성물이 제공되어 있다.

또한 본 발명에는 유효성분으로서 일반식(1)의 카르보스티릴 유도체 및/또는 그 염을 포함하는 IL-1 생산 억제제 조성물이 제공되어 있다.

특히, 본 발명에는 카르보스티릴 유도체가 카르보스티릴 유도체가 6 - [4 -(3,4 - 디메톡시벤조일) - 피페라지닐] - 3,4 - 디히드로카르보스티릴 및/또는 그 염인 IL -1 생산 억제제 조성물이 제공되어 있다.

본 발명의 이식조직 거부반응 억제제 조성물은 심장, 폐, 간, 췌장, 소장, 신장, 각막, 피부, 결합심폐 및 골수이식을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 광범위한 범위에서 실시되는 각종 이식수술에서 유리한 것으로 지적될 수 있다.

한편, 본 발명의 IL-1 생산 억제제 조성물은 IL-1의 비정상적인 생산으로부터 발생하는 각종 질병의 예방 및 치료에 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 IL-1생산 억제제 조성물 및 이식조직 거부반응 억제제 조성물에서 유효 성분으로 사용된, 그 염을 포함하는, 일반식(Ⅰ)의 카르보스티릴 유도체(이들 조성물을 이하 총칭해서 '본 발명의 약제'라고 함)의 생산 기술은 특히 JP출원 공고공보 제H1-43747호에 기재되어 있고, 이 카르보스티릴 유도체는 강심제로서의 용도도 있는 것으로 알려져 있다.

그러나 본 발명에 관계된 IL-1 생산 억제효과와 이식조직 거부반응 억제 및 이식조직 생존 연장효과는 강심성 효과와는 무관하며, 이 점에 관하여는 강심작용으로부터 고찰할 수 없다.

본 발명의 약제중 유효성분을 나타내는 일반식(Ⅰ)에 있는 기는 하기를 포함한다.

저급 알콕시기는 일반적으로 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, t-부톡시, 펜틸옥시, 헥실옥시 등 탄소원자 1∼ 6개의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기를 포함한다.

그의 페닐환이 저급 알콕시기에 의해 치환될 수도 있는 벤조일기는 페닐환에 탄소원자 1 ∼ 6개인 직쇄 또는 측쇄 알콕시기를 1 ∼ 3개 가질 수도 있는 벤조일기로, 예컨대, 벤조일, 2 - 메톡시벤조일, 3 - 메톡시벤조일, 4 - 메톡시벤조일, 2 - 에톡시벤조일, 3 - 에톡시벤조일, 4 - 에톡시벤조일, 3 - 이소프로폭시벤조일, 4 - 부톡시벤조일, 2 - 펜틸옥시벤조일, 3 - 헥실옥시벤조일, 3,4 - 디메톡시벤조일, 2,5 - 디메톡시벤조일 및 3,4,5 - 트리메톡시벤조일을 포함한다.

일반식(1)의 상기 카르보스티릴 유도체의 염은 약제학상 허용가능한 산 부가염을 포함한다. 염을 형성하는 산성 화합물은 황산, 인산, 질산, 염산, 브롬화수소산 등의 무기산과 옥살산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 구연산, 벤조산 등의 유기산을 포함한다.

본 발명의 약제의 유효성분으로서 사용하기 위한 일반식(1)의 카르보스티릴 유도체 및/또는 그 염은 일반적으로 종래의 약학적 투약 형태로 공급될 수 있다. 이와같은 투약 형태는 종래의 담체 및 부형제, 예컨대, 각종 충전제, 희석액, 결합제, 습윤제, 붕괴제, 계면활성제, 윤활제 등을 사용하여 제조할 수 있다. 적절한 약학적 투약형태는 치료 대상에 따라 선택될 수 있다. 따라서, 정제, 알약, 분말, 용액, 현탁액, 유상액, 과립, 캡슐, 좌약, 주사액(주사용액, 현탁액 등), 안약 등을 그 예로서 들 수 있다.

정제를 제조하기 위하여, 이 분야에 공지된 매우 다양한 담체를 사용할 수 있다. 따라서, 유당, 자당, 염화 나트륨, 글루코오스, 요소, 전분, 탄산칼슘, 카올린, 결정형 셀룰로오스, 실리카 등의 부형제 ; 물, 에탄올, 프로판올, 단순 시럽, 글루코오스 시럽, 전분용액, 젤라틴용액, 카르복시메틸셀룰로오스, 셸락, 메틸셀룰로오스, 인산칼륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제 ; 건조전분, 알긴산 나트륨, 한천 분말, 라미나란 분말, 탄산 수소나트륨, 탄산칼슘, 폴리옥시에틸렌-소르비탄 지방산 에스테르, 라우릴 황산나트륨, 스테아릴 모노글리세리드, 전분, 유당 등의 붕괴제 ; 자당, 스테아린, 카카오 버터, 수소화 오일 등의 붕괴 억제제 ; 4급 암모늄 염기, 라우릴 황산나트륨 등의 흡수 촉진제 ; 글리세린, 전분 등의 습윤제 ; 전분, 유당, 카올린, 벤토나이트, 콜로이드형 실리카 등의 흡착제 ; 및 정제 활석, 스테아르산염, 붕산분말, 폴리에틸렌 글리콜등의 윤활제를 그 예로 들수 있다. 또한, 필요한 때에는, 정제를 종래의 피복 조성물로 피복하여 당의정, 젤라틴 - 피복정제, 장용(腸溶) - 피복정제, 막 - 피복정제, 이층정제, 다층정제 등을 제공할 수 있다.

알약의 제조는 다양한 공지 담체를 사용하여 행할 수 있으며, 글루코오스, 유당, 전분, 카카오 버터, 수소화 식물유, 카올린, 활석 등의 각종 부형제 ; 아라비아고무 분말, 트래거캔스고무분말, 젤라틴, 에탄올 등의 결합제 ; 및 라미나란, 한천 등의 붕괴제 중에서 선택할 수 있다.

좌약의 제조는 폴리에틸렌 글리콜, 카카오 버터, 고급 알콜, 고급 알콜에스테르, 젤라틴, 반합성 글리세리드 등 그 기술분야에 공지된 각종 담체를 사용하여 행할 수 있다.

주사액을 제조할 때는, 용액 또는 현탁액을 살균하고, 바람직하게는 혈액과 등장화시킨다. 용액, 유상액 또는 현탁액을 제조하기 위하여, 이 기술분야에서 통상 사용하는 임의의 희석액을 사용할 수 있다. 따라서, 예컨대, 물, 에탄올, 프로필렌글리콜, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥실화 이소스테아릴 알콜 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 사용할 수 있다. 이 방법에서, 염화나트륨, 글루코오스, 글리세린 등은 등장제제를 제공하기에 충분한 양을 조성물에 가할 수 있다. 또한 통상적인 용해제, 완충용액, 진정제 등을 약학적 조성물에 혼입시킬 수 있다. 더군다나, 필요에 따라서는, 다른 의학 성분은 물론 착색제, 방부제, 향료, 방향제, 감미제 등을 조성물에 가할 수 있다.

본 발명의 약제에서 일반식(1)의 유효성분 화합물 비율은 크게 중요하지 않으며, 광범위한 범위로부터 자유 선택할 수 있다. 그러나, 약제는 전체 조성물에 대해 약 1 ∼ 70 중량%, 바람직하게는 약 1 ∼ 30중량% 비율로 화합물을 포함해야 한다고 추천된다.

이와같은 약학적 조성물을 사용하는 치료요법은 그리 중요하지 않으며, 투약형태, 환자의 인자 (예 : 나이, 성별 등), 질병 정도 등에 따라 선택될 수 있다. 주사 가능한 약학적 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 복막 조직내 또는 이와 유사한 경로로 투여할 수 있다. 필요할 때는, 이 조성물을 글루코오스, 아미노산 등 통상적인 주입액 또는 기타 정맥내 주입액과 혼합하여 정맥내 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 정제, 알약, 과립, 캡슐 등의 고체 형태나 경구적인 액체 형태로 경구 또는 장내 투여될 수 있다. 좌약은 직장으로 투여될 수 있다. 안약은 눈에 점적할 수 있다.

본 발명의 약제의 투여량은 광범위한 범위로부터 적절히 선택할 수 있으며, 크게 중요한 것은 아니다. 그러나, 일반적인 임상 적용시, 일반식(1)의 카르보스티릴 유도체 ( 및 그 염)에 관한 매일 투여량은 체중(㎏)당 약 0.5 내지 약 30㎎의 범위에서 선택하는 것이 바람직하고, 상기의 투여형태중 유효 성분의 양이 약 1 - 1000㎎인 것이 추천된다. 또한, 본 발명의 약제는 매일 1회 투여 또는 3 ∼ 4회 분할 투여할 수 있다.

본 발명의 이식조직 거부반응 억제제 조성물 또는 그의 유효성분 화합물은 지금까지 알려진 면역 억제제 등과 배합하여 사용할 수 있다. 이경우에, 본 발명의 이식조직 거부반응 억제제 조성물 또는 유효 성분화합물은 상기의 양립하는 면역 억제제 및 다른 약제의 효과를 공동으로 상승시킨다. 따라서 양립하는 면역 억제제의 투여량이 상당히 감소될 때에도 예기된 치료반응을 얻을 수 있고, 따라서 양립하는 약제의 원하지 않던 부작용을 경감시키는 결과를 초래한다.

따라서, 본 발명은 일반식(1)의 카르보스티릴 유도체 및/또는 그 염을 유효성분으로서 포함하는 이식조직 거부반응 억제제 조성물을 제공하며, 이는 이식조직에 대한 숙주의 거부반응에 대해 현저한 저해효과를 나타내고, 이식된 기관 또는 다른 조직의 생존률을 향상시킨다.

또한, 본 발명은 상기의 카르보스티릴 유도체 및/또는 그 염을 유효성분으로서 포함하는 IL-1 생산 억제제 조성물을 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도 및 제2도는 약리시험예 2에서 세포독성 T-세포의 유도에 대한 본 발명의 유효성분 화합물의 억제효과를 나타내는 도면이다.

제3도는 약리시험예 3에서 본 발명의 유효성분 화합물의 IL-1α 생산 억제활성을 나타내는 도면이다.

제4도는 약리시험예 3에서 본 발명의 유효성분 화합물의 IL-1β 생산 억제 활성을 나타내는 도면이다.

제5도는 약리시험예 4에서 본 발명의 유효성분 화합물의 이식조직 거부반응 억제효과를 나타내는 도면이다.

[본 발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

하기 조제예 및 약리시험예는 본 발명을 더욱 상세하게 설명하려는 것이다.

[조제예 1]

정제당 상기 조제를 가진 정제들을 제조하였다.

[조제예 2]

상기의 유효성분 화합물, 아베셀, 옥수수 전분 및 스테아르산 마그네슘을 혼합, 분쇄 및 Dragee R 10㎜ 펀치로 압착하였다. 수득한 정제를 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜 - 6000, 카스토르유 및 메탄올로 구성된 막 - 코팅으로 피복시켜 막 - 피복 정제를 얻었다.

[조제예 3]

상기의 유효성분 화합물, 구연산, 유당, 인산 2 칼슘, 플루로닉 F-68 및 라우일 황산 나트륨을 혼합하였다.

이 혼합물을 제60호 스크린으로 체질하고, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보왁스 1500 및 카르보왁스 6000을 포함하는 알콜용액으로 습윤 - 과립화 시켰다. 필요한 때, 과립화에 알콜을 가해 페이스트형 물질을 만들었다. 이 물질에 옥수수 전분을 가하고, 과립이 균질해 질때까지 계속 혼합하였다. 이 혼합물을 제10호 스크린을 통과시키고, 쟁반에 놓은 후, 100℃에서 12 ∼14시간동안 오븐 건조시켰다. 제16호 스크린으로 건조 입자들의 크기를 선별하였다. 그후, 건조 라우릴황산나트륨과 건조 스테아르산 마그네슘을 가하고, 이 혼합물을 정제기를 사용하여 목적하는 형상으로 압착하였다.

수득한 정제 중심부는 습기 흡수 방지를 위해 광을 내고, 활석을 뿌렸다. 그후 밑칠(undercoating)을 하였다. 정제를 충분한 횟수로 더욱 광을 내어 이들을 경구 섭취하기에 알맞도록 제조하였다. 표면을 원형이면서 부드럽게 만들기 위하여, 정제에 추가로 밑칠 및 부드러운 코팅을 행하였다. 그후, 목적하는 형상이 얻어질 때까지 색채를 띤 코팅을 행하였다. 건조후, 피복된 정제에 광을 내어 균일한 광택을 가진 마무리된 정제를 얻는다.

[약리 시험예 1]

시험 화합물로서 6 - [4 - (3,4 - 디메톡시벤조일) - 1 -피페라지닐] - 3,4 - 디히드로카르보스티릴 (이하 화합물(1)이라 함)을 사용하여, 쥐의 이종 심장 이식수술에서 시험 화합물의 이식조직 거부반응 억제효과와 이식 조직생존 - 연장효과를 하기와 같이 조사하였다.

동종 쥐사이에서 이종 심장 이식을 행하고, 동종 이식심장의 생존 시간이 본 발명의 시험화합물에 의해 연장되는지 여부를 조사하였다.

공여체로서 DBA/2쥐(6 주생, 수컷, Shimizu Experimental Materials Co., Ltd.에서 구입)를, 수용체로서 C 57 BL/6쥐 (6 주생, 수컷, 상기 회사로부터 구입)를 사용하였다. 수용체의 복부 대동맥과 하위 대정맥에 공여체 심장의 대동맥과 폐동맥을 각각 접합시킴으로써 심장 동종 이식수술을 행하였다. 수술 후 이식조직의 생존 능력을 심계항진과 ECG로 확인하였고, 수용체의 심장이 정지되는 희생이 있었다.

시험화합물인 화합물(1)을 0.5%카르복시메틸셀룰로오스(CMC, 셀로겐)에 현탁시키고, 이 용액을 시험 화합물에 대해 50㎎/㎏/일의 양으로 수술일에서 시작하여 하루에 한번씩 수용체에 경구 투여하였다. 화합물(1)을 처리한 군은 3마리의 쥐로 구성되었다. 화합물(1)을 처리하지 않은 대조군은 7마리의 쥐를 포함하였다.

상기 시험결과는 대조군에서 이식된 심장의 생존능력(n=12)에 대하여, 심장의 고동정지가 12일까지는 모든 경우에서 발생하였고, 이는 이식 조직의 거부반응을 제시한다는 사실을 입증하였다.

이에 비해, 화합물(1)을 처리한 군(n=10)에서는 21일째에 50%는 아직도 심장의 고동이 있었고, 이는 이식조직 생존이 현저하게 연장되었음을 의미하며, 따라서 이식조직 거부반응의 상당한 억제가 있음을 알려주었다.

상기 결과로부터 본 발명의 유효성분 화합물이 현저하게 이식조직 거부반응을 억제하고, 이식된 기관의 생존률을 향상시킨다는 것이 명백하다.

[약리 시험예 2]

세포독성 T - 임파구의 배양 및 분석은 하기와 같이 수행된다.

쥐의 지라를 절제하고 잘게 잘라 분리성 세포의 현탁액을 제조하였다. 적혈구를 ACK 용해 완충용액(0.15M Nh₄Cl, 1.0 M KHCO₃, 0.1 mM Na₂EDTA, pH 7.4)으로 용해시킨 후, 이 현탁액을 고밀도 임파구 (캐나다, 온타리오, 혼비, 세달란)상에 원심분리 (25℃, 20분, 1500×g)하여 임파구를 회수하였다.

벌크 배양에서, 7×10⁶개 세포의 미토마이신 -C(25㎍/ml, 시그마, 세이트 루이스, MO) - 처리 지라의 C 57 BL/6 반응세포 (수용체 균주)를 5.5 × 10⁶개 세포의 DBA/2 자극 세포와 함께 5일동안 공동 배양시켜 세포독성 작동세포의 발현을 일으켰다. 세포 독성 작동세포에⁵¹Cr - 라벨 DBA/2 지라 표적 세포(공여체 균주) 또는 C3H/He 표적세포(제3자)를 첨가하고, 그 결과를 기록하였다. 부수적으로, 상기 두 종류의 세포를 2일 동안 10㎍/ml의 리포다당류(디프코, 디트로이트, Mi)로 예비 자극시켰다.

표적 세포(1.7×10⁴)를 둥근바닥 96 - 웰 미크로타이터 플레이트(microtiter plates)를 사용하여 3작동/표적 세포비율이 100 : 1, 33 : 1 및 11 : 1이 되도록 C57 BL/6작동세포 200㎍/웰과 함께 공동 배양시켰다. 5% CO₂- 함유 공기하에 37℃에서 4시간 배양한 후, 각 웰로부터 100㎕의 부유물을 회수하고, 자동 감마 섬광 계수기를 사용하여 방사능을 측정하였다.⁵¹Cr의 자연 방출은 총계수의 30%이하였다.

특이 세포독성(specific cytotoxicity)은 하기 식을 사용하여 계산하였다.

상기의 최대방출(cpm)은⁵¹Cr - 라벨 표적세포를 0.1% 트리톤으로 처리하여 측정하였다.

이 시험에서, 본 발명의 유효성분 화합물로서 화합물(1)을 배지에 10㎍/㎖정도 첨가하였다. 실험상 시험에서, 이 화합물을 1N - 염산에 용해시키고, 배양액으로 희석시킨 후, 1N - NaOH로 pH를 조성하였다.

그 결과가 제1도와 제2도에 도시되어 있다.

각 도면은 본 발명의 유효성분 화합물로 실험적 처리를 한 후 세포독성 T - 세포출현에 대한 억제 효과를 나타내는 도면 (세로축 : 특이 세포독성(%), 가로축 : E/T비율) 이다. 제1도(표적 세포로 DBA/2 세포를 사용함)에 있어서, 혼합 임파구와의 반응 후 미처리 C 57 BL/6지라 세포가 DBA/2 표적 세포에 대해 증가된 CTL(폐환)을 보인 반면, 배양하는 동안 본 발명의 유효성분 화합물 10㎍/㎖을 처리한 세포는 감소된 CTL 활성(개환)을 나타내었다. x표는 정상 대조군(DBA/2 표적 세포와 공동 배양하지 않은 C 57 BL/6 지라세포)을 나타낸다.

또한 제2도 (표적 세포로서 C 3H/He 세포를 사용함)로부터, 표적 세포가 제 3 의 세포 계통일 때, C 3H/He 세포는 실질적으로 전혀 세포독성을 나타내지 않음이 명백하다.

[약리 시험예 3]

인간의 말초 혈액(n=7)을 헤파린화하고, 그 중 0.5㎖씩 리포다당류(LPS) 1, 10, 100, 1000 및 10000㎍/㎖을 각각 함유하는 RPMI-1640 배지 5㎖씩에 가하였다. 37℃에서 24시간 배양후, 각 배양액을 3000 rpm으로 원심분리하여 부유물을 분리시키고, 제조된 IL-1α와 IL-1β의 양을 각각 항 -IL-1α- 항체 (하이브리도마 KOCO 301, FERM BP 1554)(감수성 10 pg/㎖, JP 출원 공개공보 제 S 63 - 258595 호)에 의해 만들어진 항체와 항 - IL - 1β - 항체 (하이브리도마 GOM 43-4, FERM BP 2565)(감수성 20pg/㎖, JP 출원 공개공보 제 H2 - 227094호)에 의해 만들어진 항체를 사용하여 ELISA 키트(평판 고체상 방법)로 결정하였다. IL - 1α에 대해서는 Iida, M. 등, Jap. J. Clin. Path. 36. 196 (1988)에 기재된 방법, IL-1β에 대해서는 Noda, A. 등, Jap. J. Clin. Path. 36, 197 (1988)에 기재된 방법에 따라 상기를 분석 평가하였다.

상기 LPS를 첨가하기 전에, 미리 5% 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC용액, 다이-이찌 고오교 세이야꾸 가부시끼가이샤)에 현탁시킨 시험화합물로서의 화합물(1)을 각 시료에 최종농도 10㎍/㎖(실험군)로 가하였다. 또한 화합물(1)이 없는 대조군도 제공하였다.

상기 실험군과 대조군에서의 분석결과가 제3도와 제4도에 비교 도시되어 있다.

제3도는 실험군과 대조군에서 만들어진 IL-1α의 양을 나타내는 도면으로, 세로축은 IL-1α의 생산량(pg/㎖)이고, 가로축은 첨가된 LPS의 농도(로그로 표시) 이다. 도면에서, (1)은 실험군이고, (2)는 대조군이다.

도면으로부터, 본 발명의 유효성분 화합물이 말초혈액에서 IL-1α의 LPS-자극 생산을 상당히 억제한다는 것은 명백하다.

제4도는 실험군과 대조군에서 생산된 IL-β의 양을 나타내는 도면으로, 세로축은 IL-1β의 생산량 (pg/㎖)이고, 가로축은 첨가된 LPS의 농도(로그로 표시)이다. 도면에서, (1)은 실험군이고, (2)는 대조군이다.

도면으로부터, 본 발명의 유효성분 화합물이 말초혈액에서 IL-1β의 LPS - 자극 생산을 상당히 억제한다는 것은 명백하다.

따라서, 본 발명의 유효성분 화합물은 IL-1 생산을 억제시킬 수 있으며, 이는 각종 염증의 치료와 해열처치, 식욕증진, 슬로 - 웨이브 수면 억제용으로 유용하다는 사실을 말해준다.

[약리 시험예 4]

심장 등 기타 기관이식이 뒤따르는 수술후 면역 치료에서, 시클로스포린 A (Cy - A)는 중요한 역할을 하지만 신부전증 등 치료의 합병증의 심각한 문제점이 있다. 이 합병증이 Cy - A의 투여량의 의존한다는 사실은 공지되어 있다. 따라서, Cy - A의 투여량을 감소시키는 것이 중요하다.

본 시험에서, 본 발명의 약제(화합물(1))을 Cy -A와 배합하여 투여함으로써 배합치료의 동종이식 생존 - 연장효과를 조사하였다.

수용체로서 7 ∼ 10 주생 C 57 BL/6 쥐(수컷)와 공여체로서 DBA/2 쥐(수컷)를 사용하여, 공여체의 심장을 수용체의 복강내에 동종이식 시켰다. 이식한 날에 시작하여, 시험 약제를 매일 또는 매 24시간당 1회씩 위관을 매개로 하여 구강투여 하였다. 수용체 쥐를 미일 심계항진 및 1주에 3번씩 행한 ECG 기록에 의해 동종 이식심장의 거부반응에 대해 모니터하고, 조직한 발견을 토대로 최종분석을 행하였다.

우선, Cy - A만을 투여하고, 투여하지 않은 것(대조군)과 비교하여 동종 이식 생존을 상당정도 연장시키지 못한 최대량을 측정하였다. 그후, 상기 최대량을 수용하는 군 (20㎎/㎏/일) (Cy - A 모노치료군), 및 이 두 약제를 동일량 수용하는 군 (Cy - A + 화합물(1) 배합치료군)중에서, 이식 조직 생존 - 연장효과를 비교하였다.

그 결과가 제5도에 도시되어 있다.

도면중, 가로축은 이식후 시간 (일)이고, 세로축은 이식조직 생존율 (%)이다. 또한 (1)은 대조군 (약제 투여하지 않음, n=10)이고, (2)는 Cy - A 모노 치료군 (n=6)이며, (3)은 화합물(1) 모노치료군(n=10)이고, (4)는 Cy- A + 화합물(1) 배합치료군(n=6) 이다.

이 도면으로부터, 모노 치료군 (2) 및 (3)과 비교할 때, Cy - A + 화합물(1) 배합군(4)는 이식 조직 생존의 연장을 나타내었다.

Claims

하기 일반식(1)의 카르보스티릴 유도체 및/또는 그 염을 유효성분으로 포함하는 이식조식 거부반응 억제제 조성물.

[식중, R은 그의 페닐환이 저급 알콕시기에 의해 치환될 수도 있는 벤조일기이고, 카르보스티릴 핵의 3 - 탄소와 4 - 탄소원자 사이의 결합은 단일 결합 또는 이중결합이다].
제1항에 있어서, 카르보스티릴 유도체가 6 - [4 - (3,4 - 디메톡시벤조일) - 1 -피페라지닐] - 3,4 - 디히드로카르보스티릴인 이식조직 거부반응 억제제 조성물.
하기 일반식(1)의 카르보스티릴 유도체 및/또는 그 염을 유효성분으로 포함하는 IL - 1생산 억제제 조성물.

[식중, R은 그의 페닐환이 저급 알콕시기에 의해 치환될 수도 있는 벤조일기이고, 카르보스티릴 핵의 3 - 탄소와 4 - 탄소원자 사이의 결합은 단일 결합 또는 이중결합이다].
제3항에 있어서, 카르보스티릴 유도체가 6 - [4 - (3,4 - 디메톡시벤조일) - 1 -피페라지닐] - 3,4 - 디히드로카르보스티릴인 IL - 1 생산 억제제 조성물.