FR2944437A1 - Utilisation d'inhibiteurs de l'expression d'hif 1 alpha pour proteger la peau des dommages deleteres induits par le rayonnement uva - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne différentes méthodes de protection ou de prévention des effets délétères cosmétiques induits par le rayonnement UVA sur la peau d'un sujet, comprenant l'administration d'un agent capable d'inhiber le facteur de transcription HIF1α ou son expression. La présente invention concerne également des applications thérapeutiques d'un agent capable d'inhiber le facteur de transcription HIF1α ou son expression, dans la photoprotection de la peau contre le rayonnement UVA. Enfin, l'invention a également trait à des procédés pour cribler des molécules susceptibles d'assurer la protection et/ou la prévention des dommages induits par le rayonnement UVA ainsi que des méthodes d'évaluation de l'efficacité de molécules dans leur action protectrice de la peau à l'encontre du rayonnement UVA.

Description

La présente invention est dans le domaine cosmétique et thérapeutique, et concerne plus particulièrement la peau. Elle s'inscrit plus généralement dans le cadre de la prévention et de la protection des effets délétères induits par le rayonnement solaire sur la peau. La peau est composée de deux tissus majeurs, l'épiderme et le derme. L'épiderme est la 10 couche la plus superficielle. Les cellules majoritaires constituant l'épiderme sont les kératinocytes, dont la fonction essentielle est une protection vis-à-vis de l'extérieur. Cette fonction est assurée par le processus de différenciation épidermique aboutissant à la formation des couches cornées. L'épiderme repose sur le derme, qui est une matrice conjonctive de soutien assurant la vascularisation et permettant aussi une meilleure 15 protection des tissus et organes sous jacents. Ce sont les fibroblastes, cellules enchâssées dans le derme, qui synthétisent les principaux composants de cette matrice conjonctive. Ces principaux composants sont les collagènes, l'élastine et les protéoglycanes. La peau est exposée à de nombreux facteurs externes, tels que la pollution, les facteurs 20 climatiques, les agressions mécaniques, les infections, le soleil etc., qui peuvent entraîner des conséquences néfastes à court, moyen et long terme. Le soleil émet de nombreux rayonnements, dont 10 % sont constitués par des rayons ultraviolets. Parmi les rayonnements UV, seuls les rayons ultraviolets B (UVB, de longueur d'ondes comprise entre 280 et 320 nm) et les ultraviolets A (UVA, de longueur d'ondes 25 comprise entre 320 et 400 nm) atteignent la surface de la terre. Peu pénétrants, les UVB parviennent jusqu'à la couche la plus profonde de l'épiderme et entraînent des lésions directes à l'ADN. Les UVA traversent l'épiderme et atteignent le derme du fait de leur propriété de pénétration plus importante. Les UVA sont surtout générateurs de stress oxydatif 30 intracellulaire. La pénétration des rayonnements UVA rend ces derniers directement impliqués dans les atteintes profondes de la peau. L'exposition solaire entraîne des conséquences cliniques à court terme comme le coup de soleil qui apparaît dans les 24 heures qui suivent une exposition au soleil et qui traduit une réaction érythémale. Le coup de soleil est essentiellement dû aux rayonnements UVB. 35 Lors d'une exposition UVB, des lésions directes à l'ADN sont formées de type cyclobutane pyrimidine dimères ou 6-4 photoproduits. De nombreuses cytokines sont aussi impliquées dans la réaction inflammatoire induite par l'exposition solaire, comme les interleukines 1, 6 -2- et 8 (IL1, IL6, IL8) par exemple. Dans la peau humaine in vivo, l'IL-8 est produite en grande quantité après irradiation UV [1;2] et participe à une réaction d'inflammation aiguë [3]. Il a aussi été montré que, même en l'absence de coup de soleil, des expositions UVA étaient aussi responsables de la production de nombreuses cytokines, en particulier I'IL8. Une des conséquences délétères à long terme est représentée par le développement de cancers cutanés (carcinomes baso et spinocellulaires), qui sont la conséquence la plus dramatique de l'exposition solaire et qui sont associés à des mutations résultant de lésions à l'ADN mal réparées [4]. La présence de mutations spécifiques dans les carcinomes cutanés des zones exposées au soleil, attestent du rôle important des rayonnements UVB (mutations sur les bases pyrimidiques) [5]. L'autre conséquence à long terme est illustrée par les signes cliniques de photovieillissement, appelés également vieillissement actinique, ou dermatohéliose. La peau, sur les zones exposées chroniquement, perd de son élasticité, devient tannée , présente des rides très profondes et des zones d'hyperpigmentation comme les taches de vieillesse (lentigos actiniques) [6]. Le phénomène de photovieillissement est associé à une désorganisation importante de la structure dermique. Ces altérations forment progressivement l'élastose solaire, caractéristique des zones photovieillies [7]. Les modifications de la matrice dermique sont liées à la fois à la diminution en contenu de collagène, à des modifications des autres composantes de la matrice extracellulaire comme l'élastine, les protéoglycans et les glycoaminoglycans, des modifications de l'organisation des composants matriciels (crosslink, glycation) et à une augmentation de la dégradation de cette matrice par certaines enzymes de la famille des MMPs (métalloprotéinases de la matrice) [8]. La MMP la plus importante dans le processus d'altération de la matrice dans le photovieillissement, est la MMP-1 ou collagénase interstitielle. Elle est capable de dégrader les fibres de collagène natif de type I et III, qui sont les fibres majoritaires de soutien du derme [9]. L'ensemble de ces phénomènes aboutit donc à des modifications de nature, de vitesse de renouvellement, mais aussi d'organisation et d'interactions entre les différents composants du derme et les cellules qui y sont localisées. C'est l'ensemble de ces phénomènes qui est responsable de la désorganisation de la structure dermique et donc du photovieillissement. Dans les phénomènes de photovieillissement il a aussi été observé des anomalies des mitochondries, en particulier la présence dans les fibroblastes dermiques de la peau photoagée, de mutations particulières de l'ADN mitochondrial, appelées common deletion qui se traduisent par une diminution de la fonctionnalité des mitochondries [10]. In vivo et in vitro il a été montré qu'expérimentalement ces délétions de l'ADN mitochondrial pouvaient être générées [11] [12], ceci en exposant des peaux ou des -3- cellules de la peau, en particulier des fibroblastes, à des doses d'UV de type A de faible intensité mais de façon répétée. Ces mutations de l'ADN mitochondrial sont considérées comme un bio marqueur de photovieillissement attestant de l'impact des expositions UVA [13].

Au niveau cellulaire et moléculaire, la peau répond à l'exposition solaire en activant des systèmes de défense en particulier des systèmes antioxydants pour faire face au stress oxydatif. La peau induit également la modulation précoce de nombreux gènes [14] et facteurs de transcription tels que p53, c-fos, c-jun et de façon plus tardive, la modulation de gènes impliqués dans la réparation de l'ADN, l'inflammation, l'apoptose et l'adhésion cellulaire. [10]. Parmi les gènes modulés par les UV de type B il a été montré que le facteur de transcription HIF1a est modulé par les UVB.

HIF1 est un facteur de transcription composé de deux sous-unités, une sous-unité a dont l'expression est fortement régulée notamment par l'oxygène, et l'autre sous-unité R exprimée de façon constitutive [15]. HIF1 a de nombreux gènes cibles, environ 70 identifiés à ce jour, distribués dans des familles fonctionnelles très variées, comme l'angiogenèse, l'érythropoïèse, la prolifération et la viabilité cellulaires ainsi que dans les métabolismes du fer et du glucose [16]. Une hypoxie intracellulaire (dans des cellules saines ou tumorales) ou certaines altérations génétiques peuvent provoquer une surexpression de la sous-unité a de HIF1. Les ARNm hif la sont retrouvés dans la plupart des types cellulaires. Leur expression était considérée comme constitutive mais il s'avère qu'elle peut rapidement varier dans certaines conditions. Cependant, la régulation transcriptionnelle (modifications des taux d'ARN messagers) des deux gènes hif1 a et hif1 [3 est assez peu illustrée dans la littérature. Les régulations traductionnelle et post- traductionnelle de la sous-unité la sont les plus détaillées [15;17]. Un des facteurs de régulation les plus importants est la pression d'oxygène. En hypoxie, la sous-unité HIF1a s'accumule, effectue une translocation dans le noyau et s'associe avec HIF1 (3. L'hétérodimère ainsi formé reconnaît les HRE (HIF1a Responsive Elements) présents sur les promoteurs de gènes cibles et augmente la transcription des gènes reconnus. Cependant d'autres facteurs de régulation existent indépendamment de l'oxygène, en particulier l'effet de certains facteurs de croissance sur les cellules qui augmentent la traduction de l'ARNm HIF1a. Des études révèlent que la protéine HIF1a est surexprimée dans de nombreux cancers chez l'homme, et l'inhibition de Hl1a a été proposée comme stratégie anticancéreuse pour inhiber la prolifération tumorale. Il a été montré in vivo chez l'animal que la surexpression constitutive de HIF1a présente un avantage pour la cellule tumorale, par contre son -4- inhibition est néfaste à la cellule tumorale. Il existe des inhibiteurs de HIF1, comprenant des molécules de différentes familles chimiques et agissant à différents niveaux de régulation. Certaines ont été identifiées par criblage à haut débit et d'autres de façon plus fortuite. On citera le NSC607097 (ou DX52-1), un analogue de la quinocarmycine, ayant des effets anticancéreux, des analogues de la camptothécine (CPT), le 3-(5'-hydroxyméthyl-2'-furyl)-l-benzyl-indazole (YC1), connu comme inhibiteur de l'agrégation plaquettaire et de la contraction des muscles lisses vasculaires, des molécules déstabilisatrices des microtubules (2-méthoxycestradiol et la vincristine), le taxol, les inhibiteurs du chaperon Hsp90 (heat-shock protein 90), la geldanamycine, le radicicol ou un de ses dérivés, le KF58333. Les inhibiteurs de la thiorédoxine (TRX1) (pleurotine, PX12) entraînent l'inhibition de HIF1a et une diminution de l'expression de la protéine VEGF, des inhibiteurs des voies de signalisation des PI3K et des MAPK. [15].

L'expression de HIF1a dans la peau humaine normale est très faible au niveau 15 épidermique, et beaucoup plus abondante dans le follicule pileux, les glandes sébacées et les glandes sudorales [18 19]. HIF1a contrôle la prolifération des kératinocytes [20] et intervient également lors de la cicatrisation au cours de laquelle il est sur-exprimé dans les kératinocytes et dans les fibroblastes de la peau [21]. De plus, certains gènes de la matrice extracellulaire exprimés 20 par les fibroblastes dermiques sont sous le contrôle de HIF1a [22]. Une sur-expression de HIF1a a été montrée dans l'épiderme de la peau psoriasique avec apparition d'un signal au niveau dermique essentiellement localisé au niveau des cellules endothéliales des capillaires [18] . Toujours dans la peau psoriasique, un des gènes cibles de HIF1a, VEGF est aussi trouvé nettement augmenté. 25 Il a été démontré dans les kératinocytes HaCat en culture exposés aux UV de type B que HIF1a était d'abord régulé négativement dans les heures qui suivent l'exposition puis surexprimé (à T= 10h-24h). Cet effet est associé à l'induction de VEGF et à l'inflammation [23]. 30 Un autre article rapporte aussi une réponse biphasique de l'expression de HIF1a après exposition UVB dans les kératinocytes humains normaux (d'abord diminution puis augmentation). Cette réponse semble dépendante des ROS (Reactive oxygen species), générés par l'exposition UVB, essentiellement au niveau des mitochondries [24]. Une augmentation des protéines HIF1a et VEGF a aussi été démontrée dans des 35 kératinocytes humains en culture après exposition UVB. Une augmentation des ARNm de VEGF mais pas de HIF1a a été trouvée. Ces effets seraient dus à l'activation du récepteur de l'EGF (EGFR) [25]. -5- L'intérêt de ces travaux réside dans la prévention des cancers UV induits, car ce sont des cancers d'origine épidermique (carcinomes) et car l'inflammation et les processus d'angiogénèse (VEGF) sont des facteurs importants dans le développement tumoral.

Aucun de ces documents ne rapporte la modulation de HIF1a après exposition de type UVA, en particulier dans des fibroblastes dermiques.

L'exposition solaire entraînant donc de nombreuses conséquences délétères sur la peau, il existe un besoin réel de protection, de prévention des effets néfastes du soleil sur la 10 peau mais aussi de moyen de caractérisation du degré d'altération de la peau induite par les expositions solaires. Il est clairement établi que les UVB, très énergétiques et générateurs de lésions directes à l'ADN sont directement impliqués dans les processus de carcinogénèse épidermique induite par l'exposition solaire. Plus récemment il a été montré que les UVA dans une 15 moindre mesure pouvaient aussi avoir un effet négatif en terme de développement de tumeurs UV induites. Les UVA du fait de leur plus fort pouvoir pénétrant jusque dans le compartiment dermique, de leur mode d'action, essentiellement la génération d'espèces radicalaires, et par le fait qu'ils sont présents en grande quantité de façon permanente (environ 90% du spectre UV 20 solaire avec très peu de variations en fonction des conditions météorologiques, passage au travers des vitres, peu de diminution en fonction de l'heure de la journée, ou de la saison) [2627] contrairement aux UVB, sont considérés comme les principaux responsables des processus de photovieillissement et en particulier des altérations dermiques associées. 25 Pour les raisons évoquées ci-dessus et dans la mesure où l'exposition dans des conditions riches en UVA correspond à ce que les hommes reçoivent journellement dans la vie quotidienne [26] , il faut s'en protéger. Afin de se protéger des effets délétères de l'exposition solaire sur la peau, il existe à ce jour notamment les solutions citées ci-dessous. 30 Tout d'abord, il existe des filtres solaires. Ils sont appliqués directement sur la peau et ils constituent une barrière contre les rayonnements UV. Certains filtres absorbent préférentiellement les UVB, d'autres les UVA. En combinaison dans des formulations solaires on obtient des systèmes filtrants permettant de filtrer l'ensemble du spectre UV de 290 à 380 nm [28]. Cependant à ce jour, il reste une petite partie du spectre UV solaire 35 dans les UVA longs (entre 380 et 400 nm) pour laquelle aucun filtre solaire n'est efficace. Il a été montré que cette fraction d'UV était aussi impliquée dans la génération de stress -6- oxydatif, dans l'induction de MMP-1 et dans la formation des délétions mitochondriales de l'ADN [29]. II est également connu des agents anti-oxydants : les cellules sont dotées de systèmes naturels anti-oxydants pour éliminer les espèces réactives de l'oxygène. II s'agit soit de piégeurs d'espèces radicalaires soit d'enzymes stimulant les défenses anti-radicalaires. Ils peuvent être apportés à la peau de façon exogène, sous forme de formulations ou par voie orale. Par exemple, la vitamine C, la vitamine E, des extraits naturels, seuls ou en combinaison, peuvent montrer une efficacité anti-radicalaire. [30]. Enfin, sont également connus les agent qui empêchent la dégradation du derme, qui peuvent être utilisés pour éviter l'apparition des signes dermiques de photovieillissement, comme les anti-MMP1 : la MMP1 enzyme de dégradation de la matrice dermique est un acteur majeur dans les signes dermiques de photo-vieillissement. Il existe des molécules qui sont capables d'inhiber la production de MMP1. On trouve celles-ci dans des extraits naturels de plantes ou diverses entités chimiques comme certains rétinoïdes [31].

Afin de prévenir de certains effets délétères des UV, en particulier des UVA, et de prévenir les signes de photovieillissement, les présents inventeurs proposent, de manière originale, d'utiliser des agents (notamment des molécules actives, siRNA spécifiques, extraits naturels...) pour moduler l'induction de l'expression d'HIF1a et de certains de ses gènes cibles. Les inventeurs proposent également d'utiliser HIF1a comme un bio-marqueur de l'impact des expositions solaires et comme un indicateur d'évaluation de l'efficacité des produits anti-UVA. En effet, de façon inattendue, les inventeurs, dans leurs expérimentations, ont montré que le facteur de transcription HIF1a est fortement induit dans la peau après UVA surtout dans les fibroblastes dermiques et ceci au niveau transcriptionnel (augmentation des ARN messagers). Ils ont également démontré que cette induction était associée à la formation de délétions de l'ADN mitochondrial, qu'elles soient induites par les UVA, par un système de traitement chimique des cellules, ou de façon naturelle dans des cellules mutées (KSS, syndrome de Kearns-Sayre). Enfin, ils ont mis en évidence le fait que l'induction de HIF1a, par les UVA ou par des délétions de l'ADN mitochondrial, était associée à l'induction de certains gènes cibles de HIF1a comme LOX, IL8, VEGF et Aldolase A. Chacun de ces gènes peut être associé à une fonction particulière impliquée dans les phénomènes de photovieillissement.

VEGF : vascularisation û inflammation. Il existe une composante inflammatoire spécifique du derme photoagé par rapport au derme âgé chronologiquement (zones -7- photoprotégées). II a été montré que le facteur VEGF est induit par l'exposition UV, en particulier UVB [3233]. IL8 : C'est une cytokine pro-inflammatoire induite par l'exposition UV. Comme de nombreuses cytokines elle peut être impliquée dans la régulation de certains composants 5 de la matrice extracellulaire (MMPs, Collagènes, etc..). LOX : [34-36]. Amino oxydase à cuivre, jouant un rôle important dans la formation des ponts covalents à base de lysine dans les protéines de la matrice extracellulaire cutanée. Des modifications de LOX et de la matrice extracellulaire ont été décrites dans les processus de vieillissement de la peau, mais aussi dans différentes pathologies 10 cutanées associées à des modifications du derme et de sa structure ou de son remodelage (cicatrisation, fibroses, chéloïdes, sclérodermie, peau diabétique). Aldolase A : membre des enzymes glycolytiques, impliqués dans la régulation du statut énergétique de la cellule. Les inventeurs ont ainsi montré que HIF1a est au centre du processus dermique de 15 photovieillissement et qu'il représente une cible de choix pour agir sur les différents paramètres altérés dans ce désordre. Certaines molécules permettent de réduire l'induction de HIF1a et de diminuer parallèlement l'induction de gènes cibles. Les présents inventeurs proposent donc d'utiliser des inhibiteurs de HIF1a pour empêcher l'apparition des signes de 20 photovieillissement. La présente invention repose sur l'identification, par les inventeurs, de l'induction dans les fibroblastes dermiques de la protéine HIF1a, en réponse à un rayonnement UVA. Elle porte essentiellement sur la photoprotection et/ou prévention des conséquences néfastes du rayonnement UV, notamment UVA, grâce à l'inhibition de cette induction. 25 En particulier, selon un premier aspect, la présente invention concerne différentes méthodes cosmétiques, dermatologiques, de préférence sans visée thérapeutique. L'invention concerne notamment une méthode de protection des dommages délétères ou néfastes, d'ordre cosmétique, induits par le rayonnement UV, et plus spécifiquement le rayonnement UVA, sur la peau d'un sujet. Elle concerne également une méthode de 30 prévention de ces effets délétères ou néfastes. Par dommages délétères ou néfastes cosmétiques, on entend des effets qui touchent essentiellement à l'aspect visuel de la peau, en particulier la réaction érythémale de type inflammatoire et/ou le vieillissement actinique ou dermatohéliose. Le vieillissement actinique ou dermatohéliose comprend plus particulièrement la perte d'élasticité de la 35 peau, l'aspect tanné , la présence de rides très profondes et de zones d'hyperpigmentation comme les taches de vieillesse (lentigo actiniques). Les effets cosmétiques s'entendent donc des conséquences sur l'apparence de la peau. -8- De préférence, l'invention concerne la protection ou la prévention à l'encontre du photo-vieillissement ou dermatohéliose, de la peau, ou bien des photodommages. Par sujet, on entend essentiellement un être humain, aussi bien les hommes que les femmes, et quelque soit leur âge. Un sujet peut notamment être un nourrisson, un enfant en bas âge, un enfant, un adolescent, un adulte, une personne âgée, quelque soit leur sexe. Il s'agit plus particulièrement d'une femme ou d'une jeune fille. De préférence, le sujet ne souffre pas d'un cancer cutané UV-induit. Par prévention ou protection, on entend que les dommages néfastes engendrés par l'exposition solaire, et plus particulièrement la composante UVA du rayonnement solaire, sont diminués d'une manière statistiquement significative, qui peut être mesurée par comparaison avec une peau ne bénéficiant pas de prévention ou protection au sens de l'invention. Une telle méthode de photoprotection ou prévention des effets délétères comprend l'administration d'un agent capable d'inhiber le facteur de transcription HIF1a ou bien 15 d'inhiber son expression. Dans le cadre de la présente invention, on nomme facteur de transcription HIF1a, la sous-unité alpha du facteur de transcription HIF1 et qui correspond à la protéine référencée NP_001521 dans GeneBank (SEQ ID N°1, voir FIG. 5A) ainsi que les différents variants alléliques de cette protéine, présentant toutefois la même fonction in vivo, notamment celle 20 de s'associer avec la sous unité béta de HIF1. Une séquence en ADN codant pour la protéine HlFla est notamment la séquence hifla NM_001530 (SEQ ID N°2, voir la FIG. 5B). Un agent capable d'inhiber le facteur de transcription HIF1a est un agent qui inhibe les différentes fonctions de HIF1a, notamment dans la cascade enzymatique déclenchée en 25 réponse à l'exposition solaire, plus particulièrement à la composante UVA, et tout particulièrement l'activation des gènes cibles de HIF1. De préférence, dans le cadre de la présente invention, un agent inhibant HIF1a est un inhibiteur direct, qui interagit directement avec HIF1a pour en inhiber les fonctions. De tels agents sont par exemple des molécules chimiques ou des complexes de molécules, des 30 protéines, des acides nucléiques. Des agents tout particulièrement préférés sont notamment les anticorps, qu'ils soient polyclonaux ou monoclonaux. De préférence, il s'agit d'anticorps dirigés spécifiquement contre des épitopes présents au sein de la protéine HIF1a, préférentiellement des épitopes conformationels. Il peut également s'agir d'un fragment d'anticorps, par exemple un anticorps à chaîne unique ; ledit fragment de 35 préférence conserve sa capacité à interagir directement avec le facteur de transcription HIF1a. Par interaction directe, on entend tout particulièrement la capacité de se lier directement, sans nécessité de la présence d'un intermédiaire. -9- Un anticorps particulièrement préféré est un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope conformationnel de HIF1a. Une autre catégorie d'agents selon la présente invention est l'ensemble des agents qui inhibent l'expression de HIF1a. Cette inhibition de l'expression peut provenir notamment d'une inhibition intervenant au niveau de la traduction ou d'une inhibition intervenant au niveau de la transcription du gène correspondant. Dans une mise en oeuvre particulièrement préférée, un agent tel qu'utilisé dans la méthode de l'invention, est un agent qui inhibe la traduction du gène hif la, notamment grâce au phénomène d'ARN interférence ou ARNi (RNAi en anglais). D'autres agents envisagés sont aussi les ARN antisens qui sont également des inhibiteurs traductionnels et qui, en se fixant à l'ARNm, bloquent la traduction du gène visé. Etant donné la séquence du gène hif la, l'homme du métier sait pertinemment comment définir un ARN, dit siRNA pour small interfering RNA , capable d'interférer avec la transcription du gène hif la. Un tel ARN interférent, ou siRNA, est de préférence une molécule d'ARN double brin. Selon des mises en oeuvre particulièrement préférées dans le cadre de la présente invention, ledit agent est une molécule comprenant une séquence d'ARN, ladite séquence présentant un fort pourcentage d'identité avec une partie du gène hif la (représenté notamment par la séquence SEQ ID N°2), afin d'induire un phénomène d'interférence ARN. Le fort pourcentage s'entend préférentiellement d'un pourcentage d'identité d'au moins 80%, de préférence au moins 90%, voire au moins 95%. Ce fort pourcentage d'identité doit correspondre à une partie transcrite du gène hif la, comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 18 nucléotides consécutifs. Selon une mise en oeuvre préférée, la molécule est une molécule d'ARN double brin. De préférence, elle présente au moins 90% d'identité avec une partie transcrite du gène hif la d'au moins 18 nucléotides consécutifs, de préférence entre 19 et 25, voire entre 20 et 23, préférentiellement 22 ou 23. Selon une autre mise en oeuvre particulièrement préférée dans le cadre de cette invention, l'agent dont il est question est une molécule de la famille des flavonoïdes, de préférence 30 l'apigénine ou la génistéine. Leus formules chimiques sont les suivantes : génistéine Apigénine OH 0 HO OH -10- D'autres molécules, de la famille des flavonoïdes sont tout particulièrement considérées dans le cadre de la présente invention. Elles sont susceptibles d'inhiber l'expression de la protéine HIF1a en réponse à une exposition aux UVA. Il peut s'agir notamment d'extraits naturels contenant des flavonoïdes comme par exemple l'extrait de camomille ou l'extrait de persil. Des molécules préférées sont des dérivés de l'apigénine et/ou de la génistéine, par substitution, délétion ou addition de quelques atomes, de préférence d'un, deux, trois ou quatre atomes. Des agents préférés sont des agents qui inhibent plus particulièrement l'induction de 10 l'expression de HIF1a, en réponse à un rayonnement UV, plus particulièrement en réponse à un rayonnement UVA. D'autres molécules susceptibles d'être utilisées dans le cadre de cette invention sont la molécule PX12 (1-methylpropyl-2-imidazolyl-disulfide), et des dérivés de PX12, des dithiolanes et autres disulfures, qui ciblent la thioredoxine (en lien avec HIF-1 a). 15 D'autres molécules encore sont les benzymidazoles et les dérivés de benzymidazole, tout particulièrement la molécule YC-1 (3-(5'-hydroxyméthyl-2'-furyl)-1-benzyl-indazole ) et ses dérivés. Par dérivés d'une molécule donnée, on entend notamment des molécules obtenues à partir de la molécule donnée par substitution, délétion ou addition de quelques atomes ou 20 groupements, de préférence de moins d'une dizaine d'atomes, par exemple d'un, trois, cinq ou huit atomes. Selon une mise en oeuvre préférée, l'agent utilisé dans les méthodes cosmétiques selon la présente invention n'agit que sur la fonction ou l'expression de HIF1a, et n'induit pas de modulations d'autres gènes ou protéines. Un agent préféré est donc spécifique de HIF1a 25 ou du gène hif la. Dans cette optique, les agents basés sur l'interférence à ARN (RNAi) sont tout particulièrement préférés dans la mesure où leur spécificité de séquences induit une interférence au niveau traductionnel du seul ARNm visé, en l'occurrence celui de HIF1a. La photoprotection et / ou prévention à l'encontre des effets délétères ou néfastes du 30 rayonnement solaire UVA, se traduit notamment par une diminution du taux des ARNm correspondant à au moins l'une des protéines LOX, IL-8, VEGF et l'aldolase A, au sein des cellules de la peau, et tout particulièrement au sein des fibroblastes dermiques. La diminution s'entend d'une diminution au sein d'une peau, et plus particulièrement au sein de fibroblastes dermiques, ayant reçu l'administration de l'agent par rapport à des 35 fibroblastes dermiques n'ayant pas reçu cette administration. La diminution est de préférence d'au moins 10%, de préférence même d'au moins 40 à 50%. De préférence, le taux d'ARNm de l'une des protéines est divisé par un facteur d'au moins deux, de -11- préférence par un facteur 3 ou 5, voire même une diminution d'un facteur 10. Une telle diminution peut notamment être observée dans un protocole de test tel que mis en oeuvre dans l'exemple 4 de la présente demande. II est en effet bien connu que les protéines LOX, IL-8, VEGF et l'aldolase A sont toutes 5 impliquées dans les phénomènes de photovieillissement. En administrant un agent capable d'inhiber HIF1a ou son expression, selon la méthode de l'invention, il est ainsi possible de diminuer le taux d'au moins l'une des protéines LOX, IL-8, VEGF et Aldolase A dans les cellules de la peau exposée, notamment dans les fibroblastes dermiques, et donc de la protéger à l'encontre des effets néfastes liés à 10 l'exposition solaire. De préférence, le taux d'ARN messager d'au moins deux, voire trois de ces protéines est diminué. Le rayonnement UV tel que considéré dans le cadre de la présente invention est un rayonnement non ionisant, plus particulièrement un rayonnement UVA, et de préférence 15 d'une intensité comparable à celle du rayonnement solaire. II s'agit de préférence d'un rayonnement de longueur d'ondes comprise entre 320 et 400 nm, par exemple d'un rayonnement compris entre 350 et 400 nm, ou entre 380 et 400 nm. De préférence, le rayonnement est un rayonnement UVA délivré à une dose suffisante pour être prise en compte dans l'impact biologique. 20 Pour la prise en compte dans l'impact biologique, on se réfère généralement aux doses érythémales (ou S.E.D. pour Standard Erytema Dose ), qui pour les UVB sont d'environ quelques dizaines de mJ/cm2, alors qu'il faut compter plusieurs J/cm2 pour des UVA ; il est en effet couramment admis un facteur de 100 à 1000 en terme de quantité nécessaire d'UVA versus UVB pour avoir un impact biologique. 25 Un rayonnement UV selon l'invention est donc de préférence un rayonnement UVA délivré à une dose au moins supérieure à une S.E.D. ( Standard Erytema Dose ), de préférence à 2 ou 3 SED. Les méthodes cosmétiques selon la présente invention comprennent une administration de l'agent inhibant tel que décrit plus haut. Ladite administration peut être par tout moyen 30 adéquat et l'homme du métier saura déterminer, en fonction de la nature chimique de l'agent inhibant, quel moyen d'administration est le mieux adapté. Selon des mises en oeuvre plus particulièrement préférées, l'agent capable d'inhiber HIF1a ou son expression , est administré par voie orale ou bien par application topique. Dans la mesure où il s'agit d'une photoprotection locale, plus particulièrement concentrée 35 sur les zones exposées au rayonnement solaire, une administration topique est préférée dans le cadre de l'invention. De préférence, les zones d'applications sont exemptes de toute tumeur. -12- En plus des méthodes cosmétiques, la présente invention concerne également, toujours dans le domaine cosmétique, diverses utilisations des agents capables d'inhiber la protéine HlFla ou son expression tels que définis plus haut. La présente invention concerne notamment l'utilisation d'un agent capable d'inhiber la protéine HIF1a ou son expression, à des fins cosmétiques pour la prévention ou la protection de la peau à l'encontre des effets délétères induits par le rayonnement UVA. Les effets délétères induits par le rayonnement UV, notamment UVA, ont déjà été définis précédemment.

Selon un second aspect, la présente invention concerne également diverses applications dans le domaine thérapeutique. Indépendamment des conséquences sur l'apparence de la peau, le rayonnement UV peut également engendrer des effets sur la santé du sujet, certains très graves mettant sa vie en péril. Parmi les pathologies engendrées par le rayonnement UVA, on peut notamment citer des désordres dermatologiques tels que la lucite estivale. Par ailleurs, il est bien connu qu'à long terme, une des conséquences dramatiques de l'exposition solaire est le développement de cancers cutanés, notamment de carcinomes, ou épithéliomas, basocellulaires et spinocellulaires, développement auquel participent les rayons UVA. En modulant l'induction de la protéine HIF1a en réponse à l'exposition aux UV, notamment UVA, les inventeurs proposent donc un nouveau moyen pour limiter les risques de carcinomes liés à l'exposition solaire, ainsi que pour prévenir d'autres affections UVA-induites telles que la lucite estivale. La présente invention concerne donc un agent capable d'inhiber la protéine HIF1a ou son expression, pour une utilisation thérapeutique et plus particulièrement pour une utilisation prophylactique dans la protection et /ou la prévention des dommages induits par le rayonnement UVA sur la peau d'un sujet. II peut s'agir notamment de la protection et / ou la prévention des cancers cutanés ou de désordres dermatologiques tels que la lucite estivale. L'invention concerne également l'utilisation d'un agent capable d'inhiber la protéine HIF1a ou son expression, pour la fabrication d'un médicament, pour assurer la protection ou la prévention des effets délétères induits par le rayonnement UVA sur la peau d'un sujet, et tout particulièrement pour assurer la protection et/ou la prévention à l'encontre des désordres dermatologiques pathologiques et des cancers cutanés. De préférence, le sujet à traiter ne souffre d'aucun cancer UV-induit au préalable.

II a déjà été explicité ce qu'il faut entendre par agent capable d'inhiber la protéine HIF1a ou son expression, en rapport avec les applications cosmétiques. II en est de même pour les applications thérapeutiques. -13- Les effets délétères nécessitant une intervention thérapeutique s'entendent essentiellement du développement de cancers cutanés ou carcinomes et des désordres dermatologiques tels que la lucite estivale. Comme déjà explicité pour les applications de nature cosmétique, un agent préféré selon la présente invention est un agent capable d'inhiber l'expression du gène HIF1a par intervention au niveau traductionnel, et tout particulièrement par interférence avec l'ARN messager correspondant à HlFla (RNA interférence). De ce fait, un agent préféré est une molécule comprenant une séquence d'ARNi, ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec au moins 18 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2. De préférence, le pourcentage d'identité est d'au moins 90%, voire d'au moins 95%. Selon un cas préféré, l'identité est totale sur une partie d'au moins 18 nucléotides consécutifs. De préférence, il s'agit de 19 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 20 nucléotides consécutifs. Selon une mise en oeuvre préférée, ledit agent est une molécule d'ARN double brin, présentant une longueur comprise entre 18 et 25 nucléotides, de préférence entre 19 voire 20 et 23 nucléotides, agissant comme siRNA au niveau de l'ARNm du gène hifla. Selon une autre mise en oeuvre préférée, l'agent utilisé à des fins thérapeutiques est une molécule de la famille des flavonoïdes. Des agents tout particulièrement préférés pour les utilisations thérapeutiques selon la présente invention sont l'apigénine et la génistéine. D'autres agents également considérés sont des dérivés de l'apigénine et/ou de la génistéine, obtenus par substitution, délétion ou addition de quelques atomes ou groupements d'atomes, de préférence d'un, deux, trois ou quatre atomes, à condition qu'ils soient également susceptibles d'inhiber l'expression de la molécule HIF1 en réponse à une exposition à un rayonnement UVA. D'autres agents concernés sont également des extraits naturels, tel qu'un extrait de camomille ou un extrait de persil. D'autres agents sont également les dérivés de PX12 (1-methylpropyl-2-imidazolyldisulfide), des dithiolanes et autres disulfures, qui ciblent la thioredoxine (en lien avec HIF-1a). D'autres agents encore sont les benzymidazoles et les dérivés de benzymidazole, tout particulièrement la molécule YC-1 (3-(5'-hydroxyméthyl-2'-furyl)-1-benzyl-indazole ) et ses dérivés. D'autres agents envisagés dans le cadre de la présente invention sont le NSC607097 (ou DX52-1), qui est un analogue de la quinocarmycine, ayant des effets anticancéreux, des analogues de la camptothécine (CPT), des molécules déstabilisatrices des microtubules telles que le 2-méthoxycestradiol et la vincristine, le taxol, la geldanamycine, le radicicol ou un de ses dérivés, le KF58333, et les inhibiteurs de la thiorédoxine (TRX1) comme la pleurotine. 2944437 -14- Selon une autre mise en oeuvre des applications thérapeutiques selon la présente invention, des agents considérés sont des anticorps ou des fragments d'anticorps. De préférence, de tels anticorps sont spécifiquement dirigés vers la protéine HIF1a, c'est-à-dire à l'encontre de l'un des épitopes portés par cette protéine, de préférence contre un 5 épitope conformationnel de HlFla. Des anticorps selon la présente invention peuvent être des anticorps polyclonaux. De préférence, il s'agit d'un anticorps monoclonal. II peut également s'agir d'un fragment d'anticorps, par exemple un anticorps à chaîne unique ; ledit fragment de préférence conserve sa capacité à interagir directement avec le 10 facteur de transcription HIF1a. Comme explicité en regard des applications cosmétiques, ledit rayonnement dans le cadre de l'invention s'entend d'un rayonnement ou radiation UVA, de préférence d'intensité comparable au rayonnement solaire. La longueur dinde d'un tel rayonnement est supérieure à 320 nm, par exemple comprise entre 350 et 400 nm, par exemple supérieure 15 à 380 nm. Les différentes mises en oeuvre préférées relatives au premier aspect de l'invention (applications cosmétiques) sont également applicables au second aspect concernant les applications thérapeutiques.

20 Selon un troisième aspect, la présente invention concerne également des procédés de criblage, permettant de mettre en évidence des agents capables d'assurer la prévention ou la protection de la peau à l'encontre des effets délétères induits par le rayonnement UV, de préférence UVA, grâce à leur action inhibitrice sur la protéine HIF1a ou sur l'expression de cette protéine HlFla, plus particulièrement au niveau des fibroblastes dermiques. 25 L'invention concerne donc un procédé de criblage d'agents susceptibles d'assurer la prévention ou la protection de la peau à l'encontre des effets délétères induits par le rayonnement UVA, comprenant : a. la mise en contact de l'agent à cribler avec des fibroblastes dermiques ; b. l'irradiation desdits fibroblastes avec un rayonnement UVA, 30 c. la détermination du niveau d'expression de la protéine HIF1a dans lesdits fibroblastes par rapport à son expression dans des fibroblastes dermiques n'ayant pas été mis en contact avec ledit agent. La mise en oeuvre d'un tel procédé vise en effet à permettre l'identification d'un agent, qui module le niveau d'expression de la protéine HIF1a, dans l'optique d'une utilisation à des 35 fins cosmétiques ou thérapeutiques, plus particulièrement dans le domaine de la dermatologie. -15- De préférence, la modulation du niveau d'expression est une diminution du niveau d'expression de HIF1a. Un tel procédé peut comprendre une étape supplémentaire de sélection d'un agent inhibant l'expression de la protéine HIF1a dans les fibroblastes dermiques.

De préférence, un procédé selon l'invention est mis en oeuvre in vitro ou ex vivo. A l'étape a), les fibroblastes sont préférentiellement des cellules primaires. Il peut s'agir notamment d'un derme équivalent ou d'un peau reconstruite. Lesdits fibroblastes ne sont, de préférence, pas des cellules tumorales. Comme explicité dans les sections précédentes de cette demande, les effets délétères sont la réaction érythémale de type inflammatoire, le vieillissement actinique, les désordres dermatologiques tels que la lucite estivale et/ou le développement de cancers cutanés. De préférence. il s'agit de photovieillissment, ou vieillissement actinique ou encore dermatohéliose, ou bien de lucite estivale. Tout type de molécule peut être testé dans le cadre du procédé de criblage de la présente invention. Il peut s'agir de molécules générées par chimie combinatoire, et dont la structure n'est pas nécessairement élucidée. La molécule à tester peut être aussi bien une molécule naturelle que synthétique. II peut s'agir par exemple d'une molécule naturellement extraite de plantes. Il peut s'agir également d'un complexe de molécules ou d'une association.

II est notamment possible de tester de petites molécules, de faibles poids moléculaires, mais également des molécules de taille plus importante, des associations de molécules, des complexes, des protéines ou des peptides, des acides nucléiques, tels que des fragments d'ADN, d'ARN, simple ou double brin. De préférence, il s'agit de molécules déjà autorisées pour des applications topiques ou 25 considérées comme sans danger pour la peau. Des molécules de choix à tester dans le cadre de ce procédé de criblage sont tout particulièrement des molécules de la famille des flavonoïdes, notamment l'apigénine et/ou la génistéine, ou bien des molécules dérivées de l'apigénine et/ou de la génistéine. De tels dérivés sont par exemple obtenus par substitution, délétion ou addition de quelques 30 atomes ou groupements, de préférence d'un, deux, trois ou quatre groupement ou atomes, de préférence un ou deux groupements, ou bien 4 ou 5 atomes. De telles molécules sont en effet particulièrement susceptibles d'inhiber l'expression de la molécule HIF1a en réponse à une exposition solaire UVA. De telles molécules sont de ce fait d'excellentes molécules candidates dans le cadre du procédé de criblage tel que décrit. 35 D'autres molécules candidates sont les dérivés de PX12 (1-methylpropyl-2-imidazolyldisulfide), des dithiolanes et autres disulfures, qui ciblent la thioredoxine (en lien avec HIF-1 a). D'autres encore sont les benzymidazoles et les dérivés de benzymidazole, tout -16- particulièrement la molécule YC-1 (3-(5'-hydroxyméthyl-2'-furyl)-1-benzyl-indazole ) et ses dérivés. D'autres molécules candidates sont le NSC607097 (ou DX52-1), qui est un analogue de la quinocarmycine, ayant des effets anticancéreux, des analogues de la camptothécine (CPT), des molécules déstabilisatrices des microtubules telles que le 2-méthoxycestradiol et la vincristine, le taxol, la geldanamycine, le radicicol ou un de ses dérivés, le KF58333, et les inhibiteurs de la thiorédoxine (TRX1) comme la pleurotine. Un tel procédé peut être automatisé afin de réaliser du criblage à haut débit. La détermination du niveau d'expression de la protéine HIF1a est de préférence quantifiée par analyse de l'ARN messager (ARNm) transcrit au sein des fibroblastes du derme. La quantification de l'ARNm transcrit est réalisée par exemple à l'aide de la technique de Northern Blot, dot blot, RT-PCR, hybridation sur puces à ADN, méthode SAGE ou par utilisation de cartes microfluidiques. D'autres techniques permettant la quantification de l'ARNm peuvent bien entendu être utilisées. Toutes ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. Elles peuvent être utilisées dans les différentes méthodes et procédés selon l'invention. Par exemple, des amorces pourront être utilisées pour l'analyse par RT-PCR de l'expression génique de HIF1a. II est également possible de quantifier le taux de transcription de hif la par l'analyse du 20 taux de traduction et donc la quantification la protéine HIF1a produite. Le rayonnement dont il est question dans le cadre du procédé de l'invention, est préférentiellement un rayonnement UVA. De préférence, il s'agit d'un rayonnement comprenant des rayons UVA et dépourvu de rayons UVB, préférentiellement un rayonnement constitué exclusivement de rayons UVA. 25 Par exemple, les doses de rayonnement peuvent être comprises entre 4 et 20 J.cm-2, par exemple entre 5 et 15 J.cm-2. II peut également s'agir d'une exposition répétée, par exemple 3 à 10 fois, de préférence 4 à 8 répétitions d'une irradiation à environ 8 J.cm-2, plus ou moins 2 J.cm-2. Une ou des étapes supplémentaires peuvent également être réalisées, de préférence une 30 étape de détermination du taux d'ARNm pour l'une quelconque des protéines LOX, IL-8, VEGF et l'aldolase A dans les fibroblastes. Dans ce cas, le taux d'ARNm de la protéine choisie est déterminé dans les fibroblastes ayant été mis en contact avec l'agent à tester puis irradiés, et comparé au taux dans des fibroblastes irradiés, n'ayant pas été mis en contact avec ledit agent. Cette étape peut être réalisée pour au moins deux protéines 35 choisies parmi la liste constituée de LOX, IL-8, VEGF et l'aldolase A, de préférence pour les quatre protéines. -17- La présente invention concerne également différentes méthodes d'évaluation. Tout particulièrement, l'invention porte aussi sur une méthode d'évaluation de l'efficacité d'un agent dans la prévention ou la protection de la peau à l'encontre des effets délétères ou dommages induits par le rayonnement UVA, comprenant les étapes suivantes : a. la mise en contact de l'agent à évaluer avec des fibroblastes dermiques; b. l'irradiation desdits fibroblastes avec un rayonnement UVA, c. la détermination du niveau d'expression de la protéine HIF1a dans lesdits fibroblastes par rapport à son expression dans des fibroblastes dermiques n'ayant pas été mis en contact avec ledit agent, c'est-à-dire des fibroblastes contrôles. De préférence, ladite méthode d'évaluation est mise en oeuvre in vitro ou ex vivo. Les différents éléments de cette méthode ont déjà été décrits dans le cadre de cette demande en rapport avec les autres aspects de l'invention et sont identiques dans le cadre de cette méthode d'évaluation.

L'agent à tester peut être tout actif, extrait naturel, ou combinaison d'actifs. Par agent, dans le cadre de cette invention, on entend aussi bien un ingrédient ou un actif sous une forme plus ou moins purifiée, présentant une activité intrinsèque in vitro ou in vivo, qu'une formulation comprenant un ou plusieurs de ces ingrédients et un support et des adjuvants adaptés à l'application visée.

Selon cette méthode d'évaluation, un agent est considéré comme efficace dans la prévention ou la protection de la peau à l'encontre des effets délétères induits par le rayonnement UVA, lorsque le niveau d'expression de la protéine HIF1a dans les fibroblastes traités est significativement diminué relativement à des fibroblastes non traités par ledit agent.

De préférence, la diminution est dite significative si elle est supérieure à 10%, par exemple au moins 15% ou au moins 20%, voire au moins 50%. La diminution s'entend d'une diminution statistiquement significative, obtenue sur un nombre suffisant de cellules. Les fibroblastes utilisés dans le cadre de cette méthode sont de préférence des cellules 30 primaires. Il peut s'agir notamment d'un derme équivalent ou d'une peau reconstruite. Lesdits fibroblastes ne sont de préférences pas des cellules tumorales. Le rayonnement UVA dont il est question est un rayonnement de longueur d'ondes supérieure à 320 nm, de préférence comprise entre 320 et 400nm, par exemple entre 350 et 400 nm, par exemple entre 380 et 400 nm. II peut notamment s'agir d'un rayonnement 35 entièrement dépourvu de rayons UVB. Il est également possible, par les méthodes d'évaluation de la présente demande, d'objectiver l'action bénéfique d'un agent, notamment d'un produit cosmétique, par -18- exemple d'une composition cosmétique, dans la prévention ou la protection à l'encontre des effets délétères du rayonnement UVA sur la peau. Les méthodes d'évaluation décrites plus haut peuvent en effet être utilisées dans un protocole de test permettant de déterminer les produits susceptibles d'être qualifiés d'agent protecteur contre les effets du rayonnement solaire UVA. Un produit sera en effet considéré comme apportant une protection à l'encontre des dommages générés par l'exposition solaire, s'il induit une diminution d'au moins 10%, de préférence d'au moins 30% du niveau d'expression de HIF1a dans des fibroblastes exposés aux UV, par rapport à des fibroblastes non traités par le produit.

Par ailleurs, au moyen de ce test, il est possible de promouvoir le produit auprès de consommateurs, en mettant en avant les résultats obtenus avec ce produit dans les méthodes d'évaluation décrites dans la présente invention. L'évaluation de l'effet protecteur contre les effets néfastes du rayonnement UV sera basée sur l'étude de l'expression du gène hifla ou de la protéine encodée par ce gène. La présente invention fournit donc également une méthode permettant de recommander un produit en signalant son effet dans un protocole de test constitué par une méthode d'évaluation telle que décrite précédemment. L'invention a donc également pour objet une méthode pour la promotion d'un produit cosmétique consistant à faire état d'une efficacité, action ou propriété dudit produit démontrée par au moins un test opéré tel que décrit précédemment.

Une telle promotion du produit pourra se faire par n'importe quel canal de communication. Elle pourra être faite notamment par la vendeuse, directement sur le point de vente, par la radio et la télévision, notamment dans le cadre de spots publicitaires. Elle pourra être faite également par le canal de la presse écrite, ou par le biais de tout autre document, en particulier à des fins publicitaires (prospectus). Elle pourra se faire également par Internet, ou par tout autre réseau informatique adéquat. Elle pourra être faite également directement sur le produit, notamment sur son packaging ou sur toute notice explicative qui peut lui être associée. La présente invention concerne également une méthode d'évaluation de l'efficacité d'un agent dans la prévention ou la protection de la peau à l'encontre des effets délétères 30 induits par le rayonnement UVA, comprenant : (a) la détermination du niveau d'expression du facteur de transcription HIF1a dans des fibroblastes dans un échantillon provenant de la peau d'un sujet exposée aux UVA après mise en contact avec l'agent, et (b) la comparaison du niveau déterminé à l'étape (a) au niveau d'expression de 35 HIF1a dans des fibroblastes dans un échantillon provenant de la peau d'un sujet exposée aux UVA en l'absence de l'agent. -19- Par ce biais, au moyen de la comparaison réalisée à l'étape (b), il est possible de déterminer si un agent est efficace ou non. II est considéré qu'un agent est efficace si une diminution d'au moins 10% de l'expression de HIF1a ou du taux d'ARNm de hif la est observée.

De préférence, le sujet n'est pas atteint de cancer UV-induit. La présente invention concerne également une méthode de détermination de l'impact d'une exposition solaire sur la peau d'un sujet comprenant : (a) la détermination du niveau d'expression du facteur de transcription HIF1a dans des fibroblastes dans un échantillon provenant de la peau du sujet ayant été 10 exposée, et (b) la comparaison du niveau déterminé à l'étape (a) au niveau d'expression de HIF1a dans des fibroblastes dermiques n'ayant pas subi d'exposition solaire. Par impact sur la peau, on entend essentiellement les répercussions en termes de photo-vieillissement de la peau. 15 Par cette méthode, il est possible notamment de déterminer si un filtre permet ou non de limiter l'impact sur la peau d'une exposition solaire. Il est également possible de déterminer, à différentes intensités et longueur d'ondes, le rayonnement UVA le plus nocif en terme de dommages sur la peau. Il est envisageable de déterminer aussi les heures de la journée, ou bien les conditions atmosphériques 20 engendrant les effets les plus délétères, du fait de la plus importante induction de l'expression de HIF1a. De plus, la détermination de l'impact d'une exposition solaire par la méthode de l'invention peut également permettre de mettre en oeuvre et d'adapter des traitements post-exposition en fonction de l'importance de l'exposition solaire telle que mesurée par référence à 25 l'induction de la protéine HIF1a. Par cette méthode, il est également possible d'évaluer les photodommages déjà subis par la peau d'un sujet et d'élaborer des recommandations concernant de futures expositions au soleil. De manière générale, par la méthode décrite ci-dessus, le niveau d'expression de la 30 protéine HIF1a est utilisé comme un bio-marqueur de photovieillissement attestant de l'impact des expositions UVA, à la place du bio-marqueur constitué par les mutations de l'ADN mitochondrial. Dans une mise en oeuvre préférée, la comparaison est effectuée par rapport au niveau d'expression de HIF1a dans des fibroblastes du même sujet, provenant d'un échantillon 35 de peau cachée de l'exposition solaire, par exemple les aisselles. - 20 - De préférence, dans les différentes méthodes d'évaluation selon l'invention, le niveau d'expression du facteur de transcription HIF1a est déterminé par référence au niveau de transcription du gène hif1 a codant pour HIF1a.

LEGENDE DES FIGURES

Figure 1: Cette figure représente le taux de l'ADN mitochondrial (A) et de la consommation d'oxygène (B) au sein de fibroblastes dermiques traités par le Bromide d'Ethidium (EtBr) et au sein de fibroblastes contrôles non traités, au cours du temps. La figure C illustre quant à elle le taux d'ARNm codant pour HIF1a (en unités arbitraires), dans des fibroblastes dermiques traités par le Bromide d'Ethidium (EtBr), en fonction du temps (h=heures, s=semaine). Aux figures A et B, les taux d'ADN mitochondrial et de consommation d'oxygène sont arbitrairement fixés à 1 pour des fibroblastes normaux non traités.

Figure 2 : Cette figure représente l'induction de common deletion (A) au sein de fibroblastes dermiques humains normaux, et l'induction d'ARNm codant pour HIF1a (B), dans des fibroblastes de peau reconstruite, après irradiation par des UVA. Le protocole d'irradiation pour la figure A est une irradiation UVA répétitive, constituée de 20 5 irradiations successives, d'intensité de 8 J/cm2. Le protocole d'irradiation pour la figure B est une unique irradiation UVA, d'intensité de 15 J/cm2 ou 25 J/cm2. Le contrôle, à la figure B, correspond à l'absence d'irradiation.

Figure 3 : Cette figure représente l'induction de common deletion ou délétions 25 mitochondriales (A), d'ARNm codant pour HIF1-a (B), et d'ARNm correspondant à LOX, IL-8, VEGF-A et l'aldolase A (C), au sein de fibroblastes dermiques délétés de façon constitutive pour leur ADN mitochondrial (KSS, fibroblastes du syndrôme de Kearns-Sayre), par rapport à des contrôles qui sont des fibroblastes normaux humains (NHF pour normal human fibroblast ). 30 Figure 4 : Cette figure représente l'induction d'ARNm codant pour HIF1a (A) et d'ARNm correspondant à LOX (B), en présence d'apigénine et en présence du seul solvant DMSO, au sein de fibroblastes dermiques délétés de façon constitutive pour leur ADN mitochondrial (KSS, fibroblaste du syndrôme de Kearns-Sayre) et au sein de fibroblastes 35 normaux humains (NHF). - 21 - Figure 5 : Cette figure illustre la séquence protéique (NP_001521, SEQ ID N°1, FIG. 5A) de HIF1a, ainsi que la séquence nucléique ADNc (NM_001530, SEQ ID N°2, FIG. 5B) codant pour HIF1a (séquence codante : du nucléotide 405 au nucléotide 2885).

PARTIE EXPERIMENTALE

Matériel et méthodes :

Induction des délétions de l'ADN mitochondrial par un traitement au EtBr.

Des fibroblastes dérivés de peau sont cultivés dans du milieu classique DMEM contenant 4,5g/1 de glucose, 10% de sérum de veau fétal, 50pg/ml, d'uridine, 1mM de pyruvate de sodium. Pour l'induction des délétions de l'ADN mitochondriales, les cellules sont traitées en ajoutant 50ng/ml de Bromure d'Ethidium. Le milieu de culture est changé tous les 2 jours 15 et les cellules sont incubées dans un incubateur à 5% CO2 et 37°C. Les détails techniques sont décrits dans [37].

Mesure des délétions mitochondriales dans les cellules Le contenu en délétions de l'ADN mitochondrial est mesuré par PCR quantitative en temps 20 réel comme décrit dans [38].

Mesure de la consommation d'oxygène La consommation d 'oxygène est mesurée à l'aide d'une électrode de Clark comme décrit dans [39]. Les cellules sont préalablement cultivées en absence de glucose. Un aliquot de 25 3,5 106 cellules est centrifugé et repris en suspension dans du DMEM et gardé sur glace. L'électrode de Clark ( Hansatech, UK) est calibrée selon les instructions du constructeur et la mesure de consommation est calculée à l'aide d'une courbe étalon.

Dosage du taux d'ARNm dans les fibroblastes/39I 30 Les fibroblastes (en monocouche ou issus de derme équivalent d'une peau reconstruite) sont lysés et les ARN totaux sont extraits (RNeasy midi kit Qiagen). Une réverse transcription d'l pg d'ARN total est réalisée (Advantge RT for PCR kit, Clontech). Les ADNc sont amplifiés par PCR quantitative (TaqMAn) à l'aide d'amorces spécifiques de HIF1a, LOX, VEGF, IL8. 35 - 22 - Traitement des cellules par l'apiqénine. Les cellules sont traitées en ajoutant pendant 24 heures soit le solvant de l'apigénine (DMSO) à la concentration finale utilisée, soit par l'apigénine diluée dans le DMSO. Les cellules sont ensuite lysées et les taux d'ARNm sont mesurés comme décrit. 5 Dermes équivalents [401 Du collagène I bovin et 330 000 fibroblastes dermiques humains adultes sont utilisés pour réaliser un équivalent de derme (ou lattice). Pendant 4 jours d'incubation à 37°C, 5% CO2, la lattice ainsi réalisée contracte et relargue le milieu de culture. A ce stade l'équivalent de 10 derme peut être utilisé soit pour réaliser une peau reconstruite complète, soit directement pour exposition UVA, après avoir été monté sur grille.

Exposition aux UVA Les fibroblastes dermiques cultivés en monocouche ou dans un derme équivalent de peau 15 reconstruite sont soumis aux UVA (longueur d'onde > 320nm), en utilisant une source ne délivrant pas de longueurs d'onde de type UVB (le milieu de culture est retiré pendant l'exposition). Les spectres des sources utilisées sont publiées dans la référence [41] .

Exemple 1 : HIF1 a est induit dans les fibroblastes dont l'ADN mitochondrial a été 20 délété expérimentalement par un traitement au EtBr . Les fibroblastes dermiques ont été cultivés et traités par de l'EtBr pendant plusieurs semaines (de 1 à 4 semaines). Comparés aux cellules contrôles, les fibroblastes traités présentent une induction progressive au cours du temps de délétions de l'ADN mitochondriales. 25 Parallèlement cette induction entraîne une diminution de la consommation d'oxygène, attestant de l'altération des fonctions mitochondriales. L'analyse des mêmes cellules, pour l'expression des ARN messagers codants pour HIF1 a, montre également une augmentation des ARN messagers. Les résultats sont illustrés à la figure 1. 30 Cet exemple illustre le lien de causalité entre l'induction des délétions de l'ADN mitochondrial et celle de HIF1 a.

Exemple 2: L'exposition UVA des fibroblastes dermiques induit à la fois la formation de délétions de l'ADN mitochondrial et l'augmentation de l'expression des 35 ARN messagers de HIF1 a Les fibroblastes dermiques sont cultivés et exposés aux UVA. L'analyse des délétions de l'ADN mitochondrial montre une augmentation dans les cellules exposées aux UVA. - 23 - Des fibroblastes contenus dans une peau reconstruite in vitro exposée aux UVA révèlent aussi une augmentation de l'expression de HIF1 a, 24 heures après irradiation. Les résultats sont illustrés à la figure 2.

Exemple 3 : La présence de délétions de l'ADN mitochondrial dans les fibroblastes est responsable de l'induction de HIF1 a et de ses gènes cibles LOX, 1L8, VEGF, Aldolase A. Des fibroblastes délétés de façon constitutive pour leur ADN mitochondrial (issus de patients KSS, c'est-à-dire souffrant du syndrôme de Kearns-Sayre) expriment un taux 10 supérieur d'ARNm HIF1 a, mais aussi des ARNm LOX, IL8, VEGF, Aldolase A. Les résultats sont illustrés à la figure 3.

Exemple 4: L'utilisation d'une molécule réduisant le taux de HIF1a permet de réduire le taux de LOX. 15 Des fibroblastes délétés de façon constitutive pour leur ADN mitochondrial (fibroblastes de patients atteints du syndrome de Kearns-Sayre, KSS), sont cultivés et traités avec la molécule apigénine. Des cellules contrôles sont cultivées de la même façon en absence de traitement par l'apigénine mais uniquement de la même quantité de son solvant le DMSO. 20 L'analyse des ARN messagers de HIF1a montre que le traitement diminue son taux d'expression. En parallèle le taux d'expression de LOX est aussi diminué par le traitement comparé aux cellules contrôles. Les résultats sont représentés à la figure 4. Cet exemple illustre le potentiel de molécules inhibitrices de HIF1a de diminuer aussi les gènes cibles impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire dermique. 25 BIBLIOGRAPHIE

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Claims (19)

1. REVENDICATIONS: 1 Méthode de protection ou de prévention des effets délétères cosmétiques induits par le rayonnement UVA sur la peau d'un sujet, comprenant l'administration d'un agent capable d'inhiber le facteur de transcription HIF1a ou son expression, où ledit agent est un anticorps ou un fragment d'anticorps, une molécule comprenant une séquence d'ARNi, un ARN antisens ou une molécule de la famille des flavonoïdes.
2. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit agent est une molécule comprenant une séquence d'ARNi, ladite séquence présentant au moins 90% d'identité avec au moins 18 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2.
3. 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit agent est une molécule de la famille des flavonoïdes, de préférence l'apigénine ou la génistéine.
4. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les effets délétères sont le vieillissement actinique ou la dermatohéliose.
5. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite prévention ou protection consiste en une diminution du taux des ARNm codant pour les protéines LOX, IL-8, VEGF et l'aldolase A dans des fibroblastes dermiques d'une peau ayant reçu l'administration de l'agent par rapport à une peau n'ayant pas reçu cette administration.
6. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite administration est orale ou topique.
7. 7. Utilisation d'un agent capable d'inhiber le facteur de transcription HIF1a ou son expression, à des fins cosmétiques pour la prévention ou la protection de la peau d'un sujet à l'encontre des effets délétères induits par le rayonnement UVA, où ledit agent est un anticorps ou un fragment d'anticorps, une molécule comprenant une séquence d'ARNi, un ARN antisens ou une molécule de la famille des flavonoïdes.
8. 8. Agent capable d'inhiber le facteur de transcription HlFla ou son expression, pour une utilisation thérapeutique dans la protection ou la prévention des effets délétères induits 2944437 - 28 - par le rayonnement UVA sur la peau, où ledit agent est un anticorps ou un fragment d'anticorps, une molécule comprenant une séquence d'ARNi, un ARN antisens ou une molécule de la famille des flavonoïdes.
9. 9. Agent selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une molécule comprenant une séquence d'ARNi ladite séquence présentant au moins 90% d'identité avec au moins 18 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2.
10. 10. Agent selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit agent est une molécule de la famille des flavonoïdes, de préférence l'apigénine ou la génistéine.
11. 11. Procédé de criblage in vitro d'agents susceptibles d'assurer la prévention ou la protection de la peau à l'encontre des effets délétères induits par le rayonnement UVA, comprenant : a. la mise en contact de l'agent à cribler avec des fibroblastes dermiques ; b. l'irradiation desdits fibroblastes avec un rayonnement UVA, c. la détermination du niveau d'expression de la protéine HIF1a dans lesdits fibroblastes par rapport à son expression dans des fibroblastes dermiques n'ayant pas été mis en contact avec ledit agent, permettant l'identification d'un agent pour une utilisation à des fins cosmétiques ou thérapeutiques en dermatologie.
12. 12. Procédé selon la revendication 11, comprenant une étape supplémentaire de sélection d'un agent inhibant l'expression de la protéine HIF1a dans les fibroblastes.
13. 13. Procédé selon la revendication 11, ou 12 comprenant une étape supplémentaire de détermination du taux des ARNm codant pour l'une quelconque des protéines LOX, IL-8, VEGF et l'aldolase A dans lesdits fibroblastes par rapport au taux dans des fibroblastes dermiques n'ayant pas été mis en contact avec ledit agent.
14. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que les agents à tester sont des molécules de la famille des flavonoïdes.
15. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que ledit rayonnement est un rayonnement constitué de rayons UVA de longueur d'ondes supérieure à 380 nm. 2944437 - 29 -
16. 16. Méthode d'évaluation in vitro de l'efficacité d'un agent dans la prévention ou la protection de la peau à l'encontre des effets délétères induits par le rayonnement UVA, comprenant a. la mise en contact de l'agent avec des fibroblastes dermiques; b. l'irradiation desdits fibroblastes avec un rayonnement UVA, c. la détermination du niveau d'expression de la protéine HIF1a dans lesdits fibroblastes par rapport à son expression dans des fibroblastes dermiques n'ayant pas été mis en contact avec ledit agent.
17. 17. Méthode d'évaluation selon la revendication 16, où ledit agent est efficace si le niveau d'expression de la protéine HIF1a dans les fibroblastes traités est diminué d'au moins 10% relativement à des fibroblastes non traités.
18. 18. Méthode d'évaluation de l'efficacité d'un agent dans la prévention ou la protection de la peau à l'encontre des effets délétères induits par le rayonnement UVA, comprenant : (a) la détermination du niveau d'expression du facteur de transcription HIF1a dans des fibroblastes dans un échantillon provenant de la peau d'un sujet exposée aux UVA après mise en contact avec l'agent, et (b) la comparaison du niveau déterminé à l'étape a) au niveau d'expression de HIF1a dans des fibroblastes dans un échantillon provenant de la peau d'un sujet exposée aux UVA en l'absence de l'agent.
19. 19. Méthode de détermination de l'impact d'une exposition solaire sur la peau d'un sujet comprenant : (a) la détermination du niveau d'expression du facteur de transcription HIF1a dans des fibroblastes dans un échantillon provenant de la peau du sujet ayant été exposée, et (b) la comparaison du niveau déterminé à l'étape a) au niveau d'expression de HIF1a dans des fibroblastes dermiques n'ayant pas subi d'exposition solaire.