BR112019018596A2 - medicamento para cicatrização de feridas - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a um açúcar d-desoxirribose para uso na promoção de cicatrização de feridas em que o açúcar é fornecido em um carreador e em que o carreador é um material de matriz biocompatível ou um hidrogel.

Description

“MEDICAMENTO PARA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS”

CAMPO DA TÉCNICA [001]Esta invenção refere-se geralmente ao campo da restauração da pele e do cabelo. Mais particularmente, a presente invenção refere-se à aplicação de uma composição química que promove a cicatrização de feridas, angiogênese, vascularização e recrescimento capilar.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002]Existem muitos estudos sobre como promover a angiogênese nos leitos das feridas. De todos os fatores angiogênicos, o mais potente comumente usado no desenvolvimento de biomateriais é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Zhang e outros, Biomateriais. 2015; Miyagi e outros, Biomateriais. 2011; Khojasteh e outros, Materials Science and Engineering: C. 2016; Johnson e outros, Advances in Wound Care. 2014). Esse fator de crescimento pode ser produzido por tecnologia recombinante e foi examinado criticamente em muitos estudos (Neufeld e outros, The FASEB journal. 1999; Long e outros, Journal of theory biology. 2013; Xin e outros, Cell. 2016) No entanto, os resultados têm sido geralmente decepcionantes quando adicionados isoladamente, pois são rapidamente decompostos ou diluídos e lavados. Estratégias mais recentes têm sido fornecer VEGF vinculado a biomateriais. Os biomateriais podem assumir várias formas, incluindo hidrogéis, arcabouços ou partículas (Chiu e outros, Biomateriais. 2010; akak-Õzkan e outros, Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 2017; Zhang e outros, ACS Biomateriais Science & Engineering. 2016; Zhao e outros, Advanced healthcare materials. 2016).

[003]Vários grupos, incluindo o grupo de MacNeil, procuraram entregar ο VEGF a partir da heparina ligada aos materiais, porque a heparina é um glicosaminoglicano natural presente no corpo em altas concentrações nas feridas, onde atua para ligar o VEGF e outros fatores pró-angiogênicos (Wu e outros, Biomacromolecules. 2016; Gigliobianco e outros, Journal of biomateriais applications.

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2015). Assim, o grupo de MacNeil desenvolveu materiais onde procurava imobilizar a heparina em uma base eletrostática para hidrogéis (Gilmore e outros, Biotechnology and bioengineering. 2013) ou em um revestimento camada por camada de arcabouços eletrofiados (Gigliobianco e outros, Journal of biomaterials applications. 2015; Easton e outros, Journal of Materials Chemistry B. 2014). A heparina in vivo liga e libera VEGF e outros mitógenos pró-angiogênicos (Ferrara N e outros, Nature medicine. 2003). O VEGF ativa a proliferação e a migração de células endoteliais no tecido normal e tumoral e resulta na geração rápida de novos vasos sanguíneos (Harmey JH. Springer Science & Business Media; 2004; Hicklin e outros, Journal of Clinical Oncology. 2005). Consequentemente, o potencial do VEGF tem sido explorado na preparação de materiais onde a angiogênese é necessária, por exemplo, na preparação de derme sintética para o tratamento de lesões por queimaduras de espessura total (Tan e outros, Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2014; Xie e outros, Acta biomaterialia. 2013; Guo R e outros, Biomaterials. 2011) e para estimular a cicatrização de feridas em feridas crônicas não cicatrizantes, tal como úlceras diabéticas, onde a microvasculatura está comprometida.

[004]Embora o VEGF estimule a angiogênese, ele é muito dispendioso (930 $ por 50 pg a partir de Sigma-Aldrich) e é instável (Simón-Yarza e outros, Theranostics. 2012; Thompson e outros, Oxford Textbook of Vascular Surgery: Oxford University Press; 2016). Outros fatores de crescimento pró-angiogênicos envolvidos na formação de novos vasos sanguíneos são conhecidos e há uma complexa cascata de fatores que são produzidos e liberados em resposta à hipóxia.

[005]A perda da função de barreira da pele pode ser fatal (Chua e outros, Burns & trauma. 2016; Blais e outros, Stem cells translational medicine. 2013). Ο tratamento de primeira linha é geralmente o uso de enxertos autólogos de pele parcial, mas em pacientes extensivamente queimados, existem enxertos insuficientes disponíveis para alcançar uma restauração rápida da camada de barreira (Yi e outros,

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Plastic and reconstructive surgery. 2015). Apesar de 30 anos de pesquisa nessa área, permanece a necessidade de um substituto dérmico permanente funcional e econômico para auxiliar os cirurgiões no tratamento de pacientes com lesões de mais de 30% de espessura total (Chua e outros, Burns & trauma. 2016).

[006]Quando as queimaduras se estendem a mais de 30 ou 40% da área total da superfície corporal, os cirurgiões procuram usar materiais naturais e sintéticos para fornecer cobertura imediata da ferida e ajudar na eventual substituição da derme e da epiderme (Sharma e outros, Burns. 2014). Ainda é tecnicamente muito difícil produzir um material de engenharia de tecidos equivalente a um enxerto de pele de espessura parcial (contendo toda a epiderme e parte da derme) que seja “bem-sucedido” nesses leitos da ferida (Bõttcher-Haberzeth e outros, Burns, 2010). O grande desafio não está na produção dos materiais em laboratório (ver Boyce e outros), mas nos materiais de engenharia de tecidos que sobrevivem ao enxerto no leito da ferida, o que exige um rápido crescimento de novos vasos sanguíneos do leito da ferida subjacente (Boyce e outros, Annals of surgery. 2002; Supp e outros, Clinics in dermatology. 2005). Na prática, a sobrevivência do enxerto depende inteiramente do crescimento de novos vasos sanguíneos do leito da ferida subjacente para esses materiais de engenharia de tecidos que não têm vasculatura intrínseca (Laschke e outros, Tissue engineering. 2006; Hacker e outros, Scientific reports. 2016).

[007]Na prática, as queimaduras de espessura total são geralmente tratadas em dois estágios (onde o autoenxerto insuficiente está disponível). Os materiais são usados para fornecer um substituto dérmico vascularizado e, quando essa derme é bem vascularizada, um enxerto de espessura parcial fina é colocado em cima da mesma (geralmente retirando enxertos de pele dos sítios iniciais do doador depois de curados) ou colocando células cultivadas sobre a derme vascularizada. Os dois materiais mais comumente usados para fornecer uma derme vascularizada são um biomaterial, Integra, que foi desenvolvido para essa finalidade e a pele cadavérica do

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4/73 doador (Nguyen e outros, Burns. 2010; Weigert e outros, Journal of Hand Surgery (European Volume) 2011; Cleland e outros, Burns. 2014). Integra é composto de urn substrato de colágeno bovino com sulfato de condroitina de tubarão ao qual uma membrana de silício foi ligada (Chua e outros, Burns & trauma. 2016). O tecido queimado é excisado clinicamente, Integra é colocado no lugar e depois deixado no local até se tornar vascularizado, o que geralmente leva três semanas ou mais. Nesse momento, os cirurgiões podem remover a membrana de barreira de silício e colocar sobre ela um enxerto de pele de espessura parcial fina. O material alternativo que é usado é pele cadavérica. Isso pode ser usado para fornecer cobertura imediata da ferida (uma vez que o tecido queimado é excisado) e restaurar a função de barreira. Ela torna-se então vascularizada no espaço de algumas semanas e a epiderme do doador pode ser suavemente removida deixando a derme vascularizada do doador no lugar e a barreira epidérmica é substituída por um enxerto de pele de espessura parcial do paciente ou por células epidérmicas cultivadas do paciente (como discutido por MacNeil, Nature. 2007). No entanto, esses materiais nem sempre estão disponíveis para os cirurgiões de queimaduras em todo o mundo devido à falta de bancos de pele bem gerenciados (para a pele de doadores) ou porque a aquisição de Integra é vista como muito dispendiosa.

[008]A perda de cabelo é uma condição comum em humanos e é caracterizada pela perda ou redução na quantidade de cabelo da cabeça ou do corpo. Um número de condições diferentes pode envolver a perda de cabelo. Embora existam causas conhecidas de alguns tipos de perda de cabelo, incluindo infecção, drogas, trauma e gravidez, a causa de outros tipos de perda de cabelo permanece desconhecida. As terapias convencionais para perda de cabelo podem incluir terapia com fármacos, por exemplo, com medicações tal como minoxidil ou finasterida. Outra terapia usada é a cirurgia de transplante de cabelo, que envolve a colheita de folículos capilares com fibras capilares de uma parte do corpo com cabelos e a recolocação

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5/73 dos folículos capilares em uma parte do corpo desprovida de cabelos.

[009]Continua a haver necessidade de novos biomateriais eficazes e acessíveis para fornecer um substrato dérmico bem vascularizado no tratamento de queimaduras graves. A questão principal é que nenhum dos materiais atuais contém vasculatura intrínseca, portanto, o crescimento dos vasos depende inteiramente dos vasos sanguíneos no leito da ferida subjacente (Supp e outros, Clinics in dermatology. 2005; Sahota e outros, Wound repair and regeneration, 2003). Permanece a necessidade de um substrato dérmico que permita uma vascularização melhorada, levando a uma melhor sobrevivência pós-implantação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [010]Em um aspecto, a invenção fornece um açúcar D-desoxirribose para uso na promoção da cicatrização de feridas em que o açúcar é fornecido em um carreador e em que o carreador é um material de matriz biocompatível ou um hidrogel. De preferência, a D-desoxirribose é 2-desoxirribose.

[011]Em uma modalidade, o carreador é um carreador biodegradável.

[012]Em uma modalidade, o material da matriz é um arcabouço eletrofiado. Preferencialmente, o arcabouço eletrofiado compreende ao menos um de ácido polilático (PLA), poliglicolídeo (PGA), ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA) ou poli(3hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV).

[013]Em uma modalidade, o hidrogel é um hidrogel reticulado. De preferência, o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o hidrogel compreende quitosana e colágeno. Além disso, o hidrogel pode compreender polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.

[014]Em uma modalidade, o carreador compreende ainda um agente antimicrobiano.

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6/73 [015]Em uma modalidade, a ferida é uma ferida crônica.

[016]Em uma modalidade, a ferida é uma ferida de espessura total.

[017]Em uma modalidade, a ferida é uma lesão por queimadura.

[018]Em um aspecto, a invenção fornece um material de matriz biocompatível compreendendo um açúcar D-desoxirribose.

[019]Em uma modalidade, o material da matriz é um arcabouço eletrofiado. Preferencialmente, o arcabouço eletrofiado compreende ao menos um de ácido polilático (PLA), poliglicolídeo (PGA), ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA) ou poli(3hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV).

[020]Em um aspecto, a invenção fornece um hidrogel compreendendo um açúcar D-desoxirribose.

[021 ]Em uma modalidade, o hidrogel é um hidrogel reticulado. De preferência, o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o hidrogel compreende quitosana e colágeno. Além disso, o hidrogel pode compreender polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.

[022]Em um aspecto, a invenção fornece o material biocompatível de qualquer um dos aspectos ou modalidades mencionadas acima para uso na promoção de cicatrização de feridas ou para uso no tratamento de alopecia.

[023]Em um aspecto, a invenção fornece o hidrogel de qualquer um dos aspectos ou modalidades mencionadas acima para uso na promoção de cicatrização de feridas ou para uso no tratamento da alopecia.

[024]Em um aspecto, a invenção fornece o material biocompatível de qualquer um dos aspectos ou modalidades mencionadas acima para uso em um método para aumentar ou induzir a vascularização em um leito de ferida.

[025]Em um aspecto, a invenção fornece o hidrogel de qualquer um dos

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7/73 aspectos ou modalidades mencionadas acima para uso em um método para aumentar ou induzir a angiogênese em um leito de ferida.

[026]Em um aspecto, a invenção fornece um açúcar D-desoxirribose para uso no tratamento de alopecia, em que o açúcar é fornecido em um carreador e em que o carreador é um material de matriz biocompatível ou um hidrogel. De preferência, a Ddesoxirribose é 2-desoxirribose.

[027]Em uma modalidade, o carreador é um carreador biodegradável.

[028]Em uma modalidade, o material da matriz é um arcabouço eletrofiado. Preferencialmente, o arcabouço eletrofiado compreende ao menos um de ácido polilático (PLA), poliglicolídeo (PGA), ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA) ou poli(3hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV).

[029]Em uma modalidade, o hidrogel é um hidrogel reticulado. De preferência, o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o hidrogel compreende quitosana e colágeno. Além disso, o hidrogel pode compreender polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.

[030]Em uma modalidade, o carreador compreende ainda um agente antimicrobiano.

[031 ]Em um aspecto, a invenção fornece um método não terapêutico para promover o crescimento do cabelo, o dito método compreende administrar um açúcar D-desoxirribose, em que o açúcar é fornecido em um carreador e em que o carreador é um material de matriz biocompatível ou um hidrogel. De preferência, a Ddesoxirribose é 2-desoxirribose.

[032]Em uma modalidade, o carreador é um carreador biodegradável.

[033]Em uma modalidade, o material da matriz é um arcabouço eletrofiado. Preferencialmente, o arcabouço eletrofiado compreende ao menos um de ácido

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8/73 polilático (PLA), poliglicolídeo (PGA), ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA) ou poli (3hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV).

[034]Em uma modalidade, o hidrogel é um hidrogel reticulado. De preferência, o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o hidrogel compreende quitosana e colágeno. Além disso, o hidrogel pode compreender polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.

[035]Em uma modalidade, o carreador compreende ainda um agente antimicrobiano.

[036]Em um aspecto, a invenção fornece um curativo para feridas compreendendo o material de matriz biocompatível de acordo com qualquer um dos aspectos ou modalidades mencionadas acima.

[037]Em um aspecto, a invenção fornece um curativo para feridas compreendendo o hidrogel de acordo com qualquer um dos aspectos ou modalidades mencionadas acima.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [038]As modalidades da invenção são ainda descritas a seguir com referência aos desenhos em anexo, nos quais:

[039]A Figura 1 mostra imagens ópticas e de microscópio eletrônico de varredura (SEM) de fibras de PCL eletrofiadas. Imagens ópticas de folhas fibrosas (a) sem D-desoxirribose e (b) com D-desoxirribose. Micrografias SEM de fibras sem Ddesoxirribose (c) e com (d) D-desoxirribose com ampliação de 10000X.

[040]A Figura 2 mostra a aparência física dos hidrogéis (esquerda) e suas micrografias SEM (direita), (a) hidrogéis liofilizados sem TEOF; (b) hidrogéis liofilizados com 16% de TEOF; (c) carga física de açúcar em hidrogel sem TEOF (d) carga física de açúcar em hidrogel com 16% de TEOF; (a1) Micrografia SEM de

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9/73 hidrogéis sem TEOF, ampliação de 500X (b1) Micrografia SEM de hidrogéis com 16% de TEOF, ampliação de 500X (d) Micrografia SEM de hidrogel carregado de açúcar sem TEOF, ampliação de 500X (d1) Micrografia SEM de hidrogel carregado de açúcar com 16% de TEOF, ampliação de 500X.

[041 ]A Figura 3 mostra fotografias de hidrogéis de quitosana / colágeno para mostrar sua resistência, forma, flexibilidade e capacidade de serem dobrados.

[042]A Figura 4 mostra micrografias de microscopia eletrônica de varredura (SEM) do arcabouço de CS / colágeno reticulado mostrando a vista transversal dos hidrogéis. Micrografias revelando a estrutura porosa dos hidrogéis, Aumento de 200X; (a) controle (sem açúcares), (b) hidrogel carregado com D-desoxirribose, (c) hidrogel carregado com L-desoxirribose, (d) hidrogel carregado com D-desoxiramnose, (e) hidrogel carregado com L-desoxirribose, (f) hidrogel carregado com D-desoxifucose, (g) hidrogel carregado com D-desoxifucose.

[043]A Figura 5 mostra os espectros de FTIR de diferentes materiais sintetizados [A] Fibras eletrofiadas (a) fibras PCL (b) fibras PCL eletrofiadas carregadas com D-ribose (c) D-desoxirribose; [B] espectros de FTIR de hidrogéis de CS / PVA (d) controle sem TEOF (e) hidrogel carregado com D-desoxirribose com 16% de TEOF; [C] FTIR de hidrogéis de CS / colágeno / TEOF (f) hidrogel carregado com D-desoxifucose, (g) hidrogel carregado com L-desoxiramnose, (h) hidrogel carregado com D-desoxiramnose, (i) hidrogel carregado com L-desoxirribose, (j) hidrogel carregado com D-desoxirribose, (k) controle (sem açúcares).

[044]A Figura 6 mostra [A] Avaliação do potencial angiogênico de fibras eletrofiadas carregadas com D-ribose e hidrogéis (a) fibras eletrofiadas de PCL sem D-desoxirribose (b) fibras eletrofiadas de PCL com D-desoxirribose (c) hidrogel de CS / PVA carregado com D-desoxirribose com 16% de TEOF; [B] Histograma estatístico mostrando o número de vasos sanguíneos que penetram nos arcabouços. Um círculo foi desenhado a 1 mm do arcabouço e o número de vasos sanguíneos foi contado

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10/73 dentro do círculo. Para cada estudo, 8 ovos foram implantados com arcabouços e, em média, 5 filhotes sobreviveram. Os resultados são média ± S.D de 5 ovos separados.

[045]A Figura 7 mostra o potencial pró-angiogênico dos hidrogéis de CS / colágeno / TEOF usando o ensaio CAM. [A] Os arcabouços foram colocados no CAM no dia 8 da fertilização. A figura mostra imagens de microscópio de luz de arcabouços no CAM no dia 14 da fertilização (a) controle (sem açúcares), (b) hidrogel carregado com D-desoxirribose, (c) hidrogel carregado com L-desoxirribose, (d) hidrogel carregado com D-desoxirribose, (d) hidrogel carregado com D-desoxirribose, (e) hidrogel carregado com L-desoxiramnose, (f) hidrogel carregado com D-desoxifucose, (g) hidrogel carregado com L-desoxifucose. A figura também mostra os respectivos hidrogéis explantados no canto inferior esquerdo de cada figura. Para cada experimento, foram implantados 10 ovos com os respectivos arcabouços, dos quais 7 filhotes sobreviveram. [B] A parte inferior da imagem mostra a análise estatística do número de vasos sanguíneos para cada hidrogel. (a) controle (sem açúcares), (b) hidrogel carregado com D-desoxirribose, (c) hidrogel carregado com L-desoxirribose, (d) hidrogel carregado com D-desoxiramnose, (e) hidrogel carregado com Ldesoxirribose, (f) hidrogel carregado com D-desoxifucose, (g) hidrogel carregado com D-desoxifucose. Os valores estatísticos de p são dados acima das barras dos gráficos. Os valores mostrados são médias ± S.D. de sete filhotes para cada arcabouço.

[046]A Figura 8 mostra que a cicatrização da ferida foi acelerada por arcabouços carregados com D-desoxirribose. As feridas de espessura total foram criadas marcando uma área de 20 mm e, em seguida, as excisões foram realizadas sob anestesia com tesoura cirúrgica. Os respectivos materiais foram aplicados às feridas, suturados no local e inicialmente cobertos com bandagens adesivas de Mepore (Suécia) e, finalmente, com bandagens de algodão. Todos os ratos receberam os mesmos curativos que foram removidos 3 dias após o ferimento. Cada ferida foi fotografada digitalmente em momentos específicos e posteriormente quantificada

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11/73 usando o software Image J. Imagens macroscópicas representativas de feridas, hidrogéis de controle (estrutura reticulada de CS / colágeno) e hidrogéis carregados com D-ribose são mostrados nos dias 3, 9, 11, 14 e 17 pós-ferimento.

[047]A Figura 9 mostra as áreas de ferida ao longo de 17 dias nos histogramas. As feridas de espessura total foram criadas através da marcação de áreas circulares de 20 mm e excisadas com tesoura cirúrgica. Foi utilizado controle negativo, que na verdade era uma ferida aberta e foi deixado cicatrizar naturalmente. O controle continha um arcabouço de CS / colágeno sem carga de açúcar e D-R era um arcabouço de CS / colágeno carregado com D-desoxirribose. Para cada tipo de experimento, foram utilizados três ratos e a cicatrização da ferida foi observada até o fechamento completo da ferida. O diâmetro médio da ferida foi determinado usando Imagem J e cada coluna representa a média ± S.D de cálculos independentes registrados a partir de quatro feridas para cada amostra. A análise estatística mostrou que os hidrogéis não carregados aceleraram significativamente a cicatrização de feridas e a adição de D-desoxirribose acelerou bastante a cicatrização de feridas, como pode ser observado nos dias 9, 11, 14 e 17. p < 0,0001.

[048]A Figura 10 mostra imagens de H&E e tricromo de Goldner no dia 17. Barras de escala de 0,2 mm.

[049]A Figura 11 mostra imagens de imunocoloração no dia 17. Barras de escala de 0,2 mm.

[050]A Figura 12 mostra uma avaliação dos dados de imunocoloração usando um sistema de escore cego. 0 = ausência; 1 = presença leve; 2 = grande presença; 3 = abundância; 4 = grande abundância. Os resultados mostrados são médias ± S.D, n = 10. As estatísticas para múltiplas comparações e a relação M2 / M1 também são mostradas.

[051 ]A Figura 13 mostra uma ilustração esquemática das etapas da aplicação direta das substâncias e implantação dos arcabouços liberadores de substância no

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CAM. A figura mostra a metodologia básica do ensaio CAM ex-ovo a partir de EDDO.

[052]A Figura 14 mostra as etapas que demonstram o método de quantificação da macrovasculatura (A) e microvasculatura (B) de CAM.

[053]A Figura 15 mostra uma comparação da resposta angiogênica a E2 e 2dDR avaliada usando o ensaio CAM. (A) número de pontos de ramificação, (B) comprimento médio do vaso. **** P < 0,0001, *** P < 0,001, “ P < 0,01, * P < 0,05,^ns P > 0,05, n = 9 ± S.D. O número de pontos de ramificação e os comprimentos médios de macrovasos observados em resposta a diferentes concentrações de E2 e 2dDR foram calculados e comparados aos controles de PBS durante 4 dias (C). Os valores representam média ± S.D.

[054]A Figura 16 mostra uma demonstração do efeito de E2 (200 ng / dia) e 2dDR (200 pg / dia) na macrovasculatura e microvasculatura em comparação com a aplicação de PBS (Controle). O VEGF foi incluído como um controle positivo e o Sunitinibe como um controle negativo. 2dDR foi aplicado como 200 pg / dia e E2 como 200 ng / dia. Todas as comparações estatísticas são feitas com PBS. **** P < 0,0001, *** P < 0,001. As barras de escala representam 1 mm e 50 pm, respectivamente, para imagens de macrovasos (na parte superior) e microvasos (no meio), n = 9 ± S.D.

[055]A Figura 17 mostra imagens SEM dos arcabouços. (A) PHBV simples, (B) PHBV + 25 mg de E2, (C) PHBV + 50 mg de E2, (D) PHBV + 250 mg de 2dDR, (E) PHBV + 500 mg de 2dDR. O gráfico no canto inferior esquerdo mostra a distribuição dos diâmetros de fibra para cada arcabouço, **** P < 0,0001,*** P< 0,001. As barras de escala representam 100 pm.

[056]A Figura 18 mostra a liberação de (A) 2dDR e (B) E2 a partir de arcabouços de PHBV ao longo de 30 dias, n = 6 ± S.D.

[057]A Figura 19 mostra a comparação de (A) UTS, (B) rigidez e (C) tempo de retenção de gotículas nos arcabouços, **** P < 0,0001, *** P < 0,001, ** P < 0,01, * P < 0,05, n = 6 ± S.D.

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13/73 [058]A Figura 20 mostra imagens representativas que demonstram o potencial angiogênico de arcabouços liberadores de 2dDR (250 mg e 500 mg) e E2 (25 mg e 50 mg) em comparação com arcabouços de PHBV. O gráfico no canto inferior esquerdo mostra os dados quantitativos desses experimentos - contagem média de vasos, **** P < 0,0001. As barras de escala representam 3 mm, n = 6 ± S.D.

[059]A Figura 21 mostra a análise histológica de CAMs após 7 dias de incubação com ou sem arcabouços em diferentes ampliações. A orientação das camadas de arcabouço, CAM Ectoderma (*), mesoderma (**) e endoderma (***) foi indicada nas imagens. As setas mostram os vasos sanguíneos. Barras de escala = 0,2 mm (10 x), 0,1 mm (20 x), 0,05 mm (40 x).

[060]A Figura 22 mostra a quantificação dos vasos sanguíneos discerníveis adjacentes aos arcabouços com uma ampliação de 10 χ do total de seis lâminas diferentes para cada grupo e seis áreas de interesse diferentes de cada lâmina.

DESCRIÇÃO DETALHADA [061 ]Os inventores descobriram surpreendentemente que os biomateriais carregados com açúcares d-desoxirribose ou L-desoxi suportaram a rápida formação de novos vasos sanguíneos e ajudaram na cicatrização de feridas. Um hidrogel carregado com desoxirribose também estimulou a cicatrização em um modelo de ferida in vivo. A cicatrização de feridas foi associada à formação de novos vasos sanguíneos. A capacidade da d-desoxirribose de promover a cicatrização de feridas é particularmente surpreendente, uma vez que outros açúcares D-desoxi, tal como 2desoxi-D-glicose, inibem a angiogênese (Merchan J. e outros, PLoS ONE 5 (10): e13699).

[062]Cs dados apresentados mostram que os biomateriais carregados com 2desoxi-D-ribose apoiaram a formação de novos vasos sanguíneos em 7 dias. Essa propriedade angiogênica da desoxirribose não foi compartilhada em nenhum grau útil por outros dois açúcares desoxi investigados, ou seja: desoxifucose e desoxiramnose,

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14/73 mas enquanto os isômeros L dos três açúcares eram fortemente angiogênicos, apenas o isômero D da desoxirribose era fortemente angiogênico. Existem várias vantagens em usar 2-desoxi-D-ribose ou um açúcar L-desoxi para estimular a produção de VEGF. Por exemplo, eles são estáveis e baratos e podem ser introduzidos em biomateriais para fornecer liberação sustentada por vários dias para estimular o crescimento de novos vasos sanguíneos. Além disso, a maioria das bactérias pode achar difícil metabolizar a desoxirribose (Christensen e outros, Journal of bacteriology. 2003).

[063]Os inventores também descobriram que patógenos Gram-positivos comuns não foram capazes de metabolizar nenhum dos isômeros D ou L dos três açúcares desoxi testados (desoxirribose, desoxifucose e desoxiramnose), mas alguns desses açúcares podem ser metabolizados por uma espécie patogênica Gramnegativa.

[064]Os inventores demonstraram que um hidrogel de quitosana / colágeno carregado com 2-desoxi-D-ribose estimulou a cicatrização em um modelo de ferida cutânea de rato in vivo. A cicatrização de feridas foi associada à formação de novos vasos sanguíneos.

[065]Os inventores demonstraram que a liberação gradual de 2-desoxi-Dribose a partir de biomateriais promoverá a produção de novos vasos sanguíneos e, portanto, será de valor na cicatrização de feridas. Os inventores introduziram um açúcar D, 2-desoxi-D-ribose, para verificar se ele podería ser pró-angiogênico e para avaliar se isso podería ser feito usando uma variedade de biomateriais de relevância clínica. Consequentemente, este açúcar D-desoxi foi carregado em três biomateriais biodegradáveis, nanofibras de PCL eletrofiadas, hidrogéis de quitosana / PVA e hidrogéis de quitosana / colágeno.

[066]Os dados mostram que este açúcar D, 2-desoxi-D-ribose, pode ser facilmente incorporado em três biomateriais diferentes e os inventores confirmaram

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15/73 que ele era realmente pró-angiogênico usando o ensaio CAM. Também usando este ensaio, os inventores exploraram até que ponto as propriedades angiogênicas do isômero D da desoxirribose foram compartilhadas com outros açúcares desoxi. Aqui, os inventores descobriram que todos os três isômeros L de açúcares desoxi (ribose, fucose e ramnose) eram pró-angiogênicos, mas apenas o isômero D da desoxirribose era significativamente angiogênico.

[067]Analisando a capacidade desses açúcares, de atuar como substratos metabólicos para bactérias, os inventores analisaram três cepas de Staphlococcus aureus, mas nenhuma delas foi capaz de metabolizar esses açúcares. Isso é uma notícia encorajadora na tentativa de desenvolver biomateriais contendo esses açúcares, pois eles não são uma fonte de nutrientes para as bactérias.

[068]A contribuição do isômero D da desoxirribose para a cicatrização de feridas foi avaliada In vivo, usando um hidrogel de quitosana / colágeno. Para isso, os inventores usaram um modelo de ferida cutânea em rato. Os inventores descobriram surpreendentemente que a adição de D-desoxirribose a um hidrogel de quitosana / colágeno acelerou muito a cicatrização de feridas cutâneas associada a um aumento na vascularização, conforme detectado pela coloração de células CD34 positivas. Ficou claro a partir deste modelo que o próprio gel de quitosana / colágeno estimulava a cicatrização de feridas, mas isso foi bastante aumentado pela adição de açúcar D. No dia 17, as feridas tratadas com açúcar D estavam completamente fechadas e a histologia mostrou a presença de folículos capilares muito maduros. Com base nesta evidência, os inventores concluem que a liberação de açúcar D a partir de um gel de quitosana / colágeno estimula a angiogênese e propõe-se que o aumento da cicatrização de feridas seja uma consequência natural disso.

[069]O exame da resposta dos macrófagos ao açúcar desoxi mostrou uma ligeira preponderância dos macrófagos M2 sobre os macrófagos M1 no dia 17, indicativo de remodelação construtiva. Ao conduzir os experimentos com animais, o

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16/73 hidrogel inicial era bastante robusto de manusear e, de fato, podia ser suturado no local. As observações em ensaios com animais no dia 3 revelaram que os hidrogéis estavam muito bem ligados e o crescimento das células também era evidente (Figura 8). A ligação dos hidrogéis ao tecido circundante foi melhor no caso do hidrogel carregado com açúcar. No dia 9, os hidrogéis de controle e carregados com Ddesoxirribose ainda estavam intactos. Os hidrogéis foram absorvidos gradualmente e, no dia 11, mais de 50% da área da ferida foi curada com o hidrogel de D-desoxirribose (ver Figura 9), mas o hidrogel restante ainda estava presente na ferida (Figura 8). No dia 14, não havia sinal de hidrogel de açúcar D-desoxi restante na ferida. No dia 17, a ferida enxertada com D-desoxirribose havia cicatrizado completamente. Este hidrogel parecia ser totalmente absorvido pelo animal e não podia ser sentido dentro da pele curada ao apalpar. O hidrogel de controle manteve sua integridade até o final do estudo em animais.

[070]Esses hidrogéis liberadores de açúcar desoxi são uma abordagem promissora para estimular a angiogênese em feridas crônicas não cicatrizantes e também para atuar como material de substituição dérmica no tratamento de queimaduras extensas de espessura total.

[071]Existem várias vantagens em usar esse açúcar D para estimular a produção de VEGF; ele é estável e barato e pode ser introduzido em biomateriais para fornecer liberação sustentada por vários dias para estimular o crescimento de novos vasos sanguíneos.

[072]Os inventores descobriram que um hidrogel à base de quitosana que libera D-desoxirribose podería atuar como um substituto para uma derme, à medida que estimularia o crescimento de novos vasos sanguíneos e fornecería um leito de ferida vascularizada para enxerto subsequente com enxerto de pele fina ou queratinócitos autólogos em cultura para fornecer uma camada permanente de barreira da pele.

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17/73 [073]O efeito positivo da D-desoxirribose é surpreendente, como em 2010, Merchan e outros relataram a atividade antiangiogênica da 2-desoxi-D-glicose (2-DG). Eles relataram que o 2-DG inibiu a formação de capilares endoteliais e a migração celular endotelial in vitro [.R. Merchan, K. Kovács, J.W. Railsback, M. Kurtoglu, Y. Jing, Y. Pina, N. Gao, T.G. Murray, M.A. Lehrman, T.J. Lampidis, Antiangiogenic activity of 2-deoxy-D-glucose, PLoS One. 5 (2010). doi: 10.1371/journal.pone.0013699].

[074]Os dados apresentados demonstram que, para um produto clinicamente útil, a neovascularização rápida (dentro de 5 dias) após o implante é crítica. O rápido crescimento e infiltração de vasos sanguíneos é crucial para que todos os construtos de TE com mais de 200 pm possam sobreviver in vivo [C.K. Griffith, C. Miller, R.C.A. Sainson, J.W. Calvert, N.L. Jeon, C.C.W. Hughes, S.C. George, Diffusion Limits of na in Vitro Thick Prevascularized Tissue, Tissue Eng. 11 (2005) 257 a 266. doi: 10.1089/tem.2005.11.257], Os inventores superaram essa barreira funcionalizando um carreador de engenharia de tecidos com substâncias pró-angiogênicas.

[075]Os inventores produziram carreadores de engenharia de tecidos que superam a neovascularização retardada comumente vista após o transplante de construtos de engenharia de tecidos.

[076]Os inventores demonstraram que os hidrogéis de CS / colágeno carregados com 2dDR estavam firmemente ligados ao leito da ferida de feridas excisionais de espessura total (20 mm) em ratos no dia 3 e as feridas tratadas com 2dDR, foram completamente fechadas no dia 17 com crescimento claro de cabelos enquanto as feridas de controle permaneceram abertas, sem evidência de tecido epitelial ou crescimento capilar. A histologia do leito da ferida de todos os animais sacrificados no dia 17 mostrou cicatrização completa no caso de feridas tratadas com 2dDR com folículos capilares bem desenvolvidos e a presença de novos vasos sanguíneos nas feridas cicatrizadas foi confirmada com coloração de CD34 [M. Yar, L. Shahzadi, M. Azra, M.l. Raheem, S. Roman, A.A. Chaudhry, I. ur Rehman, C.W.I.

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Douglas, S. MacNeil, Deoxy-sugar releasing biodegradable membranes and hydrogels promote angiogenesis and stimulate wound healing, Mater Today Commun. 13 (2017) 295 a 305. doi: 10.1016 / j.mtcomm.2017.10.015], [077]Os carboidratos podem ter configurações enantioméricas D e L, que são determinadas pela configuração do carbono quiral que está mais distante do carbono anomérico. Quando a forma linearizada de um carboidrato é desenhada como uma projeção de Fischer, o grupo hidroxila ligado ao carbono quiral pode ser posicionado à esquerda ou à direita do carbono. Se a hidroxila estiver à direita do carbono quiral, o carboidrato será anotado como um carboidrato D, enquanto quando o grupo hidroxila estiver à esquerda do carbono quiral, o carboidrato será anotado como um carboidrato L. O exemplo a seguir ilustra as configurações das formas enantioméricas

D e L- de glicose:

oh

H·

HO-~j—H

HH•H

--OH

-—OH

CH₂OH

HO

H--OH

HO—j—H

HO —~H

CH₂OH

D-glicose

L-glicose [078]Os enantiômeros D de carboidratos são a forma mais prevalente encontrada na natureza e muitos podem ser isolados de fontes naturais. Em contraste, os enantiômeros L de ocorrência não natural de carboidratos podem ser dispendiosos de fabricar por síntese química ou enzimática. No entanto, também é conhecido que os enantiômeros L de alguns carboidratos ocorrem na natureza.

[079]Um exemplo particular de um açúcar D natural é a D-ribose (fórmula química C5H10O5):

HO HO

OH

HO forma linearizada de D-ribose

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19/73 [080]As formas fosforiladas da D-ribose estão envolvidas na síntese de aminoácidos, usadas na via da pentose fosfato e são constituintes do ácido ribonucleico (RNA).

[081]Adequadamente, a D-ribose também pode ser desidroxilada, por exemplo, na posição 2’, 3’, 4’ ou 5’. Um exemplo notável de uma ribose desidroxilada é a 2-D-desoxirribose, em que o grupo hidroxila na posição 2’ é substituído por um átomo de hidrogênio. Este açúcar é um constituinte do ácido desoxirribonucleico (DNA). A desoxi-D-ribose existe predominantemente como uma forma cíclica em solução ao invés de uma forma linearizada:

Forma linearizada de 2-D-desoxirribose

Formas cíclicas de 2-D-desoxirribose [082]Os enantiômeros D da desoxirribose encontram uso particular na invenção.

[083]Os açúcares desoxi são açúcares que têm um grupo hidroxila substituído por um átomo de hidrogênio. Exemplos de açúcares desoxi incluem L-2 desoxirribose, L-fucose (equivalente a 6-desoxi-L-galactose) e L-ramnose (equivalente a 6-desoxi-Lmanose).

[084]Os enantiômeros L dos açúcares desoxi encontram uso particular na invenção.

[085]Os inventores também descobriram surpreendentemente que os

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20/73 biomateriais carregados com estradiol (E2) suportaram a rápida formação de novos vasos sanguíneos e auxiliavam na cicatrização de feridas. O estradiol (E2) tem um papel importante na neovascularização durante o ciclo menstrual [D.W. Losordo, J. M. Isner, Estrogen e Angiogênese: A Review, Arterioscler 30 Thromb Vase Biol. 21 (2001) 6 a 12. doi: 10.1161 / 01 .ATV.21.1.6, Y. Matsubara, K. Matsubara, Estrogen and progesterone play pivotal roles in endotelial progenitor cell proliferation, Reprod Biol Endocrinol. 10 (2012) 2. doi: 10.1186 / 1477-7827-10-2], Ele é utilizado clinicamente no tratamento da osteoporose e doenças cardíacas [M.L. Stefanick, Estrogens dn progestins: Baackground and history, trends in use, and guidelines and regimens approved bly the US Food and Drug Administration, in: Am J Med, 2005. doi: 10.1016 I j.amjmed.2005.09.059]. Além disso, o bloqueio do receptor E2 com adjuvantes, tal como o tamoxifeno, para tumores positivos para o receptor de estrogênio, 10 em que o alto teor de estrogênio ajuda as células cancerosas a crescer e se espalhar, é um método eficaz para reduzir a vasculatura do tumor usada nas clínicas por muitos anos, especialmente para o tratamento de câncer de mama [B. Fisher, J. Costantino, C. Redmond, R. Poisson, D. Bowman, J. Couture, N. V. Dimitrov, N. Wolmark, D.L. Wickerham, E.R. Fisher, A randomized clinical trial evaluating tamoxifen in the treatment of pacientes with node-negative breast cancer who have estrogen-receptorpositive tumors, N Engl J Med. 320 (1989) 479-84. doi:

10.1056/NEJM198902233200802, Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group, Tamoxifen for early breast cancer: an overview of the randomised trials, Lancet. 351 (1998) 1451 a 1467. doi: 10.1016/S0140-6736 (97) 11423-4], Foi demonstrado que ο E2 promove a migração e proliferação de células endoteliais in vitro [K. Nikhil, S. Sharan, R. Wishard, S.R. Palia, R. Krishna Peddinti, P. Roy, Pterostilbene carboxaldehyde thiosemicarbazone, a resveratrol derivative inhibits 15 173-Estradiol induced cell migration and proliferation in HUVECs, Steroids. 108 (2016) 17 a 30. doi: 10.1016/j.steroids.2016.01.020, G.M. Rubanyi, A. Johns, K. Kauser, Effect of estrogen

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21/73 on endotelial function and angiogenesis, Vascul Pharmacol. 38 (2002) 89 a 98. doi: 10.1016/S0306- 3623 (02) 00131-3] e estimular a formação de novos vasos sanguíneos in vitro e in vivo [D.E. Morales, K.A. McGowan, D.S. Grant, S. Maheshwari,

D. Bhartiya, M.C. Cid, H.K. Kleinman, H. William Schnaper, Estrogen Promotes Angiogenic Activity in Human Umbilical Vein Endothelial Cells In Vitro and in a Murine Model, Circulation. 91 (1995) 755-63]. Os inventores confirmaram que os arcabouços de ácido poli-L-lático (PLLA) carregados com E2 eram altamente 15 angiogênicos usando o ensaio CAM [N. Mangir, C.J. Hillary, C.R. Chapple, S. MacNeil, Oestradiolreleasing Biodegradable 25 Mesh Stimulates Collagen Production and Angiogenesis: An Approach to Improving Biomaterial Integration in Pelvic Floor Repair, Eur Urol Focus. (2017). doi:10.1016/j.euf.2O17.05.004], [086]O E2 foi anteriormente relatado como angiogênico in vitro e in vivo por muitos grupos, bem como 15 por este grupo de pesquisa. Albrecht e outros sugeriram que ο E2 promove a angiogênese através da indução de VEGF. Eles relataram aumento rápido da expressão de VEGF e permeabilidade celular por administração de E2 a babuínos ovariectomizados [E.D. Albrecht, J.S. Babischkin, Y. Lidor, L.D. Anderson, L.C. Udoff, G.J. Pepe, Effect 15 of estrogen on angiogenesis in co-cultures of human endometrial cells and microvascular endothelial cells., Hum Reprod. 18 (2003) 2039-2047. doi:10.1093/humrep/deg415]. Os níveis de expressão de mRNA de VEGF similarmente elevados foram observados em ratas ovariectomizadas após o tratamento com E2 por Hyder e outros [S.M. Hyder, G.M. Stancel, C. Chiappetta, L. Murthy, H. L. Boettger-Tong, S. Makela, Uterine expression of vascular endothelial growth factor is increased by estradiol and 20 tamoxifen, Cancer Res. 56 (1996) 3954 a 3960]. Da mesma forma, Morales e outros relataram que ο Ε2 promoveu a migração de HUVECs e 20 a formação de redes do tipo capilar em Matrigel [D.E. Morales, K.A. McGowan, D.S. Grant, S. Maheshwari, D. Bhartiya, M.C. Cid, H.K. Kleinman, H. William Schnaper, Estrogen Promotes Angiogenic Activity in Human Umbilical Vein

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Endothelial Cells In Vitro and in a Murine Model, Circulation. 91 (1995) 755-63]. Pence e outros indicaram que E2 exógeno promoveu a produção endógena de VEGF por células epiteliais endometriais [J.C. Pence, K.B.H. Clancy, B.A.C. Harley, The induction of pro-angiogenic processes within a collagen scaffold via exogenous estradiol and endometrial epithelial cells, Biotechnol Bioeng. 112 (2015) 2185-2194. doi:10.1002/bit.25622], Mais recentemente, este grupo demonstrou a liberação de E2 tanto a partir de fibras biodegradáveis (PLA [N. Mangir, CJ Hillary, CR Chapple, S. MacNeil, Oestradiol-releasing Biodegradable 25 Mesh Stimulates Collagen Production and Angiogenesis: An Approach to Improving Biomaterial Integration in Pelvic Floor Repair, Eur Urol Focus. (2017). doi:10.1016/j.euf.2017.05.004]) quanto de fibras não degradáveis (PU [S. Shafaat, N. Mangir, SR Regureos, CR Chapple, S. MacNeil, Demonstration of improved tissue integration and angiogenesis with an elastic, estradiol releasing polyurethane material designed for use in pelvic floor repair, Neurourol Urodyn. (n.d.) n/a-n/a. doi:10.1002/nau.23510]] com arcabouços eletrofiados mostrando boa atividade pró-angiogênica no ensaio CAM.

[087]Como aqui utilizado, o termo “promoção da cicatrização de feridas” deve ser entendido como restabelecimento de uma interrupção na continuidade do tecido da pele e inclui distúrbios caracterizados por qualquer doença, distúrbio, síndrome, anomalia, patologia ou condição anormal da pele (derme e epiderme) e/ou tecido conjuntivo subjacente. Por exemplo, as feridas podem compreender pequenos cortes ou abrasões; feridas de espessura parcial; feridas complicadas / de espessura total; feridas traumáticas tais como, por exemplo, abrasões, lacerações; feridas cirúrgicas; incisões pós-cirúrgicas; feridas crônicas / não cicatrizantes tal como úlceras por pressão ou feridas diabéticas não cicatrizantes nos pés; úlceras, em particular úlcera venosa, decúbito, úlcera cutânea derivada de infecção, úlcera por pressão ou úlcera diabética; lesões no tecido conjuntivo tal como osso ou cartilagem; lesões por queimaduras químicas ou térmicas, em particular uma queimadura de terceiro grau;

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23/73 uma ferida acidental; uma ferida necrótica tal como necrose isquêmica; uma ferida infectada; um sítio de doador de enxerto de pele de espessura total e espessura parcial; uma escara; dificuldade induzida por diabetes e induzida pela idade de cicatrização de feridas na superfície da pele e cicatrizes, tal como, por exemplo, cicatrizes queloides, cicatrizes de contratura, cicatrizes hipertróficas e cicatrizes de acne. A ferida pode ser uma ferida aberta ou fechada. Uma ferida ‘fechada’, como aqui utilizada, significa uma ferida que foi aberta em um ponto (por exemplo, uma incisão cirúrgica ou um corte acidental) e que foi propositalmente fechada por meio de uma sutura, grampo, adesivo cirúrgico e similares.

[088]Como aqui utilizado, o termo “ferida de espessura total” refere-se à ruptura da derme, tecido e rompimento dos vasos sanguíneos dérmicos. Em contraste, “ferida de espessura parcial” refere-se apenas à ruptura do tecido dérmico.

[089]Uma aplicação particular da D-desoxirribose ou E2 é para uso em feridas extensas de espessura total devido a ferimentos causados por queimaduras.

[090]De acordo com a invenção, a cicatrização de feridas pode ser conseguida através da administração a um indivíduo de qualquer regime de dosagem, procedimento e/ou via de administração adequados de uma composição compreendendo um açúcar D-desoxirribose ou E2 no leito da ferida.

[091]Como aqui utilizado, o termo “leito da ferida” refere-se à superfície exposta no corpo quando ocorre uma quebra na continuidade do tecido da pele.

[092]Restauração de uma ferida pode significar cicatrização completa ou cicatrização substancialmente completa da ferida, em que o tecido ferido é restaurado para substancialmente o mesmo estado antes da ferida. Alternativamente, a restauração de uma ferida pode significar cicatrização parcial da ferida. Em uma alternativa adicional, a restauração de uma ferida pode incluir a redução da formação de tecido cicatricial fibroso. A cicatrização de feridas pode ser usada para fins terapêuticos ou não terapêuticos [cosméticos].

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24/73 [093]Conforme usado neste documento, “induzir” refere-se à ação de gerar, promover, formar, regular ou ativar um fenômeno específico. Conforme usado aqui, “aumento” refere-se à ação de acelerar ou aprimorar um fenômeno específico.

[094]D-desoxirribose ou E2 também pode ser usado para aumentar ou induzir a angiogênese no leito da ferida. Alternativamente, D-desoxirribose ou E2 pode ser utilizado para aumentar ou induzir a vascularização no leito da ferida.

[095]Como usado aqui, “vascularização” inclui formação de novo, crescimento, desenvolvimento ou proliferação de vasos sanguíneos derivados de células não diferenciadas ou subdiferenciadas. Adequadamente, os vasos sanguíneos podem se formar pela produção de novo de células endoteliais. Como usado aqui, “angiogênese” refere-se à formação de nova vasculatura (por exemplo, vasos sanguíneos; por exemplo, veias, artérias, vênulas, arteríolas, capilares) a partir de vasculatura pré-existente. Por exemplo, a angiogênese pode ocorrer brotando de novos vasos a partir de um vaso existente (angiogênese brotante) e/ou por ramificação de um vaso (angiogênese intussusceptiva). Sem desejar estar limitado a qualquer teoria em particular, a D-desoxirribose pode induzir a estimulação química da angiogênese por indução e/ou estimulação e/ou produção de VEGF. O VEGF é um estimulador químico conhecido de angiogênese.

[096]Alternativamente, D-desoxirribose ou E2 pode ser usado no tratamento de queda de cabelo. Adequadamente, D-desoxirribose ou E2 pode ser usado para aumentar ou induzir o crescimento de cabelo. D-desoxirribose ou E2 também pode ser usado para retardar, prevenir ou minimizar a queda de cabelo. É considerado que, para este fim, a D-desoxirribose possa ter usos terapêuticos e não terapêuticos [cosméticos].

[097]Adequadamente, D-desoxirribose ou E2 pode ser utilizado para tratar a alopecia. Como usado aqui, “alopecia” é um termo genérico que abrange todas as formas de queda médica de cabelo. A alopecia pode ocorrer devido à ausência de

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25/73 folículos, destruição (que pode causar cicatrizes), doença, infecção, retração, desregulação (alterações no ciclo capilar) ou desligamento / dormência completa. Essas alterações podem ser temporárias ou permanentes, parciais, regionais e/ou aparentemente totais.

[098]Exemplos de tipos específicos de alopecia que são abrangidos pelo uso do termo alopecia são selecionados a partir do grupo que consiste de: alopecia androgênica; alopecia areata; alopecia total; alopecia universal; eflúvio telógeno; eflúvio anágeno; alopecia traumática, alopecia por tração mecânica a partir de rotinas de penteado; alopecia induzida por produtos químicos; alopecia induzida pelo calor; alopecia induzida por radiação; alopecia induzida por quimioterapia; alopecia cicatricial; alopecia induzida por doença autoimune (por exemplo, a partir de lúpus eritematoso discoide ou lúpus eritematoso cutâneo crônico); alopecia relacionada à doença (por exemplo, hipertireoidismo ou hipotireoidismo, deficiência de ferro); alopecia induzida por medicação (por exemplo, alopecia induzida por antibióticos e fármacos antifúngicos; antidepressivos, anticonvulsivantes; anticoagulantes como heparina e alguns LMWH; NSAIDs tal como aspirina; anti-hipertensivos, terapia de reposição hormonal) e alopecia sifilítica.

[099]Exemplos de outras condições que seriam consideradas sob este termo são: hipopituitarismo, por exemplo, Doença de Simmonds e síndrome de Sheehan; outras endocrinopatias, por exemplo, hipotireoidismo, diabetes mellitus, displasia adrenal; doença crônica, por exemplo, lúpus eritematoso, neoplasma; moniletrix; pseudometiletrix; hipotricose hereditária simples do couro cabeludo; alopecia temporal triangular congênita; alopecia das suturas cranianas - síndrome de Hallermann Streiff; alopecia cicatricial hereditária, por exemplo, Hipotricose generalizada do tipo Marie Unna; queratose folicular cicatricial congênita difusa; nevo epidérmico - hamartoma epitelial benigno e/ou tumor maligno ou benigno; trauma físico, por exemplo, acidente de carro, lesão esportiva; pós-cirúrgico; agentes antitumorais, por exemplo, agentes

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26/73 citostáticos e/ou alquilantes; trauma químico, por exemplo, tioglicolatos, antimetabólicos; radiação ionizante; fármacos tóxicos, por exemplo, tálio, vitamina A; trauma físico autoinfligido, por exemplo, Tricotilomania; bacteriano, por exemplo, Piodermite, impetigo de Bockhart; micótico / fúngico, por exemplo, candidíase, dermatofilose; trauma / atrito acidental, por exemplo, chapéus, cabeleireiros, etc. Um termo relacionado é hipotricose, que é definido como uma diminuição na produção de cabelos.

[0100]Adequadamente, uma composição compreendendo um açúcar Ddesoxirribose ou E2 pode ser aplicada a um folículo piloso isolado. Como usado aqui, o termo “folículo piloso” refere-se a uma estrutura semelhante a um tubo originária da epiderme onde uma fibra capilar pode se desenvolver. Um folículo piloso compreende tipicamente as seguintes estruturas: papila, matriz, bainha radicular, glândula sebácea e opcionalmente fibra capilar (que compreende uma haste capilar e uma raiz capilar). A fibra capilar pode ter diâmetro diminuído ou pode não estar presente, dependendo da extensão da alopecia ou da extensão e estágio do desenvolvimento do folículo formado.

[0101]Adequadamente, D-desoxirribose ou E2 pode ser fornecido com um carreador. O carreador é preferencialmente selecionado a partir de um gel, mais preferencialmente um hidrogel, ou um material de matriz biocompatível, preferencialmente um arcabouço eletrofiado, uma partícula, um curativo para ferida ou um cotonete que é impregnado com uma solução contendo D-desoxirribose ou E2. Os carreadores podem consistir de materiais amorfos sem superfícies definidas e sem uma forma específica ou matrizes sólidas.

[0102]Adequadamente, um carreador que libera D-desoxirribose ou E2 pode atuar como um substituto para uma derme, à medida que estimula o crescimento de novos vasos sanguíneos e fornece um leito de ferida vascularizada para enxerto subsequente com enxerto de pele fina ou queratinócitos autólogos cultivados para

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27/73 fornecer uma camada de barreira de pele permanente.

[0103]O carreador pode ainda compreender uma substância que atua como um antimicrobiano, por exemplo, prata ou cério.

[0104]Estes carreadores podem ser adequados para a liberação sustentada de D-desoxirribose ou E2 na ferida. As preparações de D-desoxirribose ou E2 com um carreador são especialmente adequadas para administração tópica.

[0105]Adequadamente, D-desoxirribose ou E2 pode ser formulado com ou acoplado a um material de matriz biocompatível. Material de matriz, como aqui utilizado, significa um carreador ou um arcabouço para recrutamento celular, ligação, proliferação e diferenciação e um potencial dispositivo de entrega e armazenamento para D-desoxirribose ou E2.

[0106]A preparação de materiais de matriz biocompatível é bem conhecida na técnica. As matrizes biocompatíveis preferencialmente suportam a cicatrização de feridas e/ou aumentam ou induzem angiogênese ou vascularização em um leito de ferida.

[0107]Adequadamente, os materiais de matriz biocompatível podem compreender um material polimérico. O material polimérico pode compreender um homopolímero ou um heteropolímero / copolímero de duas ou mais substâncias poliméricas diferentes, ou uma combinação dos dois. Como usado aqui, o termo “polímero” refere-se a uma macromolécula formada pela ligação química de cinco ou mais unidades de combinação idênticas chamadas monômeros, por exemplo, açúcares. Os polímeros podem ser derivados naturalmente [por exemplo, polissacarídeos tal como amido, celulose, pectina, gomas de algas marinhas, gomas vegetais; polipeptideos tal como caseína, albumina, globulina, queratina, insulina, DNA; e hidrocarbonetos], sintéticos [tal como termoplásticos (elastômeros não vulcanizados, náilon, polivinil cloreto, poli (vinilifeno fluoreto trifluoroetileno), polietileno linear, poliestireno, polipropileno, poliuretano, resinas de acrilato); termoendurecível

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28/73 (por exemplo, elastômeros vulcanizados, polietileno reticulado, fenólicos, alquídicos, poliésteres) e semissintéticos (por exemplo, celulósicos tal como raiom, metil celulose, acetato de celulose; e amidos modificados)]. O termo “homopolímero” refere-se a um polímero natural ou sintético derivado de um único monômero. O termo “heteropolímero” refere-se a um polímero natural ou sintético derivado de mais de uma subunidade de monômero (isto é, copolímero). A menos que indicado ao contrário, o termo “polímero” é usado geralmente para se referir tanto a homopolímeros quanto a heteropolímeros (isto é, copolímero) como descrito aqui.

[0108]Conforme usado aqui, o termo “material biocompatível” ou “material de matriz biocompatível” significa que o material não estimula uma resposta ou estimula apenas uma resposta leve e/ou transiente, em oposição a uma resposta grave ou crescente quando o material de matriz é colocado ou implantado no leito de ferida desejado.

[0109]0s materiais de matriz biocompatível podem incluir, por exemplo, matrizes sintéticas ou naturais tal como colágeno, matriz acelular, moléculas de arcabouços biológicos reticulados, estrutura estrutural baseada em tecidos de bioengenharia, biopróteses biomanufaturadas, e outras estruturas implantadas tais como, por exemplo, enxertos vasculares adequados para infiltração celular e proliferação útil na promoção da cicatrização de feridas. Os materiais de matriz biocompatível adequados adicionais podem incluir tecido de colágeno quimicamente modificado para reduzir a antigenicidade e imunogenicidade. Outros exemplos adequados incluem folhas de colágeno para curativos, matriz acelular livre de antigeno ou de antigeno reduzido (Wilson G J e outros (1990) Trans Am Soc Artif Intern 36: 340 a 343) ou outras matrizes biocompatíveis que foram elaboradas para reduzir a resposta antigênica ao material do xenoenxerto. Outras matrizes úteis na promoção da cicatrização de feridas podem incluir, por exemplo, proteínas de pericárdio bovino processadas compreendendo colágeno e elastina insolúveis

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29/73 (Courtman DW e outros (1994) J Biomed Mater Res 28: 655 a 666) e outro tecido acelular que pode ser útil para fornecer um microambiente natural para a migração de células hospedeiras para acelerar a regeneração do tecido (Malone J M e outros (1984) J Vasc Surg 1: 181-91).

[0110]Adequadamente, o material de matriz biocompatível pode ser formado por eletrofiação para formar um arcabouço. O processo de eletrofiação envolve a aplicação de alta tensão a uma solução de polímero ejetável para sintetizar materiais de matriz polimérica. A alta tensão aplicada é suficiente para superar a tensão superficial de uma solução polimérica, de modo que faz com que as gotículas de polímero se alonguem, tornando-se fibras finas que formam uma matriz, tecido ou malha não tecida com orientação aleatória. A eletrofiação normalmente produz matrizes não tecidas (isto é, malha) (também conhecidas como esteiras e/ou arcabouços) com diâmetros de fibra na faixa de centenas de nanometros com poros inter-relacionados. O processo de eletrofiação normalmente leva à formação de uma superfície lisa que é substancialmente livre de quaisquer fibras frisadas. As fibras da matriz podem compreender uma malha não tecida de nanofibras aleatórias e/ou alinhadas ou uma combinação das mesmas. Adequadamente, uma vez carregadas com o açúcar D-desoxirribose, as nanofibras aumentam tipicamente de diâmetro. Por exemplo, as fibras carregadas podem ter um diâmetro de cerca de 0,2 micra a cerca de 5,0 micra.

[0111]As nanofibras eletrofiadas podem compreender policaprolactona. Vantajosamente, a policaprolactona é biodegradável. Adequadamente, outros polímeros biodegradáveis podem ser utilizados em vez da policaprolactona. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis adequados que podem ser alternativas adequadas incluem ácido polilático (PLA), poliglicolídeo (PGA), ácido poli(lático-coglicólico) (PLGA) e poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV).

[0112]Como usado aqui, o termo material “biodegradável” é aquele que é

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30/73 capaz de se decompor sob condições fisiológicas normais in vivo, durante um período finito, em componentes que podem ser metabolizados ou excretados e não têm efeitos prejudiciais ao se decompor in vivo.

[0113]Alternativamente, o carreador pode ser um hidrogel. Os hidrogéis compreendem uma rede de grupos funcionais hidrofílicos ligados a cadeias principais poliméricas naturais ou sintéticas. Eles podem compreender um gel coloidal com um meio de dispersão aquoso. A protrusão dos grupos funcionais hidrofílicos das cadeias poliméricas torna os hidrogéis altamente absorventes (alguns podem conter mais de 99,9% de água). O alto teor de líquido de hidrogéis permite que os hidrogéis tenham um grau de flexibilidade comparável ao tecido natural. A natureza absorvente dos hidrogéis também permite que os hidrogéis atuem como um reservatório para a administração tópica de fármacos. O hidrogel pode ser um hidrogel reticulado. A reticulação do hidrogel pode impedir a dissolução. A reticulação pode ser alcançada reagindo com agentes de reticulação adequados. Os hidrogéis adequados podem incluir, por exemplo, redes tridimensionais de polímeros hidrofílicos reticulados que são insolúveis em água e interagem com soluções aquosas por dilatação. Os hidrogéis exemplificativos são altamente conformáveis e permeáveis e podem absorver quantidades variáveis de solução aquosa, dependendo de sua composição. Adequadamente, o hidrogel pode ser não adesivo contra o sítio de tratamento ou tratado para fácil remoção.

[0114]Adequadamente, um hidrogel pode preferencialmente compreender ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, colágeno, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos. De preferência, o hidrogel pode compreender quitosana e colágeno. Alternativamente, os hidrogéis organoquímicos podem compreender polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato e copolímeros com uma abundância de grupos hidrofílicos.

[0115]Adequadamente, o carreador compreende ácido ascórbico ou um

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31/73 derivado do mesmo, tal como, por exemplo, ácido L-ascórbico ou ascorbato-2-fosfato (Mangir e outros Acta Biomater. 2016 Jan 1; 29: 188 a 197.doi: 10.1016/j.actbio.2015.10.019) [0116]0 termo “curativo para feridas” refere-se a um curativo para aplicação tópica a uma ferida e exclui composições adequadas para administração sistêmica. Por exemplo, o açúcar D-desoxirribose ou E2 pode ser disperso em uma folha sólida de material em contato com a ferida, tal como um material têxtil tecido ou não tecido, ou pode ser disperso em uma camada de espuma, tal como espuma de poliuretano, ou em um hidrogel tal como um hidrogel de polquitosana, um polivinil álcool, um hidrogel de poliacrilato, gelatina, metil celulose, agarose, alginato, hidrogel de ácido hialurônico ou qualquer combinação dos mesmos, por exemplo, em um gel ou pomada. Adequadamente, o açúcar D-desoxirribose ou E2 é disperso em ou sobre um material de folha biodegradável que fornece liberação sustentada dos ingredientes ativos na ferida, por exemplo, uma folha de mistura de quitosana liofilizada / polivinil álcool.

[0117]Adequadamente, D-desoxirribose ou E2 pode ser fornecido na forma de uma composição líquida, semissólida ou sólida para aplicação direta, ou a composição é aplicada à superfície ou incorporada a uma camada de contato sólida, tal como um curativo para feridas, hidrogel, arcabouço ou matriz. A composição do curativo pode ser fornecida, por exemplo, na forma de um fluido ou um gel.

[0118]Os curativos de hidrogel amorfo adequados podem incluir, por exemplo, formulações de água, polímeros e outros ingredientes sem forma, projetados para doar umidade e manter um ambiente de cicatrização úmido e ou para reidratar o sítio da ferida. Os hidrogéis podem ser utilizados em combinação com uma cobertura secundária.

[0119]Os curativos de hidrogel podem incluir, por exemplo, gazes e esponjas não tecidas, cordas e tiras saturadas com um hidrogel amorfo. Os curativos

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32/73 impregnados adequados podem incluir, por exemplo, gazes e esponjas não tecidas, cordas e tiras saturadas com uma solução, uma emulsão, óleo, gel ou algum outro composto ou agente carreador farmaceuticamente ativo, incluindo, por exemplo, solução salina, óleo, sais de zinco, petrolato, xerofórmio e vermelho escarlate, bem como os compostos aqui descritos.

[0120]Os curativos de folha de gel de silicone adequados podem incluir, por exemplo, coberturas macias compostas de polímeros reticulados reforçados ou ligados a malha ou tecido.

[0121 ]Os curativos líquidos adequados podem incluir, por exemplo, misturas de material multiproteico e outros elementos encontrados na matriz extracelular. As soluções podem ser aplicadas no sítio de tratamento após desbridamento e limpeza e, em seguida, cobertas com um curativo absorvente ou uma compressa não aderente.

[0122]Os curativos de filme transparente adequados podem incluir membranas poliméricas de espessura variável revestidas de um lado com um adesivo. Os filmes transparentes podem ser impermeáveis a líquidos, água e bactérias, mas permeáveis ao vapor de umidade e gases atmosféricos. A transparência do filme pode permitir a visualização do sítio de tratamento.

[0123]Os curativos de enchimento adequados podem incluir, por exemplo, contas, cremes, espumas, géis, pomadas, compressas, pastas, travesseiros, pós, fios ou outras formulações. Os enchimentos podem não ser aderentes e podem incluir um antimicrobiano de liberação no tempo. Os enchimentos exemplificativos podem ser úteis para manter um ambiente úmido, gerenciar o exsudato, e para o tratamento, por exemplo, de feridas de espessura parcial e total, feridas infectadas, feridas de drenagem e feridas profundas que exigem empacotamento.

[0124]D-desoxirribose ou E2 pode ser fornecido em combinação com excipientes farmacêuticos convencionais para aplicação tópica. Os carreadores

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33/73 farmacêuticos adequados incluem: géis plurônicos, géis polaxâmeros, hidrogéis contendo derivados de celulose, incluindo hidroxietil celulose, hidroximetil celulose, carboximetil celulose, hidroxipropilmetil celulose e misturas dos mesmos, e hidrogéis contendo ácido poliacrílico (Carbopol).

[0125]Outros carreadores adequados também incluem cremes / pomadas utilizados para preparações farmacêuticas tópicas, por exemplo, cremes à base de pomada emulsificante de cetomacrogol. Os carreadores acima podem incluir alginato (como um espessante ou estimulante), conservantes tal como benzil álcool, tampões para controlar o pH tal como hidrogenofosfato dissódico / di-hidrogenofosfato de sódio, agentes para ajustar a osmolaridade tal como cloreto de sódio, e estabilizadores tal como EDTA.

[0126]As formulações preferenciais são formulações para administração tópica. Também estão incluídas composições que compreendem a incorporação de D-desoxirribose ou E2 em lipossomas, microemulsões, micelas, micropartículas ou vesículas para entrega controlada durante um período prolongado de tempo no leito da ferida.

[0127]A composição farmacêutica pode compreender D-desoxirribose ou E2 formulada com ou acoplada a uma matriz biocompatível, de preferência compreendendo colágeno, gelatina, quitosana e/ou hialuronano, como descrito acima. A composição farmacêutica também pode compreender um hidrogel com Ddesoxirribose ou E2 como descrito acima.

[0128]A composição farmacêutica pode compreender um agente antimicrobiano, tal como prata ou cério.

[0129]Em particular, a presente invenção fornece a composição farmacêutica para uso como um medicamento. Usos particulares são na cicatrização de feridas e/ou na estimulação da angiogênese, conforme descrito acima. Usos alternativos são para o tratamento de alopecia e outros distúrbios associados, como descrito acima. Uma

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34/73 outra alternativa é o tratamento cosmético da queda de cabelo.

[0130]Também é fornecido o uso deste método in vivo, em particular em um indivíduo com uma ferida ou em necessidade de tal tratamento, por exemplo, para estimular a angiogênese.

[0131]“Administração tópica”, como aqui utilizada, significa administração a uma superfície definida, por exemplo, diretamente na superfície da ferida, ou se a ferida foi fechada, na área ao redor ou dentro do fechamento.

[0132]Como aqui utilizado, de acordo com todos os aspectos da invenção, o termo “indivíduo” refere-se a vertebrados. O indivíduo refere-se preferencialmente a um animal mamífero, incluindo um humano, um animal veterinário ou de fazenda, um animal doméstico ou animal de estimação e animais normalmente utilizados para pesquisa clínica, incluindo primatas não humanos, cães, ratos e camundongos. Mais especificamente, o indivíduo da presente invenção pode ser um ser humano.

[0133]Em toda a descrição e reivindicações desta especificação, as palavras “compreendem” e “contêm” e suas variações significam “incluindo, mas não limitados a”, e elas não estão destinadas a (e não excluem) outras porções, aditivos, componentes, números inteiros ou etapas. Em toda a descrição e reivindicações desta especificação, o singular abrange o plural, a menos que o contexto exija de outra forma. Em particular, quando o artigo indefinido é usado, a especificação deve ser entendida como considerando a pluralidade bem como a singularidade, a menos que o contexto exija de outra forma.

[0134]Recursos, números inteiros, características, compostos, porções ou grupos químicos descritos em conjunto com um aspecto, modalidade ou exemplo específico da invenção devem ser entendidos como aplicáveis a qualquer outro aspecto, modalidade ou exemplo aqui descrito, a menos que seja incompatível com isso. Todas as características descritas nesta especificação (incluindo quaisquer reivindicações, resumo e desenhos), e/ou todas as etapas de qualquer método ou

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35/73 processo descrito, podem ser combinadas em qualquer combinação, exceto combinações em que ao menos algumas dessas características e/ou etapas são mutuamente exclusivas. A invenção não está restrita aos detalhes de quaisquer modalidades anteriores. A invenção se estende a qualquer nova característica, ou qualquer nova combinação, das características descritas nesta especificação (incluindo quaisquer reivindicações em anexo, resumo e desenhos), ou a qualquer nova etapa, ou qualquer nova combinação, das etapas de qualquer método ou processo assim descrito.

[0135]A atenção do leitor é direcionada a todos os papéis e documentos arquivados simultaneamente com ou anteriores a esta especificação em conjunto com este pedido e submetidos à inspeção pública com esta especificação, e o conteúdo de todos esses papéis e documentos é incorporado aqui por referência.

Exemplo

Seção experimental 1 - Materiais [0136]Policaprolactona (Mw: 45.000), L-ramnose e NaOH foram adquiridos a partir de Sigma-Aldrich (EUA). A quitosana (CS) foi adquirida a partir de Mian Scientific Company, Lahore, Paquistão e posteriormente purificada nestes laboratórios (grau de desacetilação (DD) 84%; Mw: 87047,26 g / mol) (Farooq e outros, Materials Science and Engineering: C. 2015). O colágeno foi adquirido a partir de Mian Scientific Suppliers Lahore. O poli(vinil álcool) (PVA) (Mw: 72.000, grau de hidrólise 98%), ácido clorídrico (HCI) e ácido sulfúrico (H2SO4) foram adquiridos a partir de Merck (Alemanha). O trietil ortoformato (98%) foi adquirido a partir de Alfa Aesar (Alemanha). O ácido acético glacial (CH3COOH) foi adquirido a partir de AnalaR BDH Laboratory Supplies (UK). O etanol (99,8%) foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich (Alemanha). A 2-desoxi-D-ribose, D-fucose e L-fucose foram adquiridas a partir de Sigma-Aldrich China, Reino Unido e Eslováquia, respectivamente. A 2-desoxi-L-ribose e a Dramnose foram produtos de Carbosynth (UK). O caldo de infusão de cérebro - coração

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36/73 e o caldo triptona de soja (1% peso / volume) foram adquiridos a partir de Oxoid Ltd. O vermelho de fenol foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich UK.

Eletrofiação [0137]O PCL (10% em peso) foi dissolvido em 5 ml de DMF / DCM (4:1, 10% peso / volume) e a 2-desoxi-D-ribose (1,8% em peso) foi dissolvido em DMF (0,5 mL). Ambas as soluções foram combinadas e deixadas em uma estação de balanço durante a noite para produzir uma solução homogênea em temperatura ambiente. No dia seguinte, esta solução foi submetida à eletrofiação com seringas de 4 χ 5mL. Estes foram colocados horizontalmente em uma bomba de seringa programável (Kent Scientific, EUA) e descarregados a uma taxa de 40 pL / min. As seringas foram fornecidas com 17 kV usando uma fonte de alimentação de alta tensão (Genvolt, UK). O arcabouço fibroso foi coletado em um tambor rotativo de 16 cm x 6 cm de diâmetro a uma distância de 17 cm das pontas da agulha. Este tambor rotacionou a 300 rpm, resultando em uma esteira de 18 χ 16 cm. Os arcabouços foram produzidos em uma temperatura ambiente de cerca de 20^Q C.

[0138]Preparação de hidrogéis covalentemente reticulados: hidrogéis de quitosana / PVA usando quantidades variáveis de agente de reticulação para encapsulamento de açúcar D-desoxi.

[0139]O CS (2,5% peso / volume) foi dissolvido em solução de ácido acético (1%) e agitado magneticamente por 12 horas. Em um frasco separado, o PVA (10% peso / volume) foi dissolvido em água destilada a 80° C sob agitação magnética. Em seguida, as duas soluções foram misturadas nas relações de 80:20 de CS e PVA, respectivamente, e agitadas por mais 24 horas. A solução foi então vazada em placas de Petri separadas e as placas foram congeladas a -80° C por 24 horas. As amostras foram liofilizadas por 24 horas em um liofilizador a -40° C. Em seguida, os hidrogéis liofilizados foram reidratados e embebidos em diferentes concentrações de TEOF (isto é, 0, 4, 8 e 16% peso / volume) com ácido sulfúrico (17% peso / volume) por 24 horas.

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Os hidrogéis foram então removidos das placas de Petri e tratados com NaOH (12% peso / volume) por uma hora antes de serem lavados três vezes com água destilada e liofilizados por 24 horas.

[0140]Preparação de arcabouços de CS / colágeno reticulados por gelificação por congelamento [0141]CS e colágeno (0,5 g cada) foram dissolvidos em ácido acético (0,5 M, 20 mL) e agitados em temperatura ambiente até completamente dissolvidos e uma solução clara foi obtida. A isto, trietil ortoformato (4% em volume, 0,8 mL) foi adicionado como reticulador e a solução foi agitada durante a noite para melhor homogeneidade e reticulação de materiais. A mistura foi então vertida em uma placa de Petri e congelada a -20° C durante a noite. As membranas congeladas foram então imersas em uma solução etanólica pré-resfriada de hidróxido de sódio (3M) e novamente colocadas a -20° C por 24 horas. Depois disso, as membranas congeladas foram lavadas em solução de etanol a 50% (em volume) e depois com água destilada para remover o hidróxido de sódio. As membranas foram finalmente lavadas duas vezes em etanol absoluto durante 15 minutos e secas em temperatura ambiente para obter arcabouços porosos.

Análise de FTIR [0142]Os espectros de infravermelho (FT-IR) foram gravados no modo fotoacústico na faixa de frequência de 4000-400 cnr¹ com 256 varreduras consecutivas em resolução de 8 cm’¹ em um espectrômetro FTIR Thermo-Nicolet 6700 P (EUA).

Microscopia eletrônica de varredura (MEV) [0143]A morfologia da superfície das matrizes compósitas foi examinada sob SEM, Modelo JEOL JSM 6480. As amostras foram revestidas com jato de ouro antes do exame em uma série de ampliações.

Carregamento de açúcar desoxi em arcabouços

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38/73 [0144]Para o carregamento de açúcar, os hidrogéis foram embebidos em uma solução aquosa de 2-desoxi-D-ribose (1 mg / ml) a 37° C até todo o líquido ter sido absorvido pelos hidrogéis. Após armazenamento a -20° C durante a noite, os hidrogéis foram secos em um liofilizador (Christ, Alpha 1-2 LD plus, Alemanha) a -40° C antes de posterior caracterização.

[0145]Avaliação das propriedades angiogênicas de biomateriais utilizando o ensaio CAM [0146]Ovos de galinha fertilizados (Gallus domesticus) foram adquiridos a partir de Big Bird (Raiwind road, Lahore, Paquistão) e incubados a 37° C a partir do dia 2 de fertilização até o dia 8 em uma incubadora de ovos umidificada (HHD, 435, China). No dia 8, uma janela quadrada (1 cm²) foi cortada na casca e removida, e um pedaço de 2 cm² do arcabouço eletrofiado ou hidrogéis (arcabouço eletrofiado de PCL a 16% / hidrogel de PVA / CS / hidrogéis de CS / colágeno) colocados no CAM. Cada ovo foi implantado apenas com um arcabouço ou hidrogel.

[0147]A janela da casca foi fechada com parafilm (Bemis Flexible Packaging, EUA) e selada com fita adesiva. Após a implantação, os ovos foram novamente colocados a 37° C em uma incubadora umidificada a 40% até o dia 14. No dia 14, os biomateriais foram recuperados e os ovos foram sacrificados. A angiogênese foi quantificada tirando-se fotos de microscópio de luz imediatamente antes da recuperação do arcabouço e depois classificada às cegas por quatro avaliadores, utilizando imagens histológicas dos materiais recuperados. O número de ovos implantados e que sobreviveram é dado na legenda das respectivas figuras de ensaio CAM.

Modelo de ferida de rato excisional de espessura total [0148]Para experimentos in vivo, foram preparados círculos de 20 mm de diâmetro e 1,2 mm de espessura de hidrogéis. Essas amostras foram esterilizadas com solução de etanol (70%), secas ao ar e equilibradas em PBS brevemente antes

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39/73 de serem colocadas na ferida. Para ensaios em animais, ratos Sprague-Dawley (SD) machos pesando 140-170 g foram utilizados no estudo. Os animais tinham livre acesso a comida e água e foram mantidos nas instalações do Centro de Excelência em Biologia Molecular (CEMB), Lahore. Todos os animais foram tratados de acordo com os procedimentos aprovados pelo Institutional Animal Ethics Committee em CEMB, Lahore, Paquistão. Os animais foram anestesiados com cetamina (100 mg / kg de peso corporal) e xilazina (10 mg / kg de peso corporal) e, em seguida, o pelo do lado dorsal foi removido com um aparador de pelos (aparador de pelos profissional Dingling, RF-608, China). As costas dos ratos foram completamente raspadas para fixação de fita adesiva e curativo. Após a raspagem, as costas foram limpas com etanol e depois transferidas para uma mesa esterilizada limpa e três feridas de forma circular foram criadas pela remoção da pele em três áreas marcadas com a ajuda de tesouras cirúrgicas (Noorani Surgical Medical Supplies, Paquistão). Imediatamente após o processo de excisão, uma dessas feridas foi coberta com círculos de membrana esterilizados, carregados com 2-desoxi-D-ribose (usando etanol a 70%) e a outra foi coberta com as mesmas membranas materiais, mas sem qualquer 2desoxi-D-ribose. Ambas as membranas implantadas foram suturadas em posição usando suturas de seda trançadas estéreis (Mersilk, diâmetro 220 micra). Os arcabouços foram cobertos com gesso adesivo (Mepore, Suécia), depois cobertos com gaze de algodão e finalmente presos com fita adesiva cirúrgica branca (Nitto, Japão) para evitar danos causados pela autolimpeza. Uma dessas feridas foi mantida aberta e coberta apenas com curativos (Mepore, Suécia) para servir como um controle negativo.

[0149]Os curativos cirúrgicos foram removidos após três dias de implantação de membrana. Nos dias 0, 3, 9, 11, 14 e 17 após a ferida, as feridas foram medidas e fotografadas. As áreas da ferida foram quantificadas usando o software Image j. No final dos experimentos, no dia 17, os ratos foram eutanizados com uma overdose de

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40/73 anestesia e as seções de tecido a partir dos sítios de implantação dos grupos tratados com arcabouços normais, simulados, de controle e carregados com 2-desoxi-D-ribose foram removidos. As amostras foram fixadas em solução de paraformaldeído a 3,7% (Sigma-Aldrich, EUA) por 24 horas em temperatura ambiente. Elas foram desidratadas usando várias concentrações de etanol e água de 70% a 100% e blocos de parafina foram feitos.

Histologia [0150]Seções de 6 pm de espessura foram cortadas das amostras embebidas em parafina com um micrótomo (Processador Automático de Tecido Leica TP 1020) e colocadas em lâminas Superfrost® plus (Menzel-GIãser, Dinamarca). A coloração convencional de Hematoxilina e Eosina (H&E) e a tricromo de Goldner foram realizadas (Yar e outros, International Journal of Polymeric Materials e Polymeric Biomaterials. 2016) antes da montagem no meio de montagem DPX (Fisher Scientific) com uma lamela.

[0151]Para imuno-histoquimica, seções de 6 pm foram processadas com urn kit HRPI DAB (ABC) IHC de detecção específico para camundongo I coelho (Abeam). Após as etapas de reidratação, recuperação de antigeno e bloqueio de proteínas, as seções foram incubadas com 3 anticorpos monoclonais diferentes (anti-CD34 de coelho (Abeam) 1:1000, anti-CD80 de camundongo (Santa Cruz) 1:100 e anti-CD163 de camundongo (AbD Serotec) 1:300) durante 2 horas diluídas em BSA a 1% (SigmaAldrich). Isto foi seguido por 10 min de incubação com um anticorpo antipolivalente de cabra biotinilado secundário (Kit IHC de detecção Abeam). Após incubação com avidina e peroxidase de rábano biotinilada, as proteínas alvo foram visualizadas por incubação em substrato de peroxidase e cromogênio DAB (Kit IHC de detecção Abeam). As amostras foram então contrastadas com hematoxilina, desidratadas e montadas de acordo com o protocolo de H&E. Os controles consistiram de amostras incubadas sem anticorpos primários e secundários, ou incubadas apenas com

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41/73 anticorpos secundários. A avaliação semiquantitativa da extensão da imunocoloração foi realizada com base em observadores cegos, usando uma escala de classificação qualitativa; ausente = 0, presença leve = 1, presença grande = 2, abundância = 3, grande abundância = 4. Cinco imagens representativas de cada amostra em cada momento foram avaliadas por dois pesquisadores cegos (n = 10). Fotografias exemplificativas representando 0,1,2, 3 e 4 foram fornecidas para referência e o valor mediano dessas classificações foi usado. A relação M1 / M2 também foi calculada para cada um usando os valores de classificação à cega da imunocoloração.

Fermentação de açúcares por bactérias.

[0152]Para avaliar a capacidade das bactérias de metabolizar os açúcares desoxi L e D estudados nesta investigação, foi determinada sua capacidade de fermentar os açúcares produtores de ácido.

Bactérias [0153]Cinco cepas bacterianas foram empregadas no estudo; quatro cepas de Staphylococcus aureus e uma cepa de Pseudomonas aeruginosa. As cepas de S. aureus eram S235 - um isolado clínico recente que foi usado no desenvolvimento de um modelo de pele infectado por bactérias relatado anteriormente neste laboratório (Shepherd J e outros, Tissue Engineering Part C: Methods. 2009). NCTC 6571 (Oxford) - uma cepa de referência comumente usada como uma cepa de referência para testes de sensibilidade a antibióticos, cepa Newman - originária de uma cepa clínica, mas que tem um defeito na proteína de ligação à fibronectina de superfície, e L-9879 - outro isolado clínico, mas que é hidrofílico.

Crescimento e fermentação de açúcares [0154]As bactérias foram cultivadas em caldo de infusão cérebro - coração por 16h a 37° C. Alíquotas (100 ml) de caldo de triptona de soja (1% peso / volume) suplementadas com vermelho de fenol (0,02% peso / volume; Sigma-Aldrich, UK) e açúcares apropriados (conc. final de 1%) foram adicionadas às placas estéreis de 96

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42/73 poços. 5 μΙ das culturas de caldo durante a noite de cada cepa bacteriana foram então adicionados aos poços e incubados por 16 horas a 37° C. A capacidade de cada cepa de fermentar cada açúcar foi avaliada pela produção de ácido e alteração do indicador do pH de vermelho de fenol.

Estatísticas [0155]As diferenças entre os grupos para a imunocoloração foram testadas com um teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e múltiplas comparações entre grupos individuais usando o teste de Dunn.

Resultados [0156]lncorporação de açúcar D-desoxi em membranas de PLC eletrofiadas [0157]A 2-desoxi-D-ribose foi encapsulada em nanofibras eletrofiadas e o DMF em DCM foi usado como o solvente para a eletrofiação. A eletrofiação produziu uma folha de material fibroso macio carregado de açúcar (Figura 1). O diâmetro médio das fibras de PCL sem açúcar foi 224 nm ± 82 nm, enquanto o diâmetro médio das fibras carregadas com 2-desoxi-D-ribose aumentou significativamente para 323 nm ± 25 nm (diâmetro médio de 40 fibras aleatórias) (p < 0,05). No entanto, ambos os tipos de fibras foram orientados aleatoriamente com poros inter-relacionados e suas superfícies eram lisas e livres de quaisquer esferas. Após o carregamento de açúcar, a cor da membrana ficou azul claro.

[0158]lncorporação de açúcar D nos hidrogéis de quitosana / PVA [0159]O método de reticulação entre CS e PVA usando trietil ortoformato (TEOF) foi relatado anteriormente por este grupo em 2015 (Yar e outros, Materiais Science and Engineering: C. 2015; Shahzadi e outros, Journal of biomaterials applications. 2016). Neste estudo, 2-desoxi-D-ribose foi carregada por adsorção física nos hidrogéis de CS / PVA reticulados com TEOF a 16%. O hidrogel não reticulado carregado com 2-desoxi-D-ribose foi usado como controle neste estudo. As micrografias SEM mostraram que tanto a reticulação quanto o carregamento de

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43/73 açúcar pareciam afetar o tamanho dos poros e a morfologia desses hidrogéis (Figura 2). Antes da reticulação, os hidrogéis tinham uma estrutura em camadas, em vez de poros interconectados. O tamanho médio dos poros foi de 103 pm ± 52 pm. Após a reticulação, o tamanho do poro foi reduzido significativamente (p < 0,05). A adição de açúcar na ausência de reticulação alterou a estrutura em camadas para poros distorcidos. Com a introdução tanto de reticulação quanto de açúcares, o tamanho médio dos poros foi reduzido significativamente para 68 pm ± 31 pm (p < 0,05). Esses novos poros interconectados tinham uma morfologia mais uniforme e os poros estavam bem distribuídos por toda a matriz de hidrogel.

[0160]lncorporação de D-desoxirribose em hidrogéis de quitosana / colágeno reticulados com trietil ortoformato [0161]Quitosana e colágeno foram reticulados usando trietil ortoformato e depois carregados com 2-desoxi-D-ribose por imersão em solução aquosa de açúcar (1 mg / ml). A espessura média do hidrogel, antes da submersão em solução salina, era de 1,11 mm e após 24 horas de submersão aumentou para 1,37 mm. Os valores são a média de três experimentos independentes. É fundamental avaliar a estabilidade física das membranas, à medida que os materiais serão entregues a um cirurgião para aplicação na pele. A superfície das membranas era lisa e sem rachaduras. A Figura 3 abaixo mostra a aparência física desta membrana, juntamente com todos os parâmetros importantes de resistência, alongamento e capacidade de ser dobrada, o que será vantajoso durante os procedimentos cirúrgicos quanto aplicando-a no sítio da ferida. Além disso, essas membranas podem ser facilmente cortadas com uma lâmina ou tesoura na forma desejada.

[0162]As membranas eram fortes e exibiam excelentes propriedades de flexibilidade, estiramento e manuseio.

[0163]Para investigar como os diferentes açúcares afetam a estrutura e a morfologia dos hidrogéis, que desempenham um papel crucial na infiltração e

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44/73 proliferação celular, as estruturas microscópicas desses hidrogéis carregados com açúcar foram examinadas por SEM (Figura 4). Uma estrutura em forma de folha com um tamanho médio de poro de 75,07 ± 34,48 pm foi observada no caso dos hidrogéis de controle (Figura 4a). O tamanho médio dos poros de D e L-desoxirribose foi de 100,04 ± 24,01 pm e 93,33 ± 23,49 pm, respectivamente (Figura 4b, c). No caso de Ldesoxiramnose (Figura 4e), a estrutura dos poros estava intacta, uniforme e isotrópica, com tamanho médio de poro de 110,89 ± 20,56 pm e seu isômero D não era significativamente diferente (tamanho médio de poro 102,45 ± 23,05 pm). D e L-fucose apresentaram tamanhos de poros transversais médios de 72,18 ± 16,92 pm e 87,43 ± 14,11 pm, respectivamente. Assim, as micrografias SEM demonstraram que todos os hidrogéis carregados com açúcar tinham estruturas altamente porosas similares.

Caracterização

FTIR [0164]A espectroscopia FTIR foi usada para examinar as interações entre o açúcar e as microfibras de PCL. A Figura 5A mostra que o pico principal de D-ribose observado em cerca de 3400 cnr¹ foi detectado nas fibras de PCL quando esse açúcar foi adicionado ao polímero antes da fiação. Uma banda de absorbância principal foi observada a 1720 cnr¹ correspondente ao carbonil éster de PCL. Os picos de grupos alquila, tanto em açúcar D quanto em PCL, apresentaram picos de absorbância entre 2700 e 2900 cm’¹. O espectro de fibras de PCL carregadas com açúcar D também mostra que o açúcar foi distribuído homogeneamente na mistura de eletrofiação.

[0165]Os hidrogéis de CS / PVA, sem (Figura 5d) e com reticulador (Figura 5e), contêm os picos característicos de quitosana e PVA (Figura 5B). Os picos próximos a 2900 cnr¹ foram atribuídos a vibrações de estiramento em C-H (Islam e outros, Carbohydrate Polymers. 2012). Um pico a 1530 cm’¹ foi atribuído às vibrações de flexão de PVA de O-H (Li e outros, Polymer. 2000). As bandas que apareceram perto de 1400 cnr¹ foram devidas a vibrações de flexão de C-H. Os picos a 1099 cm’

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45/73 ¹ foram devido a vibrações de estiramento C-O-C. No entanto, no espectro de hidrogel reticulado, os estiramentos de OH e NH também apareceram a 3400-3200 cnr¹ (Li e outros, Polymer. 2000; Teli e outros, International Journal of biological macromolecules. 2012) como um pico amplo, mas houve uma diminuição significativa na intensidade dessa lombada. Isso pode ser devido ao uso de -NH2 de CS na formação de uma nova ligação -C = N. O novo pico da ligação imina apareceu em 1630 cm’¹ (Yar e outros, Materials Science and Engineering: C. 2015; Li e outros, Polymer. 2000; Rokhade e outros, Carbohydrate Polymers. 2007).

[0166]A Figura 5C mostra os espectros de CS / colágeno reticulados carregados com diferentes açúcares. Os espectros mostram todos os picos característicos de CS e colágeno. Uma ampla faixa de absorção de 3200-3500 cnr¹ deveu-se principalmente às vibrações de estiramento O-H / N-H. A largura da banda foi devido à ligação intermolecular de hidrogênio. Picos entre 2600-2800 cnr¹ apareceram por causa das vibrações de estiramento C-H. Os picos de amida I apareceram a 1650 cm’¹. As vibrações de estiramento C-O-C e C-0 da ligação éter também foram deslocadas para 1147 cm^-1 e 1053 cm’¹. O carregamento de açúcar não afetou os picos FTIR de hidrogéis provavelmente devido à concentração muito baixa de açúcares na matriz polimérica.

[0167]Avaliação de respostas pró-angiogênicas a biomateriais carregados com açúcar desoxi usando 0 ensaio de membrana corioalantoide (CAM).

[0168]Fibras eletrofiadas carregadas com D-desoxirribose e hidrogéis [0169]O ensaio CAM foi utilizado para investigar 0 potencial angiogênico dos materiais sintetizados. No caso de fibras carregadas com 2-desoxi-D-ribose, observou-se 0 crescimento de novos vasos sanguíneos extensos sob 0 material (ver a Figura 6A (b)). Isso confirma 0 potencial quimioatraente e angiogênico dos materiais carregados com 2-desoxi-D-ribose.

[0170]A 2-desoxi-D-ribose foi carregada nos hidrogéis de quitosana / PVA

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46/73 reticulados com trietil ortoformato por imersão em uma solução aquosa de açúcar Ddesoxi. Após secagem em um liofilizador, os hidrogéis foram enxertados nos ovos fertilizados no dia 8, e no dia 14 os ovos foram sacrificados. Observou-se que os arcabouços carregados com 2-desoxi-D-ribose promoveram angiogênese conforme julgado pela observação de vasos sanguíneos mais novos em comparação com o material de controle (Figura 6A).

[0171 ]Hidrogéis reticulados com quitosana / colágeno carregados com açúcar D e L (3 açúcares, 6 isômeros) [0172]Acredita-se geralmente que biomateriais que ajudam no rápido crescimento e infiltração de vasos sanguíneos apresentam melhor biocompatibilidade do que aqueles que exibem angiogênese retardada e inflamação contínua (Wolf e outros, Biomateriais. 2014). Consequentemente, esta é uma propriedade absolutamente essencial para os materiais de engenharia de tecidos, a fim de garantir a sobrevivência dos tecidos.

[0173]Os isômeros D e L de três açúcares desoxi (ribose, fucose e ramnose) foram carregados nos hidrogéis de quitosana / colágeno (1:1) covalentemente reticulados com trietil ortoformato gelificado poroso (4%). Os hidrogéis foram embebidos em uma solução aquosa de açúcares (1 mg / ml) e foram posteriormente liofilizados (secos por congelamento) para produzir membranas porosas. Quanto ao arcabouço eletrofiado, os hidrogéis foram enxertados nos ovos fertilizados no dia 8, e após o dia 14 os ovos foram sacrificados e o efeito dos açúcares na angiogênese foi investigado.

[0174]Como pode ser visto na Figura 7, todos os três isômeros L estimularam a angiogênese, mas para os isômeros D apenas o isômero D da desoxirribose era fortemente angiogênico, não houve resposta significativa ao isômero D da desoxifucose e apenas uma resposta marginal ao isômero D da desoxiramnose.

[0175]Avaliação das respostas de cicatrização de feridas ao hidrogel

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47/73 carregado com D-desoxirribose usando um modelo de ferida cutânea de rato.

[0176]A cicatrização de feridas em ratos foi acelerada pela aplicação de hidrogéis carregados com 2-desoxi-D-ribose. As feridas de espessura total foram criadas marcando-se uma área de 20 mm e, em seguida, as excisões foram realizadas sob anestesia com tesoura cirúrgica. Os respectivos materiais foram aplicados às feridas, suturados no local e inicialmente cobertos com bandagens adesivas de Mepore (Suécia) e, finalmente, com bandagens de algodão. Todos os ratos receberam os mesmos curativos que foram removidos 3 dias após o ferimento. Cada ferida foi fotografada digitalmente em momentos específicos e posteriormente quantificada usando o software Image J. Imagens macroscópicas representativas das feridas são mostradas na Figura 8. Hidrogéis de controle (estrutura reticulada de CS / colágeno) e hidrogéis carregados com 2-desoxi-D-ribose são mostrados nos dias 3, 9, 11, 14 e 17 pós-ferida.

[0177]No dia 3, os arcabouços carregados com 2-desoxi-D-ribose estavam muito acoplados aos tecidos circundantes em comparação com os outros materiais testados (Figura 8) e, quando estirados manualmente, mostravam boa resistência mecânica das feridas. No dia 9, as feridas tratadas com D-desoxirribose estavam em torno de 50% das áreas da ferida (Figura 9). Nos dias 11 e 14, houve uma diminuição adicional na área da ferida e, para aqueles tratados com D-desoxirribose no dia 17, a ferida foi completamente fechada em contraste com as feridas de controle e as tratadas apenas com hidrogéis.

[0178]Análise histológica e imuno-histoquímica dos tecidos excisados de ferida [0179]As amostras de todos os grupos foram colhidas no dia 17, e fixadas durante a noite em paraformaldeído. Após a desidratação, as amostras foram embebidas com parafina para fazer blocos que foram seccionados a 6 pm. As lâminas foram então coradas com H&E, tricromo de Goldner e com um kit de DAB peroxidase

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48/73 para a detecção de três antígenos (CD34 para células endoteliais progenitoras, CD80 para macrófagos M1 e CD163 para macrófagos M2). Finalmente, as lâminas foram cobertas com meio de montagem DPX e uma lamela de vidro antes da imagem com um microscópio de luz. Os grupos simulado (ferida sem qualquer tratamento), controle (as feridas tratadas com arcabouço de quitosana e colágeno) e D-desoxirribose (as feridas tratadas com arcabouço carregado com 2-desoxi-D-ribose) foram comparados com a pele normal de um rato não tratado.

[0180]Aos 17 dias, a cicatrização da ferida no grupo tratado com 2-desoxi-Dribose estava essencialmente completa e a estrutura do tecido explantado era semelhante à pele normal, como demonstrado pela coloração com hematoxilina e eosina (H&E) (Figura 10). As manchas de tricromo de Goldner em colágeno azul / verde, enquanto músculos, epitélio, folículos capilares e vasos sanguíneos são corados em vermelho. Além da camada muscular corada sob a pele, como mostrado no grupo normal, o restante se parece muito com o grupo tratado com D-desoxirribose com um epitélio e folículos capilares já formados. Por outro lado, os grupos simulado e de controle ainda mostraram tecido de granulação desorganizada por 17 dias (Figura 10).

[0181]Os macrófagos que expressam marcadores de resposta M1 estão associados à rejeição do implante e à ativação de uma resposta inflamatória crônica, enquanto os marcadores de resposta M2 são expressos por macrófagos com uma resposta inflamatória associada ao remodelamento construtivo (Badylak e outros, Tissue Engineering Part A. 2008).

[0182]Como esperado, não houve coloração para macrófagos M1 ou M2 para o grupo normal não ferido (Figura 11). Alguns macrófagos M1 e M2 foram observados nos outros grupos, como seria de esperar após o ferimento ou após a implantação dos materiais nos animais. A tabela mostrada na Figura 12 mostra uma avaliação da extensão da presença de macrófagos realizada às cegas pela equipe de pesquisa no

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49/73 laboratório. A relação de presença de M2 para M1 foi de cerca de 1 para os animais feridos e os tratados com a quitosana não carregada. Para os grupos tratados com quitosana carregada com 2-desoxi-D-ribose, foi ligeiramente (não estatisticamente significativo) maior (Figura 11).

[0183]Capacidade das bactérias de metabolizar açúcares L e D-desoxi.

[0184]Os seis açúcares sob investigação foram comparados à glicose no que diz respeito a atuar como substratos para o metabolismo bacteriano. Quatro cepas de S. aureus foram investigadas e uma cepa de Pseudomonas aeruginosa como representantes de patógenos comuns em infecções de feridas. Os resultados com todas as quatro cepas de S. aureus foram idênticos, pois todos poderíam usar glicose como um substrato para fermentação, mas nenhuma dessas cepas conseguiu usar os isômeros L ou D dos três açúcares desoxi sob investigação. P. aeruginosa foi, no entanto, capaz de fermentar todos os açúcares, exceto os isômeros L da desoxifucose e desoxiramnose.

[0185]A razão para investigar a capacidade desses açúcares de agirem como substratos para bactérias é que, se um biomaterial é preparado para ser usado em feridas de queimadura ou feridas crônicas, seria preferencial usar materiais que não poderíam ser facilmente metabolizados por bactérias.

Tabela 1 - A capacidade das bactérias de fermentar açúcares

Bactéria	Desoxi -L- ribose	Desoxi-Dribose	Desoxi -L- fucose	Desoxi-Dfucose	Desoxi-Lramnose	Desoxi- D- ramnose	Glicose
S. aureus
S2351	-	-	-	-	-	-	+
NCTC 65712 (Oxford)	-	-	-	-	-	-	+
Newman3	-	-	-	-	-	-	+
L-98794	-	-	-	-	-	-	+
P. aeruginosa	+	+	-	+	-	+	+

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50/73 ¹ Cepa clínica usada anteriormente no modelo de infecção.

² Cepa de referência usada para teste de sensibilidade a antibióticos.

Conclusão [0186]Este estudo demonstrou a capacidade pró-angiogênica da 2-desoxi-Dribose quando administrada em fibras de PCL eletrofiadas ou em hidrogéis à base de quitosana. Isto não foi compartilhado pelos isômeros D da desoxifucose ou desoxiramnose, embora os isômeros L dos três açúcares 2-desoxi testados fossem angiogênicos. A 2-desoxi-D-ribose não pode ser metabolizada por quatro cepas de Staphlococcus aureus, embora pudesse ser metabolizada por Pseudomonas aeruginosa. A adição de D-desoxirribose a um hidrogel de quitosana I colágeno acelerou a cicatrização de feridas e a restauração de folículos capilares em feridas de espessura total em ratos.

Seção Experimental 2

Ensaio CAM ex-ovo

Incubação de ovos [0187]Todos os experimentos CAM foram realizados de acordo com as diretrizes do Home Office, Reino Unido. A demonstração esquemática do ensaio CAM ex-ovo é apresentada na Figura 13. Os ovos de galinha fertilizados (Gallus domesticus) foram adquiridos a partir de Henry Stewart & Co. (MedEggs, Norwich, Reino Unido). Os ovos foram cuidadosamente limpos com solução de álcool metilado industrial (IMS) a 20%, usando toalhas de papel para remover sujeira e penas da casca. Os ovos foram então incubados a 37,5° C até o dia do desenvolvimento embrionário (EDD) 3, deitados horizontalmente em uma incubadora de ovos umidificada (RCOM King SURO, P&T Poultry, Powys, País de Gales).

Transferindo os embriões para placas de Petri [0188]No EDD3, a superfície superior dos ovos foi marcada com uma caneta hidrográfica. Os ovos foram mantidos na horizontal (com a superfície marcada no

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51/73 topo) e rachados na borda de um béquer de vidro de 1000 ml e mantidos próximos à superfície inferior das placas de Petri. Os embriões foram então transferidos delicadamente para placas de Petri estéreis e mantidos em uma incubadora umidificada (Binder, Tuttlingen, Alemanha) a 38° C.

Aplicação de substâncias em CAM [0189]Anéis de plástico (~ 6,5 mm de diâmetro) foram usados como reservatório de substâncias e um marcador para a área de implantação, foram colocados no CAM, e as substâncias foram aplicadas como volume de 20 pl no CAM duas vezes por dia para obter um volume total de 40 μΙ entre EDD7 e EDD11. As imagens dos anéis foram adquiridas usando um microscópio digital em EDD11 e, em seguida, aglutininade lens culinaris (LCA) a 20% (Vector Laboratories, Peterborough, Reino Unido) foi injetada na circulação para a marcação das células endoteliais intravasculares usando agulhas 30G sob um microscópio de dissecção (Wild Heerbrugg, Heerbrugg, Suíça). CAMs foram então removidos e fixados em solução de formaldeído a 3,7%. Os embriões foram sacrificados no final do EDD11. Amostras de CAM fixas foram então fotografadas sob um microscópio confocal (Zeiss LSM 510 Meta, Jena, Alemanha) para investigar o efeito de substâncias na estrutura microvascular dos CAMs.

Quantificação de angiogênese [0190]Os vasos sanguíneos foram quantificados por segmentação das imagens [C. Roma-Rodrigues, A. Heuer-Jungemann, A.R. Fernandes, A.G. Kanaras, P. V. Baptista, Peptide-coated gold nanoparticles for modulation of angiogenesis in vivo, IntJ Nanomedicine. 11 (2016) 2633 a 2639. doi:10.2147/IJN.S108661 ], de modo a incluir todos os vasos discerníveis e, em seguida, contar os pontos de ramificação e calcular o comprimento médio dos vasos [D. Ribatti, B. Nico, A. Vacca, M. Presta, The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay, Nat Protoc. 1 (2006) 85-91. doi:10.1038/nprot.2006.13, P. Brooks, A.P. Montgomery, D. Cheresh, Use of the 10Petição 870190088288, de 06/09/2019, pág. 56/111

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Day-Old Chick Embryo Model for Studying Angiogenesis, Integrin Protoc. 129 (1999) 257-269. doi:10.1385/1-59259-249-X:257] através de várias etapas de processamento de imagem. Primeiramente, a área interna do anel foi cortada, e os canais vermelho, verde e azul foram divididos usando o Adobe Photoshop CS6 (ADOBE Systems Inc., San Jose, Califórnia, EUA). O canal verde foi então importado para o ImageJ (Wayne Rasband, National Institutes of Health, EUA) para análises adicionais, incluindo filtragem de máscara sem nitidez, aprimorando o contraste local, remoção de ruído e segmentação. Finalmente, o número de pontos de ramificação foi quantificado usando o software de quantificação (AngioTool, National Cancer Institute, EUA) (Figura 14A) e os comprimentos médios dos vasos sanguíneos foram calculados usando histogramas de imagens binárias com relações conhecidas de pixel / mm no ImageJ (Wayne Rasband, National Institutes of Health, EUA).

[0191]A área vascular percentual (VA%) da microvasculatura de CAMs foi quantificada usando imagens confocais de amostras de CAM injetadas com lectina marcadas com rodamina, como mostrado na Figura 14B. Para isso, as imagens foram importadas para o ImageJ (Wayne Rasband, National Institutes of Health, EUA) e convertidas em imagens binárias após processos de filtragem e suavização antes da quantificação. VA% foi calculado usando a lista de histogramas de áreas em preto e branco na imagem.

[0192]Determinação da concentração ótima de E2 e 2dDR em CAM antes do carregamento dos arcabouços [0193]Todos os produtos químicos foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich, salvo indicação ao contrário. A solução estoque de VEGF165 recombinante foi diluída para concentrações de 2 ng / μΙ (VEGF-80ng). Ο E2 foi dissolvido em metanol e as soluções de trabalho foram preparadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), de modo a ser concentrações de (a) 100 ng / dia (E2-1 OOng), (b) 200 ng / dia (E2-200ng) e (b) 600 ng / dia (E2-600ng). As soluções de 2dDR foram preparadas

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53/73 dissolvendo em PBS, de modo que as concentrações finais fossem (a) 20 qg / dia (2dDR-20), (b) 200 qg / dia (2dDR-200) e (c) 1000 qg / dia (2dDR-1000). O malato de sunitinibe (Sunitinibe) foi dissolvido em DMSO e diluído com PBS com uma concentração final de 50 ng / μΙ. As soluções de trabalho de todas as substâncias foram preparadas imediatamente antes de EDD7. A eficiência angiogênica das diferentes concentrações de substâncias foi avaliada por aplicação direta das substâncias em CAM (2 doses / dia / embrião). A atividade angiogênica foi determinada quantificando o número de pontos de ramificação e calculando o comprimento médio dos vasos sanguíneos.

[0194]Comparação do potencial angiogênico de arcabouços liberadores de E2 e 2dDR em CAM [0195]Eletrofiação de arcabouços de PHBV carregados com E2 e 2dDR Preparação das soluções [0196]A solução de PHBV a 10% (em peso) carregada foi preparada antes da eletrofiação. 1 g de grânulos de PHBV (Goodfellow, Londres, Reino Unido) foi dissolvido em 1 g de metanol (Fisher Scientific, Massachusetts, EUA) e 8 g de DCM (Fisher Scientific, Massachusetts, EUA) em um exaustor. Quatro soluções de PHBV a 10% foram preparadas antes da adição de substâncias. Finalmente, 25 mg de E2, 50 mg de E2, 250 mg de 2dDR e 500 mg de 2dDR foram então adicionados a cada solução por 1 g de PHBV. As misturas foram agitadas magneticamente durante a noite.

Eletrofiação [0197]As soluções (~ 10 ml) foram carregadas em seringas de 10 ml, equipadas com pontas de seringa de 0,6 mm de diâmetro interno. As seringas foram então colocadas em uma bomba de seringa (GenieTMPIus, KentScientific, Connecticut, EUA). A folha de alumínio foi utilizada como coletor e colocada a uma distância de 17 cm a partir das pontas de agulha. A bomba foi ajustada para 40 μΙ /

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54/73 min e a tensão de 17 kV foi aplicada ao coletor e às pontas. A eletrofiação foi realizada em temperatura ambiente até que toda a solução polimérica fosse usada.

Microscopia eletrônica de varredura (SEM) [0198]A morfologia da superfície dos arcabouços liberadores de E2 e 2dDR foi observada sob SEM (Philips / FEI XL-20 SEM; Cambridge, Reino Unido). As amostras foram revestidas com ouro usando uma pulverização de ouro (Edwards S150B, Crawley, Inglaterra) antes da imagem. O diâmetro da fibra e o tamanho dos poros foram medidos usando ImageJ.

Liberação de E2 e 2dDR a partir dos arcabouços [0199]Os arcabouços foram cortados em pedaços para caberem em uma placa de 6 poços, pesados e submersos em 4 ml de PBS. As concentrações de E2 e 2dDR liberadas a partir de cada grupo (25 mg E2, 50 mg E2, 250 mg 2dDR, 500 mg 2dDR) foram medidas fluorometricamente usando um espectrofotômetro UV-VIS (Thermo Fischer Evolution 220, Massachusetts, EUA) a 238 nm para 2dDR e 220 nm para E2. Os valores de absorbância foram convertidos em concentrações usando uma curva padrão de concentrações conhecidas de E2 e 2dDR.

[0200]Implantação dos arcabouços liberadores de E2 e 2dDR em CAM [0201 ]Os arcabouços foram cortados em círculos de 5,5 mm de diâmetro usando uma máquina de corte a laser (Epilog Laser Cutter, Clevedon, Reino Unido) e esterilizados sob luz UV por 1 hora antes da implantação. Dois arcabouços circulares foram colocados no CAM em EDD8. As imagens dos arcabouços foram adquiridas usando um microscópio digital em EDD12 e EDD14. A microinjeção de lectina marcada com rodamina na circulação foi realizada, os CAMs foram removidos e fixados em solução de formaldeído a 3,7%. Os embriões foram então sacrificados no final de EDD14. A angiogênese foi quantificada pela contagem de todos os vasos sanguíneos que convergiram em direção ao enxerto.

[0202]Avaliação histológica dos arcabouços liberadores de E2 e 2dDR em

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CAM [0203]A coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) foi realizada em arcabouços impregnados de células, modificando um protocolo padrão [47], Resumidamente, amostras fixas foram embebidas em temperatura ideal de corte OCT e congeladas em nitrogênio líquido por 3 minutos. As seções foram cortadas com 810 pm de espessura usando um criostato (Leica Biosystems Nussloch, Alemanha) a 20° C. As seções foram então coradas com hematoxilina por 90 segundos e eosina por 5 minutos, respectivamente. Finalmente, as imagens de H&E foram adquiridas sob um microscópio de luz (Motic DM-B1, Xiamen, China). O número total de vasos sanguíneos adjacentes aos arcabouços foi quantificado através da contagem de vasos sanguíneos nas seções H&E [A. Minajeva, M. Kase, M. Saretok, A. AdamsonRaieste, S. Kase, K. Niinepuu, M Vardja, T. Asser, J. Jaal, Impact of Blood Vessel Quantity and Vascular Expression of CD133 and ICAM-1 on Survival of Glioblastoma Patients, Neurosci J. 2017 (2017) 8 páginas]. Resumidamente, todos os vasos sanguíneos discerníveis adjacentes aos arcabouços foram contados por dois pesquisadores independentes, usando dois microscópios independentes com ampliação de 10 χ a partir do total de seis fatias diferentes para cada grupo e seis diferentes áreas de interesse de cada fatia.

[0204]Comparação das propriedades mecânicas dos arcabouços liberadores de E2 e 2dDR [0205]As amostras de teste biomecânico foram preparadas cortando pedaços de 20 mm x 10 mm a partir dos arcabouços. Os grampos do dispositivo foram posicionados a 10 mm um do outro, e a largura e a espessura de cada arcabouço foram medidas. As amostras de teste foram fixadas com duas garras em um tensiômetro (BOSE Electroforce Test Instruments, Minnesota, EUA). Testes de tração foram realizados em cada amostra a uma taxa de 0,1 mm / s até que as amostras falhassem (n = 4). Os dados brutos desses testes foram usados para desenhar

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56/73 gráficos de tensão-deformação e carga-deslocamento. A resistência à tração final (UTS) foi calculada a partir das curvas de tensão (σ) e deformação (ε) de cada amostra, enquanto a rigidez foi calculada a partir da curva de carga (F) e deslocamento (AL).

[0206]Testes de molhabilidade de arcabouços eletrofiado de liberação de drogas também foram realizados usando um analisador de forma de gota (Krüss DSA100, Alemanha) sob condições ambientais de laboratório, a fim de ver o efeito de E2 e 2dDR na molhabilidade dos arcabouços. Em resumo, uma gotícula de 5 pl foi deixada cair na superfície do arcabouço, e os tempos de retenção da gotícula nos arcabouços antes da absorção completa foram calculados a partir de filmes gravados dos testes. O tempo de retenção para um mínimo de três gotas em três substratos diferentes foi medido para cada tipo de amostra.

Estatísticas [0207]As análises estatísticas foram realizadas usando o teste t de Student não pareado. Os valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos, e o grau de significância foi indicado com número de estrelas, **** P < 0,0001, *** P < 0,001, ** P < 0,01, * P < 0,05,^ns P > 0,05.

Resultados [0208]Avaliação da atividade angiogênica de E2 e 2dDR em CAM [0209]A quantificação das macroimagens de CAMs mostrou que os grupos E2-100ng, E2-200ng e E2-600ng aumentaram o número de pontos de ramificação 1,3 vezes, 1,5 vezes e 1,4 vezes respectivamente, e todas as concentrações aumentaram o comprimento médio do vaso 1,2 vezes em comparação com os controles durante 4 dias. Da mesma forma, 2dDR-20pg e 2dDR-200pg aumentaram o número de pontos de ramificação em 1,3 vezes e 1,4 vezes, respectivamente. Ambas as concentrações aumentaram o comprimento médio do vaso 1,2 vezes, enquanto não houve diferença significativa para o grupo 2dDR-1000pg em comparação com os arcabouços de

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57/73 controle. A quantificação dos pontos de ramificação e comprimentos médios dos vasos é dada nas Figuras 15A e 15B, respectivamente. As imagens macro de CAMs com as concentrações mais efetivas de E2 e 2dDR são mostradas na Figura 16.

[0210]A avaliação microvascular das amostras de CAM mostrou que o VA% foi aumentado de 55,3% ± 3% para 79,5% ± 5% e 71,7% ± 3% para os grupos E2 e 2dDR aplicados, respectivamente, em comparação com os controles ao longo de 4 dias (Figura 16). VEGF e Sunitinibe foram usados como controle positivo e negativo (Figura 16).

[0211 ]Efeito da inclusão de E2 e 2dDR na microestrutura dos arcabouços de PHBV [0212]lmagens SEM dos arcabouços de PHBV libertadores de E2 e 2dDR podem ser vistas na Figura 17. Os diâmetros das fibras foram significativamente aumentados pela adição de substâncias em todos os grupos de arcabouços de PHBV adicionados (25 mg E2 (0,83 ± 0,17 pm), 50 mg E2 (0,98 ± 0,35 pm), 250 mg 2dDR (0,89 ± 0,19 pm), 500 mg 2dDR (1,22 ± 0,28 pm)) quando comparados com o grupo de controle de PHBV (0,66 ± 0,16 pm), como mostrado no gráfico no canto inferior direito da Figura 17.

[0213]Liberação de E2 e 2dDR a partir de arcabouços de PHBV ao longo de 30 dias [0214]A taxa de liberação de E2 e 2dDR a partir dos arcabouços foi avaliada ao longo de 30 dias, como mostrado na Figura 18. Em 7 dias, a liberação de 2dDR a partir dos arcabouços foi de 81,3% e 86,5% do 2dDR presente na solução polimérica para arcabouços de 250 mg e 500 mg de 2dDR, respectivamente (Figura 18A). Em contraste, a liberação total de E2 a partir dos arcabouços dentro de 7 dias representou 1,3% e 1,6% do E2 inicial presente na solução polimérica para os arcabouços de 25 mg e 50 mg de E2, respectivamente (Figura 18B).

[0215]Comparação dos efeitos de E2 e 2dDR nas propriedades mecânicas

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58/73 dos arcabouços [0216]Como pode ser visto na Figura 19A, a adição de todas as substâncias aumentou significativamente o UTS dos arcabouços de PHBV quando comparado aos arcabouços de PHBV simples. O aumento mais significativo no UTS foi observado no grupo de 2dDR 250 mg. Da mesma forma, a rigidez dos arcabouços carregados com 2dDR e E2 foi significativamente maior em comparação com os arcabouços de PHBV não carregados. O carregamento de 250 mg de 2dDR aumentou a rigidez dos arcabouços de PHBV na maior extensão, conforme mostrado na Figura 19B. A molhabilidade dos arcabouços liberadores de fármacos foi investigada através de um tempo de retenção de gotículas que é calculado usando um analisador de forma de gota. O tempo de retenção da gotícula de água nos arcabouços liberadores de fármaco foi dado na Figura 19C. Isso mostrou que a adição de 2dDR tornou os arcabouços mais molháveis, enquanto a adição de E2 tornou os arcabouços menos molháveis.

[0217]Avaliação da atividade angiogênica dos arcabouços liberadores de E2 e 2dDR em CAM [0218]A avaliação dos arcabouços liberadores de E2 e 2dDR em CAM demonstrou que todos os grupos ao menos dobraram o número de vasos sanguíneos discerníveis crescendo em direção aos arcabouços em comparação com os arcabouços simples de PHBV, como pode ser visto na Figura 20. A contagem média de vasos para os arcabouços carregados com 25 mg de E2 e os arcabouços carregados com 50 mg de E2 foram de 49,5 (± 0,92) (**** P < 0,0001) e 37,9 (± 1,05) (**** P < 0,0001), respectivamente, enquanto foi de 48,6 (± 1,02) (**** P < 0,0001) e

37,1 (± 1,37) (**** P < 0,0001) para arcabouços carregados com 250 mg e 500 mg de 2dDR, respectivamente, quando comparados aos grupos de controle (contagem média de vasos: 23,1 (± 1,24)). Nenhuma das substâncias carregadas afetou a taxa de sobrevivência embrionária superior a 75% para cada grupo.

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59/73 [0219]Análise histológica dos arcabouços liberadores de E2 e 2dDR em CAM [0220]0 número médio de vasos sanguíneos adjacentes aos arcabouços aumentou significativamente em resposta a todas as concentrações tanto de arcabouços liberadores de E2 e 2dDR quando comparado aos grupos de controle e apenas de CAM (ver Figuras 21 e 22).

[0221]Todos os arcabouços, carregados com agentes pró-angiogênicos ou não carregados, apresentaram boa adesão ao CAM, e todas as membranas apresentaram infiltração celular similar. A Figura 21 mostra imagens representativas da histologia.

Conclusão [0222]A partir dos dados, pode-se concluir que tanto a aplicação direta de 2dDR e E2 quanto a liberação gradual desses fatores a partir de fibras de PHBV estimulou a angiogênese em um ensaio CAM ex-ovo. Esses dois pequenos fatores estáveis foram prontamente incorporados às fibras eletrofiadas, como aquelas que seriam usadas para construtos de engenharia de tecidos e têm grande potencial para serem usadas na funcionalização dos arcabouços de TE para promover a angiogênese In vivo.

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[0223]Certos aspectos e modalidades da invenção são descritos nos parágrafos seguintes.

[0224]Parágrafo 1. Açúcar D-desoxirribose e/ou estradiol para uso na promoção de cicatrização de feridas.

[0225]Parágrafo 2. O açúcar D-desoxirribose e/ou estradiol para uso de acordo com o parágrafo 1, em que a D-desoxirribose é 2-desoxirribose.

[0226]Parágrafo 3. Açúcar L-desoxi para uso na promoção de cicatrização de feridas.

[0227]Parágrafo 4. Açúcar L-desoxi para uso de acordo com o parágrafo 3, em que o açúcar L-desoxi é selecionado a partir de L-desoxirribose, L-desoxifucose e L-desoxiramnose.

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66/73 [0228]Parágrafo 5. O açúcar D-desoxirribose e/ou estradiol para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 2 ou o açúcar L-desoxi para uso de acordo com os parágrafos 3 ou 4, em que o açúcar é para administração tópica.

[0229]Parágrafo 6. O açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou açúcar L-desoxi para uso de acordo com qualquer parágrafo anterior, em que o açúcar é fornecido em um carreador.

[0230]Parágrafo 7. O açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou açúcar L-desoxi para uso de acordo com o parágrafo 6, em que o carreador é um material de matriz biocompatível.

[0231]Parágrafo 8^Q. O açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou açúcar L-desoxi para uso de acordo com o parágrafo 7, em que o material da matriz é um arcabouço eletrofiado.

[0232]Parágrafo 9. O açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou açúcar L-desoxi para uso de acordo com o parágrafo 8, em que o arcabouço eletrofiado é um arcabouço de policaprolactona.

[0233]Parágrafo 10. Açúcar D-desoxirribose, Estradiol ou açúcar L-desoxi para uso de acordo com a reivindicação 6, em que o carreador é um hidrogel.

[0234]Parágrafo 11.0 açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou açúcar L-desoxi para uso de acordo com o parágrafo 10, em que o hidrogel é um hidrogel reticulado.

[0235]Parágrafo 12. O açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou açúcar L-desoxi para uso de acordo com o parágrafo 10 ou 11, em que o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos.

[0236]Parágrafo 13. Açúcar D-desoxirribose, Estradiol ou açúcar L-desoxi para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 12, em que o hidrogel compreende quitosana e colágeno.

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67/73 [0237]Parágrafo 14. O açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou açúcar L-desoxi para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 13, em que o hidrogel compreende polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos.

[0238]Parágrafo 15. O açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou açúcar L-desoxi para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 14, em que o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.

[0239]Parágrafo 16. O açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou o açúcar Ldesoxi para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 6 a 15, em que o carreador compreende ainda um agente antimicrobiano.

[0240]Parágrafo 17. O açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou o açúcar Ldesoxi para uso de acordo com qualquer parágrafo anterior, em que a ferida é uma ferida crônica.

[0241]Parágrafo 18. O açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou açúcar L-desoxi para uso de acordo com qualquer parágrafo anterior, em que a ferida é uma ferida de espessura total.

[0242]Parágrafo 19. O açúcar D-desoxirribose, o Estradiol ou o açúcar Ldesoxi para uso de acordo com qualquer parágrafo anterior, em que a ferida é uma lesão por queimadura.

[0243]Parágrafo 20. Material de matriz biocompatível compreendendo açúcar D-desoxirribose e/ou estradiol.

[0244]Parágrafo 21. Material de matriz biocompatível compreendendo um açúcar L-desoxi.

[0245]Parágrafo 22. O material de matriz biocompatível de acordo com o parágrafo 20 ou o parágrafo 21, em que o material de matriz é um arcabouço eletrofiado.

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68/73 [0246]Parágrafo 23. O material de matriz biocompatível de acordo com o parágrafo 22, em que o arcabouço eletrofiado é um arcabouço de policaprolactona.

[0247]Parágrafo 24. Hidrogel compreendendo açúcar D-desoxirribose e/ou Estradiol.

[0248]Parágrafo 25. Hidrogel compreendendo um açúcar L-desoxi.

[0249]Parágrafo 26. O hidrogel de acordo com o parágrafo 24 ou parágrafo 25, em que o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos.

[0250]Parágrafo 27. O hidrogel de acordo com qualquer um dos parágrafos 24 a 26, em que o hidrogel compreende quitosana e colágeno.

[0251]Parágrafo 28. O hidrogel de acordo com qualquer um dos parágrafos 24 a 27, em que o hidrogel compreende polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos.

[0252]Parágrafo 29. O hidrogel de acordo com qualquer um dos parágrafos 24 a 28, em que o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.

[0253]Parágrafo 30. O material biocompatível de acordo com os parágrafos 20 a 23 para uso na promoção de cicatrização de feridas ou no tratamento de alopecia.

[0254]Parágrafo 31. O hidrogel de acordo com os parágrafos 24 a 29 para uso na promoção de cicatrização de feridas ou no tratamento de alopecia.

[0255]Parágrafo 32. O material biocompatível de acordo com os parágrafos 20 a 23 para uso em um método de aumentar ou induzir vascularização em um leito de ferida.

[0256]Parágrafo 33. O hidrogel de acordo com os parágrafos 24 a 29 para uso em um método para aumentar ou induzir angiogênese em um leito de ferida.

[0257]Parágrafo 34. Método para aumentar ou induzir a angiogênese em um leito da ferida, compreendendo administrar açúcar D-desoxirribose e/ou Estradiol à ferida.

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69/73 [0258]Parágrafo 35. Método para aumentar ou induzir a angiogênese em um leito da ferida, compreendendo administrar um açúcar L-desoxi à ferida.

[0259]Parágrafo 36. O método de acordo com o parágrafo 34 ou parágrafo 35, em que o dito açúcar e/ou o estradiol é administrado topicamente a um leito de ferida.

[0260]Parágrafo 37. Açúcar D-desoxirribose e/ou estradiol para uso no tratamento de alopecia.

[0261]Parágrafo 38. O açúcar D-desoxirribose para uso de acordo com o parágrafo 37, em que a D-desoxirribose é 2-desoxirribose.

[0262]Parágrafo 39. Açúcar L-desoxi para uso no tratamento de alopecia.

[0263]Parágrafo 40. Açúcar L-desoxi para uso de acordo com o parágrafo 39, em que o açúcar L-desoxi é selecionado a partir de L-desoxirribose, L-desoxifucose e L-desoxiramnose.

[0264]Parágrafo 41. O açúcar D-desoxirribose e/ou o Estradiol para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 37 a 38 ou o açúcar L-desoxi para uso de acordo com os parágrafos 39 a 40, em que o açúcar é para administração tópica.

[0265]Parágrafo 42. O açúcar D-desoxirribose e/ou o estradiol para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 37 a 38 ou 41 ou o açúcar L-desoxi de acordo com os parágrafos 39 a 41, em que o açúcar é fornecido em um carreador.

[0266]Parágrafo 43. O açúcar D-desoxirribose e/ou o estradiol ou açúcar Ldesoxi para uso de acordo com o parágrafo 42, em que o carreador é um material de matriz biocompatível.

[0267]Parágrafo 44. O açúcar D-desoxirribose, e/ou o estradiol ou o açúcar Ldesoxi, para uso de acordo com o parágrafo 43, em que o material de matriz é um arcabouço eletrofiado.

[0268]Parágrafo 45. O açúcar D-desoxirribose, e/ou o estradiol ou o açúcar Ldesoxi para uso de acordo com o parágrafo 44, em que o arcabouço eletrofiado é um arcabouço de policaprolactona.

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70/73 [0269]Parágrafo 46. O açúcar D-desoxirribose, e/ou o estradiol ou o açúcar Ldesoxi para uso de acordo com o parágrafo 43, em que o carreador é um hidrogel.

[0270]Parágrafo 47. O açúcar D-desoxirribose e/ou o estradiol ou o açúcar Ldesoxi para uso de acordo com o parágrafo 46, em que o hidrogel é um hidrogel reticulado.

[0271]Parágrafo 48. O açúcar D-desoxirribose e/ou o estradiol ou o açúcar Ldesoxi para uso de acordo com o parágrafo 46 ou parágrafo 47, em que o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos.

[0272]Parágrafo 49. O açúcar D-desoxirribose e/ou o estradiol ou o açúcar Ldesoxi para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 46 a 48, em que o hidrogel compreende quitosana e colágeno.

[0273]Parágrafo 50. O açúcar D-desoxirribose e/ou o estradiol ou o açúcar Ldesoxi para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 46 a 49, em que o hidrogel compreende polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos.

[0274]Parágrafo 51. O açúcar D-desoxirribose e/ou o estradiol ou o açúcar Ldesoxi para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 42 a 36, em que o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.

[0275]Parágrafo 52. O açúcar D-desoxirribose e/ou o estradiol ou o açúcar Ldesoxi para uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 42 a 51, em que o carreador compreende ainda um agente antimicrobiano.

[0276]Parágrafo 53. Um método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, o dito método compreendendo administrar uma composição compreendendo um açúcar D-desoxirribose e/ou estradiol.

[0277]Parágrafo 54. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com o parágrafo 53, em que o método inclui administrar uma

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71/73 composição compreendendo um açúcar D-desoxirribose e/ou estradiol a um folículo piloso isolado.

[0278]Parágrafo 55. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com o parágrafo 53 ou 54, em que a D-desoxirribose é 2desoxirribose.

[0279]Parágrafo 56. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, o dito método compreendendo administrar uma composição compreendendo um açúcar L-desoxi.

[0280]Parágrafo 57. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com o parágrafo 56, em que o método inclui administrar uma composição compreendendo um açúcar L-desoxi a um folículo piloso isolado.

[0281 ]Parágrafo 58. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com o parágrafo 46 ou o parágrafo 57, em que o açúcar L-desoxi é selecionado a partir de L-desoxirribose, L-desoxifucose, L-desoxiramnose.

[0282]Parágrafo 59. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com qualquer um dos parágrafos 53 a 58, em que o açúcar e/ou o estradiol são para administração tópica.

[0283]Parágrafo 60. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com qualquer um dos parágrafos 53 a 59, em que o açúcar ou o estradiol é fornecido em um carreador.

[0284]Parágrafo 61. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com o parágrafo 60, em que o carreador é um material de matriz biocompatíveL [0285]Parágrafo 62. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com o parágrafo 61, em que o material da matriz é um arcabouço eletrofiado.

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12Π3>

[0286]Parágrafo 63. O método não terapêutico para promover o recrescimento do cabelo de acordo com o parágrafo 62, em que o arcabouço eletrofiado é um arcabouço de policaprolactona.

[0287]Parágrafo 64. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com o parágrafo 63, em que o carreador é um hidrogel.

[0288]Parágrafo 65. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com o parágrafo 64, em que o hidrogel é um hidrogel reticulado.

[0289]Parágrafo 66. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com o parágrafo 64 ou o parágrafo 65, em que o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos.

[0290]Parágrafo 67. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com qualquer um dos parágrafos 64 a 65, em que o hidrogel compreende quitosana e colágeno.

[0291 ]Parágrafo 68. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com qualquer um dos parágrafos 64 a 67, em que o hidrogel compreende polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos.

[0292]Parágrafo 69. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com qualquer um dos parágrafos 64 a 68, em que o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.

[0293]Parágrafo 70. O método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo de acordo com qualquer um dos parágrafos 60 a 69, em que o carreador compreende ainda um agente antimicrobiano.

[0294]Parágrafo 71. Uma composição farmacêutica compreendendo um açúcar D-desoxirribose ou estradiol, ou um sal farmacêutico ou derivado do mesmo para uso na promoção da cicatrização de feridas ou no tratamento de alopecia.

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73/73 [0295]Parágrafo 72. Uma composição farmacêutica compreendendo um açúcar L-desoxi, ou um sal farmacêutico ou derivado do mesmo para uso na promoção de cicatrização de feridas ou para uso no tratamento de alopecia.

[0296]Parágrafo 73. A composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 71 ou parágrafo 72, em que a composição compreende ainda um agente antimicrobiano.

[0297]Parágrafo 74. A composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 71 a 73, em que a composição compreende um folículo piloso isolado.

[0298]Parágrafo 75. Um curativo para feridas compreendendo o material de matriz biocompatível de acordo com qualquer um dos parágrafos 20 a 23.

[0299]Parágrafo 76. Um curativo para feridas compreendendo o hidrogel de acordo com qualquer um dos parágrafos 24 a 29.

[0300]Parágrafo 77. Um curativo para feridas compreendendo a composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 71 a 74.

[0301]Parágrafo 78. Açúcar D-desoxirribose para uso substancialmente como aqui descrito com referência aos desenhos em anexo.

[0302]Parágrafo 79. Açúcar L-desoxi para uso substancialmente como aqui descrito com referência aos desenhos em anexo.

[0303]Parágrafo 80. Um hidrogel substancialmente como aqui descrito com referência aos desenhos em anexo.

[0304]Parágrafo 81. Um hidrogel substancialmente como aqui descrito com referência aos desenhos em anexo.

[0305]Parágrafo 82. Uma composição farmacêutica substancialmente como aqui descrito com referência aos desenhos em anexo.

Claims (73)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Açúcar D-desoxirribose para uso na promoção da cicatrização de feridas, CARACTERIZADO pelo fato de que o açúcar é fornecido em um carreador e em que o carreador é um material de matriz biocompatível ou um hidrogel.
2. 2. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a D-desoxirribose é 2-desoxirribose.
3. 3. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador é um carreador biodegradável.
4. 4. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de matriz é um arcabouço eletrofiado.
5. 5. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o arcabouço eletrofiado compreende ao menos um de ácido polilático (PLA), poliglicolídeo (PGA), ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA) ou poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV).
6. 6. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel é um hidrogel reticulado.
7. 7. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos.
8. 8. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende quitosana e colágeno.
9. 9. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com as reivindicações 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos.
10. 10. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com qualquer uma das

    Petição 870190088288, de 06/09/2019, pág. 79/111

    2/9 reivindicações 6 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.
11. 11. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador compreende adicionalmente um agente antimicrobiano.
12. 12. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a ferida é uma ferida crônica.
13. 13. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a ferida é uma ferida de espessura total.
14. 14. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a ferida é uma lesão por queimadura.
15. 15. Material de matriz biocompatível, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um açúcar D-desoxirribose.
16. 16. Material de matriz biocompatível, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de matriz é um arcabouço eletrofiado.
17. 17. Material de matriz biocompatível, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o arcabouço eletrofiado compreende ao menos um de ácido polilático (PLA), poliglicolídeo (PGA), ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA) ou poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV).
18. 18. Hidrogel, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um açúcar Ddesoxirribose.
19. 19. Hidrogel, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos.

    Petição 870190088288, de 06/09/2019, pág. 80/111

    3/9
20. 20. Hidrogel, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende quitosana e colágeno.
21. 21. Hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos.
22. 22. Hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende quitosana e polivinil álcool.
23. 23. Material biocompatível, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso na promoção de cicatrização de feridas ou no tratamento de alopecia.
24. 24. Hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso na promoção de cicatrização de feridas ou no tratamento de alopecia.
25. 25. Material biocompatível, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso em um método para aumentar ou induzir vascularização em um leito de ferida.
26. 26. Hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso em um método para aumentar ou induzir angiogênese em um leito de ferida.
27. 27. Açúcar D-desoxirribose para uso no tratamento de alopecia, CARACTERIZADO pelo fato de que o açúcar é fornecido em um carreador e em que o carreador é um material de matriz biocompatível ou um hidrogel.
28. 28. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a D-desoxirribose é 2-desoxirribose.
29. 29. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador é um carreador biodegradável.
30. 30. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com qualquer uma das

    Petição 870190088288, de 06/09/2019, pág. 81/111

    4/9 reivindicações 27 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de matriz é um arcabouço eletrofiado.
31. 31. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o arcabouço eletrofiado compreende ao menos um de ácido polilático (PLA), poliglicolídeo (PGA), ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA) ou poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV).
32. 32. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel é um hidrogel reticulado.
33. 33. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 27 ou reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos.
34. 34. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende quitosana e colágeno.
35. 35. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos.
36. 36. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.
37. 37. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador compreende adicionalmente um agente antimicrobiano.
38. 38. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar um açúcar Ddesoxirribose, em que o açúcar é fornecido em um carreador e em que o carreador é um material de matriz biocompatível ou um hidrogel.

    Petição 870190088288, de 06/09/2019, pág. 82/111

    5/9
39. 39. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a D-desoxirribose é 2-desoxirribose.
40. 40. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador é um carreador biodegradável.
41. 41. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de matriz é um arcabouço eletrofiado.
42. 42. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o arcabouço eletrofiado compreende ao menos um de ácido polilático (PLA), poliglicolídeo (PGA), ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA) ou poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV).
43. 43. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel é um hidrogel reticulado.
44. 44. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 38 ou reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos.
45. 45. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende quitosana e colágeno.
46. 46. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 44 ou 45, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer

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    6/9 combinação dos mesmos.
47. 47. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.
48. 48. Açúcar D-desoxirribose para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador compreende adicionalmente um agente antimicrobiano.
49. 49. Curativo para feridas, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o material de matriz biocompatível de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17.
50. 50. Curativo para feridas, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o hidrogel de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22.
51. 51. Estradiol para uso na promoção da cicatrização de feridas, CARACTERIZADO pelo fato de que o estradiol é fornecido em um carreador e em que o carreador é um material de matriz biocompatível ou um hidrogel.
52. 52. Estradiol para uso no tratamento de alopecia, CARACTERIZADO pelo fato de que o estradiol é fornecido em um carreador e em que o carreador é um material de matriz biocompatível ou um hidrogel.
53. 53. Estradiol para uso, de acordo com a reivindicação 51 ou 52, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador é um carreador biodegradável.
54. 54. Estradiol para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 53, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de matriz é um arcabouço eletrofiado.
55. 55. Estradiol para uso, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que o arcabouço eletrofiado compreende ao menos um de ácido polilático (PLA), poliglicolídeo (PGA), ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA) ou poli(3hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV).

    Petição 870190088288, de 06/09/2019, pág. 84/111

    7/9
56. 56. Estradiol para uso, de acordo com a reivindicação 51 ou 52, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel é um hidrogel reticulado.
57. 57. Estradiol para uso, de acordo com a reivindicação 51 ou reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos.
58. 58. Estradiol para uso, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende quitosana e colágeno.
59. 59. Estradiol para uso, de acordo com a reivindicação 57 ou 58, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos.
60. 60. Estradiol para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a

    59, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.
61. 61. Estradiol para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a

    60, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador compreende adicionalmente um agente antimicrobiano.
62. 62. Estradiol para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a

    61, CARACTERIZADO pelo fato de que a ferida é uma ferida crônica.
63. 63. Estradiol para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a

    62, CARACTERIZADO pelo fato de que a ferida é uma ferida de espessura total.
64. 64. Estradiol para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a

    63, CARACTERIZADO pelo fato de que a ferida é uma lesão por queimadura.
65. 65. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar estradiol, em que o estradiol é fornecido em um carreador e em que o carreador é um material de matriz biocompatível ou um hidrogel.

    Petição 870190088288, de 06/09/2019, pág. 85/111

    8/9
66. 66. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 65, CARACTERIZADO pelo fato de que o carreador é um carreador biodegradável.
67. 67. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 66, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de matriz é um arcabouço eletrofiado.
68. 68. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 67, CARACTERIZADO pelo fato de que o arcabouço eletrofiado compreende ao menos um de ácido polilático (PLA), poliglicolídeo (PGA), ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA) ou poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV).
69. 69. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com as reivindicações 65 a 66, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel é um hidrogel reticulado.
70. 70. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 65 ou reivindicação 69, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende ao menos um de quitosana, gelatina, alginato, agarose, metil celulose, hialuronano ou qualquer combinação dos mesmos.
71. 71. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 65 ou 66, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende quitosana e colágeno.
72. 72. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com a reivindicação 65 ou 66, CARACTERIZADO pelo fato de que o hidrogel compreende polivinil álcool, poliacrilato de sódio, polímeros de acrilato ou qualquer combinação dos mesmos.
73. 73. Método não terapêutico para promover o recrescimento de cabelo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 ou 66, CARACTERIZADO pelo fato

    Petição 870190088288, de 06/09/2019, pág. 86/111

    9/9 de que o hidrogel compreende quitosana e polivinil álcool.