JP4505640B2 - 心筋障害の予防又は治療剤 - Google Patents
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(1)プロアドレノメデュリンN−末端20ペプチド、その修飾体であってアンジオテンシンI変換酵素のmRNA発現を抑制する活性を有するもの、又はそれらの塩であってアンジオテンシンI変換酵素のmRNA発現を抑制する活性を有するものを有効成分として含有する心肥大又は心筋線維化の予防又は治療剤。
(3)プロアドレノメデュリンN−末端20ペプチド又はその修飾体が以下の(a)、(b)、(c)又は(d)である(1)に記載の心肥大又は心筋線維化の予防又は治療剤。
(a)配列番号1、3、5、7、9又は11のアミノ酸配列からなるペプチド
(b)配列番号1、3、5、7、9又は11のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンI変換酵素のmRNA発現を抑制する活性を有するペプチド
(c)C末端がアミド化されている(a)又は(b)に記載のペプチド
(d)C末端にGlyが付加している(a)又は(b)に記載のペプチド
(4)以下の(e)、(f)、(g)又は(h)であるペプチドを発現し、且つヒトアドレノメデュリンを発現しない非ヒト哺乳動物を用いる、心肥大又は心筋線維化におけるプロアドレノメデュリンN−末端20ペプチドの機能を検討するための方法。
(e)、配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド
(f)配列番号1のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンI変換酵素のmRNA発現を抑制する活性を有するペプチド
(g)C末端がアミド化されている(e)又は(f)に記載のペプチド
(h)C末端にGlyが付加している(e)又は(f)に記載のペプチド
プラスミドの構築
本発明者らは強力なニワトリβ−アクチンプロモーターにより転写されるPAMP導入遺伝子を構築した(図1)。プロプロアドレノメデュリンにおけるLys74をコードするコドン(AAG)が停止コドン(TAG)に改変されたヒトプロアドレノメデュリンN−末端20ペプチド(hPAMP)cDNA(GenBank accession number D14874、配列番号2)の断片をpCAGGSベクターにサブクローニングした(Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector, Gene 108(1991):193-199)。こうして得られたプラスミドpCAGGS−hPAMPにニワトリβ−アクチンプロモーターも含まれていることは標準的なDNA配列決定法により確認された。
Sal I及びBamH IによりpCAGGS−hPAMPから導入遺伝子を切り出した。そしてhPAMP DNA断片をゲル電気泳動により精製し、緩衝液に溶解し、過剰排卵Wistarラットの受精卵の前核にマイクロインジェクションにより注入した。生まれたラットの尾先端部からゲノムDNAを精製し、hPAMP cDNAをプローブとして用いるPC法によりトランスジェニック(Tg)ラットの初代個体の候補をスクリーニングした。
PAMP Tgラット及び野生型ラットについて片腎摘出を行った後、8%NaClを含有する高食塩食を5週間摂食させた(UNX hypertension model)。実験の期間中、血圧及び心拍数をモニターした。5週間の実験期間終了後、断頭屠殺し、心臓及び血液サンプルを採取した。採取された心臓を2つに切りわけて、一方を4%パラホルムアルデヒド中に浸して後で組織病理学的評価に用いた。もう一方は液体窒素中に保存して後で遺伝子及びタンパク質の評価に用いた。
ラジオイムノアッセイ法(RIA,非特許文献1)を用いて、Tgラットの血漿及び各組織におけるhPAMPのレベルを測定した。このアッセイ法はhPAMPに対する選択性が高くラットPAMPに対しては交差反応性を示さない。
全RNAを既報(Cao YN, Kitamura K, Kato J, Kuwasako K, Ito K, Onitsuka H, Nagoshi Y, Uemura T, Kita T, Eto T. Chronic salt loading upregulates expression of adrenomedullin and its receptors in adrenal glands and kidneys of the rat, Hypertension 42(2003):369-372)に従って単離した。続いてSuperScript II reverse transcriptase(Invitrogen)を用いて1μgの試料に対して逆転写を行ない、得られたcDNAをリアルタイム定量PCR(Prism 7700 Sequence Detector, Applied Biosystems, Foster City, CA)に供した。レニンmRNAの発現を評価するためのプライマーとして5’−GCTACATGGAGAATGGGACTGAA−3’(センス)及び5’−ACCACATCTTGGCTGAGGAAAC−3’(アンチセンス)を用いた。レニンcDNAを検出するプローブとして5’−CCATCCACTATGGATCAGGGAAGGTCAA−3’を用いた。アンギオテンシンI変換酵素(angiotensin I converting enzyme,ACE)mRNAの発現を評価するためのプライマーとして5’−CTGCCTCCCAACGAGTTAGAA−3’(センス)及び5’−CGGGACGTGGCCATTATATT−3’(アンチセンス)を用いた。ACEcDNAを検出するプローブとして5’−AAATGGCACTTGTCTGTCACTGGAGCC−3’を用いた。
上記のとおり4%パラホルムアルデヒド中で固定した心臓試料をパラフィンに包埋し、4μm厚の切片に薄切りした。続いて切片をキシレン中で脱パラフィンし、段階的な濃度のエタノール(100%、90%及び70%/蒸留水)中で水和して、ヘマトキシリン/エオシン(HE)又はシリウスレッドにより染色した。HE染色後、心肥大の指標として心筋細胞の断面積を測定し、比較した。心筋線維化はシリウスレッド染色後に赤色を呈した。この赤色を、Winroof画像解析ソフトウェア(三谷商事株式会社)を用いて測定された赤色シグナルの強度に基づいて定量した。
結果は平均値±SEMで表示した。分散分析及びStudentのt検定を必要に応じて行い、群間の差の有意性を評価した。P<0.05の値のとき有意差があるものと判定した。
遺伝子導入の確認
トランスジェニックマウスにおいて遺伝子導入がなされたことは、リアルタイム定量PCRを用いてラットの尾先端部におけるhPAMPを検出することにより確認された。また血漿及び種々の組織において高レベルのhPAMPが検出された(表1)。hPAMPTgラットの血漿中でhPAMPが高レベル(21±7.7fmol/ml)で検出されたものの、hPAMPTgラットと野生型ラットとの間で血圧及び心拍数に差異はなかった(データは示していない)。
PAMPの機能をより詳細に評価するために、Tgラット及び野生型ラットについて片腎摘出を行った後、8%NaClを含有する高食塩食を5週間摂食させた。この実験プロトコールは高血圧を誘導するための確立されたプロトコールである。血圧は、Tgラット及び野生型ラットの両方において、高食塩食を与えた5週間の期間中増加し続けたものの、血圧の上昇はTgラットにおいて有意に抑制されていた(図2A)。このことはPAMPが降圧ペプチドであることを示した本発明者らの知見(非特許文献8)と合致する。一方、心拍数は2群間で有意差はなかった(図2B)。
配列番号15及び18:プローブ
Claims (3)
- プロアドレノメデュリンN−末端20ペプチド、
プロアドレノメデュリンN−末端20ペプチドのC末端がアミド化されている修飾体、プロアドレノメデュリンN−末端20ペプチドのC末端にGlyが付加されている修飾体、プロアドレノメデュリンN−末端20ペプチドのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる修飾体、プロアドレノメデュリンN−末端20ペプチドのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、さらにC末端がアミド化されている修飾体、若しくはプロアドレノメデュリンN−末端20ペプチドのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、さらにC末端にGlyが付加されている修飾体であって、且つアンジオテンシンI変換酵素のmRNA発現を抑制する活性を有するもの、又は
それらの塩であってアンジオテンシンI変換酵素のmRNA発現を抑制する活性を有するもの
を有効成分として含有する心肥大又は心筋線維化の予防又は治療剤。 - プロアドレノメデュリンN−末端20ペプチド、その修飾体であってアンジオテンシンI変換酵素のmRNA発現を抑制する活性を有するもの、又はそれらの塩であってアンジオテンシンI変換酵素のmRNA発現を抑制する活性を有するものを有効成分として含有する心肥大又は心筋線維化の予防又は治療剤であって、プロアドレノメデュリンN−末端20ペプチド又はその修飾体が以下の(a)、(b)、(c)又は(d)である、前記心肥大又は心筋線維化の予防又は治療剤。
(a)配列番号1、3、5、7、9又は11のアミノ酸配列からなるペプチド
(b)配列番号1、3、5、7、9又は11のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンI変換酵素のmRNA発現を抑制する活性を有するペプチド
(c)C末端がアミド化されている(a)又は(b)に記載のペプチド
(d)C末端にGlyが付加している(a)又は(b)に記載のペプチド - 以下の(e)、(f)、(g)又は(h)であるペプチドを発現し、且つヒトアドレノメデュリンを発現しない非ヒト哺乳動物を用いる、前記ペプチドの、心肥大又は心筋線維化の予防又は治療活性を評価する方法。
(e)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド
(f)配列番号1のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアンジオテンシンI変換酵素のmRNA発現を抑制する活性を有するペプチド
(g)C末端がアミド化されている(e)又は(f)に記載のペプチド
(h)C末端にGlyが付加している(e)又は(f)に記載のペプチド
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JP2005114786A JP4505640B2 (ja) | 2005-04-12 | 2005-04-12 | 心筋障害の予防又は治療剤 |
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2005
- 2005-04-12 JP JP2005114786A patent/JP4505640B2/ja active Active
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