JPH06316534A

JPH06316534A - 治療用のプロテインホスファターゼインヒビター

Info

Publication number: JPH06316534A
Application number: JP2215092A
Authority: JP
Inventors: Kao Kishinmin; キシンミン・カオ; Guy Graeme; グリーム・ガイ; Uii Tan In; イン・ウイー・タン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-01-10
Filing date: 1992-01-10
Publication date: 1994-11-15

Abstract

(57)【要約】【構成】プロテインホスファターゼインヒビターを含
む、ＴＮＦまたはＩＬ−１の模擬物質として用いられる
物質、及び、プロテインホスファターゼインヒビターを
含む、細胞分化因子として用いられる物質、並びに、プ
ロテインホスファターゼインヒビター及びプロテインキ
ナーゼアクチベーターを、細胞分化の誘導で同時に、別
個に、または逐次用いるべく組み合わせた調製物として
含有する製品。【効果】本発明物質は、ＴＮＦまたはＩＬ−１で治療可
能な病態の治療及び細胞成長の促進に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えばオカダン酸（ｏ
ｋａｄａｉｃａｃｉｄ）及びカリキュリンＡ（ｃａｌ
ｙｃｕｌｉｎＡ）のようなプロテインホスファターゼ
１及び２Ａのインヒビターであるプロテインホスファタ
ーゼインヒビターの使用に係わる。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】免疫系
の制御はリンフォカインの、様々な種類の細胞との複雑
な相互作用によって媒介される。宿主免疫系の調整に関
与すると報告されているリンフォカインの例に腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）及びインターロイキン−１（ＩＬ−１）
が有る。ＴＮＦ及びＩＬ−１は敗血症及び自己免疫疾患
のような病態に関連し、炎症性反応の媒介物質と説明さ
れている。癌、ＡＩＤＳ及びマラリアでは、高レベルの
血清ＴＮＦがこれらの疾患における体重減少に関係付け
られる。これらのリンフォカインの病態との関連性は、
ＴＮＦ抗体またはインヒビターを敗血症性ショックの治
療に用いること、及びＩＬ−１抗体を慢性関節リウマチ
に適用することを促進した。

【０００３】ＩＬ−１は初め胸腺リンパ球のコマイトジ
ェン（ｃｏｍｉｔｏｇｅｎ）と説明され、またＴＮＦは
最初、腫瘍を壊死させる内毒素由来因子であると報告さ
れた。これら二つのリンフォカインは、相同のアミノ酸
配列を有しないか、またはそのレセプターに関して相同
性を有しなくとも、細胞上での生物学的活性においては
互いに類似する。チロシンキナーゼ活性を有することが
知られている上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長
因子（ＰＤＧＦ）及びコロニー刺激因子−１のレセプタ
ー、並びにＧＴＰ結合タンパク質を介して二次メッセン
ジャーを生じる“サーペンタインレセプター（ｓｅｒｐ
ｅｎｔｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ）”の場合に異なり、
ＴＮＦやＩＬ−１のレセプターからのＴＮＦまたはＩＬ
−１信号トランスダクションのモードは僅かしか推定さ
れていない。幾つかの報告は、ＴＮＦ及びＩＬ−１信号
化プロセスにＧＴＰ結合タンパク質が関与することを示
唆した。ｃＡＭＰ、１，４，５−トリホスホイノシトー
ル及びアラキドン酸の二次メッセンジャーとしての濃度
が上昇することも報告されている。ＴＮＦまたはＩＬ−
１で刺激した細胞中に熱ショックタンパク質、１−プラ
スチン、スタトミン、タリン及びＥＧＦレセプター（Ｅ
ＧＦＲ）など幾つかのリン酸化細胞基質を同定すること
によってセリンキナーゼ及び／またはトレオニンキナー
ゼの活性化が示唆された。この関連で上記両リンフォカ
インは、互いに協力して６３の細胞質ゾルタンパク質の
早いリン酸化を実現し、かつヒト線維芽細胞中の微小管
関連タンパク質−２及びｅＩＦ−４Ｅキナーゼを含めた
多くのプロテインキナーゼを活性化すると報告されてい
る。

【０００４】ＴＮＦまたはＩＬ−１は、ＮＦ−ｋＢ、Ｎ
Ｆ−ＩＬ６、多応答因子、インターフェロン応答因子−
１、インターフェロン応答因子−２、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−
ｊｕｎ及びＮＦ−ＧＭａを含めた幾つかの転写因子を活
性化し、数種の遺伝子を発現させる。トランスメンブラ
ンレベル、細胞質ゾルレベル及び遺伝子発現レベルでの
ＴＮＦ及びＩＬ−１信号化効果については多くが語られ
ているが、一次信号化経路は未解明で、場合によっては
矛盾を抱えたままである。

【０００５】即時型初期遺伝子Ｅｇｒ−１（ＮＧＦ１−
Ａ、ｚｉｆ２６８、ＴＩＳ８及びＫｒｏｘ２４としても
公知）は、細胞が血清または精製成長因子の刺激に応答
してＧ₀期からＧ₁期に移行する際に急速に、かつ一時的
に誘導される。この遺伝子Ｅｇｒ−１はＤＮＡ結合ドメ
インを有する核リンタンパク質をコードし、転写因子と
して機能する。Ｅｇｒ−１の発現は、Ｅｇｒ−１プロモ
ーター領域内に位置する配列５′ＣＧＣＣＣＣＣＧＣ−
３′に結合する亜鉛フィンガー保有タンパク質（Ｗｉｌ
ｍｓ腫瘍遺伝子の産物及びＥｇｒ−１遺伝子自体）によ
って調節される。ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、腫瘍サプ
レッサーと推定されるＷｉｌｍｓ腫瘍遺伝子産物はＥｇ
ｒ−１の発現を抑圧し、一方Ｅｇｒ−１タンパク質その
ものが自体の発現を誘導する。成人Ｔ細胞白血病にヒト
Ｔ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）が関連付け
られているが、このウイルスＨＴＬＶ−１のトランス調
節タンパク質（Ｔａｘ）が構成的に発現する幾つかのＨ
ＴＬＶ−１感染Ｔ細胞ラインにおいてＥｇｒ−１は高レ
ベルに発現する。更に、Ｅｇｒ−１の発現はＴａｘによ
ってトランス活性化されることが判明した。これらのこ
とから、Ｅｇｒ−１遺伝子の発現は細胞の成長及び形質
転換に関連すると考えられる。Ｅｇｒ−１遺伝子発現の
誘導ではプロテインキナーゼＣの活性化が一つの役割を
占めることが報告されている。

【０００６】米国特許第４，８３５，１７６号には、Ｔ
ＮＦが哺乳動物に及ぼす悪液質様の副作用の治療に用い
られるグリコオカダン酸（ｇｌｙｃｏｏｋａｄａｉｃ
ａｃｉｄ）が開示されている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本願出願人は今や、クロ
イソカイメン（ｍａｒｉｎｅｂｌａｃｋｓｐｏｎｇ
ｅ）由来のホスファターゼインヒビターであるオカダン
酸（Ｔａｃｈｉｂａｎａｅｔａｌ．，Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３，２４６９−２
４７１，１９８１）が一次ヒト線維芽細胞において、
ＴＮＦまたはＩＬ−１によって誘導されるものにきわめ
て類似の早期リン酸化と遺伝子発現とを複合的に誘導す
ることを発見した。本願出願人はまた、オカダン酸、及
び別のホスファターゼインヒビターであるカリキュリン
Ａがヒト及びマウスの線維芽細胞においてＥｇｒ−１遺
伝子の持続的発現を強力に誘導すること、並びにオカダ
ン酸とプロテインキナーゼアクチベーターであるホルボ
ール１２−ミリステート１３−アセテートとがＥｇｒ−
１遺伝子の誘導を相乗的に媒介し得ることも発見した。
これらの発見は一般的な有用性を有する。

【０００８】従って本発明は、プロテインホスファター
ゼインヒビターを含む、ＴＮＦまたはＩＬ−１の模擬物
質（ｍｉｍｉｃ）として用いられる物質を提供する。本
発明はまた、プロテインホスファターゼインヒビターを
含む、細胞分化因子として用いられる物質も提供する。
更に本発明は、プロテインホスファターゼインヒビター
及びプロテインキナーゼアクチベーターを、細胞分化の
誘導で同時に、別個に、または逐次用いるべく組み合わ
せた調製物として含有する製品も提供する。

【０００９】プロテインホスファターゼインヒビターは
典型的には、プロテインホスファターゼ１または２Ａの
インヒビターのようなプロテインセリン／トレオニンホ
スファターゼインヒビターである。プロテインホスファ
ターゼインヒビターはオカダン酸か、または該酸の医薬
的に許容可能な塩、アミドもしくはエステルであり得
る。塩は、ナトリウムまたはカリウム塩のようなアルカ
リ金属塩、またはアルカリ土類金属塩であり得る。アミ
ドは単純な酸アミド−ＣＯＮＨ₂であっても、式−ＣＯ
ＮＲ₁Ｒ₂〔Ｒ₁は水素かＣ₁〜Ｃ₄アルキル、Ｒ₂はＣ₁〜
Ｃ₄アルキル〕で表わされるアミドのようなモノまたは
ジアルキルアミドであってもよい。あるいは他の場合に
は、アミドはアミノ酸とのアミド、即ち例えばオカダン
酸とグリシンまたはリシンとのアミドであり得る。グリ
シンとのアミドがグリコオカダン酸である。オカダン酸
とアミノ酸とのアミドは、医薬的に許容可能な塩の形態
を取り得る。エステルはオカダン酸の、メチルまたはエ
チルエステルのようなＣ₁〜Ｃ₄アルキルエステルであり
得る。

【００１０】本発明に用いる別のプロテインホスファタ
ーゼインヒビターとして、カリキュリンＡまたはその誘
導体が有る。カリキュリンＡの機能性誘導体は、ＴＮＦ
またはＩＬ−１を模倣し得、またはＥｇｒ−１遺伝子を
誘導し得るものであれば任意のものを用いることが可能
である。誘導体はカリキュリンＡの酸またはアミンであ
り得る。

【００１１】ＴＮＦまたはＩＬ−１の模擬物質として、
プロテインホスファターゼインヒビターをＴＮＦまたは
ＩＬ−１で治療可能な病態の治療に用いることができ
る。従って、プロテインホスファターゼインヒビターは
腫瘍の治療に用い得る。治療する腫瘍は、転移性癌のよ
うな進行癌、黒色腫、腎細胞癌、白血病、気管支癌、鼻
咽頭癌及びカポジ肉腫の中から選択し得る。進行癌は転
移性の癌または肉腫であり得る。白血病は成人白血病で
あり得る。好ましくは、プロテインホスファターゼイン
ヒビターでの腫瘍治療は主腫瘍部の縮小化（ｄｅｂｕｌ
ｋｉｎｇ）後に行なう。主腫瘍部は外科的に、放射線治
療によって、及び／または化学療法で除去し得る。

【００１２】プロテインホスファターゼインヒビターを
細胞分化因子として用いることも可能である。プロテイ
ンホスファターゼインヒビターは細胞成長の促進に用い
られ得る。プロテインホスファターゼインヒビターは、
Ｅｇｒ−１遺伝子を誘導することによって機能し得る。
従って、プロテインホスファターゼインヒビターは白血
病、即ち例えば成人白血病の治療に用いられ得る。分化
が誘導されることによって白血病の症状が弱まる（Ｓａ
ｃｈｓ，Ｎａｔｕｒｅ２７４，５３５−５３９，
１９７８；Ｄｅｇａｓ，ＬｅｕｋｅｍｉａＲｅ
ｓｅａｒｃｈ１４，７１７−７１９，１９９０）。
好ましくは、プロテインホスファターゼインヒビターで
の腫瘍治療は上記同様主腫瘍部の縮小化後に行なう。

【００１３】プロテインホスファターゼインヒビター
は、細胞の分化及び成長の誘導に適用する場合、プロテ
インキナーゼアクチベーター、即ち例えばプロテインキ
ナーゼＣのアクチベーターと組み合わせて用い得る。プ
ロテインホスファターゼインヒビター及びプロテインキ
ナーゼアクチベーターは細胞成長の促進に用いられ得
る。プロテインキナーゼアクチベーターはプロテインホ
スファターゼインヒビターと同時に投与しても、あるい
はまたプロテインホスファターゼインヒビターより先か
後に投与してもよい。

【００１４】適当なプロテインキナーゼＣアクチベータ
ーは、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−ア
セテートとも呼称するホルボール１２−ミリステート１
３−アセテートである。短鎖（Ｃ₆、Ｃ₈及びＣ₁₀）脂肪
酸の１，２−ジグリセリド、即ち例えば１，２−ジヘキ
サノイル−ｓｎ−グリセロール（Ｃ₆：０）及び１，２
−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール（Ｃ₈：０；
１，２−ジカプリロイル−ｓｎ−グリセロールとも呼
称）もプロテインキナーゼＣのアクチベーターである。
プロテインキナーゼＣアクチベーターとしてはこのほか
に、１−オレオイル−２−アセチル−ｒａｃ−グリセロ
ール（Ｃ₁₈：１，［ｃｉｓ］−９／Ｃ₂：０；１−
［（ｃｉｓ）−９−オクタデセノイル］−２−アセチル
−ｒａｃ−グリセロールとも呼称）、１−オレオイル−
２−アセチル−ｓｎ−グリセロール及び１−ステアロイ
ル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロール（Ｃ₁₈：
０／Ｃ₂₀：４，［ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ］−
５，８，１１，１４；１−オクタデカノイル−２−
［（ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ）−５，８，１
１，１４−エイコサテトラエノイル］−ｓｎ−グリセロ
ールとも呼称）が有る。

【００１５】従って、ＴＮＦまたはＩＬ−１の模擬物質
として用いられるか、または細胞分化及び成長プロモー
ターとして用いられる物質が提供され得る。この物質は
プロテインホスファターゼインヒビターを含む。プロテ
インホスファターゼインヒビターと医薬的に許容可能な
担体または稀釈剤とを含有する医薬組成物を調製するこ
とができる。プロテインホスファターゼインヒビター
は、経口または直腸投与も注射による投与も可能であ
る。

【００１６】注射剤を製造する場合、ｐＨ調節剤、緩衝
剤、安定剤及び／または賦形剤を添加し得る。更に、通
常の技術により、凍結乾燥注射剤を製造することも可能
である。皮下注射、筋内注射または静脈注射用の製剤を
製造できる。

【００１７】経口投与用の固形製剤は、プロテインホス
ファターゼインヒビターに賦形剤、及び所望であれば結
合剤、崩壊剤、滑剤、着色剤及び／または矯正剤（矯味
剤）等を添加し、通常の技術によって錠剤、コーティン
グ錠剤、顆粒剤、散剤またはカプセルを形成することに
よって製造し得る。経口液剤は、主薬に矯正剤、緩衝剤
及び／または安定剤を添加し、シロップ剤または乾燥シ
ロップ剤を形成することによって製造し得る。

【００１８】プロテインホスファターゼインヒビターに
賦形剤、及び所望であれば界面活性剤を添加し、かつ通
常の技術で成形することによって坐剤も製造し得る。

【００１９】プロテインキナーゼアクチベーターは、用
いる場合、上記プロテインホスファターゼインヒビター
と調合し得る。あるいは他の場合には、プロテインキナ
ーゼアクチベーターを単独で医薬的に許容可能な担体ま
たは稀釈剤と調合することも可能である。

【００２０】用時、治療有効量のプロテインホスファタ
ーゼインヒビターをホストに投与する。ホストは普通人
間であるが、他の哺乳動物であってもよい。こうして、
患者の状態を改善し得る。患者の掛かっている疾病を軽
くすることができる。プロテインホスファターゼインヒ
ビターの投与レベルは、患者の状態、患者の年齢及び体
重、治療する病態並びに投与形態を含めた様々な要因次
第で異なる。注射の場合は１日当たり約０．０５〜５０
０ｍｇ程度の投与レベルが有用であるが、有用な投与レ
ベルは投与部位毎に相違し得る。経口または直腸投与の
場合は、投与レベルを１日当たり約０．０５〜１０００
ｍｇとする。投与レベルは医師の要求に従って変更可能
である。

【００２１】治療有効量のプロテインキナーゼアクチベ
ーターをプロテインホスファターゼインヒビターと組み
合わせてホストに投与し得る。プロテインキナーゼアク
チベーターの投与は、プロテインホスファターゼインヒ
ビターの投与前または投与後数日以内に行なっても、あ
るいはまたプロテインホスファターゼインヒビターの投
与と同時に行なってもよい。従って、プロテインキナー
ゼアクチベーターはプロテインホスファターゼインヒビ
ターの投与前か投与後７日以内、例えば２日以内に投与
し得る。

【００２２】プロテインキナーゼアクチベーターの投与
経路及び投与レベルは、いずれのプロテインキナーゼア
クチベーターを投与するかということを含めた様々な要
因に依存する。投与レベルはやはり患者の年齢、体重及
び状態に依存し得る。しかし通常は、プロテインキナー
ゼアクチベーターの投与は例えば静脈内への注射によっ
て、１日当たり約０．０５〜５００ｍｇの投与レベルで
行ない得る。経口または直腸投与の場合は、１日当たり
０．０５〜１０００ｍｇの投与レベルが適当であり得
る。

【００２３】

【実施例】本発明を、以下の実施例によって詳述する。

【００２４】添付図面中の第１図に、ヒトの線維芽細胞
における早期タンパク質リン酸化の、アゴニストによっ
て惹起される変化の比較を示す。³²Ｐで標識した培養物
をＴＮＦまたはオカダン酸（ＯＡ）で１５分間処理し
た。次に細胞を、コンピューター処理映像化と組み合わ
せた高解像度二次元ゲル電気泳動によって分析した（Ｇ
ｕｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６６，１４３４３−１４３５２，１９９１）。
第１図に示したのは、対照の細胞質ゾル（ａ）、ＴＮＦ
（５０単位／ｍｌ）で処理した細胞質ゾル（ｂ）、２０
０ｎＭのＯＡで処理した細胞質ゾル（ｃ）、未処理の核
／細胞骨格抽出物（ｄ）、ＴＮＦ（５０単位／ｍｌ）で
処理した核／細胞骨格抽出物（ｅ）、及び２００ｎＭの
ＯＡで処理した核／細胞骨格抽出物（ｆ）のオートラジ
オグラムである。矢印はリン酸化の、対照を越えての顕
著な増進を指示している。幾つかのスポットは写真撮影
の間に“失われる”。オードラジオグラムｆへの插入図
は、より低い濃度（１００ｎＭ）のＯＡで処理した細胞
に由来する核／細胞骨格抽出物におけるｈｓｐ複合体の
リン酸化の増進を明示する。

【００２５】第２図に、ＴＮＦ（５０単位／ｍｌ）、Ｉ
Ｌ−１（５０単位／ｍｌ）、または図中に記した濃度の
ＯＡ（オカダン酸）で１５分間処理したヒト線維芽細胞
の細胞質ゾル抽出物によるキャップ構造認識タンパク質
のリン酸化を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製し、
³²Ｐで標識したキャップ構造認識タンパク質（２７，０
００ｋＤａ）をコンピューター処理デンシトメーターで
定量し、相対リン酸化度について比較した。

【００２６】第３図に、オカダン酸またはＴＮＦによる
２７ｈｓｐ複合体の、用量に依存するリン酸化を示
す。［³²Ｐ］オルトリン酸塩（１ｍＣｉ／ｍｌ）で予め
標識したヒト線維芽細胞を様々な濃度のＯＡ、またはＴ
ＮＦと共にインキュベートした。細胞から細胞質ゾル画
分を得、この画分を二次元ゲル電気泳動に掛けた。第３
図のａは対照、ｂは８０ｎＭのＯＡで処理した場合、ｃ
は１６０ｎＭのＯＡで処理した場合、ｄは５０単位／ｍ
ｌのＴＮＦで処理した場合、ｅは３２０ｎＭのＯＡで処
理した場合である。

【００２７】第４図に、［³²Ｐ］オルトリン酸塩（１ｍ
Ｃｉ／ｍｌ）で予め標識したヒト線維芽細胞の細胞質ゾ
ル画分の２７ｈｓｐ複合体のオカダン酸によるリン酸
化の経時変化を示す。上記線維芽細胞を２００ｎＭのオ
カダン酸で０分間（ａ）、５分間（ｂ）、１５分間
（ｃ）または３０分間（ｄ）処理した。線維芽細胞から
細胞質ゾル画分を得、この画分を二次元ゲル電気泳動に
よって分析した。

【００２８】第５図に、アゴニストで処理した細胞にお
けるＥＧＦ−Ｒのリン酸化、即ちＥＧＦ−ＲのＴＮＦ、
ＩＬ−１、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ（図中ＰＧＦと表記）及び
オカダン酸（ＯＡ）によるリン酸化を示す。³²Ｐで標識
した線維芽細胞培養物を、ＴＮＦ（１００単位／ｍ
ｌ）、ＩＬ−１（１００単位／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎ
ｇ／ｍｌ）、ＰＤＧＦ（３２ｎｇ／ｍｌ）またはＯＡ
（２５０ｎＭ）で１５分間処理した。対照は“０”と表
記する。ＥＧＦ−Ｒを抗ＥＧＦ−Ｒ抗体（Ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｈａｓｓｅｔ，Ｎ．
Ｙ．，ＵＳ）で免疫沈降させた。得られたタンパク質
を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィ
ーに掛けた。

【００２９】第６図に、ＴＮＦまたはオカダン酸で処理
した後の線維芽細胞におけるｃｄｃ２キナーゼ基質のリ
ン酸化を示す。ｃ−ａｂｌ（図上部）またはｐ５３（下
部）のリン酸化の測定では、細胞を５０単位／ｍｌのＴ
ＮＦまたは１００ｎＭのＯＡで図中に記した時間だけ処
理した。ＲＢ（図中央部）のリン酸化の測定では、細胞
を図中に記した用量のＴＮＦ（単位／ｍｌ）またはＯＡ
（ｎＭ）で１５分間処理した。細胞溶解物に、ｃ−ａｂ
ｌ、ＲＢまたはｐ５３に対する抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を添加して免疫沈降を実現した。
免疫沈降したタンパク質を、６％または１０％ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーに掛けた。図中央
部で、５００ｎＭのＯＡで処理した場合に１００ｎＭの
ＯＡで処理した場合より小規模のＲＢリン酸化しか観察
されないのは、５００ｎＭのＯＡで処理した試料タンパ
ク質を１００ｎＭのＯＡで処理した試料タンパク質より
約４倍少ない量でしかゲルに添加しないためであること
に留意されたい。上記いずれのＯＡ濃度においても、Ｒ
Ｂの高リン酸化形態の方が低リン酸化形態より高比率と
なる。

【００３０】第７図に、ＴＮＦ及びオカダン酸（ＯＡ）
がＥｇｒ−１、ｃ−ｊｕｎ及びＩＬ−６遺伝子の発現に
及ぼす影響のノザン法分析を示す。静止状態のヒト線維
芽細胞を５００単位／ｍｌのＴＮＦ（ａ）または５００
ｎＭのＯＡ（ｂ）と共に０分間、３０分間及び６０分間
インキュベートし、その後全細胞ＲＮＡを抽出した。イ
ンキュベートした細胞から抽出したＲＮＡのブロット
と、放射性物質で標識した（１０⁶ｃｐｍ／ｍｌ）Ｅｇ
ｒ−１ｃＤＮＡプローブとをハイブリダイズした。図
中ｃに、ｂのブロットからプローブを除き、ｃ−ｊｕｎ
ｃＤＮＡをプローブとした場合を示す。Ｅｇｒ−１
ｍＲＮＡプローブはブロットから完全には除かれなかっ
たことに留意されたい。ブロットのオートラジオグラム
が示してある。図中ｄには、通常に維持した細胞を単独
で（対照、時間０）か、またはＯＡと共に１時間、３時
間、５時間または７時間インキュベートし、かつＩＬ−
６ｃＤＮＡプローブ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，ＭＤ，ＵＳ）を用いてノザン法分析を行なった
結果を示す。

【００３１】第８図に、オカダン酸によって誘導された
Ｅｇｒ−１遺伝子のノザン法分析を示す。１０μｇのＲ
ＮＡを各レーンにアプライし、このＲＮＡにＥｇｒ−１
特異的ｃＤＮＡプローブ［１．６ｋｂのＢｇｌＩＩ断片
（Ｓｕｋｈａｔｍｅｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ５３，
３７−４８，１９８８）］を用いてノザン法分析を
施した。同じブロットを、使用ＲＮＡの量を規格化する
べくアクチンまたはＧＡＤＰＨｃＤＮＡで再度ハイブ
リダイズした。ブロットを乾燥し、オートラジオグラフ
ィーに掛けた。

【００３２】第８図のＡに、一次ヒト線維芽細胞におけ
るオカダン酸誘導Ｅｇｒ−１及びｃ−ｊｕｎメッセージ
の経時変化を示す。静止状態のヒト線維芽細胞を１μＭ
のオカダン酸で、図中に記した時間だけ処理した。上記
細胞を０．１％ＤＭＳＯでも処理して対照とした。図
中央部に、得られたブロットのプラスミドｐＣＭＶ−ｊ
ｕｎ（Ｒａｕｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ．２，１６８７−１６９９，１９８８）
でのハイブリダイゼーションを示す。

【００３３】第８図のＢに、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞
におけるオカダン酸誘導Ｅｇｒ−１メッセージの経時変
化を示す。静止状態のＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞をオカ
ダン酸（０．５μＭ）で、図中に記した時間だけ処理し
た。

【００３４】第８図のＣに、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞
でのオカダン酸によるＥｇｒ−１メッセージ誘導がオカ
ダン酸の濃度に依存する様子を示す。静止状態のＢａｌ
ｂ／ｃ３Ｔ３細胞を、図中に記した濃度のオカダン酸
で１時間処理した。対照には様々な濃度のＤＭＳＯを添
加した。これらの対照は、０．２５μＭのオカダン酸中
に存在する量（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．
０２５％）、０．５μＭのオカダン酸中に存在する量
（ＤＭＳＯ０．０５％）及び１μＭのオカダン酸中に
存在する量（ＤＭＳＯ０．１％）に対応した。

【００３５】第８図のＤに、カリキュリンＡによるＥｇ
ｒ−１メッセージ誘導がカリキュリンＡの濃度に依存す
る様子、及び該誘導の経時変化を示す。静止状態のＢａ
ｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞を様々な濃度のカリキュリンＡで
１時間処理した。カリキュリンＡによるこの用量依存性
誘導のノザン法分析を、図中左手に示す。同様に、静止
状態のＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞を１５ｎＭのカリキュ
リンＡで０．５時間、１時間、１．５時間及び３時間処
理した。上記様々な時間にわたり実現したカリキュリン
Ａによる誘導のノザン法分析を、図中右手に示す。同じ
ブロットを、図中央部に示したようにｐＣＭＶ−ｆｏｓ
（Ｃｕｒｒａｎｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
２，７９−８４，１９８７）及びｐＣＭＶ−ｊｕｎ
（Ｒａｕｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，１９８８）で再
度ハイブリダイズした。ブロットを乾燥し、オートラジ
オグラフィーに掛けた。

【００３６】第９図は、核の経時分析結果を示す。核
は、実施例２の「実験方法」に記載された条件の下で、
静止状態（０時間）及びオカダン酸（0.5μＭ）-処理し
たBalb/c 3T3細胞から単離した。記載のプラスミドを含
むナイロンマトリックスを、invitroで転写したＲＮＡ
でハイブリダイスし、次いでオートラジオグラフ分析し
た。対照の細胞もDMSO 0.05%を含むDMEMで処理し、これ
らの細胞由来のＲＮＡも転写し、記載の種々のプラスミ
ドにハイブリダイズした。

【００３７】第１０図は、オカダン酸によるEgr-１ｍ
ＲＮＡの安定化を示す。

【００３８】（Ａ）．静止状態のBalb/c 3T3細胞を、各
々オカダン酸0.5μＭまたは20%血清で、３時間または0.
5時間インキュベートした。アクチノマイシンＤ（終濃
度25μg/ml）を添加した。次いでアクチノマイシンＤを
添加後、細胞を0.5、１、1.5、２及び３時間で収集し
た。ＲＮＡをこれらの細胞から単離し、ノザン法（Nort
hern blot）で分析した。ブロットをEgr-１またはGADPH
ｃＤＮＡでプローブした。

【００３９】第１１図は、オカダン酸処理したヒト線維
芽細胞中のEgr-１メッセージのスーパーインダクション
を示す。細胞をオカダン酸0.5μＭまたはシクロヘキシ
ミド10μg/ml並びに、オカダン酸0.5μＭ及びシクロヘ
キシミド10μg/mlで1.5、３または６時間インキュベー
トした。細胞を収集し、ＲＮＡを単離し、ノザン法で分
析した。ブロットをEgr-１またはアクチンｃＤＮＡでプ
ローブした。

【００４０】第１２図は、オカダン酸によるEgr-１ｍ
ＲＮＡの誘導に於けるプロテインキナーゼアクチベータ
ー及び阻害剤の効果を示す。

【００４１】（Ａ）．静止状態の一次ヒト線維芽細胞を
オカダン酸（OA）またはTPAで１または３時間インキュ
ベートした。OA及びTPAの濃度は、各々0.5μＭ及び120n
g/mlであった。使用した1-（5-イソキノリニルスルホニ
ル）-2-メチルピペラジン二塩酸塩（H7）及びN-（2-グ
アニジノエチル）-5-イソキノリンスルホンアミド二塩
酸塩（HA1004）の濃度は、25μＭであった。OAまたはTP
Aで１または３時間誘導する前に、細胞をH7またはHA100
4で15分前処理した。細胞を収集し、ＲＮＡを単離し、
ノザン法で分析した。ブロットをEgr-１またはGADPH ｃ
ＤＮＡでプローブした。

【００４２】（Ｂ）．正の対照として、一次ヒト線維芽
細胞をTPA（30ng/ml）で１時間処理した（第１のレー
ン）。TPAで１時間処理する前に、その線維芽細胞を、H
7（25μＭ）またはHA1004（25μＭ）で15分前処理もし
た（第２及び第３のレーン）。図は、この処理にかけた
細胞から単離したＲＮＡのノザン法分析結果を示す。ブ
ロットをEgr-１またはアクチンｃＤＮＡでプローブし
た。

【００４３】（Ｃ）．静止状態のBalb/c 3T3細胞をO
A、TPA若しくはdBt-cAMPで１時間インキュベートする
か、またはH7（25μＭ）若しくはHA1004（25μＭ）で前
処理し、次いで各アゴニストで１時間インキュベートし
た。細胞を収集し、ＲＮＡを単離し、ノザン法で分析し
た。使用した各アゴニスト濃度は以下の通りであった。

【００４４】レーンａ：0.5μＭ OA，レーンｂ：100ng/ml TPA，レーンｃ：１mＭ dBt-cAMP，レーンｄ：H7 ＋ OA（0.5μＭ），レーンｅ：H7 ＋ TPA（100ng/ml），レーンｆ：H7 ＋ dBt-cAMP（１mＭ），レーンｇ：HA1004 ＋ OA（0.5μＭ），レーンｈ：HA1004 ＋ TPA（100ng/ml），レーンｉ：HA1004 ＋ dBt-cAMP（１mＭ）．ブロットをEgr-１またはGADPH ｃＤＮＡでプローブし
た。

【００４５】第１３図は、オカダン酸で誘導した一次ヒ
ト線維芽細胞由来のEgr-１タンパク質のウエスタン法分
析を示す。静止状態の一次ヒト線維芽細胞を、オカダン
酸0.5μＭ含むMEMで記載の時間、インキュベートした。
正の対照として、静止細胞を、また20%ウシ胎児血清を
含む培地で２時間インキュベートした。全細胞性タンパ
ク質を抽出し、前述の如くウエスタン法にかけた（Cao
ら、Mol．Cell．Biol．10，1931-1939，1989）。ブロッ
トを抗-Egr-１ポリクロナール抗体（R5232）と反応させ
た。

【００４６】第１４図は、Balb/c 3T3細胞由来の
［³²Ｐ］-標識したEgr-１タンパク質の免疫沈降反応を
示す。

【００４７】（Ａ）．静止状態のBalb/c 3T3細胞を［³²
Ｐ］-オルトリン酸塩で標識し、次いで実施例２の「実
験方法」で記載の如く、20%ウシ胎児血清またはオカダ
ン酸（0.5μＭ）で２時間インキュベートした。Egr-１
タンパク質を抗-Egr-１抗体（R5232）で免疫沈降させ、
次いで7.5% SDS-PAGEにかけた。乾燥したSDSゲルをオー
トラジオグラフにかけた。レーンＣ、Ｓ及びＯＡは、各
々静止細胞、血清及びオカダン酸処理した細胞から誘導
した免疫沈降させたタンパク質を示す。

【００４８】（Ｂ）．オカダン酸処理した［³²Ｐ］-標
識したBalb/c 3T3細胞由来の免疫沈降させたEgr-１タン
パク質を、前述の如く二次元ゲル電気泳動にもかけた
（Guyら、J．Biol．Chem．266，14343-14352，1991）。
対照の静止状態の［³²Ｐ］-標識した細胞から免疫沈降
させたタンパク質を使用して分析を同時に繰り返した。
ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフ分析した。２つの
オートラジオグラフは互いに重なった。点線で囲んだ丸
の部分は、対照静止細胞から誘導した弱くリン酸化した
Egr-１タンパク質の位置を示す。

【００４９】

【実施例】実施例１実験方法細胞培養及び試薬ヒト２倍体線維芽細胞、FS-4、2343
は、J.Vilcek博士（New York大学）より進呈されたもの
である。これらを組織培養フラスコ内で増殖させ、本明
細書中、通常培地と呼称する、10%ウシ胎児血清（Hyclo
ne，Logan，UT，US）を補った最小必須培地（MEM）で保
持した。ヒトWISH細胞は、American Type Culture Coll
ectionから購入した。各々、２×10⁷ユニット及び１×10
⁸ユニット/mgタンパク質の比活性で、純度99%以上の組
換体ヒトTNF及びIL-１は、Genzyme Corp.（Cambridge，
MA，US）より購入した。ホルボール12-ミリステート13-
アセテート、ブラジキニン、フォルスコリン（forskoli
n）、ジブチリル-環状AMP（dBt-cAMP）及びFGFは、Sigm
a社から、オカダン酸はBiomol（Plymouth Meeting，P
A，US）から購入した。放射性［³²Ｐ］Ｐは、Du Pont-N
ew England Nuclear製であった。組換体ヒトα及びγイ
ンターフェロンは、Schering Corp．（Bloomfield，N
J，US）のPaul Trotts博士及びW．Berthhold博士（Karl
Thomae GmbH，Biberach，ドイツ）から進呈されたもの
である。これらのインターフェロンの純度は、99%以上
である。

【００５０】細胞及び細胞リシスの放射性標識
［³²Ｐ］オルトリン酸塩で細胞を標識するために、細胞
を90mmプラスチック製組織培地皿上に広げ、３日間イン
キュベートすると融合した。標識直前に培地を除去し、
細胞をリン酸塩及び血清を含まない培地（150mＭ NaC
l，5mＭ MgCl₂，5mＭ KCl，1.6mＭ CaCl₂，0.5% グルコ
ース，10mＭ Tris，0.1% ウシ血清アルブミン，pH7.4）
5mlで２回洗浄した。これは、各プレート皿に上記と同
一培地３ml中の１mCi/mlの［³²Ｐ］リン酸塩を添加する
前に行った。オカダン酸または他のアゴニストを図及び
表に示した濃度及び時間で添加する前に、プレートを湿
らせたCO₂インキュベーター内で37℃で２時間インキュ
ベートした。アゴニストを水性緩衝溶液またはジメチル
スルホキシド中で再構成した。培地だけの中で、緩衝液
またはジメチルスルホキシドで実施した適切な対照は、
得られたオートラジオグラフではっきりした違いを示さ
なかった。標識完了時に培地を除去し、細胞質ゲル抽出
緩衝液（10mM Tris-HCl，50mM EDTA，50mM NaCl，30mM
リン酸ナトリウム，50mM NaF，100μＭ Na₃VO₄，0.65%
Nonidet P-40，２mM ロイペプチン，２mM フッ化フェニ
ルメチルスルホニル，pH 7.4）200μl中に細胞を溶解さ
せる前に、その細胞を氷冷したリン酸塩-緩衝させた生
理的食塩水で迅速に２回洗浄した。その溶解物を収集
し、14,000rpmで５分間遠心分離した。核画分（細胞骨
格-膜画分を含む）を含むペレットを細胞質ゾル画分か
ら分離した。両方の画分を凍結乾燥した。

【００５１】二次元ゲル電気泳動凍結乾燥した画分
（各約12μg）を、Millipore Investigator 二次元電気
泳動システム（Millipore）を使用して、pH３〜10の電
界質で18,000 V/hで等電点電気泳動にかけた。この後、
一次元のゲルを成形し、二次元12.5% SDS-ポリアクリル
アミドゲル上に充填する前に２分間SDS緩衝液で平衡さ
せた。ゲルを固定し、乾燥させ、³²Ｐ-標識したポリペ
プチドの位置を、−80℃で増感板を使用してオートラジ
オグラフにより調べた。pHプロフィールを測定するため
に、カルバミル化した標準タンパク質（Pharmacia LKB
Biotechnology Inc.）をうり二つのゲル上で同時に泳動
し、予め目盛りをつけてあるサンプル上で既知pIのタン
パク質と関連づけた。Sigma製の分子量マーカータンパ
ク質をクーマシーブルー（Coomassie Blue）で染色する
ことにより検出し、オートラジオグラフ上でマークし
た。ヒト線維芽細胞を43℃30分、熱ショックさせて製造
した³²Ｐ-標識した27 hsp複合体もマーカーとして使用
した。

【００５２】タンパク質の定量検出リン酸化タンパク質を等量含む細胞質ゾル膜からまた
は抗体-沈澱させた調製物から誘導したオートラジオグ
ラフ上のタンパク質リン酸化量を、Visage 2000イメー
ジ分析システム（BioImage Products，Ann Arbor，MI，
US）を用いてコンピュータ制御したデンシトメトリーに
より分析した。

【００５３】ＲＮＡの調製及びノザン法ヒト線維芽細
胞（４×10⁶）を、175cm²組織培地フラスコに撒き、通
常培地中37℃で６時間インキュベートした。細胞を通常
培地で３日育てた。６日目に、培地を0.25%ウシ胎児血
清を含む最小必須培地と置き換え、さらに48時間インキ
ュベートし静止状態に細胞を保持した。静止状態または
通常状態に保持された細胞を、記載の時間（第７図参
照）だけ特定のアゴニストで処理した。細胞を収集し、
１段階グアジニウムチオシアネート/フェノール/クロロ
フォルム法により全細胞質ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを
6.5%ホルムアルデヒドを含む1.3%アガロースゲルを介し
て電気泳動にかけ、次いでHybond-N膜（Amersham，Buck
inghamshire，UK）にトランスブロットした。ブロット
をUV架橋し、0.5Ｍリン酸塩緩衝液、pH7.2、7% SDS、
１% ウシ胎児血清アルブミン及び１mＭ EDTAを含む溶液
中でハイブリダイズした。ＤＮＡ鋳型上でのランダムプ
ライミングにより生じた³²Ｐ-標識したプローブ（終濃
度２×10⁶cpm/ml）を用いて、65℃18時間ハイブリッド
形成が行われた。Egr-１ cＤＮＡのヌクレオチド302-19
58に対応する1.6kbのBglIIフラグメントを、ハイブリッ
ド形成に使用した。なお、IL-6 cＤＮＡプローブはAmer
ican Type Culuture Collection（Rockville，MD，US）
より入手し、c-jun cＤＮＡプローブは、本出願人の大
学のD．Carter博士より入手したものである。得られた
膜をＸ線フィルムに−85℃で14時間〜７日暴露し、β-
アクチンプローブで再びハイブリダイズした。ブロット
をオートラジオグラフィにかけ、Visage 2000イメージ
システム（BioImage Products，Ann Arbor，MI，US）に
より定量した。

【００５４】結果オカダン酸、TNFまたは他のアゴニストで処理した細胞
中の細胞タンパク質の初期リン酸化の変化上記³²Ｐ-標識したタンパク質スポットを再溶解し、³²
Ｐ-標識したヒト線維芽細胞から調製した細胞質ゾル抽
出物の高鮮明度二次元ゲル電気泳動のオートラジオグラ
フィーにより検出した。その放射能性のスポット（各々
は１つ以上のリンタンパク質を示す）を、コンピュータ
制御したデンシトメトリーにより分析した。各スポット
は、恣意的に番号付けした。さらに、アゴニストで予め
処理した細胞の抽出物から誘導した各再溶解スポットの
強度は、アゴニストを使用しなかった場合のリン酸化の
基本レベルを基準として表される。リン酸化のレベルの
これらの変化は、コンピュータ制御したデンシトメトリ
ー分析中の幾つかの内部標準と匹敵する。TNF（50ユニ
ット/ml）またはオカダン酸（200ｎＭ）で15分間処理し
た細胞から調製した細胞質ゾルまたは核/細胞骨格膜画
分から誘導した、³²Ｐ-標識したリンタンパク質の二次
元ゲル分析のオートラジオグラフィーの典型例は、第１
図に示されている。リガンド活性化細胞中のタンパク質
リン酸化に対する顕著な変化が示されている（矢印）。
細胞質ゲル画分中では、オカダン酸は、TNF（第１図,ｂ
及びｃ）と同様な初期タンパク質リン酸化変化を誘導し
た（約95%で一致）。IL-１により誘導されたリン酸化パ
ターンは、第１図には示されていない。オカダン酸は、
TNF処理とほぼ同様に、核/細胞骨格膜画分中の46−50タ
ンパク質のタンパク質リン酸化中の変化（コンピュータ
制御したデンシトメトリーにより識別されるように）も
誘導した（第１図、ｅ及びｆ）。細胞質ゾルのタンパク
質リン酸化の変化の概要は第１表に列挙されており、TN
F、オカダン酸、TPAまたはこれらのリガンドの組み合わ
せにより15分間活性化されたヒト線維芽細胞から誘導し
たこれらの画分に於けるタンパク質リン酸化の変化の複
合パターンを示している。多くの実験に於いて使用した
オカダン酸は、リガンド処理（第１表）の最初の15分間
に於ける、細胞質ゲル画分中の６つのタンパク質の脱リ
ン酸化の変化及び約60の初期リン酸化の変化を誘導する
場合のTNFに酷似することが示されている（第１表）。
線維芽細胞の処理に於けるオカダン酸（200ｎＭ）とTNF
（50ユニット/ml）との最適投与量の組み合わせは、こ
れらの変化（第１表）に付加的効果も相乗効果も生み出
さない。ヒト線維芽細胞のTPA（プロテインキナーゼＣ
の活性剤）処理は、オカダン酸またはTNFにより生じた
ものとはかなり異なったリン酸化変化のパターンを生じ
た（第１表）。TPAと、オカダン酸またはTNFとの組み合
わせでは、各アゴニストにより生じた相補変化の合計を
表すリン酸化変化パターンを生じた（第１表）。これら
の結果は、オカダン酸及びTNFは、プロテインキナーゼ
ＣのTPA-誘導活性とは異る、共通経路を介するタンパク
質リン酸化の初期変化を生じることを示している。同様
に、ブラジキニン、cAMPアゴニスト、EGFまたはIFN-α
により処理した細胞中で誘導したタンパク質リン酸化パ
ターンは、オカダン酸またはTNF/IL-1により誘導したも
のとは異なっている（データは示されていない）。さら
に、ヒト線維芽細胞のIFN-γによる処理では、初期タン
パク質リン酸化の測定し得る変化を生じなかった。

【００５５】初期リン酸化変化を経る細胞質ゾル画分中
の約66タンパク質及び核/細胞骨格膜画分中の46−50タ
ンパク質の一群は、マーカータンパク質によりまたはそ
の分子量及び等電点によりここに同定された。これら
は、27 hsp複合体（第１表中、165、172及び176として
識別される）、stathmin（第１図、ｂ及びｃ中のS［2
7］）、小核素（第１図、３及びｆ中のN［28］）及びミ
オシンライト鎖（第１図、ｅ及びｆ中のMLC）を含む。
これらのタンパク質のリン酸化は、TNF（第１図、ｂ及
びｅ）、オカダン酸（第１図、ｃ及びｆ）またはIL-１
（示されていない）により活性化された細胞中で調和し
て促進される。

【００５６】オカダン酸-処理したヒト線維芽細胞からT
NF及びIL-１に対する前述の方法（Guyら,1991）によりe
IF-4Eを単離するためにｍ⁷GTP-セファロースを用いる別
個の実験に於いて、オカダン酸はまたこのタンパク質の
リン酸化を15分後に２〜３倍促進させた（第２図）。細
胞のオカダン酸処理をWISH細胞に拡張すると、再びTNF
と殆ど同一の初期タンパク質リン酸化の変化を生じた
（示されていない）。これは、オカダン酸によるTNFシ
グナル形質導入の初期の結果の擬似性が一次ヒト線維芽
細胞に制限されていないことを示している。第１図及び
第１表に示されているタンパク質リン酸化に対しTNFま
たはIL-１が誘導した変化は、リガンド処理15分後に測
定されるが、これらの変化は３分以内で検出可能であ
り、基本レベルに45−60分で戻る前に約15分の時に最大
であったことは重要である。45−60分では既に、TNFま
たはIL-１により誘導したリン酸化の変化の大部分は、
もはや測定可能でない。

【００５７】27 hsp複合体のリン酸化のオカダン酸誘導
変化の用量-反応及び時間経過 27 hsp複合体は、オカダン酸及びTNFにより誘導したリ
ン酸化変化に最も感応性である（第１図）。27 hsp複合
体のリン酸化の変化に於けるオカダン酸の濃度依存効果
を測定し、TNF 50ユニット/mlで処理した細胞に於ける
変化と比較した（第３図）。この比較から、TNF 50ユニ
ット/mlで15分間細胞処理すると、オカダン酸 160〜320
ｎＭで15分間細胞処理したのと同様に27 hsp複合体のリ
ン酸化が増加することが明らかである（第３図、ｃ〜
ｅ）。

【００５８】27 hsp複合体のタンパク質リン酸化を、20
0 ｎＭオカダン酸で0、5、15及び30分間処理した細胞で
測定した。この測定から、オカダン酸処理の時間が増加
すると、27 hspのリン酸化も比例して増加することが知
見される（第４図、ａ〜ｄ）。オカダン酸で30分間処理
後、27 hsp複合体は過リン酸化された。

【００５９】IL-１、TNFまたはオカダン酸処理による、
EGFレセプターのリン酸化の刺激化 TNF及びIL-１作用の一態様としては、リン酸化を経るEG
FRのトランスモジュレーションがある。TNF及びIL-１の
この効果に擬似し得るオカダン酸の効果が知見されるか
どうか、オカダン酸をヒト線維芽細胞に添加した。³²Ｐ
-標識したヒト線維芽細胞を、リガンド（TNF、IL-１、E
GF、PDGFまたはオカダン酸）で15分間処理し、分析用に
抽出した。抽出物を抗-EGFR抗体で免疫沈降させた。種
々に処理した線維芽細胞から誘導した免疫沈降させたEG
FRを、SDS-PAGE及びオートラジオグラフィーで分析し
た。オカダン酸は、EGFRのリン酸化をかなり刺激し、TN
F、IL-１、EGFまたはPDGFの刺激以上であった（第５
図）。

【００６０】IL-１、TNFまたはオカダン酸で処理した細
胞中のcdc2 キナーゼ基質のリン酸化第１図（ｅ及びｆ）には、TNF及びオカダン酸処理によ
りミオシンライト鎖及び小核素のリン酸化が促進される
ことが示唆されている。両方のタンパク質は、cdc2 キ
ナーゼの基質として公知である。これに関連して、オカ
ダン酸処理によりリン酸化されると公知の他のcdc2キナ
ーゼ基質も、TNF−処理したヒト線維芽細胞中で作用さ
れるのかどうかという問題が出てくる。cdc2 キナー
ゼ、即ちc-abl、RB及びp53に対して３つの基質を試験し
た。オカダン酸と同じく、TNFはヒト線維芽細胞に於け
る全部で３つのcdc2キナーゼ基質のリン酸化を誘導し
た。オカダン酸またはTNFは、c-abl、RB及びp53のリン
酸化を促進した（第６図）。この結果は、RBタンパク質
が２つの形態［即ち１つは他方（110 kDa）よりやや高
分子量（115 kDa）］で発見されたことも示している。1
15-kDaタンパク質は過リン酸化RBタンパク質と同様であ
るが、110-kDaタンパク質は過少リン酸化形態を表して
いる。オカダン酸処理した細胞と同様に、TNFは、過リ
ン酸化RBタンパク質に対するRBの過少リン酸化形態の比
を増加させる（第６図）。同様に、p53タンパク質は２
つの非常に関連した形態で存在し、やや高分子量の種
は、やや低い分子量の種以上により多くリン酸化されて
いる。TNF-処理した細胞と同様に、オカダン酸処理した
線維芽細胞は、これらのタンパク質の少なくリン酸化さ
れたものよりも３〜５倍以上多い量の過リン酸化された
RB及びp53タンパク質を示した。

【００６１】TNF及びオカダン酸によるEgr-１、c-jun及
びIL-6の誘導オカダン酸-、TNF-、及びIL-１で処理した線維芽細胞の
細胞質ゾル及び核/細胞骨格膜画分中に於けるタンパク
質リン酸化の初期変化を示してきたが、本出願人は、１
つの遺伝子発現に於けるオカダン酸の効果について研究
した。TNFは、一次ヒト線維芽細胞に於ける８種の遺伝
子を誘導することが公知である。近年、本出願人は、TN
Fに応答する一次ヒト線維芽細胞中、ごく初期の応答遺
伝子（immediate early response gene）、即ちEgr-１
遺伝子の誘導を知見した。選択されたオカダン遺伝子に
より発現を誘導し得る３種のTNF/IL-１遺伝子は、Egr-
１、c-jun及びIL-6であった。TNFと同様に、オカダン酸
は効果的に総ての遺伝子を誘導し、Egr-１はオカダン酸
処理30分以内で迅速に誘導され、c-junは60分以内で誘
導されたが、IL-6はオカダン酸処理７時間後よりずっと
後で誘導された（第７図）。実施例２実験方法細胞培養及び試薬ヒト二倍体包皮線維芽細胞はＤｒ．ＪＶｉｌｃｅｋ
（ニューヨーク大学、ニューヨーク）からの寄贈であっ
た。この細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＭＥＭ
（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳ）中で増殖
させた。マウスＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞はＡｍｅｒｉ
ｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎから購入し、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベ
ッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。オカダン酸、
カリキュリンＡ、Ｈ７、及びＨＡ１００４はＢｉｏｍｏ
ｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐ
ｌｙｍｏｕｔｈＭｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳ）から購
入した。ＴＰＡ、ピューロマイシン及びｄＢｔ−ｃＡＭ
ＰはＳｉｇｍａ（ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ）から
購入し、オカダン酸またはカリキュリンＡの１ｍＭ保存
液をＤＭＳＯ中に溶解した。［³²Ｐ］オルトリン酸及び
他の放射性化学物質はＤｕＰｏｎｔ−ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｎｄＮｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購
入した。

【００６２】ＲＮＡの調製及びノザン解析Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎児血清を補
充したＤＭＥＭ中でほぼ集密になるまで増殖させた。次
いで細胞を、血清を含まないＤＭＥＭ中に４８時間維持
してから、記載のアゴニストを用いて記載の時間だけ処
理した。同様にヒト線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清
を補充したＭＥＭ中に維持した。ほぼ集密のヒト線維芽
細胞を、０．２５％ウシ胎児血清を補充したＭＥＭ中に
２日間維持してから、アゴニストを用いて処理した。細
胞を回収し、細胞質ＲＮＡ全部を単離し、既に記載され
ているようなノザン分析（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉｅ
ｔａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−
１５９，１９８７）をこれに実施した。ブロットをオー
トラジオグラフィー処理し、Ｖｉｓａｇｅ２０００
ＩｍａｇｅＳｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＩｍａｇｅＰｒｏ
ｄｕｃｔｓ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳ）によっ
て定量化した。

【００６３】転写の核ランオン（ｒｕｎ−ｏｎ）分析既に報告されており（Ｍａｒｚｌｕｆｆ，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９，３１７−３３１，１９
７８）且つ最近改良された（Ｍｕｒｐｈｙｅｔａ
ｌ，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４，１０５１−１
０５９，１９９０）方法に従って静止状態の（ｑｕｉｅ
ｓｃｅｎｔ）またはオカダン酸処理したＢａｌｂ／ｃ
３Ｔ３細胞から核を単離した。即ち、１７５ｃｍ²プラ
スチック組織培養フラスコ中で増殖した線維芽細胞の単
層を約１００ｍｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２回洗
浄した。洗浄した細胞を氷上の冷たい（１０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ，１０ｍＭＮａＣｌ，３ｍＭＭｇＣｌ₂，
０．５％ＮＰ４０及び５０単位／ｍｌヒト胎盤リボヌ
クレアーゼインヒビターを含む）ＮＰ−４０溶解緩衝液
ｐＨ７．０，４ｍｌ中に５分間で溶解し、５００×ｇで
５分間遠心分離した。核ペレットを、（５０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ，５ｍＭＭｇＣｌ₂，４０％グリセロール及び
５００単位／ｍｌヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビ
ターを含む）グリセロール保存緩衝液ｐＨ７．９，１０
０μｌ中に再度懸濁し、−８０℃で凍結した。

【００６４】ｉｎｖｉｔｒｏ転写反応のために、１０
０μｌの核を氷上で溶かし、２０μｌの１０倍反応緩衝
液（１．５ＭＮａＣｌ，２５ｍＭＭｇＣｌ₂，５０
ｍＭ酢酸マグネシウム，１０ｍＭＭｎＣｌ₂，２０ｍ
ＭＤＴＴ，１．２５ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭＡＴＰ，
５ｍＭＧＴＰ，５ｍＭＣＴＰ，２０ｍＭクレアチ
ンリン酸，３０単位／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ
及び５ｍｇ／ｍｌヘパリン）、ヌクレオチド５’−ジホ
スフェートキナーゼ（終濃度１２単位／ｍｌ）、ＲＮＡ
ｓｅインヒビター（終濃度５００単位／ｍｌ）及び２５
０μＣｉの［³²Ｐ］ＵＴＰと一緒に即座にインキュベー
トした。次いで水を加えて最終容積２００μｌとした。

【００６５】３０℃で１時間インキュベートした後、バ
ナジルリボヌクレオシド複合体（終濃度２ｍＭ）を６０
０単位のＤＮＡｓｅＩと一緒に加え、３０℃で更に３
０分間インキュベートした。消化物を、０．１５ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、３７．５ｍＭＥＤＴＡ
及び１．５％ＳＤＳを含む溶液中で２μｇのプロテイ
ナーゼＫと一緒に４２℃で３０分間インキュベートし
た。フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール
（２４：２４：１）で抽出することにより、インキュベ
ートした調製物からＲＮＡを単離し、抽出物を冷たいエ
タノールで沈澱させた。沈澱したＲＮＡを氷冷の０．２
ＭＮａＯＨ４５μｌ中に再度懸濁し、氷上で１０分
間インキュベートし、５μｌの２．４ＨＥＰＥＳで中
和した。ＲＮＡ溶液を、ＲＮａｓｅを含まない水で予め
平衡させておいたＮｉｃｋ（登録商標）カラム（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に通した。

【００６６】ｉｎｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡの放射能
を測定し、等量の未誘導細胞及びオカダン酸処理した細
胞由来の放射性ＲＮＡを使用し、スロットブロットアプ
リケーター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌ
ｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ，ＵＳ）によって予めナイロンマ
トリックスに塗布しておいた特定のプラスミド（５μ
ｇ）とハイブリダイズした。該プラスミドを含むナイロ
ンマトリックスは、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ
６．８）、７％ＳＤＳ及び１ｍＭＥＤＴＡ中で６５℃
で６時間前処理してから、［³²Ｐ］標識ＲＮＡとの４８
時間のハイブリダイズに使用した。ハイブリダイズした
フィルターをＸ線フィルムに１〜３日間暴露した。

【００６７】放射性標識細胞及び免疫沈降Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３マウス線維芽細胞を３５ｍｍ組織
培養皿中に播種し、ほぼ集密になるまで増殖させた。次
いで細胞を、ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ中に４８
時間維持し、静止状態（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｙ）に至ら
しめた。次いで培地を除去し、細胞を、リン酸及び血清
を含まない媒質（１５０ｎＭＮａＣｌ，５ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂，５ｍＭＫＣｌ，１．６ｍＭＣａＣｌ₂，０．
５％グルコース，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１
％ウシ血清アルブミン，ｐＨ７．４）５ｍｌで２回洗浄
した。次いで細胞を、０．５ｍＣｉ／ｍｌの［³²Ｐ］オ
ルトリン酸を含む同じ媒質２ｍｌ中で２時間インキュベ
ートした。

【００６８】オカダン酸またはカリキュリンＡをそれぞ
れ終濃度０．５μＭまたは２５ｎＭまで加え、更に２時
間インキュベートした。培地を除去し、細胞を氷冷のＰ
ＢＳ５ｍｌを用いて素早く２回洗浄してから、２００μ
ｌの抽出緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ
ＥＤＴＡ，５０ｍＭＮａＣｌ，３０ｍＭピロリン
酸ナトリウム，５０ｍＭＮａＦ，１００μＭＮａ₃
ＶＯ₄，０．６５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０，２ｍＭ
ロイペプチン，２ｍＭフェニル−メチルスルホニル
フッ素化物，ｐＨ７．４）中に溶解した。細胞溶解物
を、記載された方法（Ｃａｏｅｔａｌ，Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０，１９３１−１９３９，１９８
９）に従ってＥｇｒ−１に対するポリクローナル抗体
（Ｒ−５２３２）を用いて免疫沈降した。免疫沈降した
タンパク質を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び既に記
載されているような２次元ゲル電気泳動（Ｇｕｙｅｔ
ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１４３４３
−１４３５２，１９９１）によって分析した。

【００６９】結果オカダン酸及びカリキュリンＡによるマウス及びヒトＥ
ｇｒ−１ｍＲＮＡ誘導の速度及び用量依存度静止状態の一次ヒト線維芽細胞またはマウスＢａｌｂ／
ｃ３Ｔ３を、オカダン酸をそれぞれ１μＭまたは０．
５μＭ含むＭＥＭまたはＤＭＥＭと一緒に第８図Ａ及び
第８図Ｂに示した時間だけインキュベートした。これら
の細胞から単離したＲＮＡにノザンブロット分析を実施
した。第８図Ａ及び第８図Ｂの結果は、オカダン酸がヒ
ト及びマウス線維芽細胞両方において１時間以内にＥｇ
ｒ−１を急速に誘導することを示している。このｍＲＮ
Ａの誘導は約２時間で最大になり、Ｅｇｒ−１ｍＲＮ
Ａの濃度はかかるレベル（対照の３０〜４０倍）に最高
７時間維持される。誘導はオカダン酸の濃度に依存する
（第８図Ｃ）。まずオカダン酸をＤＭＳＯ中に溶解した
ため、上記実験に使用したＤＭＳＯの濃度は０．０５％
であった。０．０５％ＤＭＳＯを含むＭＥＭを用いた対
照実験は、オカダン酸によって誘導された量と比較にな
らないほど少量のＥｇｒ−１ｍＲＮＡを誘導した。更
に、ＤＭＳＯによるＥｇｒ−１ｍＲＮＡの誘導は用量
依存的ではない（第８図Ｃ）。

【００７０】オカダン酸と構造的に関連のない別の強力
なプロテインホスファターゼインヒビターであるカリキ
ュリンＡによるＥｇｒ−１ｍＲＮＡの誘導も試験し
た。カリキュリンＡはマウスＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３線維
芽細胞において、オカダン酸を用いて見られるのと同様
の速度でＥｇｒ−１ｍＲＮＡの発現を強力に誘導し、
この誘導は、カリキュリンＡの濃度と共に用量依存的に
最高２５ｎＭまで増大した（第８図Ｄ）。１０ｎＭのカ
リキュリンＡは１０００ｎＭのオカダン酸と同等のＥｇ
ｒ−１ｍＲＮＡの倍増をもたらし得るが故に（第８図
Ｃ及び第８図Ｄ）、カリキュリンＡはより強力なＥｇｒ
−１遺伝子の誘導物質であることは明らかである。第８
図Ｄに示したように、初期遺伝子（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ
ｅａｒｌｙｇｅｎｅ）ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎも
またカリキュリンＡによって誘導された。これらの遺伝
子も最近、オカダン酸によって誘導されると報告された
（Ｓｃｈｏｎｔａｈｌｅｔａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
６，４２３−４３０，１９９１；Ｔｈｅｖｅｎｉｎ
ｅｔａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，９３６
３−９３６６，１９９１）。

【００７１】オカダン酸によるＥｇｒ−１ｍＲＮＡ転
写の活性化静止状態のＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞を、０．５
μＭのオカダン酸を含むＤＭＥＭと一緒に第９図に示し
た時間だけインキュベートした。細胞を洗浄し、回収
し、核のランオン分析のために核フラクションを調製し
た。これらの分析の結果（第９図）は、単離された核中
でのＥｇｒ−１ｍＲＮＡの転写の速度を示す。細胞を
オカダン酸に暴露してから早くも０．５時間後に、新た
に転写されたＥｇｒ−１ｍＲＮＡが微量検出された。
１時間までに有意な量のＥｇｒ−１ｍＲＮＡが転写さ
れ、４時間までに最高に達した。新たに転写されたＥｇ
ｒ−１ｍＲＮＡの濃度は、オカダン酸処理の６時間後
に低下した（データは示さない）。ｃ−ｊｕｎのような
他の初期遺伝子及び関連遺伝子Ｅｇｒ−２及びＥｇｒ−
３もまた同様の速度で転写されるが、その転写量はＥｇ
ｒ−１遺伝子ほど多くない。ｃ−ｆｏｓ遺伝子も転写さ
れたが、比較的低いレベルであった。ｐＵＣ１８プラス
ミドを用いて実施した対照は放射性標識ｍＲＮＡとハイ
ブリダイズしなかった。この結果は、オカダン酸はマウ
スＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞においてＥｇｒ−１
ｍＲＮＡの転写を活性化することを示している。

【００７２】オカダン酸誘導Ｅｇｒ −１ｍＲＮＡ対血
清誘導Ｅｇｒ−１ｍＲＮＡの安定性静止状態のマウスＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３を、０．５μＭ
オカダン酸または１０％ウシ胎児血清のいずれかを含む
ＤＭＥＭと一緒に第１０図に示した時間だけインキュベ
ートした。オカダン酸または血清刺激した細胞にアクチ
ノマイシンＤの保存液を、第１０図に示した時間に、ア
クチノマイシンＤの終濃度が２５μｇ／ｍｌとなるよう
に加えた〔この濃度は、かかる線維芽細胞中でのＲＮＡ
合成を強力に阻害することが公知な濃度である（Ｓｃｈ
ｏｎｔｈａｌｅｔａｌ，１９９１〕。記載の時点で
細胞を回収し、ＲＮＡを抽出し、これにノザンブロット
分析を実施した（第１０図）。この結果は、細胞をアク
チノマイシンＤで処理して新たなＥｇｒ−１転写物の合
成をブロックすると、血清誘導のＥｇｒ−１ｍＲＮＡ
は細胞から速やかに消失するが、オカダン酸誘導Ｅｇｒ
−１ｍＲＮＡは安定のままであり、アクチノマイシン
Ｄ処理の５．５時間後まで細胞中で検出可能であること
を示している。Ｅｇｒ−１ｍＲＮＡの交代について
は、（第１０図におけるデータから計算して）血清誘導
Ｅｇｒ−１ｍＲＮＡにおいては約１２分間の半減期、
オカダン酸誘導Ｅｇｒ−１ｍＲＮＡにおいては約１２
０分間の半減期が推定される。

【００７３】オカダン酸誘導Ｅｇｒ −１遺伝子に及ぼす
タンパク質合成及びプロテインキナーゼインヒビターの
作用静止状態のヒト線維芽細胞を、シクロヘキシミド（１０
μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下に０．５μＭオカダ
ン酸を含むＭＥＭを用いて第１１図に示した時間だけ刺
激した。明らかにシクロヘキシミドは単独でＥｇｒ−１
ｍＲＮＡを誘導した。シクロヘキシミドで細胞を処理
すると、１．５及び３時間でオカダン酸によるＥｇｒ−
１ｍＲＮＡの誘導を増強した（第１１図）。シクロヘ
キシミドと同様にピューロマイシンも、オカダン酸によ
るＥｇｒ−１ｍＲＮＡの誘導を“強力に誘導”した
（データは示さない）。これらの結果は、細胞タンパク
質合成が阻害されても、オカダン酸によるＥｇｒ−１
ｍＲＮＡの誘導が起こり得ることを示している。しかし
ながら、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）及びプ
ロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）が細胞タンパ
ク質合成に関連する酵素を調節することから（Ｃｏｈｅ
ｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，４５３
−５０８，１９８９）、マウス及びヒト線維芽細胞にお
けるタンパク質合成に及ぼすオカダン酸の作用を測定し
た。本発明者らは、細胞を０．５μＭオカダン酸で処理
すると、最初の２時間で細胞タンパク質合成全体に及ぼ
す作用はわずかしか測定されないことを見い出した。し
かしながらかかる細胞において、４時間で最高５０％ま
でのタンパク質合成を一部阻害し始めた（データは示さ
ない）。このときまでにＥｇｒ−１ｍＲＮＡメッセー
ジは既に誘導されていた。このことから、プロテインホ
スファターゼインヒビター処理した細胞及び対照細胞由
来のＲ５２３２抗体によって免疫沈降した³⁵Ｓ−メチオ
ニン標識Ｅｇｒ−１タンパク質の量を比較した。実質的
に、オカダン酸またはカリキュリンＡで２時間処理した
細胞からのほうが、少量ではあるが検出可能な量のＥｇ
ｒ−１タンパク質を含む対照細胞からよりも多くの³⁵Ｓ
−メチオニン標識Ｅｇｒ−１タンパク質（４〜５倍多く
の量）が免疫沈降した（データは示さない）。このこと
は、オカダン酸またはカリキュリンＡ処理に応答しての
Ｅｇｒ−１タンパク質の新たな合成を示している。従っ
て、ホスファターゼインヒビターによるＥｇｒ−１遺伝
子の誘導は、細胞タンパク質合成に及ぼすそれらの阻害
効果が遅れることによって成立するのではないらしい。

【００７４】更に、静止状態のヒトまたはマウス線維芽
細胞を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）及びプロテイ
ンキナーゼＡ（ＰＫＡ）のインヒビター（Ｈ７）または
ＰＫＡの選択的インヒビター（ＨＡ１００４）の存在下
または不在下にオカダン酸またはＴＰＡで刺激した。こ
の実験の結果（第１２図）から、オカダン酸及びＴＰＡ
はヒト及びマウス線維芽細胞中でのＥｇｒ−１ｍＲＮ
Ａの発現を相乗作用的に誘導し、ＨＡ１００４ではなく
てＨ７は、Ｅｇｒ−１ｍＲＮＡの誘導をいずれかによ
って効果的にブロックしたことが判明し（第１２図Ａ、
第１２図Ｂ及び第１２図Ｃ）、このことは、Ｅｇｒ−１
遺伝子の誘導におけるプロテインキナーゼ及びホスファ
ターゼ両方の役割を示唆している。

【００７５】オカダン酸処理した一次ヒト線維芽細胞由
来のタンパク質のウェスタンブロット分析静止状態、オカダン酸処理及び血清処理したヒト線維芽
細胞から細胞タンパク質を抽出し、ウサギポリクローナ
ルＥｇｒ−１抗体を使用してウェスタンブロット分析を
実施した。対照の静止細胞においては、分子量８０ｋＤ
ａ及び１００ｋＤａを有する微量のＥｇｒ−１タンパク
質が検出された。血清刺激の２時間後の細胞中では約６
倍増の８０ｋＤａタンパク質が測定された。オカダン酸
処理した１時間後の細胞中では約２倍増の８０ｋＤａ
Ｅｇｒ−１タンパク質が検出された。しかしながらオカ
ダン処理の２．５時間後には、Ｅｇｒ−１タンパク質は
ほとんどが、８０ｋＤａタンパク質ではなくて１００ｋ
Ｄａ部分として検出された（第１３図）。更にこの１０
０ｋＤａＥｇｒ−１タンパク質の分子レベルは、対照
細胞中に見られた８０ｋＤａＥｇｒ−１タンパク質よ
りも約３〜４倍多く、このことは、オカダン酸処理に応
答したＥｇｒ−１の新規合成を示唆するものである。オ
カダン酸処理の６時間後までに、１００ｋＤａＥｇｒ
−１タンパク質の細胞レベルは低下した（第１３図）。
８０ｋＤａ形態は未リン酸化または低リン酸化Ｅｇｒ−
１タンパク質（Ｃａｏｅｔａｌ，１９８９）であ
り、１００ｋＤａ形態は高リン酸化Ｅｇｒ−１を表して
いる可能性がある。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞の抽出物由
来の免疫沈降［³²Ｐ］標識タンパク質の分析（次のセク
ションで記載する）はこの説明と一致する。

【００７６】オカダン酸処理したＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３
細胞から抽出された［ ³²Ｐ］標識Ｅｇｒ−１の免疫沈降静止状態のマウスＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞を［
³²Ｐ］−オルトリン酸と一緒に２時間インキュベート
し、０．５μＭオカダン酸または２０％ウシ胎児血清
を加え、細胞を更に２時間インキュベートした。細胞を
回収し、抽出し、Ｅｇｒ−１ウサギポリクローナル抗体
を用いて免疫沈降した。免疫沈降した³²Ｐ標識タンパク
質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び２次元ゲル電気泳動によっ
て分析した。これらのゲルを乾燥し、オートラジオグラ
フィー処理した（第１４図Ａ及び第１４図Ｂ）。

【００７７】第１４図Ａにおいてオートラジオグラフ
は、（分子量５４、約１００及び１３５ｋＤａを有す
る）少なくとも３種の主要なリン酸化タンパク質がオカ
ダン酸処理細胞から免疫沈降したことを示している。オ
カダン酸処理細胞において検出された約１００ｋＤａの
種（図１４ＡのレーンＯＡ）はＥｇｒ−１リンタンパク
質であるらしく、一方、約１３５ｋＤａの種は、抗原的
に関連のタンパク質またはＥｇｒ−１を伴なうタンパク
質であり得、約５４ｋＤａの腫は、分解したＥｇｒ−１
リンタンパク質であるらしい。時間のたった免疫沈降試
料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、約５４ｋＤａのリ
ンタンパク質の量が増加するに伴なって約１００ｋＤａ
のリンタンパク質が減少することが判明し（図示な
し）、約５４ｋＤａの種が分解産物であるという説明と
一致する知見が得られた。

【００７８】オカダン酸処理した細胞における約１００
ｋＤａＥｇｒ−１リンタンパク質の高い細胞濃度と比
較し、静止細胞由来の免疫沈降物において分子量８０〜
９０ｋＤａのＥｇｒ−１リンタンパク質は低レベルで検
出された（第１４図ＡのレーンＣ及びレーンＯＡを比
較）。２時間血清処理した細胞中ではＥｇｒ−１リンタ
ンパク質は認められなかった（第１４図Ａのレーン
Ｓ）。これに関係し、本発明者らは、Ｂａｌｂ／ｃ３
Ｔ３細胞を血清で処理した１時間後にはあったものの２
〜３時間後には消失したＥｇｒ−１リンタンパク質（８
０〜９０ｋＤａ）を検出した（Ｃａｏｅｔａｌ，１
９８９；Ｌｅｍａｉｒｅｅｔａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌＢｉｏｌ．１０，３４５６−３４６９，１９９
０）。このことは、Ｅｇｒ−１タンパク質は急速にリン
酸化されるが２時間血清刺激した後にはほとんどが脱リ
ン酸化されること、及び、オカダン酸処理した細胞中に
認められた約１００ｋＤａのＥｇｒ−１リンタンパク質
は恐らくＥｇｒ−１の高リン酸化形態であることを示し
ている。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３マウス線維芽細胞を２５
ｎＭのカリキュリンＡで処理しても同様の結果が認めら
れた（データは示さない）。

【００７９】対照細胞及びオカダン酸処理したＢａｌｂ
／ｃ３Ｔ３細胞由来の免疫沈降³²Ｐ標識リンタンパク
質もまた２次元ゲル電気泳動によって分析した。オカダ
ン酸細胞試料の２次元ゲル分析のオートラジオグラフを
静止細胞試料の２次元ゲル分析のオートラジオグラフ上
に重ね合わせ、この合成物を第１４図Ｂに示す。オカダ
ン酸処理した細胞由来のＥｇｒ−１免疫沈降リンタンパ
ク質は、分子量約１００ｋＤａを有し且つＥｇｒ−１タ
ンパク質が複数部位でリン酸化されているらしいことを
示すｐＨ４．６〜５．１の範囲の等電点を有するリンタ
ンパク質複合体として検出される。また、分子量８５ｋ
Ｄａ及びｐＩ５．１を有する静止対照細胞由来のＥｇｒ
−１リンタンパク質（第１４図Ｂにおける静止細胞から
誘導されたわずかではあるが検出可能なリンタンパク質
を示した破線の円を参照されたい）はかろうじて検出可
能であった。

【００８０】

【表１】

【００８１】

【表２】

【００８２】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図。ヒト線維芽細胞における早期タンパク
質リン酸化の、アゴニストによって惹起される変化の比
較を示す。

【図２】第２図。ＴＮＦ、ＩＬ−１及びＯＡで処理した
ヒト線維芽細胞の細胞質ゾル抽出物による相対リン酸化
度を示す。

【図３】第３図。オカダン酸またはＴＮＦによる２７ｈ
ｓｐ複合体の、用量に依存するリン酸化を示す。

【図４】第４図。ヒト線維芽細胞の細胞ゾル画分の２７
ｈｓｐ複合体のオカダン酸によるリン酸化の経時変化を
示す。

【図５】第５図。アゴニストで処理した細胞におけるＥ
ＧＦ−Ｒのリン酸化を示す。

【図６】第６図。ＴＮＦまたはオカダン酸で処理した後
の線維芽細胞におけるｃｄｃ２キナーゼ基質のリン酸化
を示す。

【図７】第７図。ＴＮＦ及びオカダン酸（ＯＡ）がＥｇ
ｒ−１、ｃ−ｊｕｎ及びＩＬ−６遺伝子の発現に及ぼす
影響のノザン法分析を示す。

【図８】第８図Ａ。一次ヒト線維芽細胞におけるオカダ
ン酸誘導Ｅｇｒ−１及びｃ−ｊｕｎメッセージの経時変
化を示す。

【図９】第８図Ｂ。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞における
オカダン酸誘導Ｅｇｒ−１メッセージの経時変化を示
す。

【図１０】第８図Ｃ。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞でのオ
カダン酸によるＥｇｒ−１メッセージ誘導がオカダン酸
の濃度に依存する様子を示す。

【図１１】第８図Ｄ。カリキュリンＡによるＥｇｒ−１
メッセージ誘導がカリキュリンＡの濃度に依存する様
子、及び該誘導の経時変化を示す。

【図１２】第９図。核の経時分析結果を示す。

【図１３】第１０図。オカダン酸によるＥｇｒ−１ｍ
ＲＮＡの安定化を示す。

【図１４】第１１図。オカダン酸処理したヒト線維芽細
胞中のＥｇｒ−１メッセージのスーパーインダクション
を示す。

【図１５】第１２図。オカダン酸によるＥｇｒ−１ｍ
ＲＮＡの誘導におけるプロテインキナーゼアクチベータ
ー及びインヒビターの効果を示す。

【図１６】第１３図。オカダン酸で誘導した一次ヒト線
維芽細胞由来のＥｇｒ−１タンパク質のウェスタン法分
析を示す。

【図１７】第１４図Ａ。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞由来
の［³²Ｐ］標識したＥｇｒ−１タンパク質の分析を示
す。

【図１８】第１４図Ｂ。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞由来
の［³²Ｐ］標識したＥｇｒ−１タンパク質の分析を示
す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年１月２６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図。ヒト繊維芽細胞における早期タンパ
ク質リン酸化の、アゴニストによって惹起される変化の
比較を示す電気泳動の写真である。

【図２】第２図。ＴＮＦ、ＩＬ−１及びＯＡで処理し
たヒト繊維芽細胞の細胞質ゾル抽出物による相対リン酸
化度を示す。

【図３】第３図。オカダン酸またはＴＮＦによる２７
ｈｓｐ複合体の、用量に依存するリン酸化を示す。

【図４】第４図。ヒト繊維芽細胞の細胞ゾル画分の２
７ｈｓｐ複合体のオカダン酸によるリン酸化の経時変化
を示す。

【図５】第５図。アゴニストで処理した細胞における
ＥＧＦ−Ｒのリン酸化を示す。

【図６】第６図。ＴＮＦまたはオカダン酸で処理した
後の繊維芽細胞におけるｃｄｃ２キナーゼ基質のリン酸
化を示す。

【図７】第７図。ＴＮＦ及びオカダン酸（ＯＡ）がＥ
ｇｒ−１、ｃ−ｊｕｎ及びＩＬ−６遺伝子の発現に及ぼ
す影響のノザン法分析を示す。

【図８Ａ】一次ヒト繊維芽細胞におけるオカダン酸誘
導Ｅｇｒ−１及びｃ−ｊｕｎメッセージの経時変化を示
す。

【図８Ｂ】Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞におけるオカダ
ン酸誘導Ｅｇｒ−１メッセージの経時変化を示す。

【図８Ｃ】Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞でのオカダン酸
によるＥｇｒ−１メッセージ誘導がオカダン酸の濃度に
依存する様子を示す。

【図８Ｄ】カリキュリンＡによるＥｇｒ−１メッセー
ジ誘導がカリキュリンＡの濃度に依存する様子、及び該
誘導の経時変化を示す。

【図９】核の経時分析結果を示す。

【図１０】オカダン酸によるＥｇｒ−１，ｍＲＮＡの
安定化を示す。

【図１１】オカダン酸処理したヒト繊維芽細胞中のＥ
ｇｒ−１メッセージのスーパーインダクションを示す。

【図１２】オカダン酸によるＥｇｒ−１ｍＲＮＡの
誘導におけるプロテインキナーゼアクチベーター及びイ
ンヒビターの効果を示す。

【図１３】オカダン酸で誘導した一次ヒト繊維芽細胞
由来のＥｇｒ−１タンパク質のウェスタン法分析を示
す。

【図１４Ａ】Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞由来の［^３２
Ｐ］標識したＥｇｒ−１タンパク質の分析を示す。

【図１４Ｂ】Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞由来の［^３２
Ｐ］標識したＥｇｒ−１タンパク質の分析を示す。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図５】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図２】

【図３】

【図７】

【図８Ｄ】

【図１０】

【図４】

【図６】

【図８Ａ】

【図１１】

【図１４Ａ】

【図９】

【図１２】

【図１３】

【図１４Ｂ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者キシンミン・カオシンガポール国、シンガポール・0511、ケント・リツジ・クレセント・10 (72)発明者グリーム・ガイシンガポール国、シンガポール・0511、ケント・リツジ・クレセント・10 (72)発明者イン・ウイー・タンシンガポール国、シンガポール・0511、ケント・リツジ・クレセント・10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プロテインホスファターゼインヒビター
を含む、腫瘍壊死因子またはインターロイキン１の模擬
物質として用いられる物質。
【請求項２】進行癌、黒色腫、腎細胞癌、白血病、気
管支癌、鼻咽頭癌及びカポジ肉腫の中から選択される腫
瘍の治療に用いられることを特徴とする請求項１に記載
の物質。
【請求項３】主腫瘍部の縮小化後に用いられることを
特徴とする請求項２に記載の物質。
【請求項４】プロテインホスファターゼインヒビター
を含む、細胞分化因子として用いられる物質。
【請求項５】白血病の治療に用いられることを特徴と
する請求項４に記載の物質。
【請求項６】プロテインホスファターゼインヒビター
がプロテインホスファターゼ１または２Ａのインヒビタ
ーであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１
項に記載の物質。
【請求項７】プロテインホスファターゼインヒビター
がオカダン酸か、または該酸の医薬的に許容可能な塩、
アミドもしくはエステルであることを特徴とする請求項
６に記載の物質。
【請求項８】プロテインホスファターゼインヒビター
がカリキュリンＡかまたはその誘導体であることを特徴
とする請求項６に記載の物質。
【請求項９】プロテインホスファターゼインヒビター
及びプロテインキナーゼアクチベーターを、細胞分化の
誘導で同時に、別個に、または逐次用いるべく組み合わ
せた調製物として含有する製品。
【請求項１０】進行癌、黒色腫、腎細胞癌、白血病、
気管支癌、鼻咽頭癌及びカポジ肉腫の中から選択される
腫瘍の治療に用いられることを特徴とする請求項９に記
載の製品。
【請求項１１】プロテインホスファターゼインヒビタ
ーがプロテインホスファターゼ１または２Ａのインヒビ
ターであることを特徴とする請求項９または１０に記載
の製品。
【請求項１２】インヒビターがオカダン酸か、または
該酸の医薬的に許容可能な塩、アミドもしくはエステル
であることを特徴とする請求項１１に記載の製品。
【請求項１３】インヒビターがカリキュリンＡかまた
はその誘導体であることを特徴とする請求項１１に記載
の製品。
【請求項１４】プロテインキナーゼアクチベーターが
プロテインキナーゼＣのアクチベーターであることを特
徴とする請求項９から１３のいずれか１項に記載の製
品。