JP2017164562A - 細胞外マトリックス材料から生理活性ゲルを製造する方法 - Google Patents

細胞外マトリックス材料から生理活性ゲルを製造する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】煩雑な調製及び精製工程を避けつつ、当初の材料の生理活性を保つゲルを生じる、ＥＣＭからの生理活性ゲルの製造が必要とされている。
【解決手段】本発明は、ＥＣＭ材料から生理活性ゲル、すなわち、生理活性を保ち、かつ前臨床及び臨床組織工学並びに組織再建への再生医療アプローチのための足場として働くことのできるゲルを製造する方法を対象とする。本製造方法は、アルカリ性環境で微粒子化されたＥＣＭ材料を消化し、中和して生理活性ゲルを得ることにより、ＥＣＭ材料からの生理活性ゲルを作製できるという新しい認識を利用している。
【選択図】 図１

Description

本発明は、細胞外マトリックス材料から生理活性ゲルを製造する方法及び患者の組織の復元のためのその使用に関する。
細胞外マトリックス材料（ECM: extracellular matrix material）から構成される生物学的足場は、下部尿路、食道、心筋及び筋腱組織を含む様々な組織の修復のために使用されており、これにより、瘢痕組織の形成が最小限、又は全く形成されない、組織特異的で有益な再形成が導かれることが多い。
前臨床及び臨床組織工学並びに組織再建への再生医療アプローチのために、ＥＣＭを足場として使用することは非常に有望であるが、生理活性を保っている生理活性ゲルをＥＣＭから製造するプロセスには、課題が残っている。
先行技術に記載されたＥＣＭから生理活性ゲルを製造する方法では、酵素の使用が必要であり、かつ過度の精製工程が必要であるため時間がかかる。これにより、ゲルの生理活性が低下することがあり、また上市に対する追加の規制障壁を生じさせることがある。
よって、煩雑な調製及び精製工程を避けつつ、当初の材料の生理活性を保つゲルを生じる、ＥＣＭからの生理活性ゲルの製造が必要とされている。
本発明は全体として、積極的に組織修復の助けとなるように、十分な生理活性を保つ、ＥＣＭから生理活性ゲルを製造する改善された方法に関する。本発明は、本ゲル発明の上市の承認又は認可のための更なる規制負担を招かない試薬を利用する。よって、本発明は、ＥＣＭから生理活性ゲルを製造する方法であって、（ａ）小腸粘膜下組織（SIS: small intestine submucosa）、膀胱粘膜下組織（UBS: urinary bladder submucosa）、膀胱マトリックス（UBM: urinary bladder matrix）（上皮基底膜を含む）、ブタ真皮（PD: porcine dermis）、及び肝臓基底膜（LBM: liver basement membrane）からなるが、これらに限定されない群の中の１つ又は複数からＥＣＭを用意することと、（ｂ）ＥＣＭを、約１μｍ〜約１０００μｍの範囲の粒子サイズに微粒子化することと、（ｃ）０．１〜１．０Ｍの範囲の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）中で、濃度が約０．５〜１１重量／体積（w/v）％の範囲の微粒子化された粉末を、約１時間〜約４８時間の範囲の時間、４℃で可溶化することと、（ｄ）工程（ｃ）で調製された可溶化されたＥＣＭを、０．１〜１Ｍの範囲の塩酸（ＨＣｌ）で、任意選択によりＮａＯＨに対して等モルの塩酸で中和して、ゲルを形成することと、（ｅ）任意選択により、工程（ｄ）で調製された、可溶化され中和されたＥＣＭを凍結することと、任意選択により（ｆ）工程（ｅ）で調製された凍結したＥＣＭを凍結乾燥することと、任意選択により（ｆ）凍結乾燥したゲルを水又は食塩水で戻すこととを含む、方法を示す。
上記のように生理活性ゲルを製造する方法により提供される利点は、生理活性に有害であるか、実施するには冗長であるか、又は時間がかかり、かつ規制負担（例えばFDA承認）を増大させる、過度の精製工程が避けられることである。
本発明の実施形態による、ＮａＯＨ中での様々な可溶化条件に従うゲルのＦＧＦ−２含有量（pg/mg）を示す図である。％ｗ／ｖで示されていない全てのゲルは、ＮａＯＨに対して７．０％ｗ／ｖのＵＢＭで行った。図１の全てのゲルは、ＮａＯＨに対して７．０％ｗ／ｖのＵＢＭで行った。 本発明の実施形態による、ＮａＯＨ中での様々な可溶化条件に従うゲルのＶＥＧＦ含有量（pg/mg）を示す図である。％ｗ／ｖで示されていない全てのゲルは、ＮａＯＨに対して７．０％ｗ／ｖのＵＢＭで行った。図１の全てのゲルは、ＮａＯＨに対して７．０％ｗ／ｖのＵＢＭで行った。
本発明は、ＥＣＭから生理活性ゲルを製造する方法を対象とする。すなわち、本発明による生理活性ゲルで処理されていない損傷組織と比較して、修復に必要な時間を減少させること、瘢痕組織の形成を減少させること、並びに損傷組織の損傷前の天然の構造及び機能への復元を改善することにより、積極的に組織修復の助けとなるように、十分な生理活性を保つゲルを製造する方法を対象とする。ゲルの発明及び本明細書に記載の作製方法は、前臨床及び臨床組織工学並びに組織再建への再生医療アプローチのための足場として働く。本発明によるＥＣＭゲル中の生理活性は、ゲルが由来した天然のＥＣＭ中の１つ又は複数の生理活性分子の生理活性の約０〜１００％、２５〜７５％、１０〜２５％、１０％未満、５％未満又は１％未満の範囲にある。以下で詳細に記載されるように、これらの製造方法は、塩基性（ｐＨ７を超える）環境で微粒子化されたＥＣＭを可溶化することで、ＥＣＭからの生理活性ゲルを作製できるという新しい認識を利用しているが、その塩基性環境を酸で中和すると生理活性ゲルが得られる。
本発明の方法によると、ＥＣＭは、粘膜下組織、真皮、上皮基底膜を含むがこれらに限定されない天然の哺乳動物組織の層、又は腱膜、筋膜、腱、靱帯、平滑筋及び骨格筋並びに治療部位特異的ＥＣＭなどの組織に由来し得る。天然の哺乳動物組織源は例えば、ブタ、ウシ、ヒツジ、同種、又は自家であってもよい。例えば、ＥＣＭは、米国特許第６，５７６，２６５号、米国特許第６，５７９，５３８号、米国特許第５，５７３，７８４号、米国特許第５，５５４，３８９号、米国特許第４，９５６，１７８号、及び米国特許第４，９０２，５０８号に記載されるＳＩＳ（小腸粘膜下組織）、ＵＢＳ（膀胱粘膜下組織）若しくはＵＢＭ（膀胱マトリックス）又は肝臓基底膜（LBM）であってもよく、上記特許文献のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の一実施形態において、ＥＣＭは哺乳動物組織に由来し、天然型の組織のものと同様の量で同様に配置されている細胞外マトリックス材料の生理活性成分を含む。
本発明の方法によると、上記組織源のいずれか１つに由来するＥＣＭは、微粒子化されている、すなわち、ＥＣＭ粒子のサイズは、約１μｍ〜約１０００μｍの範囲にある。一実施形態において、ＥＣＭを塩基性環境下に置く前に、ＥＣＭを微粒子化することにより、ＥＣＭが均質になる、すなわち、個々の動物からのＥＣＭよりも均一な組成物が得られ、これによりドナー間の変動性の影響が減少する。別の実施形態において、ＥＣＭを微粒子化することで、体積に対する表面積の比率が増大し、マトリックスの塩基性環境下での可溶化が容易になる。
微粒子のＥＣＭ製品、例えば、微粒子化されたＥＣＭは、典型的に、ただし限定せずに、最初はシート状で提供されるＥＣＭに対して、摩砕／粉砕又はサイズを小さくする他のプロセスを行うことにより製造される。結果として得られる微粒子は、任意の所望の密度の範囲、例えば約０．１ｇ／ｃｍ３〜１０ｇ／ｃｍ３、約０．１０．１ｇ／ｃｍ３〜１ｇ／ｃｍ３又は約１ｇ／ｃｍ３の範囲、及び粒子サイズの範囲、例えば約１ミクロン〜１０００ミクロン、約２００〜７００ミクロン、約３００〜６００ミクロン、又は約４００ミクロンの範囲にすることができる。
塩基性環境は、アルカリ性化合物の溶液により提供される。本発明に従って使用できるアルカリ性化合物は金属水酸化物であり、ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＲｂＯＨ、及びＣｓＯＨを含むが、これらに限定されない。本発明に従って使用できるアルカリ性化合物は弱塩基も含み、アンモニア（ＮＨ３）、ピリジン（Ｃ５Ｈ５Ｎ）、ヒドロキシルアミン（Ｈ２ＮＯＨ）、メチルアミン（ＮＨ２ＣＨ３）及びこれに類するものなどがあるが、これらに限定されない。アルカリ性化合物は通常、０．１モル〜１．０モルの範囲の濃度で使用されるが、０．１モルより低い濃度又は１．０モルより高い濃度も、本発明の実施形態で考慮される。
微粒子化されたＥＣＭのＮａＯＨに対する濃度（w/v）は、０．１％〜約２０％、特に０．５％〜１１％の範囲にあり、より具体的には、７％である。
微粒子化されたＥＣＭの４℃での可溶化工程（すなわち、消化）は、数分〜数時間（例えば、３０分〜４８時間）又は数日間（例えば、３〜７日間）、３０分〜１２時間、１２〜２４時間、２４〜３６時間、３６〜４８時間、又は２〜７日間の範囲の時間にわたってもよい。本発明の実施形態において、消化工程に必要な時間は、微粒子化された細胞外マトリックス材料のサイズ及び／又は可溶化に使用される金属水酸化物の濃度によって決定されると考えられる。例えば、ＮａＯＨなどのアルカリ性化合物の濃度が低い場合、長時間の培養、すなわち、長時間の可溶化が必要であってもよい。塩基性溶液中での可溶化工程の後、可溶化されたＥＣＭ（すなわち、ゲル状）を、モル濃度、例えば、可溶化されたＥＣＭがｐＨ６．８〜７．４に達するのに十分な容量の等モルの濃度の酸を使用して、中性ｐＨに中和する。ＥＣＭゲルの中和の助けとなる酸は、弱酸又は強酸から選択できる。中和工程のための酸の選択性は、中和中に酸が塩基性環境と反応する際に生成される塩に依存する。生じる塩は、生体適合性とすべきである。例えば、本発明の実施形態において、塩酸（ＨＣｌ）は、塩基ＮａＯＨにより形成された塩基性環境を中和するために使用されるが、これは、生じる塩（すなわち、ＮａＣｌ）が臨床上許容できるからである。
変性した生理活性成分のリフォールディングを促進するために、中和の後、任意選択により、ゲルは、様々な滞留時間、１〜４８時間、１２〜３６時間、又は３６〜４８時間に従うことができる。滞留時間は通常、ゲルを振とう若しくは撹拌して、又は振とう若しくは撹拌せずに、低温室（すなわち、約４℃の温度）で、又は室温で行われる。滞留時間は、ゲルの再構築を促進するために、４８時間〜数日間、例えば、３〜７日間を超えてもよい。
本発明の方法によると、一旦ゲルが中和されれば、中和されたゲルを粉末（中性ｐＨを有する）に容易に転換するために、任意選択により１つ又は複数の凍結乾燥サイクルの工程を行ってもよい。粉末は、水などの液体、又はゲルの中性ｐＨを維持する緩衝溶液と粉末を混合することにより、生理活性を変えずにゲルに戻すことができる。更に、ＥＣＭの生理活性は、凍結乾燥を通じて保存され得る。
本発明に従う一実施形態において、凍結乾燥され、可溶化されたＥＣＭは、水及び２本の３ｍＬシリンジを使用して、戻される。一方のシリンジは凍結乾燥したゲルを含有し、他方は水を含有し、これらを２本のシリンジの間のコネクタを通して混合する。混合を達成するため、混合物を、前後に数回注入する。２本のシリンジシステムを使用して、ＮａＯＨ中の様々な濃度のＥＣＭの取扱い性（すなわち、注入性、粘着性、粘度）を試験することができ、適用可能性を決定できる。全てのゲルの最終粘稠度は泡状であり、それぞれが、適用される表面に付着しながら、粘稠度も維持するが、これは、無重力条件、例えば、宇宙において望ましいことがある。したがって、ゲルの発明は、宇宙探査中の組織修復に使用できる。
一実施形態において、ゲルの粘度又は生理活性を増大するために、可溶化され、かつ中和されたＥＣＭゲルに対し、微粒子化されたＥＣＭが加えられる。例えば、サイズ範囲が約１ミクロン〜１０００ミクロン、約２００〜７００ミクロン、約３００〜６００ミクロン、約１００〜４００ミクロン、約２００ミクロン又は約４００ミクロンのＵＢＭ粉末を、上記方法により調製されたＵＢＭゲルに加えて、ゲルの粘度又は生理活性を向上する、すなわち、ゲルの取扱い性を良好にし、又はゲルがより高濃度の生理活性分子、例えば、ＦＧＦなどの成長因子、例えば、ＦＧＦ−２、ＣＴＧＦ、若しくはＶＥＧＦを生成できるようにする。ＥＣＭ粉末は、ゲルの中和前、中和中、又は中和後に加えることができる。
特定の実施形態において、生理活性ゲルを製造するために、４℃で可溶化された、１００ｍＭのＮａＯＨに対して７．０％のＵＢＭが使用される。滞留時間は使用しても使用しなくてもよい。粘度及び／又は生理活性を増大するために、ＵＢＭ粉末をゲルに加えてもよい。
例証
下記の例証では、例えば分離された膀胱粘膜下組織、小腸粘膜下組織、真皮のうちの１つ又は複数などの、ただしこれらに限定されない任意の数のＥＣＭ製品を使用できる。下記の例証では、膀胱から分離され、上皮基底膜を有するＥＣＭであるＵＢＭが、代表的なＥＣＭとして使用される。しかし、本明細書で開示される発明はＵＢＭに限定されず、任意の分離されたＥＣＭに適用可能である。
例証において、様々な濃度のＮａＯＨ（０．１〜１．０Ｍ）中に可溶化された、様々な濃度の微粒子化されたＵＢＭ（０．５〜１１％ｗ／ｖ）を使用して、ゲルを作製した。ＵＢＭを、様々な時間（１〜４８時間）、ＵＢＭ及びＮａＯＨのそれぞれの濃度で、４℃で可溶化した。ＵＢＭが可溶化後に再構築できるか試験するために、中和後、様々な滞留時間（１〜４８時間）も使用して、ゲルを作製した。
上記のように作製したＵＢＭゲルを、生理活性分子含有量について、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。この研究において、成長因子（例えば、FGF-2、CTGF、VEGF）の含有量を分析した。各ゲル構造の可溶化後のＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ含有量のデータを、図１及び図２に示す。より低濃度のゲル（１〜６％）は示さないが、同様の結果であった。図１及び図２に示すように、これらの研究において、ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ、特にＶＥＧＦレベルが増大した。
１つの研究において、様々な範囲のＮａＯＨに対して、７．０％ｗ／ｖのＵＢＭを使用して、２４時間、４℃で可溶化し、滞留時間を設けないことで、ゲル中のＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ含有量が著しく影響を受けることが見出された。ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ含有量は、標準ＥＬＩＳＡ法による値とした。

Claims (15)

  1. 細胞外マトリックス材料から生理活性ゲルを製造する方法であって、
    ａ）哺乳動物組織に由来し、天然型の前記組織で見出される量で配置されている、細胞外マトリックス材料の生理活性成分を含む、細胞外マトリックス材料を用意することと、
    ｂ）ａ）の前記細胞外マトリックス材料を微粒子化することと、
    ｃ）ｂ）の前記微粒子化された細胞外マトリックス材料を、アルカリ性溶液中で可溶化することと、
    ｄ）酸の添加により、工程ｃ）の前記溶液を中和することと
    を含む、方法。
  2. ｅ）工程ｄ）で調製された、前記可溶化され中和された細胞外マトリックス材料を凍結することと、
    ｆ）工程ｅ）で調製された、前記凍結した材料を凍結乾燥することと
    を更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記凍結乾燥したゲルを水溶液中で戻すことを更に含む、請求項２に記載の方法。
  4. 工程ｄ）の後、４℃で最大４８時間の滞留時間を更に含む、請求項１に記載の方法。
  5. 工程ｃ）の時間が、３０分〜４８時間、及び３〜７日間からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記細胞外マトリックス材料が、小腸粘膜下組織、膀胱粘膜下組織、上皮基底膜を含む膀胱マトリックス、及び肝臓基底膜からなる群に由来する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記微粒子化された細胞外マトリックス材料の粒子範囲サイズが、１μｍ〜約１０００μｍである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記細胞外マトリックス材料が、モル濃度範囲約０．１Ｍ〜約１．０ＭのＮａＯＨ中に、微粒子化された細胞外マトリックス材料の濃度約０．５％〜１１％ｗ／ｖで可溶化される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記可溶化された細胞外マトリックス材料が、塩酸中で中和される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記塩酸が、０．１Ｍ〜１．０Ｍの濃度を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記生理活性成分が、ＦＧＦ−２、ＣＴＧＦ及びＶＥＧＦからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記細胞外マトリックスが２時間を超えて可溶化される際、前記可溶化された細胞外マトリックス材料中の前記ＦＧＦ−２の濃度が、前記細胞外マトリックス材料が１．０ＭのＮａＯＨ中に可溶化される場合、１００ｍＭのＮａＯＨ中に可溶化される場合よりも高い、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記細胞外マトリックス材料が２時間を超えて可溶化される際、前記可溶化された細胞外マトリックス材料中の前記ＶＥＧＦの濃度が、前記細胞外マトリックス材料が１．０ＭのＮａＯＨ中に可溶化される場合、１００ｍＭのＮａＯＨ中に可溶化される場合よりも高い、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記微粒子化された細胞外マトリックス材料がＵＢＭを含み、前記ＵＢＭが、１００ｍＭのＮａＯＨ中に、微粒子化されたＵＢＭの濃度７％で、４℃で２４時間可溶化される、請求項１に記載の方法。
  15. 工程（ｂ）の前記微粒子化された材料が、２００〜７００ミクロンの範囲にある、請求項１に記載の方法。
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