JP4869942B2 - インスリン感受性/抵抗性、糖尿病および肥満におけるrbp4 - Google Patents
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Description
本出願は2003年12月11日に出願された米国特許仮出願第60/528,919号の受益を請求する。上記出願の全教示を参照により本明細書に援用する。
(米国政府資金提供)
本発明は米国立衛生研究所の補助金RO1DK43051によりその全部または一部を援助された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
筋肉および脂肪等の周辺組織におけるインスリン抵抗性は、膵臓β細胞によるインスリン分泌の増加と関連している。分泌されたインスリンはグルコース消費を促進し、肝臓によるグルコース産生を阻害する。しかしながら、膵臓β細胞は多くの場合インスリンの産生増加を維持することができず、最終的にインスリン産生の減少とグルコース不耐性をもたらす。
本発明はインスリン抵抗性、代謝症候群および2型糖尿病に関連する症状および疾患を軽減または緩和する、治療の開発のために使用し得る分子または薬剤の検出および/または同定のための重要な新しい標的とスクリーニング法を提供する。本発明で初めて示される様に、血清レチノール結合蛋白質4(RBP4)の上昇はインスリン抵抗性を引き起こしグルコース耐性を損なうが、血清RBP4の低下はインスリンの作用とグルコース耐性を改善する。インスリン耐性のいくつかのマウスモデルの結果は、ヒトのデータで確認された。さらに、RBP4とトランスチレチンとの間の相互作用を妨害するレチンアミドでob/obマウスを処置すると、血漿RBP4レベルが低下し、長期の状態を減少する。RBP4はそれにより脂肪細胞におけるGLUT4の発現の下方制御が全身的なインスリン抵抗性を生じる機構的関連であると考えられる。
可溶性因子がインスリン抵抗性と相関し、その因子はRBP4であることが本発明で初めて明らかとなった。糖尿病および/または肥満でなくても、RBP4はインスリン抵抗性と相関している。従って、RBP4はインスリン抵抗性を減少する化合物のスクリーニングの他、インスリン抵抗性の早期診断と治療のための有用な標的である。本明細書に述べる様に、インスリン応答性グルコース輸送因子(GLUT4)が脂肪組織中で特異的にノックアウトされた場合、RBP4がマウスの血清中で上昇する(AG4KOマウス)。AG4KOはインスリン抵抗性に対するマウスモデルである。
本明細書に記載の様に、本発明はRBP4活性をインビボで(たとえば哺乳動物中)またはインビトロで調節する化合物の同定法に関し、その化合物がRBP4活性を調節する能力は以前には知られていなかった。
RBP4は例えば肝細胞および脂肪細胞で産生される循環蛋白質である。RPB4はレチノールの細胞外輸送システムの一部である。RBP4はアポ型として粗面小胞体中で合成される。しかしながら、レチノールと複合体を生成しなければRBP4は小胞体から効率的に転送されない。さらに、RBP4はホモ4量体蛋白質であるトランスチレチン(TTR)と結合して血清中に優先的に見出される。TTR自体は甲状腺蛋白質の2個の分子と結合できるが、レチノール恒常性に関しては、腎臓における血漿濾過中は21kDaのRBP4の排出が阻止されると考えられる。従って、体内で製造または維持されるRBP4のレベルを変えることにより、RBP4の活性レベルを変化させることができる一方、(1)発生期RBP4の産生速度、(2)RBP4がレチノールと相互作用する能力、(3)RBP4がTTRと相互作用する能力、および(4)体内のRBP4の半減期を変えることにより変化し得る。さらに、例えばレチノール依存性シグナル伝達が影響される様に、RBP4がレチノールを細胞に送達する能力を変えることにより、RBP4活性が変化し得る。
また、特異的インスリン抵抗性/代謝症候群代用マーカーを用いる、哺乳動物(例えばヒト)におけるインスリン抵抗性または代謝症候群等の関連する状態の診断法であって、そのマーカーはRBP4蛋白質、またはその断片(例えば生物活性断片または特徴的断片)である診断法も本発明に含まれる。
I. インスリン抵抗性のマウスモデル
A. 脂肪組織グルコース輸送因子4(GLUT4)ノックアウトマウス(AG4KO)および脂肪組織Glut4過剰発現マウス(G4A+)
グルコース輸送因子GLUT4の脂肪組織選択性ノックアウトを有するマウスを作製するため、Cre/LoxP DNA組み換えを使用した。LoxP部位で囲まれたGLUT4遺伝子を含む遺伝子組み換えマウスを、選択的に脂肪組織中にCREリコンビナーゼを発現する遺伝子組み換えマウスと交配した。
図4Aに示す様に、雄および雌AG4KOマウスの生育曲線は3〜16週齢の野生型と類似していた。AG4KOマウスにおける脂肪パッドの重量および脂肪細胞のサイズも、野生型と類似していた(それぞれ図4Bおよび図4C)。さらに、脂肪細胞の形態はAG4KOマウスで均一であった。従って、脂肪組織における選択性のGLUT4の減少は生育の遅れ、または脂肪組織重量または脂肪組織サイズの減少をもたらさない。AG4KOマウスの心臓の重さも野生型と類似していた。
図5Aに示す様に、AG4KOマウスの骨格筋中のGLUT4発現は野生型と類似している。GLUT4発現をイムノブロッティングで測定した。組織を摘出し、ポリトン用メディウムおよび緩衝液(HEPES 50mM Triton(登録商標)X−100(ポリオキシエチレン)1%、ピロリン酸ナトリウム50mM、NaF100mM、EDTA10mM、バナジウム塩10mM、アプロチニン10μg/ml、ロイペプチン10μg/ml、ベンズアミジン2mM)を用いてホモジェナイズした。13,000gでの最初の遠心分離後、次いで上澄みを4℃、100,000gで1時間遠心分離した。得られた上澄みをAbelら、J. Clin. Invest., 104:1703−1714(1999)に従ってイムノブロッティングに使用した。
図6Aに示す様に、AG4KO脂肪細胞中のグルコースの取り込みは損なわれている。グルコース輸送を測定するため、飼育マウス由来の卵巣周辺または副睾丸脂肪パッドから脂肪細胞をコラゲナーゼ消化(1mg/ml)で単離した。Satou、Y. およびSatou, N.、Dev. Biol. 192:467−481(1997)に従ってグルコース輸送を測定した。
A. AG4KOマウスのインスリン抵抗性は分泌因子で媒介される
インスリンシグナル伝達がAG4KOマウスの筋肉で損なわれる。図9に示す様に、GLUT4の活性化に必要なシグナル伝達工程であるインスリン受容体(図9A)およびIRS1(図9B)の活性化のレベルでもインスリン抵抗性が存在した。
AG4KOマウスのインスリン抵抗性表現型に含まれる血清因子を同定するため、WAT RNAのマイクロアレイアッセイを行った。図11はマイクロアレイアッセイの概略を示す。白色脂肪組織由来の全RNAをRNeasy(登録商標)ミニキット(Qiagen、Valencia、CA製)を用いて抽出した。標識脂肪組織RNAをハイブリダイゼーション条件下でマウスオリゴヌクレオチド(MG−U74A v. 2、Affymetrix製)とインキュベーションした。マウスRBP4 mRNAをTaqMan(登録商標)ワンステップRT−PCRマスターミックス(Applied Biosystems製)と以下のプライマー/プローブセットを用いるリアルタイムPCRで定量した:
(順方向)配列番号1 TCTGTGGACGAGAAGGGTCAT
(逆方向)配列番号2 CCAGTTGCTCAGAAGACGGAC、および
(プローブ)配列番号3 TGAGCGCCACAGCCAAGGGAC
A. 血清RBP4は多くのマウスインスリン抵抗性モデルで上昇する
図15Bに示す様に、血清RBP4レベルは、脂肪−筋肉GLUT4ノックアウト(2倍)、脂肪組織11βHDS−1過剰発現体(代謝症候群に対するマウスプロトタイプ;3倍)、ob/obマウス(13倍)、MC4受容体ノックアウトマウス(3.5倍)、および高脂肪飼料(脂質55%)飼育マウス(2.8倍)を含むインスリン抵抗性マウスモデルで増加する。血清RBP4の上昇が様々な遺伝的および栄養原因論のインスリン抵抗性状態の一般的特徴であるという事実は、RBP4がインスリン抵抗性に寄与する可能性を提示する。
チアゾリジンジオン(TZD)はAG4KOマウスでグルコース恒常性を改善するインスリン感作薬である。図18AおよびBに示す様に、血糖および血液インスリンをAG4KOおよび対照マウスの双方でTZDクラス薬剤のない場合、および薬剤を注射後指定した時間で測定した。図18の*は対照に対する処置前後の0.05以下のP値を示す。#は処置後のGA4−/−マウスに対する0.05未満のP値を示し、“a”は処置前の対照に対する0.05未満のP値を示す。TZD処置はAG4KOマウスで血糖のレベルを有意に低下し、またこれらのマウスで血漿インスリンレベルも有意に低下した。驚くべきことに、AG4KOマウスをTZDクラスの薬剤で処置すると血清RBP4が減少した(図21)。
遺伝子組み換えマウス
マウス筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーターで作動するヒトRBP4を発現する遺伝子組み換えマウスは、血液中にRBP4を分泌し、非遺伝子組み換えマウスと比較して全血清RBP4が約2〜3倍増加する。BPR4遺伝子組み換えマウスは正常に発育し、生育曲線は少なくとも16週齢までは野生型マウスと同様であった。血清インスリンレベルは遺伝子組み換えマウスでより高かった(図21)。与えたグルコース、FSA、レプチン、アジポネクチン、またはレシスチンに差はなかった(図21)。RBP4過剰発現マウスは11週齢までに軽度のインスリン抵抗性を発症した(図22A)。
遺伝子組み換えマウスで胚発生の最初からRBP4の過剰発現の発生的または補償的効果が発達する可能性を避けるため、精製組み換えヒトRBP4(hRBP4)を正常な成体FVBマウスに注射した。RBP4は腎臓糸球体膜で容易に濾過される21kDa蛋白質である。循環系でRBP4はトランスチレチン(TTR)と結合し、RBP4の腎臓クリアランスを阻止する80kDa蛋白質複合体を形成する。外因性RBP4の薬力学を測定するため、0.5mgの組み換えhRBP4を腹腔内注射し、マウスRBP4に対しはるかに低い親和性を有する抗ヒトRBP4抗体を用いて血清hRBP4を測定した(図22B)。hRBP4を注射の10分後に検出可能であり、そのレベルは120分でピークに達した。240分でそのレベルはピークレベルの25%であり、迅速な減少を示した。注射したRBP4は注射後16時間(終夜)で血清から完全に消失した(図22B)。
ビタミンA富化飼料で飼育した場合、RBP4ノックアウトマウス(RBP4KO)は体重が正常で生存能力があり、繁殖能力があったが(図21)、生後早くにレチノールレベルが減少し、視力が損なわれた。餌の摂取は正常であった。RBP4ノックアウトマウスは野生型マウスと比較してインスリン感受性が優れていた(図19)。対照と比較して、血清遊離脂肪酸レベルはRBP4異型接合体(Het)および同型接合体(KO)ノックアウトマウスでより低かった(図21)。与えられたインスリン、グルコース、レプチン、アジポネクチンおよびレシスチンは正常であった(図21)。RBP4 HetおよびRBP4 KOマウスの双方は、インスリン感受性の増大を示した(図23A)。
遺伝子組み換え操作と独立にRBP4の効果を決めるため、成体FVBマウスを本来癌治療のために設計された合成レチノイドであるフェンレチニド(4−ヒドロキシフェニルレチンアミド、4−HPR)で処置した。嵩高い側鎖(ヒドロキシフェニル基)はRBP4とTTRとの相互作用を妨害し、RBP4を腎臓で排出しRBP4の血清レベルを低下させる(Malpeliら、Biochem. Biophys. Acta、1294:48−54(1996))。3週齢雄FVBマウスを固形飼料、高脂肪飼料または0.04%のフェンレチニドを添加した高脂肪飼料で飼育した。フェンレチニドゲルカプセルを空にし、餌を調製する時点でHarlan−Teklad研究所の高脂肪飼料の脂溶性ビタミン成分に直接添加した。フェンレチニド高脂肪飼料を調製する間は光暴露を最少にした。フェンレチニド高脂肪飼料を暗い場所で4℃で保存し、2〜3日間隔でマウスケージに置いた。フェンレチニドを経口投与すると、高脂肪飼料で飼育した肥満マウス(HFD)の血清RBP4レベルを固形飼料で飼育した非肥満対照マウスのレベルに低下した(図23Bおよび23C)。フェンレチニド処理は食物摂取、体重または高脂肪飼料飼育による肥満の発生に影響しなかった。HFDマウスは顕著なインスリン抵抗性(図23D)とグルコース不耐性(図23E)を発症した。フェンレチニド処理はインスリン感受性を改善し(図23D)、グルコース耐性を正常化した(図23E)。従って、RBP4レベルを減少する遺伝的および薬理学的介入は、肥満であってもインスリン感受性を改善する。
フェンレチニド処理がob/obマウスのグルコース耐性を改善する
IPGTT(2mg/g体重)を食餌/処理の8週間後にマウス(12週齢)で行った(図26A)。指定された時間に血漿グルコースを測定した:白丸はob/+、黒丸はob/obマウス、白角はフェンレチニド処理ob/obマウスを表す。図26Aに示す様に、ob/obマウスをフェンレチニドで処理するとそのグルコース耐性を大きく改善した。
IPGTT(1mg/g体重)をマウス(42週齢)で行った。食餌/処理の38週後(図26B)、指定された時間に血漿グルコースを測定した:黒角はob/+、黒丸はフェンレチニド処理ob/+マウス、白角はob/ob、白丸はフェンレチニド処理ob/ob。図26Bに示す様に、フェレンチニド処置の38週間後に、グルコース排出はほぼ異型接合マウスのものに改善される。
フェンレチニドによる処置の10ヶ月後、未処置コントロール(白丸)およびob/+異型接合マウス(黒角)と比較してob/obマウス(黒丸)の長期罹患率はほとんど半分に減少した。10ヶ月齢のob/obマウスは重度の肥満であった。
RBP4がどの様にインスリン感受性を変えるかを理解するため、RBP4 TgおよびKOマウスの筋肉および肝臓インスリンシグナル伝達を調べた。
血清RBP4は肥満および肥満/糖尿病のヒトで上昇するが、痩せた非糖尿病のヒトでは上昇しない。肥満−糖尿病被験体は肥満−非糖尿病および痩せた非糖尿病対照被験体より年を取っていた(図20)。正常血糖−過インスリン血症クランプアッセイで測定した場合、痩せた非糖尿病被験体と比較して、肥満および肥満−糖尿病被験体のBMIおよび絶食時インスリンレベルは高く、GDRは低かった。図20Aは肥満および肥満/糖尿病のヒト由来の血清のイムノブロットを示す。図20Aに示す様に、肥満および肥満/糖尿病のヒトではRBP4レベルが上昇している。図20Bは、このレベルがほぼ2倍の増加であることを示している。肥満グループと肥満−糖尿病グループとの間の血清RBP4の上昇の大きさに差はなく、肥満とインスリン抵抗性がヒトにおける血清RBP4の上昇と関連するが、高血糖症は関連しないことを示唆している。
Claims (13)
- 哺乳動物から採取した生物学的試料中のRBP4活性を測定する工程を含み、ここで、RBP4活性の増加が、インスリン抵抗性、代謝症候群、または2型糖尿病を示す、哺乳動物においてインスリン抵抗性、代謝症候群、または2型糖尿病を検出する方法であって、該RBP4活性が、
a) RBP4 mRNAまたはRBP4蛋白質の発現;
b) RBP4の細胞への結合、ここで該細胞は脂肪細胞、肝臓細胞または筋肉細胞である;
c) RBP4のトランスチレチンへの結合;
d) RBP4のレチノールへの結合;
e) RBP4の細胞表面受容体への結合;ならびに
f) インスリンシグナル伝達経路およびレチノール依存性シグナル伝達経路からなる群より選択されるシグナル伝達経路の活性化
からなる群より選択される、方法。 - RBP4蛋白質またはその断片の量を測定する、請求項1記載の方法。
- RBP4蛋白質またはその断片の量を、イムノアッセイによって測定する、請求項2記載の方法。
- レチノール結合蛋白質4(RBP4)またはトランスチレチン(TTR)またはRBP4/TTR複合体を試験化合物と接触させる工程、および
試験化合物の存在下のRBP4活性のレベルを、試験化合物の非存在下のRBP4活性のレベルと比較する工程を含み、ここで、RBP4活性が、
a) RBP4 mRNAまたはRBP4蛋白質の発現;
b) RBP4の細胞への結合、ここで該細胞は脂肪細胞、肝臓細胞または筋肉細胞である;
c) RBP4のトランスチレチンへの結合;
d) RBP4のレチノールへの結合;
e) RBP4の細胞表面受容体への結合;ならびに
f) インスリンシグナル伝達経路およびレチノール依存性シグナル伝達経路からなる群より選択されるシグナル伝達経路の活性化
からなる群より選択され、RBP4活性の変化は、哺乳動物におけるインスリン抵抗性のレベルを低下させる化合物を示す、
哺乳動物においてインスリン抵抗性のレベルを低下させる化合物の同定方法。 - 試験化合物の存在下のRBP4活性のレベルが、試験化合物の非存在下のRBP4活性のレベルと比べて低減される、請求項4記載の方法。
- 哺乳動物から採取した生物学的試料中のレチノール結合蛋白質4(RBP4)蛋白質またはその断片の量を測定する工程を含み、ここで、試料中のRBP4蛋白質またはその断片の量の増加が、インスリン抵抗性、代謝症候群、または2型糖尿病を示す、インスリン抵抗性に付随する状態の非存在下または該状態が生じる前での哺乳動物におけるインスリン抵抗性、代謝症候群、または2型糖尿病を検出する方法。
- 生物学的試料が、組織、全血、血清、血漿および尿からなる群より選択される、請求項1または6記載の方法。
- RBP4蛋白質またはその断片の量を、イムノアッセイによって測定する、請求項7記載の方法。
- 生物学的試料を固相支持体上に固定化する、請求項8記載の方法。
- 固相支持体が濾紙である、請求項9記載の方法。
- イムノアッセイが、ELISA、RIA、ネフロメトリーアッセイまたはウエスタンブロットである、請求項10記載の方法。
- 哺乳動物が肥満である、請求項6記載の方法。
- 哺乳動物が、代謝症候群、脂質異常症、妊娠糖尿病の病歴、空腹時血糖異常、グルコース寛容減損または2型糖尿病を有する、請求項6記載の方法。
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