CN112538460B - 一种提高猪圆环病毒增殖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高猪圆环病毒增殖的方法。本发明提供了一种提高猪圆环病毒增殖的方法，包括如下步骤：A1)降低宿主细胞中RBP4蛋白的表达和/或活性；A2)用A1)处理过的所述宿主细胞繁殖猪圆环病毒。本发明制备了一种敲除宿主RBP4基因的PK‑15细胞系，该细胞基因编辑技术对宿主基因RBP4进行特异性的敲除。将宿主基因RBP4敲除后筛选单克隆细胞接种猪圆环病毒，能显著提高猪圆环病毒的拷贝数，从而提高了用细胞培养猪圆环病毒所收获的病毒滴度，能有效解决实验室生产猪圆环病毒滴度较低的问题。

Description

一种提高猪圆环病毒增殖的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域和病毒领域，具体涉及一种提高猪圆环病毒增殖的方法。
背景技术
视黄醇结合蛋白4(Retinol binding protein 4，RBP4)是新发现的一种细胞因子，属于视黄醇结合蛋白家族成员，主要由肝脏和脂肪组织分泌。RBP4主要负责视黄醇的储存、吸收，并将视黄醇及其活性代谢产物从肝脏运输到靶组织，在辅助视黄醇发挥生理功能过程中发挥重要作用。已有研究表明，RBP4与胰岛素抵抗、II型糖尿病密切相关，参与慢性炎症、代谢综合征病理生理过程。在免疫细胞中，血清中RBP4水平升高会激活脂肪组织巨噬细胞和树突状细胞，提高细胞因子分泌，从而导致炎症和胰岛素抵抗，能够活化CD4+T细胞，提高其增殖和分化。最新的研究还发现，RBP4还与乙肝病毒的复制密切相关。
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为目前已知的最小的动物病毒之一。其中II型圆环病毒(PCV2)感染可以导致猪发生断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸系统混合疾病、繁殖障碍综合征等猪圆环病毒病(Porcine circovirus diseases,PCVD)。我国自2000年报道猪群中存在PCV2感染以来，流行范围迅速波及至全国，给养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2主要感染宿主免疫细胞，可导致机体发生免疫抑制，增强机体对其它病原体的易感性。临床上，PCV2与其他病毒或细菌的混合感染十分常见，使得疾病复杂化，难以治愈。随着猪场的规模化、集约化发展，由PCV2及其混合感染引起的疾病造成的损失越来越大，已成危害养猪业重大疫病之一。疫苗免疫是预防和控制PCVD的最为经济和有效的方式，目前市场上PCV2疫苗主要种类有灭活疫苗和基因工程疫苗等。然而，PCV2病毒在普通工程细胞上复制能力弱的特点是获得高滴度病毒用于制备高效价PCV2疫苗的关键瓶颈之一。因此，显著提高PCV2病毒产量是制备高效价PCV2疫苗的重要手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种能用于提高猪圆环病毒增殖的方法，能够克服目前实验室生产中猪圆环病毒滴度不高的问题，从而弥补现有技术的不足。
第一方面，本发明要求保护一种提高猪圆环病毒增殖的方法。
本发明所要求保护的提高猪圆环病毒增殖的方法，可包括如下步骤：
(A1)降低(如缺失)宿主细胞中视黄醇结合蛋白4(RBP4)的表达和/或活性；
(A2)用(A1)处理过的所述宿主细胞繁殖猪圆环病毒。
在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为PK-15细胞；所述猪圆环病毒具体为II型猪圆环病毒(PCV2)。
进一步地，步骤(A1)中，所述降低宿主细胞中RBP4蛋白的表达和/或活性可为敲除所述宿主细胞中RBP4蛋白的编码基因。
更进一步地，所述“敲除所述宿主细胞中RBP4蛋白的编码基因”可通过序列特异性的基因编辑技术对所述编码基因进行特异性剪切来实现。
其中，所述序列特异性的基因编辑技术可为CRISPR/Cas9基因编辑技术。
在本发明的具体实施方式中，所述“敲除所述宿主细胞中RBP4蛋白的编码基因”具体是通过CRISPER/Cas9基因编辑技术实现的；以RBP4蛋白的编码基因中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。具体地，所述靶序列为SEQ ID No.1。
更加具体地，所述“敲除所述宿主细胞中RBP4蛋白的编码基因”是通过包括如下步骤的方法实现的：将重组载体pX459M-gRNARBP4导入所述宿主细胞中；所述重组载体pX459M-gRNARBP4为将SEQ ID No.1所示DNA克隆到pX459M质粒的两个酶切位点Bbs I之间后得到的重组质粒。
第二方面，本发明要求保护RBP4基因被敲除的PK-15细胞。
本发明所要求保护的RBP4基因被敲除的PK-15细胞，可按照包括如下步骤的方法制备得到：将重组载体pX459M-gRNARBP4导入PK-15细胞；所述重组载体pX459M-gRNARBP4为将SEQ ID No.1所示DNA克隆到pX459M质粒的两个酶切位点Bbs I之间后得到的重组质粒。然后筛选阳性细胞。
第三方面，本发明要求保护如下任一生物材料：
(B1)SEQ ID No.1所示DNA；
(B2)将SEQ ID No.1中的T替换为U后的gRNA；
(B3)含有SEQ ID No.1所示DNA的表达盒、重组载体。
第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
(C1)前文所述RBP4基因被敲除的PK-15细胞或前文所述的生物材料在提高猪圆环病毒增殖中的应用；
(C2)前文所述RBP4基因被敲除的PK-15细胞或前文所述的生物材料在制备用于提高猪圆环病毒增殖的产品中的应用；
(C3)前文第一方面所述方法或前文所述RBP4基因被敲除的PK-15细胞或前文所述的生物材料在制备猪圆环病毒疫苗中的应用；
(C4)RBP4基因编码蛋白在调控猪圆环病毒增殖中的应用。
在各应用中，所述猪圆环病毒具体可为II型猪圆环病毒。
在上述各方面中，所述提高猪圆环病毒的增殖具体可体现为与对照细胞相比，同条件下所述猪圆环病毒的滴度更高(拷贝数更多)。所述对照细胞为所述RBP4基因未经敲除的正常宿主细胞(如PK-15细胞)。
在上述各方面中，所述RBP4基因为猪RBP4基因(参见Genbank no.NC_010456.5)；所述RBP4蛋白为猪RBP4蛋白。
本发明制备了一种敲除宿主RBP4基因的PK-15细胞系，该细胞经CRISPR/Cas9技术对宿主基因RBP4进行特异性的敲除。将宿主基因RBP4敲除后筛选单克隆细胞接种猪圆环病毒，能显著提高猪圆环病毒的拷贝数，从而提高了用细胞培养猪圆环病毒所收获的病毒滴度，能有效解决实验室生产猪圆环病毒滴度较低的问题。
附图说明
图1为pX459M连接RBP4 gRNA菌落PCR结果。M：DNA标准DL 2000；1、2：单克隆阳性菌落。
图2为免疫印迹检测RBP4敲除结果。
图3为DNA测序验证RBP4敲除效果。
图4为荧光定量PCR检测PCV2拷贝数。
图5为免疫印迹检测PCV2复制和RBP4蛋白表达结果。
各图中，WT表示野生型细胞，KO表示RBP4基因敲除细胞。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pX459M载体：Addgene#62988。
PK-15细胞：(
Figure BDA0002210964510000031
CCL-33)。
II型猪圆环病毒为PCV2 IDSDTA2017-1毒株(GenBank accession number，MN400446)。
实施例1、敲除PK-15细胞中的RBP4基因
本实施例采用CRISPER/Cas9基因编辑技术敲除PK-15细胞中的RBP4基因。具体如下：
1、猪RBP4基因编辑重组质粒的构建与鉴定
1)设计针对猪RBP4基因的gRNA序列：参考Genbank中猪RBP4的基因序列(NC_010456.5)，根据http://crispr.mit.edu/设计gRNA序列为：
5’-CGCCCTAGGGAAACCGCTCG-3’(SEQ ID No.1)
2)引物的合成与退火：
根据设计的针对猪RBP4的gRNA序列，分别合成如下两个寡核酸序列：上游引物：5’-CACCGCGCCCTAGGGAAACCGCTCG-3’；下游引物：5’-AAACCGAGCGGTTTCCCTAGGGCGC-3’。通过退火获得双链互补序列，引物退火反应体系：上游引物(100μM)1μL；下游引物(100μM)1μL；10×T4 ligase buffer 1μL；T4连接酶1μL；H2O6μL；总体积10μL。
3)重组载体的构建：
将纯化的pX459M载体以Bbs I酶消化，反应体系为：质粒6-10μg，Bbs I酶2μl；10×buffer 5μl；H2O补足至50μl。37℃反应2h后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收载体骨架(回收后的载体浓度应大于50ng/μl)。然后将退火产物与胶回收的载体骨架进行连接，反应体系如下：退火引物2μL，载体骨架100ng，10×T4 ligase buffer1μL，T4 ligase 1μL，加超纯水补足至10μL，置于16℃恒温金属连接仪中过夜连接。连接后热激90秒转化JM109大肠杆菌感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行阳性菌筛选。24h后用灭菌牙签挑取菌落至含氨苄抗性的LB培养基中37℃、220rpm振荡培养12h，提取重组质粒用于鉴定。
4)重组质粒的PCR鉴定：
以设计的gRNA的上游引物和鉴定下游引物(5’-GTACTGGGCACAATGCCAG-3’)，以提取的重组质粒为模板，按照下列反应体系和条件进行PCR扩增：模板DNA 1μL，上、下游引物各0.5μL，10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2μL，rTaq 0.125μL，加超纯水至总体积25μL。反应条件：98℃预变性5min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，阳性质粒PCR产物大小为750bp(图1)。结果显示gRNA成功连接到pX459M质粒中。将菌落PCR鉴定阳性的重组质粒进一步测序验证，经测序验证正确的重组质粒命名为pX459M-gRNARBP4。pX459M-gRNARBP4的结构描述为：在pX459M载体的两个Bbs I酶切位点之间插入SEQID No.1所示DNA片段后的重组质粒。
2、重组质粒转染猪PK-15细胞
将重组敲除质粒pX459M-gRNARBP4进行乙醇沉淀纯化，然后转染PK-15细胞，转染体系如表1所示。
表1脂质体2000转染PK-15细胞的反应体系(6孔板)
Figure BDA0002210964510000041
Figure BDA0002210964510000051
操作方法：首先将表1中A组2种试剂混合均匀，再将B组2种试剂混匀，然后将A组和B组液体均匀混合在一起，室温静置20分钟。将反应产物均匀加入含10％FBS的DMEM培养基培养的PK-15细胞上，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，加入3μg/ml嘌呤霉素连续筛选3～4天，获得嘌呤霉素抗性的多克隆细胞系。
3、RBP4基因敲除PK-15细胞系的鉴定与单克隆细胞筛选
取样针对RBP4蛋白的表达情况进行免疫印迹检测，结果显示RBP4在PK-15细胞中成功敲除(图2)。利用有限稀释法对鉴定RBP4敲除的多克隆细胞进行单克隆细胞系筛选，得到单克隆细胞后，分别提取细胞基因组DNA。设计以下鉴定引物：
上游引物：5’-CCTCGGTCTTTCACCCCGC-3’；
下游引物：5’-CCTCCAGATGCCACTGACTTT-3’。
以提取的细胞基因组DNA为模板，按照下列反应体系和条件进行PCR扩增：模板DNA2μL；上、下游引物各1μL；10×buffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL；rTaq 0.25μL；加超纯水至总体积50μL。反应条件：98℃预变性5min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR片段长度为712bp，产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收，将回收产物进行DNA测序，确定RBP4基因的敲除效果。测序结果显示基因敲除型PK-15细胞相RBP4基因序列发生了缺失和突变(图3)，表明成功获得了RBP4基因敲除单克隆PK-15细胞系。
实施例2、利用RBP4基因敲除PK-15细胞进行猪圆环病毒的高效增殖
供试猪圆环病毒：II型猪圆环病毒(简称PCV2)，为本实验室保存的II型猪圆环病毒为PCV2 IDSDTA2017-1毒株(GenBank accession number，MN400446)。
分别将实施例1筛选得到的RBP4基因敲除型PK-15单克隆细胞(图3所示)和野生型PK-15细胞以1.5×105个细胞/孔铺于12板中，于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，12h后接种PCV2，在感染后不同时间收集样品，提取总DNA，荧光定量PCR检测PCV2病毒ORF2基因拷贝数，GAPDH基因作为内参。
检测引物序列如下：
ORF2上游引物：5’-CTCCCGCCATACCATAACCCA-3’；
ORF2下游引物：5’-GTCTACATTTCCAGCAGTTTG-3’。
猪GAPDH上游引物：5’-ACTCACTCTTCCACTTTTGATGCT-3’；
猪GAPDH下游引物：5’-TGTTGCTGTAGCCAAATTCA-3’。
荧光定量PCR反应体系为2×SYBR Premix Ex Taq 5μL、引物各0.3μL、模板2μL、超纯水补足体系至10μL。荧光定量PCR反应条件为：95℃5min；95℃20s，55℃20s，70℃30s，40个循环。结果显示与野生型PK-15细胞相比，在RBP4基因敲除型PK-15细胞中，PCV2的病毒感染不同时间后病毒DNA拷贝数显著升高(图4)。
进一步利用免疫印迹检测PCV2病毒感染的野生型和RBP4敲除的PK-15细胞中Cap蛋白表达水平，以Actin作为内参。操作方法：收取的细胞样品用100μL RIPA细胞裂解液冰上裂解30min，裂解完成后于4℃下13,500g离心10min，将上清转移至新的1.5mL离心管中，用BCA蛋白浓度测定试剂盒按说明书方法对各组蛋白样品的浓度进行测定，其余样品按比例加入6×蛋白上样缓冲液，煮沸10min。取10μL样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，以抗Cap蛋白抗体和RBP4抗体分别检测PCV2 Cap蛋白和RBP4蛋白表达情况。结果显示在野生型PK-15细胞中能够检测到RBP4蛋白表达，而在RBP4基因敲除的细胞中则检测不到RBP4蛋白表达，并且在RBP4敲除的细胞中PCV2 Cap蛋白表达水平显著高于野生型PK-15细胞(图5)。
<110> 山东农业大学
<120> 一种提高猪圆环病毒增殖的方法
<130> GNCLN191848
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cgccctaggg aaaccgctcg 20

Claims (14)

1.一种提高猪圆环病毒增殖的方法，包括如下步骤：
（A1）降低宿主细胞中RBP4的蛋白的表达和/或活性；
（A2）用（A1）处理过的所述宿主细胞繁殖猪圆环病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为PK-15细胞；所述猪圆环病毒为II型猪圆环病毒。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（A1）中，所述降低宿主细胞中RBP4蛋白的表达和/或活性为敲除所述宿主细胞中RBP4蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述“敲除所述宿主细胞中RBP4蛋白的编码基因”是通过序列特异性的基因编辑技术对所述编码基因进行特异性剪切来实现的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述序列特异性的基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述“敲除所述宿主细胞中RBP4蛋白的编码基因”是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现的；以RBP4蛋白的编码基因中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述靶序列为SEQ ID No.1。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述“敲除所述宿主细胞中RBP4蛋白的编码基因”是通过包括如下步骤的方法实现的：将重组载体pX459M-gRNARBP4导入所述宿主细胞中；所述重组载体pX459M-gRNARBP4为将SEQ ID No.1所示DNA克隆到pX459M质粒的两个酶切位点Bbs I之间后得到的重组质粒。
9. RBP4基因被敲除的PK-15细胞，是按照包括如下步骤的方法制备的：将重组载体pX459M-gRNARBP4导入PK-15细胞；所述重组载体pX459M-gRNARBP4为将SEQ ID No.1所示DNA克隆到pX459M质粒的两个酶切位点Bbs I之间后得到的重组质粒。
10.权利要求9所述RBP4基因被敲除的PK-15细胞或如下（B1）-（B3）中任一所示生物材料在提高猪圆环病毒增殖中的应用；
（B1）SEQ ID No.1所示DNA；
（B2）将SEQ ID No.1中的T替换为U后的gRNA；
（B3）含有SEQ ID No.1所示DNA的表达盒、重组载体。
11.权利要求9所述RBP4基因被敲除的PK-15细胞或如下（B1）-（B3）中任一所示生物材料在制备用于提高猪圆环病毒增殖的产品中的应用；
（B1）SEQ ID No.1所示DNA；
（B2）将SEQ ID No.1中的T替换为U后的gRNA；
（B3）含有SEQ ID No.1所示DNA的表达盒、重组载体。
12.权利要求1-8中任一所述方法或权利要求9所述RBP4基因被敲除的PK-15细胞或如下（B1）-（B3）中任一所示生物材料在制备猪圆环病毒疫苗中的应用；
（B1）SEQ ID No.1所示DNA；
（B2）将SEQ ID No.1中的T替换为U后的gRNA；
（B3）含有SEQ ID No.1所示DNA的表达盒、重组载体。
13.RBP4基因在制备用于提高猪圆环病毒增殖的产品中的应用。
14.根据权利要求10-13中任一所述的应用，其特征在于：所述猪圆环病毒为II型猪圆环病毒。
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