JP2000516935A

JP2000516935A - 生物活性インターロイキン―１（ｉｌ―１）の放出を抑制する方法

Info

Publication number: JP2000516935A
Application number: JP10511023A
Authority: JP
Inventors: エルマクダニエル，マイケル; アールヒル，ジャネット; エイコルベット，ジョン
Original assignee: ワシントンユニヴァーシティ
Priority date: 1996-08-22
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2000-12-19
Also published as: US5780513A; AU4084997A; WO1998007439A1; EP0938327A4; EP0938327A1; CA2264070A1

Abstract

(57)【要約】ＩＬ−１生物活性によって引き起こされる病状で苦しむ患者を治療する方法が提供される。この方法は、ＮＯＳ抑制剤、アミノグアニジンの効果的量を患者に投与することからなる。

Description

【発明の詳細な説明】生物活性インターロイキン−１（ＩＬ−１）の放出を抑制する方法政府援助について本発明は、助成金番号DKO6181、T32、DKO7297による政府援助を得て為された。政府は本発明に所定の権利を保有する。発明の背景（１）発明の分野本発明はインターロイキン−１（ＩＬ−１）に関し、より詳しくは一酸化窒素シンターゼ（nitric oxide synthase）抑制剤の適用による生物活性ＩＬ−１の放出を減少させる方法に関する。（２）関連技術の説明インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、一般に２つの構造的に関連したポリペプチド、ＩＬ−１αとＩＬ−１βが知られている。これらは、発熱、睡眠、食欲減退、低血圧、そして急性及び慢性の炎症性反応の誘発を含む多様な生物学的効果を産生する（Dinarello，Trends in Pharmaceut．Sci．14:155-158，1993，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）。他の物質中でのＩＬ−１（αとβ）は、免疫応答性を規則化するための媒介物質として働くプロインフラマトリサイトカイン（proinflammatory cytokine）である。ＩＬ−１は微生物の侵入に対する宿主の防御応答の刺激や傷の治癒促進のような状況で有効である。しかし、ＩＬ−１の慢性或いは過剰な産出により障害的な効果を生じることがある。驚いたことに、多くの病理生態学的な病状はＩＬ−１が関与していると考えられている（Dinarello，Adv．Pharmacol．25:21-51，1994ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）。例えば、ＩＬ−１産出物は自己免疫性の糖尿病でランゲルハンス島のβ−細胞の死滅に関与していた（Corbett et al.，Diabetes 41:897-903，1992，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）；敗血症ショック症候群における重大な低血圧症（0kusawa et al.，J．Clin．Invest．81:1162-1172，1988;Fische r et al.，Am．J．Physiol．261:R442-R452，1991;Smith et al.，Am．Soc．Cli n．Oncol 9:717，1990;Fischer et al.，Crit．Care Med．22:12-21，1994,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）；急性の骨髄芽球性及び慢性の骨髄性白血病細胞の成長（Rambaldi et al.，Blood 78:3248-3253，1991;Estr ov et al.，Blood 78:1476-1484，1991，Peled et al.，Blood 78:1172-1177，1 991ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）；アテローム硬化症の展開（Dinarello，Trends pharmaceut．Sci．14:155-159，1993,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）；虚血性脳障害（Rothwell et al.，C erebrovasc．Brain Metab．Rev．5:178-198，1993,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）；アルツハイマー症に伴う進行性退行効果及びダウン症におけるアルツハイマー症に類似の神経病理学的な変化（Mrak et al.，Human Pathology，26:816-824，1995，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする），そして、骨粗鬆症（Kimble et al.，Calcif．Tissue Int.，55:260-2 65，1994，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）。ＮＯＳの複数のアイソフォームは特徴付けされ、遺伝子発現及び共同因子要求性に基づき構造性（ｃＮＯＳ）又は誘導性（ｉＮＯＳ）のサブタイプによりクラス分けされた。ｃＮＯＳサブタイプは血管内皮及び脳に局在し、Ｃａ²⁺及びカルモジュリン依存性で、身体的な刺激や受容体の活性に応答して少量のＮＯ・を放出する（Bredt et al.，PNAS，USA 87:682-685，1990，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）。ｉＮＯＳサブタイプの発現は、マクロファージ、血管平滑筋、繊維芽細胞を含む種々の細胞中、そしてエンドトキシンやサイトカインに晒された内皮細胞で誘発される。このｉＮＯＳサブタイプはＣａ²⁺及びカルモジュリン非依存性で、標的細胞に対して細胞増殖抑制及び細胞毒のあるＮＯ・を極めて多量に産出する（Hibbs et al.，in M oncada，S.，Higgs，E．eds．Nitric Oxide From L-Arginine:A Bioregulatory System．New York:Elsevier;pp 189-223，1990，Rosa et al.，Biochem．Biophy s．Res．Commun．172:1246-1252，1990，Stuehret al.，PNAS，USA，88:7773-77 77，1991,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）。多くのタイプの細胞は構造的に低レベルのＮＯ・を産出するｃＮＯＳを利用し、特定の他のタイプの細胞や組織は、病気、損傷或いはストレスによる刺激を受けた時にＮＯ・を多量に産出するｉＮＯＳを利用する。過度のＮＯ・の産出はＩＬ-１生物活性物のレベルを増加させることに結び付く、ただしこの関係に関してその因果関係は未だ解明されていない。このＩＬ-１の有害な効果を抑制するための多くの試みは現在調査中である。これらの典型的な試みは、転写或いは翻訳を禁止して病気や外傷の発症の間、ＩＬ-１の産出を低減させようとすることを含んでいる。幾つかの薬やサイトカインはこの点に関してＩＬ-1の産出を禁止するように作用することが知られている、しかし多くの事例でそれらの作用は他のサイトカインの産出に多面的であることか明らかになった。ＩＬ−１の生物活性低減に対する一つの研究はＩＬ−１βの前駆体のタンパク質分解開裂を禁止することを含む。非ＩＬ−１α前駆体、ＩＬ−１βは最適な生物活性のためにタンパク質分解開裂を必要とする。成熟或いは活性形態へのＩＬ −１β前駆体のタンパク質開裂のための酵素はＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）として知られ、細胞の細胞質のみに見出されている。ＩＣＥの抑制剤は同定されているが、単にペプチド−ベース（peptide-base）の形式であり、臨床上で適切にＩＬ−１の生物活性を低減させる事については未だ示されていない。さらに、ＩＬ−１αは前駆体として作用し、ＩＬ−１を産出する細胞からの放出の過程を要求しない。すなわち、ＩＬ−１の成熟を要求する酵素を進行させるタンパク質前駆体をブロックすることの研究は殆ど価値がないと思われている。ＩＬ−１受容体をブロックすることは、病中で有害な効果を及ぼすＩＬ−１の能力を低減させるためのもう一方の選択肢であった。標的細胞上にＩＬ−１受容体を結合させる能力のある自然ペプチドは同定されており、ＩＬ−１の結合を阻害し、これは炎症や他の病理生態学的な過程を軽減して患者に改善をもたらす。この研究は、効果的に経口で適用できずその代わりに注射によって適用しなければならないという組み替えペプチド分子を使用することを要求する欠点を有していた。一般に組み替えペプチド分子の注射で患者には副作用があり、所望の効果を得るために所定期間に亘り注射を繰り返さなければならない（Arend et al.， Arthritis & Rheumatism，38:151-160，1995，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）。他の自然ペプチドが同定され、これは特に標的細胞受容体に結合することを完全に抑制する可溶ＩＬ−１に結合する。これらの分子は、ＩＬ−１モノクロナール抗体ばかりでなくＩＬ−１の結合領域受容体から成る組み替えペプチドを含む。これらのペプチドは、体内で受容体と相互作用するすべてのＩＬ−１を完全にブロックできるという利点があり、ＩＬ−１の全てを効果的に中和する。ただし、この研究の欠点は、効果的な宿主免疫応答のための要求として幾つかのＩＬ− １生物活性には望ましいことである。全てのＩＬ−１生物活性を抑制する方法としては好ましくなく、実施される前に真剣な判断が必要である。そこで、慢性或いは過度のＩＬ−１生物活性の有害効果を有効に抑制すること、さらに生物学的な利用性での処理欠陥を含むことが無く、望ましくない副作用を生み出すことがない開発がなされることが望まれる。本発明の簡単な説明したがって、本発明は増加したＩＬ−１生物活性によってなされる有害な状態に対処するための新規な方法を提供する。この方法はＮＯＳ抑制剤、アミノグアニジンの有効量もって適用することからなる。驚いたことに、ＩＬ−１生物活性の増加は、アミノグアニジンによる時間−と濃度−依存形態（time-and concent ration-dependent manner）で殆ど十分に抑制される。この処理は、慢性的に或いは過度の量で産出される生物活性なＩＬ−１の環境下で有効である。ここで使用する、用語の”処理する”又は”処理”は病状を軽減すること或いは病状の発症及び発現の抑制を意味するものである。また、本発明では細胞内に産出されたＩＬ−１タンパク質の総量に影響を及ぼすことなくＩＬ−１産出細胞から放出されるＩＬ−１生物活性物を規制するＮＯ・を示した。本発明により達成される複数の利点のうちで、ＩＬ−１生物活性によって作られる状態を処理するための方法を提供するものであること；慢性或いは過度のＩＬ−１生物活性に関連した状態を処理するための方法を提供するものであること；ＩＬ−１を産生させる細胞からのＩＬ−１合成に変化させることなくＩＬ−１生物活性物の規制をするための方法を提供するものであること；ＮＯＳによってＮＯ・形成を仲介するＩＬ−１の抑制方法を提供するものであること；そして経口的に又は非経口的に適用されてＩＬ−１が作った状況を処理する方法を提供するものであることについて、注目される。図面の説明図１は、アミノグアニジンに類似のＮＭＭＡの効果で、（ａ）はマウスのマクロファージを活性化したＬＰＳによる、（ｂ）はＬＰＳ及びＩＦＮにより活性化されたマウスの腹膜マクロファージによるＩＬ−１生物活性の放出抑制に関して示し；図２は、ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ264．7細胞から放出された生物活性なＩＬ −１の抑制依存投与量及び、（ａ）アミノグアニジン及び（ｂ）アミノグアニジンに類似のＮＭＭＡによる同一のＬＰＳで刺激されたＲＡＷ264．7細胞からの培地内で検出されたＮＯ・レベル減少を示し；図３は、ＮＭＭＡの効果との比較における生物活性ＩＬ−１の放出でのＮＯＳ抑制剤アミノグアニジンとヨードニウムジフェニル（ＩＤ）の効果について示している；図４は、ＩＬ−１を過度に産出する試験管中でＬＰＳによって刺激された細胞からの培地中での生物活性ＩＬ−１の増加したレベルはＮＭＭＡによって抑制され、そしてＮＯ・供与体はＮＭＭＡによって抑制されたＬＰＳで刺激されたＩＬ −１生物活性を再構成することができることを示し；図５は、ＥＬＩＳＡアッセイによる評価として、ＬＰＳが刺激したＩＬ−１産出細胞から放出されたＩＬ−１タンパク質でのＮＭＭＡとＮ０・の効果について示し；図６は、（ａ）はＮＭＭＡの存在又は不存在或いはＮＯ・供与体存在又は不存在で細胞内と細胞外でのＩＬ−１生物活性について、（ｂ）［³⁵Ｓ］−メチオニンのイムノプレシピテーションがラベルされた細胞外及び細胞内でＬＰＳが誘発したＩＬ−１αについて、（ｃ）［³⁵Ｓ］−メチオニンのイムノプレシピテーションがラベルされた細胞外及び細胞内でＬＰＳが誘発したＩＬ−１βについて、そして（ｄ）［³⁵Ｓ］−メチオニンのイムノプレシピテーションがラベルされた細胞外及び細胞内でＬＰＳが誘発したＩＬ−１Ｒａについて示し；図７は、ＬＰＳが刺激したＩＬ−１産出細胞から放出された生物活性ＩＬ−１のＮＭＭＡ抑制を反転することにおける８−ブロモ−ｃＧＭＰの効果を示し；図８は、ＬＰＳが刺激したRAW264.7細胞から放出される生物活性ＩＬ−１を測定するアッセイの比較であり、（ａ）はRINm5Fバイオアッセイ、そして（ｂ）はＩＬ−１固有の抗体で前処理する前後で胸腺細胞増殖反応アッセイについて示し；図９はＮＯＳ抑制剤の効果に関し、（ａ）ＬＰＳとＰＭＡに刺激されたヒト単核細胞からの生物活性ＩＬ−１の放出そして（ｂ）刺激されたヒト単核細胞、U9 37から放出されたＩＬ−１についてのＮＯＳ抑制剤による抑制依存量について示している。好ましい例の説明本発明に基づき、ＩＬ−1産出細胞により放出されたＩＬ−１生物活性物を効果的に低減するＮＯＳの抑制剤による処理について説明する。ＩＬ−１生物活性の低減は、細胞内で産出されるＩＬ−１の量或いはＩＬ−１産出細胞を産出からの工程に影響を及ぼすことなく行なわれる。加えて、その効果は濃度依存であり、高濃度のＮＯＳ抑制剤で完全なＩＬ−１生物活性物の停止を達成することが出来る。この方法は個体にＮＯ・のＮＯＳ生成物に作用する抑制剤としてアミノグアニジンを適用することからなり、これはＮＯＳ抑制剤が、合成されたＩＬ−１タンパク質或いはＩＬ−１産出細胞による工程に影響を与えることなく、効果的にＩＬ−１の生物活性を抑えるという発見に基づくのである。アミノグアニジンは本発明における実施について、好ましいＮＯＳ抑制剤である。他のやや好ましいＮＯＳ抑制剤は本発明において同様に有効であり、Ｎ-モノメチル-Ｌ-アルギニン（ＮＭＭＡ）、Ｎ，Ｎ'-ジアミノグアニジン、メチルグアニジン及び１，１ '-ジメチルグアニジンのようなアミノグアニジンの類似体又はこれから誘導されたものである。上記類似体又は誘導物に比較したアミノグアニジンの優れた点は、他の抑制剤がｉＮＯＳ及びｃＮＯＳ双方を抑制するのに対し、アミノグアニジンはｉＮＯＳからのＮＯ・形成を選択的に抑制することである。ＩＬ−１は直接的に病気又は外傷に応答する宿主に作用する。これは一般に、決まった病状、特に炎症や感染症で初期或いは戦力的な応答を引き起こす本来のサイトカインであると推測される。ＩＬ−１は免疫応答性を高め、感染に対する非特異対抗性を増加させる。しかし、急性又は慢性のＩＬ−１生物活性物は、免疫学的な或いは炎症性の状態とは直接関係の無い、衰弱している又は生命の危機にある患者に対し相当な有害性を持つことがある。例えば、低血圧、ショック及び瀕死を伴った敗血症で高レベルのＩＬ−１が血液中に見出される。ＩＬ−１の受容体に対する結合をブロックする方法或いはＩＬ−１に特異的に結合することでＩＬ−１を中和する方法はこれらの徴候を抑制し、これら徴候を伴った潜在的な有害効果を緩和し、そして死亡率を低減する。しかし、ＩＬ−１は、慢性的に或いは過度の量が産出されたときに宿主に対してその有毒性があるにも拘わらず、その存在は必要である。ＩＬ−１の防御システムレベルは生命維持の臨床的戦術であることが分かっているが、しかし、ＩＬ−１生物活性物の排除は宿主に好ましい免疫学的な防御をもたらさない。すなわち、アミノグアニジンの適用によりＩＬ−１の生物活性を制御することは宿主に有利なことであり、炎症或いは感染症及びＩＬ−１による代謝障害又は他の症状に応答する宿主の能力は減じられないからである。ＩＬ− １の過剰量は一般に様々な環境刺激に対する応答における刺激でマクロファージから放出される（Mrak et al.，Human Pathology，26:816-824，1995）。アミノグアニジンはｉＮＯＳの遮断はするがｃＮＯＳや他のサイトカインは遮断しないという反応機構によりこれをブロックすることができる。つまり、ＩＬ−１生物活性物の過剰産出のみ緩和され、ＩＬ−１生物活性物の過剰産出によって生じた病状の効果的な処理を提供する。病状によっては外観或いは病気の徴候が参照され、全体においては必要がない。すなわち、複数の患者の特異な外観、徴候又は状態は、同じ病気で明らかにされていなかった外観、徴候又は状態の他の患者の病気を明らかにすることを可能にする。当業者はＩＬ−１生物活性物の過剰産出によってもたらされる状態の処理を指向する本発明を当然に評価する。そのような状態は含むが、グラム陰性菌感染により誘発された敗血症ショックの急性低血圧危機やグラム陽性菌毒、エドトキシンにより誘発された低血糖症には限定されない（Henricson et al.，Infect．Immun．59:1188-1191，1991,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、単球性白血病（Mazzei et al.，Eur．J．I mmunol．20:683-689，1990;Seckinger et al.，Ann．Inst．Pasteur/Immunol．1 39:461-516，1987;Seckinger et al.，J．Immunol．139:1546-1549，1987，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、急性骨髄芽球性白血病（Es trov et al.，Blood 78:1476-1484，1991,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、慢性骨髄性白血病（Rambaldi et al.，Blood 78:3248-3253 ，1991,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、慢性若年性顆粒球性白血病（Bagby et al.，J．Clin．Invest．82:1430-1436，1988; Dinarel lo，Tips 14:155-158，1993,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、アルツハイマー症に伴う進行性退行効果及びダウン症におけるアルツハイマー症に類似の神経病理学的な変化（Mrak et al.，Human Pathology，26:816-8 24，1995,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、エストロゲン欠乏のよる骨喪失と骨吸収の介在（Kimble et al.，Calcif．Tissue Int.，55 :260-265，1994，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、そして他のＩＬ−１は発熱を伴う病状を誘発した。実験データは宿主の自然防御機構を高めるＩＬ−１の役割を示しているが、過剰なＩＬ−１生物活性物は、病気への応答において有害な効果を生じさせる主な要因となることが示され、ＩＬ−１生物活性物の抑制はこれら有害効果からの防御出来ることを示唆している。同様に、複数のＩＬ−１生物活性物は、効果的な宿主の自然防御機構に要求され、全てのＩＬ−１生物活性物の抑制をすることは好ましくないことが表されている。本発明はＩＬ−１の好ましい必要な効果を全体的に排除することなく、アミノグアニジン又はその関係化合物によって過剰なＩＬ−１生物活性物を十分に低減し、望ましい効果を提供するもので、これにより慢性或いは過度のＩＬ− １生物活性物により引き起こされる有害な状態が軽減若しくは除かれる。本発明は、ＩＬ−1産出細胞からのＩＬ−１合成のレベルに影響を及ぼすことがないので従来の研究とは区別することができ、しかもＩＬ−１生物活性物を十分に低減している。傷害、外傷又は病気の状態は、主に造血細胞から生物活性なＩＬ−１α及びＩＬ−１βの産出を誘導する。これらのペプチドは免疫応答の規則においてキーとなる媒介者である。しかし、ＩＬ−１の不適切な発現は、関節炎や糖尿病の患者に見られるように有害な病状に結びつく。そして、高レベルのＩＬ−１は、低血圧、ショック及び瀕死の状態を伴う敗血症の血液中に見出された。ＩＬ−１の研究は一般に、ＩＬ−１合成、工程を制限する方法、また分泌系、また標的細胞の受容体との相互作用に着目して為されてきた。ＩＬ−１は効果的な宿主の防御を要求されるので、全体的にその効果をブロックすること、宿主を感染に対してより傷つき易く或いは免疫学的な攻撃に対する応答性の低下を生じるような、またその合成を低減させることは可能である。本発明は、ＩＬ−1 産出細胞のＩＬ−１合成のレベルに影響を及ぼすことがないので従来の研究とは区別することができ、しかもＩＬ−１生物活性物を十分に低減している。ＩＬ−１の生体内での主な起源はマクロファージと単核細胞である。科学者のＩＬ−１活性及びその効果の研究は、これらの細胞から誘導したセルラインから得たものを利用している。本研究で使用された培養セルラインは不滅化されたリンパ細胞、腹膜洗浄液から誘導されたマウスのリンパ細胞又はヒトの血液から誘導された単球にもかかわらず、当業者は全ての細胞が発現したＩＬ−１を類似の形式で使用できるということに容易に気付くであろう。さらに、アミノグアニジン又はこれに類似の化合物で処理された効果は新規に合成されたＩＬ−１の合成又は放出で複数の効果、またいくつかの効果はそれらペプチドの産出工程や放出に影響している可能性がある。一般的な分泌タンパク質ではシグナルペプチドによるアミノ端末のアミノ酸配列を含む前駆体が最初に合成され、これは成熟、活性タンパク質を放出する分泌工程の間に必須的にタンパク質分解開裂される。しかし、ＩＬ−１αとＩＬ−１βの両方は、成熟、生物活性形態を放出するために必須的に開裂された前駆体として合成され、さらにシグナルペプチドに関係した配列を含まず、そして細胞を合成したＩＬ−１からのそれらの放出モードも知られていない。本発明はアミノグアニジン又はその関連化合物での処理で、ＩＬ−1産出細胞によるＩＬ−１αとＩＬ−１βの合成或いは工程のどちらにも実質的な影響を与えず、これによりそれらの工程における複数の影響を与えると思われる処理を抑制することが出来る。いくつかの作用機構により結合されることを意図したものではないが、細胞死及び膜浸透性はＩＬ−１放出を要求することを可能とする。過度のＮＯ・形態は細胞死及び膜透過に導くことが確認された。細胞死と膜透過性を観察する１つの方法は、合成、そして細胞質又はいくつかの他の細胞構成、液胞或いは細胞小官のみに局在することが知られた酵素の存在について全細胞と媒質をモニターすることである。乳酸デヒドロゲナーゼはそのような酵素の１つで、これは実質的に全てのタイプに存在し、無傷細胞の境界内にのみ見出される（Estrada et al.， Biochem．Biophys．Res．Commun．186:475-482，1992，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）。本発明者等は、ＬＰＳが刺激した細胞からの媒体中に放出されたＩＬ−１のＬＤＨレベルの測定により、膜透過性或いは細胞死を生じさせないＩＬ−１合成をＬＰＳは誘導するということを確認し、これはマクロファージを活性化するＬＰＳからのＩＬ−１生物活性物の放出機構は細胞の溶菌によるものではないということが示される。ＩＬ−１転換酵素（ＩＣＥ）とカルパイン（calpain）はＩＬ−１の前駆体形態の開裂に係るプロテアーゼである。この両酵素は細胞内の細胞質と残さ中に合成される。両酵素はシステインプロテアーゼであり、遊離チオール残基を含む。ＩＬ−１αは細胞内プロテアーゼにとって通常のように開裂された大きめの前駆体として合成されるが、この前駆体は同様に活性があることが知られている。ＩＬ−１βはその前駆体の形態で不活性であり、適切な処理でのみで活性となる。ＮＯ・はよく知られたＳ−ニトロシレート（Ｓ-nitrosylate）であり、これはアミノグアニジンのようなｉＮＯＳ抑制剤の存在下で放出されたＩＬ−１の生物活性抑制のための機構となる。ミセチェッティ等(Michetti et al.,)（Biochem．B iophys．Res．Comm．207:1009-1014，1995,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）は、ＮＯ・供与体は逆にカルパインのタンパク質分解活性を不活性とし、タンパク質分解の前工程における調製によったＩＬ−１生物活性物の減少を想定させる。しかし、未処理の前駆体がパルス/チェイス法（pulse/cha se）及び免疫沈降反応によって、或いはＥＬＩＳＡによって検出された、ただし生物活性アッセイでは検出されなかった。本発明者は、［³⁵Ｓ］−メチオニンでラベルしたＩＬ−１ αとＩＬ−１ βの免疫沈降反応によりＮＯ・の存在はＩＬ −１ αとＩＬ−１ βの合成又はＬＰＳが刺激したマクロファージの前工程に影響を与えないということを証明した。上述したように、本発明ではＮＯ・がＩＬ −１生物活性を変えることを見出したものである。さらに、ＬＰＳが活性化したマクロファージ細胞（特にＩＬ−１Ｒａ）から協分泌（co-secreted）されたＩＬ−１抑制要因のレベル又は活性を修正することによって、ＮＯ・はＩＬ− １生物活性を刺激しない。加えて、アミノグアニジン又はその関連化合物による処理はＩＬ−１Ｒａ又はその産出又はＩＬ−１が引き起こす細胞からの放出に影響を与えない。これはＩＬ−１ＲａはＩＬ−１生物活性のＮＯ・修正で役割をしていないことを示唆している。ＩＬ−１タンパク質の生物活性は、病気或いは外傷により産出したIL−１の量よりも、ＩＬ−１によって為された重大な病状のより有効な指標であるということが確認できる。すなわち、アミノグアニジン又はその関連化合物の有効用量の適用によって慢性或いは過剰なIL−１生物活性によることが明らかな病状の処理は、IL−１の生物活性を抑制し、患者の状態を改善してその生存率を高める。慢性或いは過剰のIL−１生物活性によることが明らかにされている複数の適切な例は単球性白血病（Mazzei et al.，Eur．J．Immunol．20:683-689，1990;ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、急性骨髄芽球性白血病（ Estrov et al.，Blood 78:1476-1484，1991,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、慢性骨髄性白血病（Rambaldl et al.，Blood 78:3248-325 3，1991,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、慢性若年性顆粒球性白血病（Bagby et al.，Tips 14:155-158，1993,ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、アルツハイマー症に伴う進行性退行効果及びダウン症におけるアルツハイマー症に類似の神経病理学的な変化（Mraket al.，Hu man Pathology，26:816-824，1995，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、エストロゲン欠乏のよる骨喪失と骨吸収の介在（Kimble et al. ，Calcif．Tissue Int.，55:260-265，1994，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）、そして他のＩＬ−１は発熱を伴う病状を誘発した。ＩＬ−１生物活性の不適或いは過剰産出によりもたらされた病気或いは症状を処理するための本発明に従って、アミノグアニジンと他のＮＯＳ抑制剤は使用される。そのような病気或いは症状としては、炎症又は免疫的な病気を伴わないこと及び／又はそれらの炎症又は免疫的な病気を伴うことを含むことができる。本発明の範囲にある病状は後生的なグリコシ化された終産物を含む病状とは区別されるものである。すなわち、それはＩＬ−１生物活性によってもたらされた病気の特異な外観、症状或いは状態であり、一方で、後生的なグリコシ化された終産物の産出のような他のメカニズムによって別の外観、症状或いは状態で同時又は異った時に発現するものにも適用できる。本発明の処理はＩＬ−１生物活性によって生じた状態或いは症状向けられているということを当業者は容易に理解できるであろう。すなわち、本発明は、慢性或いは過剰なＩＬ−１生物活性の放出の結果としての重大な病状を軽減し、取り除くものである。本発明の組成物は、多くの投与形式をもって適用することができ、経口、舌下、鼻内、皮下、筋内、静脈内、経皮、腹腔内、くも膜下及び直腸経路を含む。その組成物には医薬的な調製において一般的なものが採用できる。この調製は医薬業界でよく知られた形式で行なわれ、約１から95重量％の少なくとも１つのＮＯＳ抑制剤から構成される。そのような医薬組成物は活性成分アミノグアニジン又はその類似体或いはその誘導体、そして医薬的に適用可能な担体により構成される。この組成物の製造において、活性成分又は他の成分は、通常のように担体と混合され、担体により希釈され、或いはカプセル又は他の容器の形態での担体内に詰められる。担体が希釈の役割を果たす時、それは固形、半固形或いは液体原料であり、活性成分のための媒介物、賦型剤又は媒質として機能する。すなわち、この組成物は、タブレット、ピル、粉、ロゼンジ（lozenge）、カシェ剤、エリキシル、乳剤、溶液、シロップ、懸濁剤、エーロゾル（固体又は液体媒質中）、例えば上記の活性化合物を10重量％まで含む軟膏、軟又は硬質のゼラチンカプセル、坐剤、殺菌注入液そして殺菌包装パウダーの形態とすることができる。適用可能な担体、賦型剤、希釈剤の複数例として、ラクトース、デキストラーゼ、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、ガムアカシア、カルシウム、リン酸塩、アルギン酸塩、珪酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチル-及びプロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウム、ステアリン酸塩、水、ミネラルオイル、その他が含まれる。この形態には潤滑剤、湿潤剤、乳剤、懸濁剤又は賦香剤を含めることができる。この組成物は、当業界でよく知られた手順にしたがって患者に投与した後、活性成分の即時的、持続的又は遅延的放出のための形態を採用することができる。経口投与のために、本発明の組成物は担体及び希釈剤と混合され、型付け或いは加圧されてタブレットに入れられ、或いはゼラチンカプセル内に封入される。この混合物は、10％のゼラチン水溶液、等張塩水、殺菌水その他の溶液内に選択的に溶解することができ、点滴或いは注射で投与される。この様な溶液は、所望により、筋内注入のために殺菌水が添加されて再構成できるように凍結乾燥されその後殺菌アンプル内に保存される。この組成物は好ましくは、アミノグアニジン又はその類似体或いはその誘導体の有効量を含有するそれぞれの投与量で、単位投与形態の形式が取られる。アミノグアニジン又はその類似体或いはその誘導体の量はその効果及び効力により決定されるが、一般には１日当たり約0.001から約1000mg、好ましくは約0.01から約500mgの範囲内である。アミノグアニジン又はその類似体或いはその誘導体の量は、同様にその抑制効果によるが、しかし、一般には１日当たり約0.001から約1000mg、好ましくは約0.01から約500mgの範囲内である。用語の”単位投与形態”はヒト及び他の哺乳類のための単一の投与量として適切な独立単位で、それぞれの単位は所望の医薬の担体を伴って、所定量の活性材料又は所望の治療効果を促進するための材料を含む。本発明の組成物は、治療或いは予防の効果また使用された所定の化合物によって投与の範囲で有効である。例えば、アミノグアニジン又はその類似体或いはその誘導体の有効投与量を含む本組成物は、体重によって約0.00002から約50mg/Kg の範囲内となる投与量で構成される。成人の治療に関して、本組成物は体重によって約0.0002から約20mg/Kgの範囲内となる量で少なくとも１つのＮＯＳ抑制剤を含有していることが好ましい。しかし、本化合物の現実的な投与量については、状態或いは治療すべき症状を含んだ適切な状況、アミノグアニジン又はその類似体或いはその誘導体を含めて投与されるべき化合物の選択、年齢、体重、個々の患者の応答、患者の病状の程度、投与形態の選択を考慮し、医師の決定によるものであることが理解される。なお、上記投与量の範囲はいかなる場合にも本発明の範囲を限定するものではない。本発明の好ましい実施は以下の例により説明される。本件の請求の範囲内となる他の実施形態は、本明細書の理解をした或いはここでの開示に基づいて本発明を実施した当業者にとっては明らかである。例に続く請求の範囲によって示された本発明の範囲及び思想によった、例を含めた本明細書は単なる例示である。上記例によって得られた結果は以下の表１及び添付の図１から９に示される。例１この例は、ＬＰＳで剌激するマウスマクロファージからのＩＬ−１生物活性物の時間依存放出、及びＩＬ−１放出抑制についてアミノグアニジンの類似体、ＮＭＭＡについて説明する。ＩＬ−１生物活性を測定するための一般的なＩＬ−１共誘導（co -induced）胸腺細胞増殖反応に基づいた方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６及びＴＮＦαを含む他のサイトカインとの交差反応により複雑化される（Gerain g et al.，J．Immun．Methods，83:1-27，1985;Remving Dan．Med．Bull.，40:2 55-265，1993，ここでの引用により本明細書に記載されたものとする）。そこで、ＩＬ−１が作用する細胞により合成されたＩＬ−１の分析を簡易化するために、本発明者等はＩＬ−１がインスリノーマセルライン、ＲＩＮｍ５Ｆから誘導した一酸化窒素生成物に基づいてＩＬ−１生物活性を測定するために、特別の無放射バイオアッセイを開発した（Hill et al.，Analytical Biochemistry，236:14 -19，1996）。ＲＩＮｍ５Ｆはインシュリン分泌セルラインで、放射線誘発のラット小島細胞腫瘍（rat islet cell tumor）から精製されたものである（Dinare llo，FASEB J.，8:1314-1325，1994; miller et al.，Ann．NY Acad．Sci.，696 :133-148，1993，Iここでの引用により本明細書に記載されたものとする）。ＲＩＮｍ５Ｆ細胞は、0.1-1U/ml（10-100pg）の範囲でマウスとヒトのＩＬ−１α とＩＬ−１βに特異的かつ線形的に応答し、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＬＰＳと交差反応しない。ＲＩＮｍ５Ｆ細胞のＩＬ−１に対する応答は、この特異な刺激応答において産出されたＮＯ・のレベルを決定することにより測定できる。ＮＯ・のレベルは、96ウエルマクロタイタプレート（96well microtiter plate：Green et al. ，Anal．Biochem．126:131-138，1982）中で50μｌの培地を等量のグリエス試薬（Griess reagent：水中で0.1％のナフチルエチレンジアミンジヒドロクロリドの１部を60％の酢酸中で1.32％のスルファニルアミド１部に加える）と混合して作られた培地に放出された亜硝酸塩により決定された。540nmでの吸収は、96 ウエル自動プレートリーダーを使用して測定され、亜硝酸塩濃度は、濃度範囲0. 1から10nmolのＮａＮＯ₂（Fisher）を用いた標準曲線から外挿された。ＲＡＷ26 4.７細胞、マウスマクロファージセルライン（Washington University Tissue Cultu re Support Center）及びベックマン等（J．Immuno.，150:888-895，1993）に示されたように雄のＣＤ１マウスの腹腔液から得たマウス腹腔浸出細胞（ＰＥＣ）は、ＬＰＳが誘導するＩＬ−１の合成のための源として使用された。外因性添加のＬＰＳはＩＬ−１産出細胞からのＩＬ−１αとＩＬ−１βを誘発する。全ての細胞は完全ＣＭＲＬ（CMRL-10066(Gibdo Laboratorles，Grand Island，NY)加熱培養された10％の胎仔ウシ血清、2MmのL-グルタミン、100units/mlのペニシリン及び100μｇ/mLのストレプトマイシンで補足された）中で生育、保持され、37℃ 、95％の空気、５％の二酸化炭素で平板培養した後、24時間培養し、培地（200 μＬ）は実験開始前に交換された。ＲＡＷ264.7細胞又はＰＥＣ細胞は、実験前の24時間にマイクロタイタの各ウエルに総量200μｌで2×10⁵セルで平板培養された、培地（200μｌ）は除かれ、事件開始の直前新しい培地（200μｌ）に変えられた。ＩＬ−１生物活性は、ＬＰＳが活性化したＲＡＷ264.7細胞又はＬＰＳプラスＩＦＮγが活性化したＰＥＣ細胞そしてＲＩＮｍ５Ｆ細胞（200μｌで2×10⁵セル；使用無細胞培地の1：100希釈）に2μｌを添加する無細胞培地を得て決定した。同時に、標準曲線が0.1から1U/ml（10-100pg）間の濃度でヒトＩＬ−1β（C istron，Pine Bluff，NJ）を使用してなされた。37℃、95％の空気、５％の二酸化炭素で24時間培養した後、培地は回収され、亜硝酸塩（NO・）レベルが決定された。データは図１（ａ）と（ｂ）に示され、使用培地中のＩＬ−１濃度は標準曲線から外挿された。択一的に、ＩＬ−１生物活性は、胸腺細胞増殖反応アッセイにより決定された。ＬＰＳが刺激するＲＡＷ264.7細胞又はＰＥＣ細胞から最終希釈1：100、1：50 又は1：10で得た無細胞培地は、１×10⁶の胸腺細胞（200μｌ）に添加された。胸腺細胞は、５％の胎仔ウシ血清と2.5μＭのβ-メルカプトエタノールを伴い、１μ ｇ/mlのＰＨＡ（Muegga and Durham，Jhon Wiley and Sons，1991，6.2.1）で刺激（co-stimulated）されたＲＰＭＩ培地中の6から12週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（Jackson Labs）から分離された。［³Ｈ］−チミジン（１μＣＩ）は48時間培養の最後の６時間で添加された。細胞はガラスファイバーフィルターで採取され、合併したラベルは液体シンチレーションカウンターで決定された。ＩＬ−１の濃度はヒトＩＬ−1βを同時に使用することで標準曲線から外挿した。ＬＰＳが刺激したＲＡＷ264.7マウスマクロファージ細胞とＬＰＳプラスＩＦＮγが刺激したＰＥＣ細胞は培地中に生物活性ＩＬ−１を放出していることが示された（図１（ａ）及び（ｂ））。ＲＡＷ264.7は細胞は、24時間、１μｇ／ml のＬＰＳ又は1μｇのＬＰＳと0.25mMのＮＭＭＡに晒された。ＰＥＣ細胞は、24 時間、１μｇ／mlのＬＰＳと150u/mlのＩＦＮγ又は1μｇ／mlのＬＰＳと150u/m lのＩＦＮγと0.25mMのＮＭＭＡに晒された。無細胞培地は24時間後に除去され、-70℃で保存された。ＩＬ-1生物活性は上述のようにＲＩＮｍ５Ｆアッセイによって測定された。図１について、ＬＰＳがＲＡＷ264.7マウスマクロファージ細胞は生物活性なＩＬ-1を放出した。ＩＬ-1はＬＰＳの添加後18時間で最初に検出され、24時間でレベル10に増加し非刺激制御レベルを維持した（図１ａ）。ＬＰＳの添加がさせている培地へのＮＭＭＡの添加は殆ど完全にＩＬ-１生物活性の時間依存放出を抑制した。無細胞培地中のＩＬ-１生物活性は、上記のようにＬＰＳが刺激したＩＬ-１産出細胞からの培地へ放出された生物活性なＩＬ-１に応答する亜硝酸塩レベルを測定するＲＩＮｍ５Ｆバイオアッセイにより示された時間で決定された。ＲＡＷ264.7とＰＥＣ培地からのＮＭＭＡの取り込みがＲＩＮｍ５Ｆバイオアッセイで阻害されないことを確実にするために、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞に添加される直前24時間でＮＭＭＡは刺激されたＲＡＷ264.7細胞に添加された。ＬＰＳ及びＬＰＳ＋ＮＭＭＡから得た培地でのＩＬ−１生物活性は24時間で刺激したＲＡＷ264.7細胞は同一であった。持ち越されたＮＭＭＡの低濃度（1:100希釈）はＲＩＮｍ５Ｆ細胞によるＮＯ・生成物に影響を与えないということが示される。ＬＰＳとＩＦＮγで刺激されたマウス腹腔浸出細胞（ＰＥＣ）は同様に時間依存形態で生物活性なＩＬ−１を放出した。そして、この活性はＮＭＭＡとの共培養（ co-incubation）により十分に抑制された。例２本例はＬＰＳ−刺激ＲＡＷ細胞からの生物活性ＩＬ−１放出の投与量依存抑制と、（ａ）アミノグアニジン及び（ｂ）そのアミノグアニジンの類似体、ＮＭＭＡによる同じＬＰＳ−刺激ＲＡＷ264.7細胞からの培地で検出されたＮＯ・レベルの減少について説明する。図２を参照すると、ＲＡＷ264.7細胞は、24時間、濃度0から1mMの範囲で1μｇ /mlのＬＰＳとアミノグアニジンにより共培養され、上述のように亜硝酸塩とＩＬ−１生物活性の培地レベルが決定された。図２（ａ）のグラフは、ＩＬ−１生物活性の放出とＮＯ・の形成のアミノグアニジン濃度依存抑制について示している。ＮＯ・の濃度は、アミノグアニジンの濃度が上昇することによるＩＬ−１生物活性の減少に並列に減少することが示されている。このデータは、ＮＯ・及びＬＰＳに刺激されたマクロファージからのＩＬ−１生物活性量のレベル間の直接的な相互関係を示す。ＮＯ・とＩＬ−１生物活性の培地へ放出されたＩＬ−１生物活性の両レベルにおけるこの協調的な減少は、この両者が何らかの関係を有していることを示唆している。これは多分、ＮＯＳに対するアミノグアニジンの抑制効果、すなわちＮＯ・の合成を抑えたこと、による減少である。図２（ｂ）では、さらに、アミノグアニジンと同様に、アミノグアニジン類似体、ＮＭＭＡ、同様に抑制されたＩＬ−１生物活性及びＮＯ・の濃度が示されている。例３この例は、ＮＭＭＡの効果と比較で、生物活性なＩＬ−１の放出にけるＮＯＳ抑制剤アミノグアニジンとヨードニウムジフェニル（ＩＤ）の効果を説明する。ＮＭＭＡによる、ＬＰＳにより刺激されたＩＬ−１による細胞から放出の生物活性なＩＬ−１の減衰を決定するために、ＮＭＭＡは一酸化窒素シンターゼ抑制剤により分けられ、上記のＬＰＳで刺激されたＲＡＷ264.7細胞は、ＮＯＳ抑制剤に似た２つの代替物で処理された。アミノグアニジンは選択的にｉＮＯＳを抑制し、非類似ＮＭＭＡは両ｃＮＯＳとｉＮＯＳの抑制で非選択的である。他のＮＯＳ抑制剤、ヨードニウムジフェニル（ＩＤ）は同様に両ｃＮＯＳとｉＮＯＳの抑制で非選択的である。この物質は、ＮＡＤＰＨをブロックし、ＦＡＤが部位に結合することにより作用する（Stuehr et al.，FASEB J．5:98-103，1991）。上記のように、ＲＡＷ264.7細胞は、24時間、ＮＯＳ抑制剤を伴うＬＰＳに晒された。この抑制剤は0.25mMのＮＭＭＡ及びアミノグアニジン、と0.5μＭのヨードニウムジフェニル（ID）である。上記例１のように培地中の残留ＮＯＳ抑制剤はＩＬ−１バイオアッセイを阻害しないことを示すために、コントロールが同時に準備された。亜硝酸塩とＩＬ−１生物活性の培地レベルは上記例１のように決定された。図３に関し、アミノグアニジン、ＮＭＭＡ、及びＩＤは、ＬＰＳにより活性化されたＲＡＷ264.7細胞からのＩＬ−１生物活性とＮＯ・両方の放出を抑制した。これは、抑制剤としてのＮＭＭＡとの比較で、ＩＬ−１生物活性の抑制剤としてアミノグアニジンの有効性を示している。ＮＯ・の形成及び生物活性なＩＬ− １の放出を効果的に抑制することについてのアミノグアニジンとＮＭＭＡの能力は実質的に区別可能である。さらに、これらの抑制剤は、無関係の抑制剤ＩＤの効果とは区別できるレベルで、ＮＯ・のＮＯＳ形成と低減されたＩＬ−１生物活性を効果的に抑制した。ここでのデータ及び例２から、ＮＯ・のレベルと、ＬＰＳが刺激したマクロファージから放出された生物活性なＩＬ−１量の双方の直接的な関係が示され、そしてＮＯ・はＬＰＳが刺激したＩＬ−１が作用した細胞から放出されることが確認でき、生物活性なＩＬ−１の量に影響を与えるということが示唆されていることは明らかである。例４この例は、ＬＰＳにより刺激された細胞からの培地中で増加した生物活性なＩＬ−１のレベルはＮＭＭＡによって低減され、そしてＮＯ・供与体はＮＭＭＡによって抑制されたＬＰＳが刺激したＩＬ−１生物活性を再構成できることが示される。ＮＯ・がマクロファージからの生物活性なＩＬ−１放出を引き出す媒介者として機能しているかどうか判断するために、われわれはＮＯ・供与体、Ｓ-ニトロソ-Ｎ-アセチルペニシルアミン（ＳＮＡＰ）がＮＭＭＡによって抑制された生物活性なＩＬ−１を再構成できるか判断した。図４に関して、ＲＡＷ264.7細胞は、24時間、図４に示されるように、0.25mM のＮＭＭＡとＳＮＡＰの存在下でＬＰＳで刺激され、ＩＬ−１生物活性の培地レベルが上記例１のように測定された。ＲＡＷ264.7細胞への24時間のＬＰＳ刺激は、コントロールレベルより生物活性なＩＬ−１で10倍増加した。ＬＰＳが刺激した生物活性なＩＬ−１レベルは0.25mMのＮＭＭＡにより十分に抑制された。ＳＮＡＰの添加は、投与依存形態（50-200μＭ）でのＬＰＳ刺激細胞による放出が確認されたＩＬ−１生物活性のＮＭＭＡ抑制を逆転した。これらのデータは、ＮＯ・形成の抑制剤が生物活性ＩＬ−1の放出をブロックし、外来のＮＯ・供与体は投与依存形態での抑制効果を逆転しうるということを示している。機構的にＩＬ−１生物活性の放出抑制に無関係なＮＯＳ抑制剤（例３）の能力、ＮＯ・供与体のこの抑制を逆にする能力は、ＮＯ・がＬＰＳが刺激したＩＬ−１産出細胞から放出される生物活性なＩＬ−１の放出と形成の刺激に応答可能な媒介者であることを示している。例５この例は、マウスのマクロファージのＬＰＳ刺激によって産出されたＩＬ−１生物活性の増加は細胞の溶菌によるものではないということが示される。例４に示された細胞は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）で監視される溶菌によってＩＬ−１生物活性が増加したのか決定することについてさらに有意義であり、これは無傷の哺乳類の細胞と同様にＲＡＷ264.7細胞内に見出される。培地中のＬＤＨのレベルを決定するために、後述のようにＲＡＷ264.7細胞から得られた無細胞上澄みの部分100μｌが、最終量0.1mlでｐＨ７のトリス0.1M中で10mMのピルベート（pyruvate）と0.1mMのＮＡＤＨ（Sigma）で培養されて評価された。ＮＡＤＨの酸化は、同一のサンプルの吸収が340nmとなってから10分後に測定された。同一のアッセイが、溶菌のコントロール細胞によって総ＬＤＨ活性を決定するために30分間0.1％のトリトン（Triton）で行われ、更に10分間のＬＤＨアッセイが為された。コントロール細胞内で測定された総ＬＤＨレベルに対する培地内のＬＤＨレベルの比較は、コントロール細胞の溶解質に見られる総ＬＤＨ活性のパーセントとして示されるＬＤＨレベルの決定によった。表１に関して、ＲＡＷ264.7細胞は、刺激の合成と生物活性ＩＬ−１の放出のために、24時間、ＬＰＳ（１μｇ／ml）±0.25mMのＮＭＭＡ±ＳＮＡＰで処理された。培地は除かれ、そしてＬＤＨ活性、ＩＬ−１生物活性及び亜硝酸塩レベルが上述のように測定された。結果は、条件毎に３つの複製を保持する３つの分割された試験の平均とした。表１は、ＬＰＳ刺激が増加させるＩＬ−１生物活性は細胞の溶菌によるものではなく、培地で測定する乳酸デヒドロゲナーゼによる細胞内ＩＬ−１の連続的な放出であることが示されている。ＬＤＨ放出のレベルでの僅かな差は、ＮＯ・（ＬＰＳ及びＬＰＳ＋ＳＮＡＰ＋ＮＭＭＡ）の存在又はＮＯ・（コントロール及びＬＰＳ＋ＮＭＭＡ）の不存在で検出された。種々の条件下での培地中で検出されたＬＤＨのレベルは、ＲＡＷ264.7細胞からの生物活性ＩＬ−１の放出と相互間系はない。ＲＡＷ264.7細胞を200μＭのＳＮＡＰに晒す時間をＬＤＨ放出に十分な48時間に延長しても、ＮＯ・は膜透過性を介した又はＩＬ−１生物活性の放出を検出したときの24時間での細胞死からの細胞質タンパク質の非特異的な放出を刺激するようにならなかった。ＮＯ・−誘導死細胞の24時間での不存在は、トリパンブルー圧排法（trypan blue exclusion）とＤＮＡ断片試験（データは示さず）により確認された。すなわち、本発明者等はＩＬ−１生物活性を増加するための細胞のＬＰＳ刺激は、細胞の溶菌又は膜透過性の増加によるものではないことを確認した。例６本例は、ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ264.7細胞により放出されたＩＬ−1タンパク質の量についてのＮＭＭＡとＮＯ・の効果について説明する。可能性をテストするために、ＬＰＳ刺激が増加したＩＬ−１生物活性におけるＮＯＳ抑制剤の効果は、培地中に放出されたタンパク質の総量での作用によった。ＲＡＷ264.7細胞はＬＰＳと共に、ＮＭＭＡ（0.25mM）の存在、不存在とＳＮＡＰ（200μＭ）の存在、不存在で誘導された。細胞は例１のように刺激された。ＬＰＳ刺激ＲＡＷ264.7細胞から放出されたＩＬ−１タンパク質の濃度は、マウスのＩＬ−１α とＩＬ−１βの抗血清剤を使用するＥＬＩＳＡ法により測定された。マウスのＬ −１αとＩＬ−１βのＥＬＩＳＡアッセイは、生産者指示にしたがって（Genzym e）、無マクロファージ培地の1:10と1:50希釈で行われた。この方法は、ＬＰＳ刺激細胞から放出されたＩＬ−１特異タンパク質の総量を直接的な測定を提供したが、不活性と生物活性ＩＬ−１間の区別はできない。図５での結果は、条件につき３つの反復実験をもつ６つに分割された実験の平均±ＳＥＭである。ＩＬ− １αコントロールとの十分な相違は、”★”（ｐ＜0.001）と、”Ｓ”（ｐ＜0.0 01）により示され、そしてＬＰＳ＋ＮＭＭＡサンプルのＩＬ−1αレベルからの違いは”＃”によって示された。図５に関して、ＲＡＷ264.7細胞は、24時間ＬＳＰの存在下で刺激されＩＬ−1 α放出の量をコントロールレベルより十分に増加させた。ＬＰＳで活性化された細胞へのＮＭＭＡ添加は、ＮＯ・供与体のＳＮＡＰの存在下で逆転されるＩＬ− １αの放出を抑制する。ＬＰＳ刺激でＩＬ−1βの量を増加させ、そしてＳＮＡＰによる低減での逆転ばかりでなくＮＭＭＡの存在下での増加におけるＩＬ−１ β放出の低減の傾向があるが、これら３つの傾向は統計的な意味はない。例７本例は、細胞内のその増加に関してのＮＭＭＡの効果の欠如とマウスのマクロファージのＬＰＳ刺激で放出されるＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−１Ｒａについて説明する。マウスのＰＥＣ細胞はＬＰＳ＋ＩＦＮγ±ＮＭＭＡ±ＳＮＡＰ及び［³⁵Ｓ］- メチオニン（1000Ci/mMol，American Chemicals，Arlington Heights，IL）でラベルされたパルス/チェイス法で刺激された。メチオニン欠損培地（メチオニン無しのＭＥＭを９部：メチオニン有りのＭＥＭを１部）中のマウスＰＥＣ（１× 10⁶細胞）細胞はＬＰＳ（1μｇ/ml）とＩＦＮ-γ（150u/mL）±ＮＭＭＡ（0.25m M）±（200μＭ）により３時間活性化された。その時、細胞は150ｕCiの［³⁵Ｓ］-メチオニントランス-ラベル（trans-label）で４時間、脈動（pulsed）された。細胞はラベル除去のためにＭＥＭで洗浄され、そしてＮＭＭＡとＳＮＡＰに置き換えられた。細胞は追加の17時間（総培養時間は24時間）で培養された。上澄みは採集され、細胞は1分間の遠心分離200×ｇで除かれた。ラベルされた細胞はＰＢＳ中で洗浄され、0.15MのＮａＣｌ、１％のノニデット（nonidet）＋プロテアーゼ抑制剤（アプロチニン１μｇ/ml；レウペプチン（leupeptin）１μｇ/m l：ＰＭＳＦ0.1mM；ヨードアセトアミド1mM；ＥＤＴＡ0.1mM）中で音波破砕によって溶菌され、溶菌質は4℃で30分間、10,000×ｇで遠心分離に掛けられた。プロテアーゼ抑制剤が同様に上記上澄みに添加された。溶菌質と上澄みは、20μｌのプロテインＡセファロース（Sigma）でプレクリア（preclear）された。それぞれの均等要因は、坑-マウスＩＬ−１α、坑-マウスＩＬ−１βまたは坑-ヒトＩＬ−１Ｒａ（最終希釈1：1000）の添加により２時間の免疫沈降がされた。プロテインＡセファロースが1時間、添加され、ビーズ（beads）はＰＢＳ＋１％ノニデット＋0.2％ＳＤＳで３回、最後にＰＢＳで洗浄され、更にサンプル緩衝液ＳＤＳ-ＰＡＧＥ中で煮沸された。サンプルは 15％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解され、蛍光光度法によって視覚化された。図６（ａ）に関して、細胞と上澄み培地は、例４のようにＲＩＮｍ５Ｆアッセイを使用するＩＬ−１生物活性に関して評価された。図６（ｂ）、図６（ｃ）、図６（ｄ）に関して、上記のように調製されたサンプルが、坑-マウスＩＬ−１ α、坑-マウスＩＬ−１βまたは坑-ヒトＩＬ−１Ｒａの特異抗体で免疫沈降された。細胞内・外のＩＬ−１生物活性が、ＬＰＳ単独誘導の後、或いはＮＯ・供与体（SNAP）の添加及び無添加でのＮＭＭＡ存在下で、決定された。図６（ａ）は培地中のＩＬ−１生物活性がＮＭＭＡにより抑制され、例４に示されるようにＮＯ・供与体ＳＮＡＰで再構成できた。［³⁵Ｓ］-メチオニンでラベルされたＩＬ −１αとＩＬ−１βの免疫沈降は、これら沈殿の主な細胞内形態は未開裂33ｋDa 前駆体であることが示された（図６ｂと６ｃ）。培地内に見られる優勢な形態は処理された17.5ｋDaタンパク質であった。この結果は、ＮＭＭＡとＮＯ・供与体、ＳＮＡＰのいずれも細胞又は上澄みに見られるＩＬ−１タンパク質の優性形態を変えるものでないことを示す。関連して、細胞内又はＬＰＳ刺激で引き出されたＩＬ−１Ｒａの放出形態はＮＭＭＡ又はＳＮＡＰにより変更されなかった（図６ｄ）。例８本例は、ＬＳＰで刺激されたＩＬ−１生物活性でのＮＭＭＡのブロッキング効果を逆転させるｃＧＭＰ拮抗の役割について説明する。ＲＡＷ264.7細胞は24時間、１μｇ/mlのＬＳＰ±0.25mMのＮＭＭＡで、例１のように誘導された。8-Br-ｃＧＭＰは最後の3時間の培養にために培地に添加された。ＩＬ−１生物活性の培地レベルは、例１のようにＲＩＮｍ５Ｆバイオアッセイにより測定された。図７に示される結果は条件ごとに３つの反復実験を持つ３つの分割された試験の平均±ＳＥＭである。ＬＰＳ刺激が増加させたＩＬ−１生物活性とこれを抑制するＮＭＭＡは前記のとおりである。8-Br-ｃＧＭＰの添加はこの濃度範囲0.1-1.0mMで濃度依存形式にあるＮＭＭＡの抑制をブロックした。この結果は、ＮＯ・がｃＧＭＰ依存機構による生物活性なＬ−１の放出を仲介しているとを示唆している。例９本例は、ＲＩＮｍ５ＦのＬＰＳに刺激されたＩＬ−１生物活性をブロックすることについてＮＭＭＡの効果と胸腺細胞バイオアッセイについて説明する。ＲＡＷ264.7細胞は、24時間、１μｇ/mlのＬＰＳ±0.25mMのＮＭＭＡ±ＳＮＡＰによって活性化され、培地は例１のようにＲＩＮｍ５Ｆバイオアッセイと胸腺細胞増殖反応バイオアッセイでＩＬ−１生物活性について評価された。ＩＬ−1 α又はＩＬ−1βからの生物活性を区別するために、ＲＡＷ264.7無細胞培地が、それぞれの生物活性評価に先だって1μｇ/mlの坑-ＩＬ−1α、坑-ＩＬ−1β又は両方を30分、４℃で前定温にされた。図8に示される結果は条件ごとに３つの複製を持つ３つの分割試験の平均±ＳＥＭである。生物活性なＩＬ−１の刺激放出の能力は両アッセイにより確認された。ＲＩＮｍ５Ｆのバイオアッセイ（図８ａ）及び胸腺細胞増殖反応バイオアッセイ（図８ｂ）はＬＳＰ刺激ＲＡＷ264.7細胞によるＩＬ−１生物活性の放出でコントロールレベルから10倍の増加を示した。生物活性の増加はＮＭＭＡにより十分に抑制され、この抑制はＮＯ・供与体ＳＮＡＰの添加で打ち消された。坑-ＩＬ−1α及び坑-ＩＬ−1β抗体の前処理では両アッセイにおいて生物活性が失われるが、坑 -ＩＬ−１α抗体の単独では測定される生物活性の90％以上をブロックし、そして坑-ＩＬ−1β抗体は殆ど効果がなかった。これらの結果は、ＬＳＰ刺激ＲＡＷ 264.7細胞から放出され測定されるＩＬ−１生物活性の殆どはＩＬ−1αに基づくものであるということを示唆している。例１０本例は、ヒト単核細胞のＬＰＳとＰＭＡで刺激され産出された生物活性なＩＬ −１の放出におけるＮＯＳ抑制剤の効果について説明する。ヒト単核細胞からの生物活性なＩＬ−１の放出をブロックするＮＯＳ抑制剤の効果をテストするために異なる実験が計画された。一つの実験で、ヒト単核細胞は一般の成人ボランティアの静脈穿刺からのヘパリン化全血（heparinized whol e blood）から得、ヒストパック-1077（Histopaque-1077:Siguma Chemical Comp any，St.Louis，MO）の密度勾配遠心分離により分離した。精製された単核細胞は向流遠心洗浄（CCE）によりえた。得られた細胞個体群は、ロイコスタットシトスピン染色（Leuko Stat cytospin stain:Fisher Scientific，Pittsburgh，P A）により決定され、常に98％以上の単核細胞が存在した。精製された完全ＣＭＲＬ中のヒト単核細胞（１×10⁶ cells/ml）は、95％の空気、5％の二酸化炭素中、24時間、37℃で、0.5mMのＮＭＭＡ、0.5mMのアミノグアニジン（ＡＧ）、0.5mMのL-N6-（１-イミノエチル）-リシン（ＮＩＬ）又は1 μＭのヨードニウムジフェニル（ＩＤ）の存在下で10μｇ/mlのＬＰＳ＋50ng/ml のＰＡＭにより活性化された。無細胞上澄みは、ＲＩＮｍ５ＦバイオアッセイでＩＬ−１生物活性について評価された。他の実験において、ヒト単球Ｕ937細胞は、アメリカンタイプティッシュカルチャー（American Type Tissue Culture）から得、そして熱培養された15％の胎仔ウシ血清、2MmのL-グルタミン及び0.1mM の非-必須アミノ酸で補足されたＲＰＭＩ中で密生した。活性化前の24時間で、完全ＣＭＲＬ中で2×10⁵cells/200μｌで平板培養された。Ｕ937細胞（１×10⁶ cells/ml）は、濃度範囲0.05-0.5mMのＮＭＭＡ、ＡＧとＮＩＬ及び0.05から1.0 μＭのＩＤでのＮＯＳ浴製剤の存在下、 72時間、10μｇ/mlのＬＰＳ＋50ng/mlで刺激された。上澄みは上記のように、ＲＩＮｍ5 ＦのバイオアッセイでＩＬ−１生物活性が評価された。残留ＮＯＳ抑制剤がバイオアッセイに影響を与えていないか確認するために、ＮＯＳ抑制剤は、刺激細胞に与えたのと同一の濃度で、未刺激細胞に添加された。このＮＯＳ抑制剤を伴う未刺激細胞の一部は、刺激細胞に対するものと等しい次のＩＬ−１生物活性物培養の希釈度1：50及び1：100でＲＩＮｍ5 Ｆ細胞に添加された。ここで、ヒトＩＬ−１β（0.5U/ml）はＲＩＮｍ５Ｆ細胞に添加され、得られた亜硝酸塩のレベルはＮＯＳ抑制剤を含まない部分と比較された。亜硝酸塩レベルでは相違が観察されず、上記例１で確認されたように持ち越されたＮＯＳ抑制剤の低濃度はＲＩＮｍ５Ｆ細胞によるＮＯ・の産出に影響を与えないことが示された。図９ａと９ｂに示された結果は、条件ごとに３つの反復実験を持つ４つの分割された試験の平均±ＳＥＭである。図９に示されるように、ＬＰＳとＰＭＡで活性化されたヒト単核細胞は、培地への生物活性ＩＬ−１放出で10倍の増加を産生した。このＮＯＳ抑制剤、アミノグアニジン、ＮＭＭＡ、ＮＩＬ及びＩＤでは、原単核細胞によるＩＬ−１生物活性の放出が十分に区別できた（図９ａ）。同様のＮＯＳ抑制剤は、Ｕ937ヒト単核細胞からのＩＬ−１生物活性放出を低減させる濃度効果を示した（図９ｂ）。上述から明らかなように、本発明によって複数の効果が得られ、さらに他の有利な結果も付加されている。本発明の範囲から逸脱しないで、上述した方法及び組成物に種々の変更を加えることが可能であり、上述の説明とこれに付随して示された図面を含む全ての形式は単なる例示であり、限定的に解釈されるべきものではない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年３月２０日（１９９８．３．２０）【補正内容】１１．前記アミノグアニジンは、静脈的又は皮下的に適用可能であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。１２．前記症状は、急性低血圧症、エンドトキシンにより誘発された急性低血糖症、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性若年性顆粒球性白血病、アルツハイマー症の進行性退行効果、ダウン症における神経病理学的な変化、エストロゲン欠乏のよる骨の変質及び発熱で構成される群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。１３．ＩＬ−１産出細胞から放出されたＩＬ−１生物活性を、ＩＬ−１生物活性放出を低減させる有効量によって上記細胞にアミノグアニジンを適用して抑制する方法。１４．前記細胞は、造血細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。１５．前記細胞は、単核細胞又はマクロファージであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。１６．前記細胞が産出したＩＬ−１で苦しめられる個体の病気は、急性低血圧症、エンドトキシンにより誘発された急性低血糖症、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性若年性顆粒球性白血病、アルツハイマー症の進行性退行効果、ダウン症における神経病理学的な変化、エストロゲン欠乏のよる骨の変質及び発熱で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。１７．前記アミノグアニジンは、経口的、静脈的又は皮下的に上記個体に適用されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者コルベット，ジョンエイアメリカ合衆国，ミズーリ州 63139，セントルイス，クレイトン 6605，アパートメント312

Claims

【特許請求の範囲】１．ＩＬ−１産出細胞から放出されたＩＬ−１生物活性によってもたらされる症状で苦しめられる個体におけるＩＬ−１生物活性を、アミノグアニジンの抑制有効量を適用して抑制する方法。２．前記アミノグアニジンは、薬剤として適用可能な製剤形態であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記アミノグアニジンは、経口的に適用可能であることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．前記アミノグアニジンは、非経口的に適用可能であることを特徴とする請求項２に記載の方法。５．前記アミノグアニジンは、静脈的又は皮下的に適用可能であることを特徴とする請求項４に記載の方法。６．前記症状は、急性低血圧症、エンドトキシンにより誘発された急性低血糖症、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性若年性顆粒球性白血病、アルツハイマー症の進行性退行効果、ダウン症における神経病理学的な変化、エストロゲン欠乏のよる骨の変質及び発熱で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。７．個体内でＩＬ−１産出細胞から放出されたＩＬ−１生物活性によってもたらされる症状を、ＩＬ−１生物活性を抑制する有効量によってアミノグアニジンを適用して治療する方法。８．前記アミノグアニジンは、薬剤として適用可能な製剤形態であることを特微とする請求項７に記載の方法。９．前記アミノグアニジンは、経口的に適用可能であることを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．前記アミノグアニジンは、非経口的に適用可能であることを特徴とする請求項８に記載の方法。１１．前記アミノグアニジンは、静脈的又は皮下的に適用可能であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。１２．前記症状は、急性低血圧症、エンドトキシンにより誘発された急性低血糖症、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性若年性顆粒球性白血病、アルツハイマー症の進行性退行効果、ダウン症における神経病理学的な変化、エストロゲン欠乏のよる骨の変質及び発熱で構成される群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。