JP2001255318A - 神経細胞死抑制作用を有する薬剤及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アルツハイマー病等の患者の生体内に存在す
る自己会合型アミロイドβ蛋白質と同等の高い毒性を有
するアミロイドβ蛋白質を用いて、精度よく神経細胞死
抑制作用を有する薬剤をスクリーニングする方法を提供
する。 【解決手段】 神経細胞死抑制作用を有する薬剤のスク
リーニング方法であって、下記の工程：(1)アミロイド
β蛋白質を含む水溶液を対流させることなどにより得ら
れる高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質及
び被検物質の存在下で神経系細胞又は神経系器官を培養
する工程；及び(2)上記神経系細胞又は神経系器官の細
胞死が抑制された場合に上記被検物質が神経細胞死に対
して抑制作用を有すると判定する工程を含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、高い毒性を有する
自己会合型アミロイドβ蛋白質を用いた神経細胞死抑制
作用を有する化合物のスクリーニング方法、並びに該方
法でスクリーニングされた神経細胞死抑制作用を有する
化合物又はその塩、及び該化合物又はその塩を有効成分
として含むアルツハイマー病の予防及び／又は治療のた
めの医薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】アミロイドβ蛋白質はアミノ酸約４０残
基の非常に凝集性の高い蛋白質であり、アルツハイマー
病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）
の主要な病理学的変化のひとつである老人斑の主要な構
成成分である。また、この蛋白質は、突然変異によって
早期発症型アルツハイマー病の原因遺伝子となるアミロ
イド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）からプロテアーゼによるプ
ロセッシングにより産生されることが判明している（Ｋ
ａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，７
３３−７３６（１９８７）；Ｇｏｌｄｇａｂｅｒ，Ｄ．
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，８７７−８８
０（１９８７）；Ｒｏｂａｋｉｓ，Ｎ．Ｋ．ｅｔ ａ
ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８４，４１９０−４１９４（１９８７））。

【０００３】このプロセッシングによりアミロイドβ蛋
白質は水溶性のペプチドとして細胞外に放出されるが、
その状態では神経細胞死誘発活性（以下、本明細書にお
いて神経細胞死誘発活性を「毒性」と称することがあ
る。）を発揮せず、自己会合してアミロイドβ線維を形
成することにより初めて毒性を獲得することが知られて
いる（Ｌｏｒｅｚｏ，Ａ．ａｎｄ Ｙａｎｋｅｒ，Ｂ．
Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，９１，１２２４３−１２２４７（１９９４）；以
下、自己会合して毒性を示すアミロイドβ蛋白質を「自
己会合型アミロイドβ蛋白質」又は「毒性アミロイドβ
蛋白質」と呼ぶ場合がある。）。Ｌｏｒｅｚｏらの方法
は、アミロイドβ_1-40を超純水に７００μＭになるよう
に溶解し、同量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で塩
濃度を調節した後、３７℃で５日間インキュベートする
工程を含んでいる。アミロイドβ_1-42を用いる場合に
は、超純水に３５０μＭになるように溶解し、３７℃で
３日間インキュベートする工程を含む。

【０００４】この自己会合型アミロイドβ蛋白質を神経
系の培養細胞に高濃度で添加すると細胞を死に至らしめ
ることができることから、アルツハイマー病においては
自己会合して毒性を獲得した自己会合型アミロイドβ蛋
白質が神経変性を誘発していると考えられている。従っ
て、自己会合型アミロイドβ蛋白質の添加により神経系
細胞等に細胞死を誘発する実験系は、アルツハイマー病
における生体内での神経細胞死を反映していると考える
ことができ、神経細胞死の抑制剤のスクリーニング系な
どに有用である。

【０００５】しかしながら、上記のＬｏｚｅｒｏらによ
る細胞死を誘発する系において用いられた自己会合型ア
ミロイドβ蛋白質はその毒性が低く、試験管内で神経細
胞死を誘発するために必要な濃度は、アルツハイマー病
等の患者の生体内に存在する毒性アミロイドβ蛋白質の
１，０００倍以上であった。また、上記の方法では毒性
を有するアミロイドβ蛋白質含有液が再現性よく調製で
きず、調製された毒性を有するアミロイドβ蛋白質含有
液を保存すると、ある期間を過ぎて毒性が失われるとい
う問題もあった。

【０００６】従来、神経細胞死の抑制剤をスクリーニン
グする方法として、上記の自己会合型アミロイドβ蛋白
質を用いてインビトロでスクリーニングを行う方法が採
用されているが、上記の理由から、この方法では生体内
の環境とは大きく乖離した条件を適用するものであり、
精度のよいスクリーニング方法であるとは言いがたい。
このため、生体内に存在する毒性アミロイドβ蛋白質と
同等の毒性を有する自己会合型アミロイドを用いて、生
体内環境により近い条件で精度よくスクリーニングを行
う方法の開発が望まれていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、アル
ツハイマー病等の患者の生体内に存在する自己会合型ア
ミロイドβ蛋白質と同等の高い毒性を有し、かつその毒
性が維持される自己会合型アミロイドβ蛋白質を用い
て、生体内環境により近い条件で精度よくスクリーニン
グを行う方法を提供することにある。また、本発明の別
の課題は、上記の方法によりスクリーニングされた神経
細胞死の抑制剤を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アミロイ
ドβ蛋白質を含む水溶液を対流させて一定時間処理する
ことにより、あるいは該水溶液中にアミロイドβ蛋白質
の凝集媒体を添加することによりアミロイドβ蛋白質の
自己会合を誘起させることによってアミロイドβ蛋白質
の自己会合を再現性よく誘発できること、及びこの処理
によって得られる自己会合型アミロイドβ蛋白質が生体
内に存在する自己会合型アミロイドβ蛋白質と同等の高
い毒性を有しており、かつその毒性が長期にわたって保
持されることを見いだした。さらに、本発明者らは、上
記の自己会合型アミロイドβ蛋白質を用いることによっ
て、生体内環境により近い条件で精度よく神経細胞死の
抑制剤をスクリーニングできることを見出した。本発明
はこれらの知見を基にして完成されたものである。

【０００９】すなわち、本発明は、神経細胞死抑制作用
を有する薬剤のスクリーニング方法であって、下記の工
程： (1)アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させること
により得られる、又はアミロイドβ蛋白質を含む水溶液
中にアミロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加することによ
り得られる高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋
白質及び被検物質の存在下で神経系細胞又は神経系器官
を培養する工程；及び(2)上記神経系細胞又は神経系器
官の細胞死が抑制された場合に上記被検物質が神経細胞
死に対して抑制作用を有すると判定する工程を含む方法
を提供するものである。

【００１０】この方法の好ましい態様によれば、アルツ
ハイマー病等の患者の生体内に存在する自己会合型アミ
ロイドβ蛋白質と実質的に同等の毒性を有する自己会合
型アミロイドβ蛋白質の存在下で行う上記の方法；その
毒性がアルツハイマー病等の患者の生体内に存在する自
己会合型アミロイドβ蛋白質と実質的に同等の濃度で神
経系細胞に細胞死を誘発するのに十分な毒性である自己
会合型アミロイドβ蛋白質の存在下で行う上記の方法が
提供される。

【００１１】別の観点からは、上記の方法によりスクリ
ーニングされた神経細胞死抑制作用を有する化合物又は
その塩；上記の化合物又は生理学的に許容されるその塩
を有効成分として含む神経細胞死抑制剤；上記の化合物
又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む
アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための医薬が
本発明により提供される。

【００１２】また、上記スクリーニングにより神経細胞
死の抑制作用を有すると判定される化合物の代表例とし
て、下記の一般式(I)：

【化２】 （式中、Ｒ¹はハロゲン原子及びＣ_1-6アルキル基からな
る群から選ばれる１又は２以上の置換基を有していても
よいフェニル基を示し；Ｒ²は水素原子又はＣ_1-6アルキ
ル基を示す）で表される神経細胞死抑制作用を有する化
合物又はその塩が本発明により提供される。

【００１３】また、本発明により、上記の一般式(I)で
表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効
成分として含む神経細胞死抑制剤；上記の一般式(I)で
表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効
成分として含むアルツハイマー病の予防及び／又は治療
のための医薬；上記の医薬の製造のための上記の一般式
(I)で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩
の使用；神経系細胞の神経細胞死の抑制方法であって、
上記の一般式(I)で表される化合物又は生理学的に許容
されるその塩の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与す
る工程を含む方法；並びにアルツハイマー病の予防及び
／又は治療方法であって、上記の一般式(I)で表される
化合物又は生理学的に許容されるその塩の予防及び／又
は治療有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を
含む方法が提供される。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明のスクリーニング方法に用
いられる自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製原料とし
て使用されるアミロイドβ蛋白質の種類は特に限定され
ない。アミロイドβ蛋白質は、約４０のアミノ酸残基か
らなる蛋白質であり、アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰ
Ｐ）からプロテアーゼによるプロセッシングで産生され
る。このプロテアーゼの種類やその後の修飾によってさ
まざまな種類が存在することが知られているが、分泌直
後にはＣ末端のアミノ酸残基の長さの違いによりアミロ
イドβ４０（Ａβ_X-40）とアミロイドβ４２（Ａ
β_X-42）が存在する。

【００１５】本発明のスクリーニング方法に用いられる
自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製には、例えば、分
泌直後のアミロイドβ蛋白質の全長の分子種であるアミ
ロイドβ４０（Ａβ_1-40：配列番号１）若しくはアミロ
イドβ４２（Ａβ_1-42：配列番号２）、又はそれらの変
異体、あるいはそれらの誘導体が好ましく用いられる。
アミロイドβ蛋白質は、ペプチド合成機などを用いて合
成したもの、市販のもの、又は生体内から抽出精製した
もの、いかなるものを用いてもよい。アミロイドβ蛋白
質の合成、抽出精製は、それ自体公知の通常用いられて
いる方法で行うことができる。合成ペプチド等の精製は
高速液体クロマトグラフィにおいて単一のピークが得ら
れる程度行えば十分であるが、精製方法として、例え
ば、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィ等が用いられ
る。

【００１６】本発明のスクリーニング方法に用いられる
自己会合型アミロイドβ蛋白質の調製は、通常、このよ
うにして得られたアミロイドβ蛋白質を滅菌精製水に溶
解し、得られた溶液を惹起して維持することにより行わ
れる。溶解に用いる滅菌精製水の量は、アミロイドβ蛋
白質が溶解する範囲であればよいが、好ましくは水溶液
中のアミロイドβ蛋白質の濃度が５０ｎＭ〜２ｍＭ、好
ましくは１μＭ〜１ｍＭ、さらに好ましくは１００〜７
００μＭとなる範囲である。この溶液を適当な塩濃度に
調節することが望ましい。塩濃度は、アミロイドβ蛋白
質が溶解される範囲であればいかなるものでもよいが、
例えば、最終ｐＨが３〜１２、好ましくは５〜１０で、
塩が１Ｍ以下であることが好ましい。このような塩濃度
に調節する方法として、例えば、ＰＢＳ（−）をアミロ
イドβ蛋白質水溶液と等量加える方法が用いられる。溶
解の方法はアミロイドβ蛋白質が適当な量の適当な塩濃
度の溶液に完全に溶解する方法であれば特に制限はな
い。

【００１７】上記水溶液中のアミロイドβ蛋白質を自己
会合させるために上記水溶液を対流させるが、対流の流
速及び維持時間は、水溶液中のアミロイドβ蛋白質が自
己会合し、アルツハイマー病の患者の生体内における毒
性アミロイドβ蛋白質と同等の濃度で神経細胞死を誘導
する活性を有するようになるものであれば特に制限はな
い。ここで、アミロイドβ蛋白質の自己会合とは、該蛋
白質の２分子以上が共有結合以外の分子間相互作用によ
って結合し、１個の分子のように行動する現象を意味し
ており、通常は、さらに多数の分子が会合することによ
り、顆粒状、線維状等の分子が形成され、その結果とし
てアミロイドβ蛋白質の毒性が獲得される。

【００１８】例えば、アミロイドβ蛋白質水溶液を含む
容器を、適当な温度範囲中で一定時間、適当な速度で回
転し続ける方法が有効である。また、アミロイドβ蛋白
質水溶液が常に対流し、かつ疎水性の界面に接触する状
態を維持させてもよい。例えば、超音波分散機やスター
ラー等で該水溶液を攪拌する方法、またはアミロイドβ
蛋白質水溶液を適当な流速で疎水性チューブ内で対流さ
せる方法等も挙げられる。

【００１９】また、アミロイドβ蛋白質水溶液中にアミ
ロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加する方法では、凝集媒
体としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ：分子量３０
００〜６０００程度のもの）などを添加し、１Ｍ以下程
度の適当な塩濃度の存在下で静置することによる方法が
挙げられる。アミロイドβ蛋白質の自己会合を誘起する
凝集媒体としては、一般的に、蛋白質の結晶化を誘起す
る物質を用いることができる。例えば、塩化リチウム、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩
化カルシウム、ギ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、
クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硫酸アン
モニウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムセチルトリメ
チルアンモニウム塩、リン酸ナトリウム、リン酸カリウ
ムなどの無機塩類；ＰＥＧ１００、ＰＥＧ４０００、Ｐ
ＥＧ６０００、ＰＥＧ１００００などのポリエチレング
リコール類；アセトニトリル、アセトン、イソプロパノ
ール、エタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシ
ド、ブタノール、１，３−ブチロラクトン、１，３−プ
ロパンジオール、２，５−ヘキサンジオール、メタノー
ル、２−メチル−２，４−ペンタンジオールなどの有機
溶媒を挙げることができる。凝集媒体の添加方法として
は、一般的に蛋白質の結晶化に用いられる添加方法を採
用することができる。これらの技術については、例え
ば、「生命科学のための結晶解析入門−タンパク質結晶
解析のてびき、平山令明著、丸善株式会社」などに記載
されている。

【００２０】対流を維持するにあたり一定温度を維持す
ることが望ましいが、その温度範囲はアミロイドβ蛋白
質が変性しない範囲であれば特に制限はない。具体的に
は４〜５０℃、好ましくは４〜４０℃、さらに好ましく
は４〜３７℃の範囲が挙げられる。容器に回転を加え続
ける方法としては、アミロイドβ蛋白質の水溶液を含む
容器を回転培養機、攪拌機、振とう機等を用いて回転さ
せる方法が用いられるが、この中で回転培養器を用いる
のが最も好ましい。回転速度は、通常２００ｒｐｍ以
下、好ましくは５〜５０ｒｐｍ、さらに好ましくは２０
〜４０ｒｐｍで行われる。また、回転を維持する時間
は、水溶液中のアミロイドβ蛋白質が自己会合して十分
な毒性を獲得するまで行われるが、具体的には回転の速
度等の条件により４時間〜７日程度行われる。

【００２１】アミロイドβ蛋白質水溶液を充填する容器
としては、アミロイドβ蛋白質以外の蛋白質の混入が防
げるものであればいかなるものでもよいが、一般的に
は、蛋白質が吸着しない素材の容器が望ましい。具体的
には、プラスチック容器や、市販のエッペンドルフチュ
ーブ等がさらに望ましい。容量にも特に制限はない。ま
た、他の蛋白質の混入を防ぐために、容器をあらかじめ
オートクレーブ等を用いて滅菌しておくことは効果的で
ある。容器に充填するアミロイドβ蛋白質水溶液の量
は、容器の全容積の３０〜９０％、さらには５０〜８０
％が望ましい。容器中でアミロイドβ蛋白質水溶液に十
分な対流を惹起させ、その対流を一定に維持することが
望ましい。

【００２２】このようにして得られた自己会合型アミロ
イドβ蛋白質は、このままでも神経系細胞に細胞死を誘
導することができ、本発明のスクリーニング方法にその
まま供することが可能である。もっとも、本発明のスク
リーニング方法に使用するにあたり、らにアミロイドβ
線維を取り除く等の精製を行ってもよい。精製の方法と
しては、自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を遠心分
離してその上清を分取する方法や、例えば０．４５μｍ
以上の孔径を有するフィルター（例えば０．６５μｍの
フィルターと３０ｋダルトン以上の分子量の物質をカッ
トするフィルターとの組み合わせなど）で線維を除去す
る方法、ＬＰＦＦＤ（βシート破壊ペプチドｉＡβ５、
ペプチド研究所；アミノ酸配列は一文字標記で示した）
やＫＬＶＦＦ（アミノ酸配列は一文字標記で示した）等
のβシート破壊ペプチドで線維を分解して取り除く方
法、ゲル濾過等なども用いることが可能である。

【００２３】本発明のスクリーニング方法は、下記の工
程； (1)アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させること
により得られる、又はアミロイドβ蛋白質を含む水溶液
中でアミロイドβ蛋白質の結晶化を誘起させることによ
り得られる高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋
白質及び被検物質の存在下で神経系細胞又は神経系器官
を培養する工程；及び(2)上記神経系細胞又は神経系器
官の細胞死が抑制された場合に上記被検物質が神経細胞
死に対して抑制作用を有すると判定する工程を含むこと
を特徴としている。

【００２４】本発明の方法に用いられるスクリーニング
系では、被検薬物の非存在下において、上記の自己会合
型アミロイドβ蛋白質により神経系細胞又は神経系器官
の細胞死が誘導されるように調整する必要がある。本発
明のスクリーニング方法において、自己会合型アミロイ
ドβ蛋白質により誘導される細胞死は、アポトーシス又
はネクローシスのいずれでもよい。また、用いられる細
胞としては、神経系細胞であれば特に制限はなく、哺乳
動物（ヒト、ラット、マウス、サル、ブタ等）由来の神
経系細胞や、これらの細胞に分化が可能な細胞等でもよ
い。また、初代培養細胞又は樹立培養株のいずれでもよ
い。初代培養細胞としては、上記した動物の海馬、およ
び前脳基底野等から取得したものが好ましく、樹立培養
株としては、例えば、ＰＣ−１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ−１７２１）、Ｂ１０３（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４９（４５４），２２４
−２２７（１９７４））等が好ましい。また上記動物の
海馬等の器官をそのまま用いることも可能である。

【００２５】これらの細胞や器官は、通常の培養法によ
り培養することができる。具体的には、神経系細胞の初
代培養、および神経系細胞の培養方法としては、Ｈｏｓ
ｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，２７１９−２７２３（１
９９６）、およびＳａｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４９（４５４），２２４−２２
７（１９７４）に記載されている方法等を用いることが
でき、器官培養は、Ｇａｒｙ Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄＫ
ｉｍｂｅｒｙ Ｇｏｓｌｉｎ，Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｎ
ｅｒｖｅ ｃｅｌｌｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭＩ
Ｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（１９９８）に記
載された方法等を用いることができる。このようにして
培養された神経系細胞および神経系器官に細胞死を誘導
するために添加する上記の自己会合型アミロイドβ蛋白
質の量は適宜選択可能であるが、通常、アルツハイマー
病等の患者の生体内に存在する毒性アミロイドβ蛋白質
と実質的に同等の濃度で細胞死を誘導できる。例えば、
初代培養(１．２５×１０⁶個／ｍｌ)あたり１０ｎＭ以
上、４００μｍ海馬スライス／１ｍｌ培養液あたり１０
０ｐＭ以上などの量で細胞死を誘導できる。もっとも、
上記の濃度は例示のためのものであり、この量に限定さ
れることはない。

【００２６】上記の自己会合型アミロイドβ蛋白質によ
って誘導される神経系細胞又は神経系器官の細胞死は、
通常の場合、本発明の自己会合型アミロイドβ蛋白質の
有効量を添加した後、約６時間程度から起こり、４８時
間程度の後には顕著な細胞死の様子が観察できる。これ
らの細胞死を測定する方法としては、通常用いられる細
胞死検出法を用いることができる。具体的には、被検体
が細胞の場合、ＭＴＴアッセイ（Ｍｏｓｓｍａｎ，
Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５
５，（１９８３）、またはトリパンブルーダイエクスク
ルージョン法（Ｗｏｏ，Ｋ．Ｂ．，Ｗ．Ｋ．Ｆｕｎｋｈ
ｏｕｓｅｒ，Ｃ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ａｎｄＯ．Ａｌａ
ｂａｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｎｅ
ｔ．，１３（６），５９１−６０４（１９８０））、プ
ロピディウムイオダイド等による染色法などが用いら
れ、器官スライス等の場合にはプロピディウムイオダイ
ド等による染色法等が用いられる。

【００２７】上記の培養系に被検薬物を添加し、神経系
細胞又は神経系器官の細胞死が抑制された場合には、そ
の被検薬物が神経細胞死に対する抑制作用を有すると判
定することができる。例えば、神経系細胞または神経系
器官の培養液に予め被検物質を添加した後、上記の自己
会合型アミロイドβ蛋白質を添加し、あるいは神経系細
胞または神経系器官の培養液に上記の自己会合型アミロ
イドβ蛋白質を添加した後に被検物質を添加して、該神
経系細胞や組織の細胞死が被検薬物により抑制されるか
否かを検出すればよい。

【００２８】本発明のスクリーニング方法により神経細
胞死に対して抑制作用を有すると判定された化合物は、
アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための医薬の
有効成分として有用である。このような化合物の代表例
として、Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ、Ｄａｍｎａｃａｎｔｈａ
ｌ、ＰＰ１、ＰＰ２（以上、いずれもＣａｌｂｉｏｃｈ
ｅｍ社より入手可能である）などのチロシンキナーゼの
阻害剤を例示することができるが、好ましくはＳｒｃフ
ァミリーチロシンキナーゼの阻害剤を例示することがで
き、さらに好ましくは上記一般式(I)で表される化合物
を挙げることができる。もっとも、本発明のスクリーニ
ング方法で神経細胞死に対して抑制作用を有すると判定
される化合物は上記したチロシンキナーゼの阻害剤、Ｓ
ｒｃファミリーチロシンキナーゼの阻害剤、及び上記式
(I)で表される化合物に限定されることはなく、上記ス
クリーニングの結果物として神経細胞死に対して抑制作
用を有すると判定された化合物は、いずれも本発明の範
囲に包含される。

【００２９】一般式(I)中、Ｒ¹はハロゲン原子及びＣ
_1-6アルキル基からなる群から選ばれる１又は２以上の
置換基を有していてもよいフェニル基を示し；Ｒ²は水
素原子又はＣ_1-6アルキル基を示す。Ｒ²が示すＣ_1-6ア
ルキル基としては直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれら
の組み合わせのいずれでもよく、より具体例には、メチ
ル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、シ
クロプロピル基、n−ブチル基、sec−ブチル基、tert−
ブチル基、イソブチル基、シクロブチル基、シクロプロ
ピルメチル基、n−ペンチル基、n−ヘキシル基などを挙
げることができる。Ｒ¹が示すフェニル基上に置換する
置換基はハロゲン原子及びＣ_1-6アルキル基からなる群
から選ばれ、その個数及び置換位置は特に限定されな
い。環上に置換するハロゲン原子は、フッ素原子、塩素
原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、ア
ルキル基としては上記Ｒ²について説明したものを用い
ることができ、好ましくはＣ_1-4アルキル基である。

【００３０】上記一般式(I)において、Ｒ¹としてはｐ−
クロロフェニル基又はp−メチルフェニル基が好まし
く、Ｒ²としてはtert−ブチル基が好ましい。最も好ま
しい化合物は、４−アミノ−５−（４−クロロフェニ
ル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリ
ミジン、又は４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）
−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジ
ンである。この化合物はHanke, J.H., et al., J. Bio
l. Chem., 271, 695, 1996に記載されており、Calbioch
em社から市販品を入手可能である。また、一般式(I)で
表される化合物は米国特許第５，５９３，９９７号明細
書に記載された方法で容易に製造することが可能であ
る。

【００３１】本発明により提供される医薬は、本発明の
スクリーニング方法により神経細胞死に対して抑制作用
を有すると判定された化合物、好ましくは上記式(I)で
表される化合物及び生理学的に許容されるその塩、並び
にそれらの水和物及びそれらの溶媒和物からなる群から
選ばれる物質を有効成分として含み、アルツハイマー病
の予防及び／又は治療のための医薬として用いることが
できる。上記式(I)で表される化合物の生理学的に許容
される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸
類の塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、p-トルエンスルホン
酸塩などの有機酸の塩、グリシンなどのアミノ酸の塩な
どを挙げることができる。上記式(I)で表される化合物
は置換基の種類に応じて、１又は２以上の不斉炭素を有
する場合があるが、任意の光学活性体又はジアステレオ
異性体などの立体異性体、立体異性体の任意の混合物、
ラセミ体などを上記医薬の有効成分として用いてもよ
い。

【００３２】本発明のスクリーニング方法により神経細
胞死に対して抑制作用を有すると判定された化合物、好
ましくは上記式(I)で表される化合物若しくはその塩、
又はそれらの水和物若しくはそれらの溶媒和物は、それ
自体を医薬として患者に投与してもよいが、一般には、
これらの有効成分の１種または２種以上を含む医薬組成
物を製造して患者に投与することが好適である。このよ
うな医薬組成物として、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散
剤、丸剤、トローチ、舌下剤、又は液剤などの経口投与
の製剤、あるいは注射剤、座剤、軟膏、貼付剤などの非
経口投与用の製剤を例示することができる。

【００３３】経口投与用の錠剤又はカプセル剤は、通常
は単位投与物として提供され、結合剤、充填剤、希釈
剤、打錠剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、香味剤及び湿潤
剤のような通常の製剤用担体を添加して製造することが
できる。錠剤は、この当業界で周知の方法に従って、例
えば、腸溶性コーティング剤を用いてコーティングする
ことができ、例えばセルロース、マンニトール、又はラ
クトース等の充填剤；澱粉、ポリビニルポリピロリド
ン、澱粉誘導体、又はナトリウム澱粉グリコラート等の
崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；ラウリ
ル硫酸ナトリウム等の湿潤剤を用いて製造してもよい。

【００３４】経口投与用の液剤は、例えば水性又は油性
懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤又はエリキシ
ル剤等の他、使用前に水又は適当な媒体により再溶解さ
れうる乾燥製剤として提供される。このような液剤に
は、通常の添加剤、例えばソルビール、シロップ、メチ
ルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミ
ニウムゲル又は水素化食用脂肪のような沈殿防止剤、レ
シチン、ソルビタンモノオレート、アラビアゴムのよう
な乳化剤、アーモンド油、精製ココナッツ油、油状エス
テル（例えばグリセリンのエステル）、プロピレングリ
コール、エチルアルコールのような（食用油も包含しう
る）非水性媒体、p-ヒドロキシ安息香酸のメチルエステ
ル、エチルエステル、もしくはプロピルエステル、又は
ソルビン酸のような保存剤及び必要に応じて通常の香味
剤又は着色剤を配合することができる。

【００３５】経口投与剤の製剤は、混合、充填、又は打
錠などの当業界で周知の方法により製造することができ
る。また、反復配合操作を用いて多量の充填剤等を使用
した製剤中に有効成分を分布させてもよい。非経口投与
用の製剤は、一般には有効成分である化合物と滅菌媒体
とを含有する液体担体投与量製剤として提供される。非
経口投与用の溶剤は、通常、化合物を媒体に溶解させて
滅菌濾過し、次に適当なバイアル又はアンプルに充填し
て密封することにより製造される。安定性を高めるため
に組成物を凍結させた後にバイアル中に充填し、水を真
空下で除去してもよい。非経口懸濁液は実質的に非経口
溶液の場合と同じ方法で製造されるが、有効成分を媒体
に懸濁させてエチレンオキシド等により滅菌することに
より好適に製造できる。また、有効成分が均一分布とな
るように必要に応じて界面活性剤、湿潤剤等を添加して
もよい。

【００３６】有効成分である上記式(I)の化合物の投与
量は、治療や予防の目的、患者の症状、体重、年齢や性
別等を考慮して適宜決定すればよいが、通常の場合、成
人一日あたり経口投与により０．０５〜３０ｍｇ／ｋｇ
程度を投与することができる。このような投与量を１日
あたり１〜数回に分けて投与するのが望ましい。

【００３７】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 例１：自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液の調製 （１）アミロイドβ（Ａβ_1-40：配列番号１）樹脂の製
造 Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ樹脂３４２ｍｇ（アミン含量０．７３
ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）をパーキンエルマーアプライドバイ
オシステムズ社製Ａ４３３型自動ペプチド合成機にセッ
トし、これにＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌ
ｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ
−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−
ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ｏ
Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｏ
Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏ
ｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍ
ｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔ
Ｂｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆ
ｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍ
ｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｏ
Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｈ
ｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−
ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ
ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）
−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏ
ｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍ
ｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌ
ｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｆｍ
ｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを供給し、ＨＢＴＵ
［２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙ
ｌ）−１，１，３，３，−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒ
ｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ］を縮合剤として順次縮合させて上記の側鎖保護アミ
ロイドβ（Ａβ_1-40）樹脂１．５１５ｇを得た。

【００３８】（２）トリフルオロ酢酸処理 上記（１）で得た側鎖保護アミロイドβ（Ａβ_1-40）樹
脂中の３０４ｍｇを採取し、これにフェノール０．７５
ｍｌとチオアニソール０．５ｍｌとトリフルオロ酢酸
８．２５ｍｌとエタンジチオール０．２５ｍｌと蒸留水
０．５ｍｌを加え、氷冷下５分、続いて室温で１．５時
間反応させた。反応終了後、氷冷したジエチルエーテル
２００ｍｌを加えてペプチドを沈殿させた。全内容物を
グラスフィルターで濾取し、冷ジエチルエーテルで洗浄
した後、３５％のアセトニトリルを含む０．１％トリフ
ルオロ酢酸（約２００ｍｌ）で抽出処理してＨ−Ａｓｐ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈ
ｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈ
ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−ＯＨで表される粗ペプチド１９１ｍｇを
得た。

【００３９】（３）ペプチドの精製 この粗ペプチドを３５％のアセトニトリルを含む０．１
％トリフルオロ酢酸（４０ｍｌ）に溶解しＯＤＳ（オク
タデシルシラン）をシリカに結合した逆相系のカラム
（内径２ｃｍ、長さ２５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣにより
精製した。溶出は０．１％トリフルオロ酢酸中、アセト
ニトリル濃度を２２％から４２％へ直線的に２０分間で
上昇させることによりおこなった。精製物の収量は３５
ｍｇであった。本物質の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量
分析により確認された。測定値［Ｍ＋Ｈ］＋４３３０．
９９、計算値（Ｃ₁₉₄Ｈ₂₉₅Ｎ₅₃Ｏ₅₈Ｓ₁＋Ｈ）４３３
０．８９。

【００４０】（４）自己会合型アミロイドβ蛋白質含有
液の調製 上記（３）で精製を行ったアミロイドβ蛋白質０．４μ
ｍｏｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに入
れ、これに５３２μｌの超純水と５３２μｌのＰＢＳ
（ＳＩＧＭＡ社製）を順次加え、アミロイドβ蛋白質を
完全に溶解させた。このアミロイドβ蛋白質水溶液の入
ったエッペンドルフチューブをダックローター（ＴＡＩ
ＴＥＣ社製、ローター：ＲＴ５０）に取り付け、３７℃
において３５ｒｐｍの速度で７日間回転させた。

【００４１】例２：自己会合型アミロイドβ蛋白質含有
液の毒性の検定 （１）初代培養細胞の調製 ラット１８日胎児（２腹分）の前脳基底野より分散培養
によって初代培養細胞を調製した。この初代培養細胞を
ポリエルリジン（ナカライテスク社製）によりコーティ
ングした２４ウェルプラスチック細胞培養プレート中で
培養した。コーティングは０．５ｍｇポリエルリジン／
１ｍｌ ０．１５Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）の
ポリエルリジン溶液に培養プレートを１晩浸漬した後、
滅菌精製水で洗浄し、自然乾燥させて行った。初代培養
細胞は培養プレート１ウェルの底面積に対して、３×１
０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の密度となるように、５％牛胎児
血清（ハイクローン社製）／５％馬血清（ライフテック
オリエンタル社製）１ｍＭＰｙｒｕｖａｔｅ／５０μｇ
／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ライフテックオリエン
タル社製）／ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地
（ライフテックオリエンタル社製）で調製した。培養は
３７℃、１０％ＣＯ₂中で４日間行った。

【００４２】（２）自己会合型アミロイドβ蛋白質の添
加 上記（１）で得られた初代培養細胞について、培養液を
Ｂ２７（ライフテックオリエンタル社製）、Ｎｅｕｒｏ
ｂａｓａｌ（ライフテックオリエンタル社製）、０．５
ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０μｇ／ｍｌ Ｇｅ
ｎｔａｍｉｃｉｎ（ライフテックオリエンタル社製）培
地０．５ｍｌ／１ウェルに交換した。培地交換後、３７
℃、１０％ＣＯ₂中で３日間さらに培養を行った。この
培養細胞に対し、例１で得られた自己会合型アミロイド
β蛋白質含有液を最終アミロイドβ蛋白質濃度が１、
２、５、１０μＭ／１ウェル、またコントロールとして
ＰＢＳ／Ｈ₂Ｏを等容量２ウェルのそれぞれ細胞外液に
添加した。添加後、３７℃、１０％ＣＯ₂中で１６時間
培養を行った。

【００４３】（３）ＭＴＴ活性測定 上記（２）で自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を添
加していない２ウェルのうちの１つにＴｒｉｔｏｎＸ−
１００を最終濃度が０．１％となるように添加し、３７
℃、１０％ＣＯ₂中で１０分間培養した。このようにし
て毒性アミロイドβ蛋白質含有液を添加した４ウェル、
コントロールの１ウェル、及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００
を添加してウェル内の培養細胞を死滅させた１ウェルの
計６ウェルについて培地を除去し、２５０μｇ ＭＴＴ
（シグマ社製）／ＰＢＳ５０μｌを注入した。これらを
３７℃、１０％ＣＯ₂中で３時間培養した後、２０％
ＳＤＳ（ナカライテスク社製）、５０％ ＤＭＦ（ｄｉ
ｍｅｔｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）ｐＨ３．５／Ｈ₂Ｏを
５０μｌ添加した。これをさらに３７℃、１０％ＣＯ₂
中で２時間静置し、細胞を完全に融解させた。この各ウ
ェル中の細胞融解液について５７０ｎｍの吸光度を測定
した。この５７０ｎｍの吸光度について、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００を加えて細胞をすべて死滅させたウェルにお
ける値をバックグラウンドとして他のウェルにおける値
から差し引いた値の結果を図１（白丸）に示した。

【００４４】例３：アミロイドβ蛋白質水溶液を回転を
加えず調製したアミロイドβ蛋白質含有液の毒性の検定 アミロイドβ蛋白質を可溶化後、回転を加えないで調製
したアミロイドβ蛋白質含有液を用いた他は、例２と同
様の実験を行った。結果を図１（黒四角）に示した。例
２で得られた結果との比較から、アミロイドβ蛋白質を
可溶化後、回転をさせて自己会合型アミロイドβ蛋白質
を調製した場合にのみ、神経系細胞に細胞死を誘導する
活性を有する毒性アミロイドβ蛋白質を調製できること
が明らかになった。

【００４５】例４：自己会合型アミロイドβ含有液によ
る神経細胞死のＰＰ２による抑制試験 （１）初代培養細胞の調製 ラット１８日胎児（２腹分）の前脳基底野より分散培養
によって初代培養細胞を調製した。この初代培養細胞を
ポリエルリジン（ナカライテスク社製）によりコーティ
ングした２４ウェルプラスチック細胞培養プレート中で
培養した。コーティングは０．５ｍｇポリエルリジン／
１ｍｌ ０．１５Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）の
ポリエルリジン溶液に培養プレートを１晩浸漬した後、
滅菌精製水で洗浄し、自然乾燥させて行った。初代培養
細胞は培養プレート１ウェルの底面積に対して、３×１
０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の密度となるように、５％牛胎児
血清（ハイクローン社製）／５％馬血清（ライフテック
オリエンタル社製）１ｍＭＰｙｒｕｖａｔｅ／５０μｇ
／ｍｌ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ライフテックオリエン
タル社製）／ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地
（ライフテックオリエンタル社製）で調製した。培養は
３７℃、１０％ＣＯ₂中で４日間行った。

【００４６】（２）自己会合型アミロイドβ蛋白質の添
加 上記（１）で得られた初代培養細胞について、培養液を
Ｂ２７（ライフテックオリエンタル社製）、Ｎｅｕｒｏ
ｂａｓａｌ（ライフテックオリエンタル社製）、０．５
ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０μｇ／ｍｌ Ｇｅ
ｎｔａｍｉｃｉｎ（ライフテックオリエンタル社製）培
地０．５ｍｌ／１ウェルに交換した。培地交換後、３７
℃、１０％ＣＯ₂中で３日間さらに培養を行った。この
培養細胞のうち３ウェルに対してＰＰ２（４−アミノ−
５−（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラ
ゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、カルバイオケム社製：
Ｃａｔ．Ｎｏ．５２９５７３）を最終濃度５０ｎＭとな
るように添加した。これを３７℃、１０％ＣＯ₂中で１
時間培養した後、例１で得られた自己会合型アミロイド
β蛋白質含有液を最終アミロイドβ蛋白質濃度が０．
５、２、５μＭ／１ウェルとなるように１ウェルずつ、
またコントロールとして２ウェルにＰＢＳ／Ｈ₂Ｏを等
容量を、それぞれ細胞外液に添加した。添加後、３７
℃、１０％ＣＯ₂中で１６時間培養を行った。また、Ｐ
Ｐ２の替わりにＰＢＳを添加した以外は上記と同様に調
製した細胞外液に例１で得られた自己会合型アミロイド
β蛋白質含有液を最終アミロイドβ蛋白質濃度が０．
５、２、５μＭ／ウェルとなるように１ウェルずつ添加
した。さらに、コントロールとしてＰＰ２のみを添加し
たウェルを用意した。

【００４７】（３）ＭＴＴ活性測定 上記（２）で自己会合型アミロイドβ蛋白質含有液を添
加していない２ウェルのうちの１つにＴｒｉｔｏｎＸ−
１００を最終濃度が０．１％となるように添加し、３７
℃、１０％ＣＯ₂中で１０分間培養した。このようにし
て毒性アミロイドβ蛋白質含有液を添加した３ウェル、
毒性アミロイドβ蛋白質を添加したがＰＰ２を添加して
いない３ウェル、ＰＰ２のみの１ウェル、コントロール
の１ウェル、及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加してウ
ェル内の培養細胞を死滅させた１ウェルの計９ウェルに
ついて培地を除去し、２５０μｇ ＭＴＴ（シグマ社
製）／ＰＢＳ５０μｌを注入した。これらを３７℃、１
０％ＣＯ₂中で３時間培養した後、２０％ ＳＤＳ（ナ
カライテスク社製）、５０％ ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｙｌ
ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）ｐＨ３．５／Ｈ₂Ｏを５０μｌ添
加した。これをさらに３７℃、１０％ＣＯ₂中で２時間
静置し、細胞を完全に融解させた。この各ウェル中の細
胞融解液について５７０ｎｍの吸光度を測定した。この
５７０ｎｍの吸光度について、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
を加えて細胞をすべて死滅させたウェルにおける値をバ
ックグラウンドとして、他のウェルにおける値から差し
引いた値の結果を図２（白丸）に示した。 以上の結果
より、毒性アミロイドβ含有液による神経細胞の細胞死
はＰＰ２により阻害されることが明らかになった。

【００４８】

【発明の効果】本発明のスクリーニング方法では、アル
ツハイマー病等の患者の生体内に存在する自己会合型ア
ミロイドβ蛋白質と同等の高い毒性を有し、かつその毒
性が維持される自己会合型アミロイドβ蛋白質を用いる
ことにより、生体内環境により近い条件で精度よくスク
リーニングを行うことができる。

【００４９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> Agent having inhibitory action on nerve cell death and method for screening said agent <130> A01091M <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Human <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Human <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のスクリーニング方法で用いる自己会
合型アミロイドβ蛋白質が神経系細胞に細胞死を誘導す
る高い毒性を有することを示した図である。図中、白丸
は本発明のスクリーニング方法に用いる自己会合型アミ
ロイドβ蛋白質の結果を示し、黒四画はアミロイドβ蛋
白質の溶液に回転を加えずに調製したアミロイドβ蛋白
質溶液についての結果を示す。

【図２】 毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質
を添加した神経細胞にＰＰ２を添加することにより、細
胞死が抑制された結果を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｄ 487/04 １４３ Ｃ０７Ｄ 487/04 １４３ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 CB26 4B063 QA01 QA07 QA18 QQ61 QR41 QR48 QR66 QR77 QS07 QS36 QX01 4C050 AA01 BB05 CC08 EE04 FF02 FF05 GG04 HH01 4C084 AA17 MA01 NA14 ZA162 ZB222 4C086 AA01 AA02 CB06 MA01 MA04 NA14 ZA16 ZB22

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 神経細胞死抑制作用を有する薬剤のスク
   リーニング方法であって、下記の工程： (1)アミロイドβ蛋白質を含む水溶液を対流させること
   により得られる、又はアミロイドβ蛋白質を含む水溶液
   中にアミロイドβ蛋白質の凝集媒体を添加することによ
   り得られる高い毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋
   白質及び被検物質の存在下で神経系細胞又は神経系器官
   を培養する工程；及び(2)上記神経系細胞又は神経系器
   官の細胞死が抑制された場合に上記被検物質が神経細胞
   死に対して抑制作用を有すると判定する工程を含む方
   法。
2. 【請求項２】 アルツハイマー病等の患者の生体内に存
   在する自己会合型アミロイドβ蛋白質と実質的に同等の
   毒性を有する自己会合型アミロイドβ蛋白質の存在下で
   行う請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 その毒性がアルツハイマー病等の患者の
   生体内に存在する自己会合型アミロイドβ蛋白質と実質
   的に同等の濃度で神経系細胞に細胞死を誘発するのに十
   分な毒性である自己会合型アミロイドβ蛋白質の存在下
   で行う請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
   の方法によりスクリーニングされた神経細胞死抑制作用
   を有する化合物又はその塩。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の化合物又は生理学的に
   許容されるその塩を有効成分として含むアルツハイマー
   病の予防及び／又は治療のための医薬。
6. 【請求項６】 下記の一般式(I)： 【化１】 （式中、Ｒ¹はハロゲン原子及びＣ_1-6アルキル基からな
   る群から選ばれる１又は２以上の置換基を有していても
   よいフェニル基を示し；Ｒ²は水素原子又はＣ_1-6アルキ
   ル基を示す）で表される神経細胞死抑制作用を有する化
   合物又はその塩。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の一般式(I)で表される
   化合物又は生理学的に許容されるその塩を含む神経細胞
   死抑制剤。
8. 【請求項８】 請求項６に記載の一般式(I)で表される
   化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分とし
   て含むアルツハイマー病の予防及び／又は治療のための
   医薬。