CN111150836B - 一种负载生长因子的多孔微球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种负载生长因子的多孔微球及其制备方法和应用，属于复合生物材料技术领域，其特征为：所用微球为高分子基多孔微球，具有很好的亲水及吸水性能，直径为10～1000μm，微球表面具有直径为0.5～5μm，深度100～500nm的浅坑，浅坑内壁及微球内部又具有相互连通的孔径为0.05～1.5μm的微孔道。在微球浅坑内及微孔道中充满吸附的生长因子颗粒。其制备方法为将生长因子配成浓度为10～500μg/mL的水溶液,将微球浸入生长因子溶液充分溶胀，然后将吸收溶胀吸收了生长因子溶液的微球冻干。本发明所构建的负载生长因子的多孔微球，利用微球独特的形貌及毛细微孔道，将生长因子负载于其中，生物相容性好，其具有非常优异的缓释功能，能够有效的促进皮肤伤口愈合。

Description

一种负载生长因子的多孔微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及复合生物材料技术领域，具体是指一种负载生长因子的高分子多孔微球及其制备方法与应用。
背景技术
难愈合的伤口也经常带给患者很大痛苦甚至造成死亡，伤口的快速止血和愈合能够极大程度地减少患者痛苦。
生长因子是生物体内对细胞的生长、增殖、分化及其他细胞功能具有广泛调控作用的活性蛋白或多肽类物质。生长因子对于伤口愈合具有很好的促进作用。但是由于其稳定性差、活性期短、价格昂贵等问题限制了其应用效果，而且大部分生长因子以溶液形式使用，在创面局部使用时停留时间短，大大降低了其使用效率。
本发明人团队前期工作所研发的多孔微球材料PHM具有独特的多孔结构，在止血方面也具有很好的效果，参见中国专利公开号：CN109517225A，但是该材料缺少促进伤口的愈合方面的功能。
伤口的止血和愈合是创伤发生后的两个重要过程，不可控的出血是许多创伤致死的主要原因，难愈合的伤口也经常带给患者很大痛苦甚至造成死亡，伤口的快速止血和愈合能够极大程度地减少患者痛苦。
生长因子调控急性创面愈合的关键在于促进肉芽组织的形成，加速创面再上皮化进程。角质细胞生长因子2(keratinocyte growth factor-2,KGF-2)，又称为成纤维细胞生长因子-10(FGF-10)，是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的一员，KGF-2具有促进角质细胞生长、增殖和分化的生物学功能，在维持正常组织结构和组织损伤修复中发挥重要作用。
尽管KGF-2在促进皮肤伤口愈合方面具有很好的效果，但其稳定性差、半衰期短等问题限制了其应用效果，而且大部分KGF-2以溶液形式使用，在创面局部使用时停留时间短，大大降低了其使用效率。
另外对于传统的其他生长因子，如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)和血小板源性生长因子(PDGF)等，也普遍存在稳定性差、半衰期短的问题。
发明内容
为解决现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种能够延长生长因子停留作用时间、维持创面处的生长因子浓度、提升药效，从而延长生长因子作用效果的一种负载生长因子的多孔微球。
本发明进一步提供一种负载角质细胞生长因子2的多孔微球，该产品能够同时具备止血和促进皮肤伤口愈合效果，且药效稳定性好、半衰期好、具有陨石形貌。
本发明的第二个目的是提供一种该负载角质细胞生长因子2的多孔微球的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种负载角质细胞生长因子2的多孔微球在用于制备皮肤切口型创面治疗药物的应用。
为实现本发明的第一个目的，其技术方案是提供一种负载生长因子的多孔微球的制备方法，包括有以下步骤：
(1)制备多孔微球，其步骤是：将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠配置成混合水溶液，通过微量注射泵加入含有司盘80的液体石蜡中，搅拌乳化，得到均匀乳液，然后通过微量注射泵将CaCl2水溶液缓慢加入到上述乳液中，交联反应，最后将反应完的乳液分别用正己烷、无水乙醇和超纯水依次各洗至少1次，抽滤并冻干，得到多孔微球，多孔微球直径为10～1000μm，微球表面具有直径为0.5～5μm、深度100～500nm的浅坑，该浅坑分布在多孔微球球面上整体呈陨石坑状，浅坑内壁及多孔微球内部又具有相互连通的孔径为0.05～1.5μm的微孔道，多孔微球的吸水倍率为200％～3000％；
(2)负载生长因子，其步骤是：将多孔微球装入生长因子水溶液中进行震荡培养，使得多孔微球充分吸收细胞生长因子水溶液，然后在进行冷冻干燥，得到负载生长因子的多孔微球。
进一步设置是所用的生长因子包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、类胰岛素生长因子、神经生长因子、血小板源性生长因子。
进一步设置是所述的步骤(2)具体为：
用超纯水将生长因子配成浓度为10～500μg/mL的水溶液，在4℃下，将1g微球倒入10mL生长因子水溶液中，振荡培养1～4h，使微球充分吸收生长因子溶液而溶胀，之后将吸收了生长因子溶液的微球在-80℃下冷冻2h，然后放到冻干机中冻干。
进一步设置是所述的步骤(2)具体为：
(2)负载角质细胞生长因子2，其步骤是：将多孔微球装入角质细胞生长因子2水溶液中进行震荡培养，使得多孔微球充分吸收角质细胞生长因子2水溶液，然后在进行冷冻干燥，得到负载角质细胞生长因子2的多孔微球。
进一步设置是所述步骤(1)中羧甲基壳聚糖、海藻酸钠与CaCl2水溶液中所含CaCl2的质量比为：1.5:1:2。
进一步设置是所述的步骤(1)为：将1.5g羧甲基壳聚糖和1g海藻酸钠溶于100mL超纯水，得到混合溶液，取30mL多糖混合溶液，通过微量注射泵缓慢的加入到90g含有0.4wt％司盘80的液体石蜡中，在30℃的水浴中600rpm的转速下机械搅拌乳化1h，得到均匀乳液，随后，将转速调到300rpm，通过微量注射泵将10mL质量体积浓度为20％的CaCl2水溶液缓慢加入到上述乳液中，交联反应4h，最后将反应完的乳液分别用正己烷、无水乙醇和超纯水各洗3次，抽滤并冻干。
进一步设置是所述步骤(2)为：在4℃下，将1mg角质细胞生长因子2溶到10mL超纯水中得到10mL浓度为100μg/mL的角质细胞生长因子2水溶液，取所述多孔微球1g，在4℃条件下倒入10mL浓度为100μg/mL的角质细胞生长因子2水溶液中，震荡培养60min使微球充分吸收角质细胞生长因子2水溶液，将所得微球液放到-80℃冰箱中冷冻2h，然后放到冻干机中干燥。
本发明的第二个目的是提供一种如所述的制备方法所制备的负载生长因子的多孔微球，所述多孔微球的浅坑内及微孔道中充满了吸附的生长因子颗粒或纤维。
此外，本发明还提供一种所述的负载生长因子的多孔微球在用于制备皮肤切口型创面治疗药物的应用，该生长因子为角质细胞生长因子2。
进一步设置是该药物的形态为敷料形态。
有益效果
本发明所构建的负载角质细胞生长因子2(KGF-2)的多孔微球(PHM)是一种具有独特形貌的(球面凹坑结合毛细孔道)的生物材料(KGF-2-PHM)；利用该毛细孔道的作用将角质细胞生长因子2负载于其上，其具有非常优异的缓释效果，负载角质细胞生长因子2的多孔微球同时具有止血和促进伤口的愈合方面的功能，研究发现比单纯的多孔微球(PHM)，负载角质细胞生长因子2的多孔微球组大鼠具有更高的创面愈合率，甚至高于单纯角质细胞生长因子2组的愈合率，证明本申请的负载角质细胞生长因子2的多孔微球具有较好的促愈合功能。角质细胞生长因子2(KGF-2)有效的抗炎作用改善了多孔微球(PHM)带来的炎症反应，二者之间相互配合形成协同效应，加快创面愈合速度，同时多孔微球(PHM)也通过其缓释作用提升了角质细胞生长因子2(KGF-2)的生物利用度。
上述具体效果详细参见实施例实验数据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1本发明实施例工艺流程图；
图2角质成纤维细胞生长因子-2(KGF-2)、多孔微球(PHM)与负载角质细胞生长因子2(KGF-2)的多孔微球KGF-2-PHM红外光谱对比图；
图3角质成纤维细胞生长因子-2(KGF-2)(a,b)、多孔微球(PHM)(c,d)与负载角质细胞生长因子2的多孔微球(KGF-2-PHM)(e,f)的SEM图像对比图
图4多孔微球内部低分辨率SEM图像(a)和高分辨SEM图像(b)和负载角质细胞生长因子2的多孔微球(KGF-2-PHM)内部低分辨率SEM(c)和高分辨率(SEM)；
图5负载角质细胞生长因子2的多孔微球(KGF-2-PHM)的体外缓释曲线；
图6体外生物相容性评价图：(a)与样品浸提液接触培养24h后的3T3细胞生存率对比，(b)样品溶血率对比；
图7SD大鼠全层切割模型皮肤创面愈合率及组织构建图。A，SD大鼠全层切割模型创面拍照图(标尺每小格0.2cm)；B：烫伤皮肤创面愈合率。与对照组相比*：P<0.05；**；P<0.01；***：P<0.001(7d：n＝10；21d：n＝7)；C，HE染色(40x)；图D，Masson染色(40x)；
图8IL-6，Collagen3，α-SMA，PCNA免疫组化结果图，(a)：IL-6，Collagen3，α-SMA，PCNA免疫组化(400x)；(b)：IL-6 7d表达统计分析图(n＝3)；(c)：IL-6 21d表达统计分析图(n＝3)；(d)：PCNA 21d表达统计分析图(n＝7)；(e)：α-SMA 21d表达统计分析图(n＝7)；(f)：Collagen3 21d表达统计分析图(n＝7)。与Control组相比，*：P<0.05；***：P<0.001，相互对比，#：P<0.05；###：P<0.001。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例
材料
羧甲基壳聚糖(CMC,Mn＝150-200kDa，羧化度≥80％)购买于上海源叶生物科技有限公司，海藻酸钠、司盘80、Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)、磷酸盐缓冲液(PBS)和MTT试剂(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。氯化钙(纯度99.9％)购买于上海麦克林生化科技有限公司，液体石蜡、正己烷、无水乙醇来自于温州市鹿城金山化学试剂仪器公司。胶原III型N-末端抗体，1：250；白细胞介素-6(IL-6)抗体，1：100；alpha平滑肌肌动蛋白(α-SMA)特异性抗体，1：250；增殖细胞核抗原(PCNA)，1：250；均购自Proteintech Biotech Co.，Ltd。角质细胞生长因子2(KGF-2)由温州医科大学药学院提供。超纯水由Milli-Q系统(美国密理博公司)提供。本申请中使用的化学试剂为分析纯。所有化合物无需进一步纯化即可使用。40只清洁级SD大鼠购自温州医科大学动物实验中心。所有动物在中国科学院大学温州研究院动物房适应性地喂养饮用水和固体颗粒。室温保持在约23℃，相对湿度为60％，日夜交替时间表为12小时。所有动物实验均经温州医科大学动物伦理委员会(温州，中国)批准，并按照温州医科大学动物实验指南进行。确保对所有研究动物的人道待遇。所有合格的动物随机编号并分成4组，每组10只。
所制备的材料多孔微球(PHM),负载角质细胞生长因子2的多孔微球(KGF-2-PHM)。
以下实施例和实验例中为了便于行文简练，部分化学试剂或材料采用上述括号内的英文简写等同替换。
本实施例包括以下步骤：
(1)多孔微球(PHM)的制备
首先，将1.5g羧甲基壳聚糖和1g海藻酸钠溶于100mL超纯水，得到混合溶液。取30mL混合溶液，通过微量注射泵缓慢的加入到90g含有0.4wt％司盘80的液体石蜡中，在30℃的水浴中600rpm的转速下机械搅拌乳化1h，得到均匀乳液。随后，将转速调到300rpm，通过注射泵将10mL浓度(w/v)为20％的CaCl2水溶液缓慢加入到上述乳液中，交联反应4h。最后将反应完的乳液分别用正己烷、无水乙醇和超纯水各洗3次，抽滤并冻干，得到多孔微球(PHM)。
(2)负载角质细胞生长因子2的多孔微球(KGF-2-PHM)的制备
在4℃下，将1mg负载角质细胞生长因子2溶到10mL超纯水中得到10mL浓度为100μg/mL的负载角质细胞生长因子2水溶液，将多孔微球(PHM)取1g，在4℃条件下倒入10mL浓度为100μg/mL的角质细胞生长因子2水溶液中(装在50mL离心管中)，震荡培养60min使微球充分吸收角质细胞生长因子2水溶液。将吸水后的微球液放到-80℃冰箱中冷冻2h，然后放到冻干机中干燥，得到负载角质细胞生长因子2的多孔微球(KGF-2-PHM)。
本发明的该负载角质细胞生长因子2的多孔微球(KGF-2-PHM)药物的形态优选敷料形态，便于敷于皮肤创面使用。
采用本实施例中所述多孔微球，同样可以负载所用的生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)和血小板源性生长因子(PDGF)。
实验例
为了充分验证本申请所制备的负载角质细胞生长因子2的多孔微球(KGF-2-PHM)的形貌特征、化学结构、缓释性能、以及在止血和促进伤口的愈合方面的功能，发明人进行实验测试，具体如下：
1.形貌及化学结构测试
通过场发射扫描电子显微镜(SEM)(Hitachi SU8010，Japan)对负载角质细胞生长因子2的多孔微球(KGF-2-PHM)的表面形貌进行表征，所有样品在拍电镜之前在10mA下镀金60s，所得SEM图像用Nano Measurer软件进行辅助分析。将微球均匀的包埋在固化的环氧树脂样条中，然后折断样条得到微球的截断面，然后用SEM观察微球的内部结构。
通过傅里叶变化红外光谱仪(FTIR)(Bruker Tensor II，Germany)对样品进行化学结构表征，采用衰减全反射附件(ATR)测试PHM的红外吸收光谱。
样品的表面电位通过马尔文纳米粒度仪(Zetasizer Nano ZS，UK)测定。
负载生长因子止血微球的制备工艺流程如图1所示。以CMC和海藻酸钠为原料，通过乳化交联的方法，根据之前的工艺条件，制备了具有坑-孔结构的PHM止血微球；然后将干燥的PHM微球浸渍在一定浓度的KGF-2的低温缓冲溶液里并孵育1h，由于PHM微球具有丰富的孔结构，在孵育过程中能够充分吸收KGF-2缓冲液；最后将吸收了KGF-2缓冲液的湿微球冻干，得到载有KGF-2的KGF-2-PHM。负载了微量KGF-2的微球KGF-2-PHM的尺寸并无变化，其平均直径与PHM相同也是40μm左右(表1)。KGF-2-PHM表面也带负电荷，其表面电位是-16.8mV左右，而PHM和KGF-2的表面电位是分别是-13.1mV和-3.4mV左右，说明负载的KGF-2增强了PHM表面的负电势。
表1样品及其基本性能
Figure BDA0002356759580000081
图2显示了PHM、KGF-2和KGF-2-PHM的红外光谱图，KGF-2是一种蛋白，含有丰富的-OH、-NH2和-COOH，因此在1587cm-1波长处以及3100cm-1～3400cm-1范围内有明显的吸收峰。PHM也含有大量-OH和-COOH，在1587cm-1和3342cm-1波长处同样具有较强的吸收峰。对比谱图可以发现，相比PHM，KGF-2-PHM在1587cm-1和3342cm-1两处的吸收峰明显增强，这是PHM表面吸附KGF-2的结果。红外谱图表明，我们所制备的KGF-2-PHM上已经成功负载了KGF-2。
图3(a,b)显示了KGF-2冻干粉的微观形态，可以明显看出KGF-2是微小的无规则片状颗粒，没有特殊的形貌结构。图3(c,d)和图3(e,f)分别为空白多孔止血微球(PHM)和负载了KGF-2的多孔止血微球(KGF-2-PHM)的微观形貌，它们都是粒径数十微米的微球，表面具有许多凹坑结构。但通过对比可以明显看出，PHM表面比较整洁，只有凹坑，而KGF-2-PHM表面并没有那么整洁，凹坑中吸附了许多片状颗粒物(如图3f中箭头所标示)，并且坑中孔道也被蛋白颗粒填充堵塞(图3f中虚线圆圈中所示)，这些吸附的颗粒物即为KGF-2，图3f中红色矩形线框中所示为KGF-2-PHM表面的局部放大图，可以清楚看到表面吸附的KGF颗粒。
图4显示了PHM微球和KGF-2-PHM的内部形貌，可以发现PHM内部具有很多空道，而负载了KGF-2的PHM内部孔道明显减少很多，说明KGF-2已经完全进入PHM内部孔道，孔道中充满了KGF-2。因此载生长因子止血微球KGF-2-PHM的表面和内部都含有KGF-2。SEM图像也证明我们制备的KGF-2-PHM上已经成功负载了KGF-2。
2.KGF-2-PHM的体外缓释测试
为了评估负载角质细胞生长因子2的多孔微球(KGF-2-PHM)的控释动力学，使用实施例1中所制备的负载角质细胞生长因子2的多孔微球，取1g，将其置于5mLEP管中，加入3ml的PBS缓冲液，置于37℃培养箱中。在0.5,1,2,3,4,5,6,7和8小时后分析PBS中所释放的角质细胞生长因子2(KGF-2)。并且用BCA蛋白质测定试剂盒(TransGen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China)对释放的角质细胞生长因子2(KGF-2)总蛋白进行定量检测。
图5展示了KGF-2-PHM体外缓释KGF-2的情况，可以明显看出，KGF-2的体外缓释有两个阶段，初始的0～3小时为第一阶段，表现出快速释放行为，KGF-2浓度快速升高；3小时以后则释放较慢，KGF-2浓度逐渐维持恒定。这种释放行为能够提升KGF-2的利用效率，在创面使用时，KGF-2溶液容易在短时间内溶液溢出伤口，而KGF-2-PHM则能够在有效时间内通过缓释维持KGF-2浓度，避免大量KGF-2溢出伤口，从而提高其使用效果。
3.细胞毒性测试
首先将样品(空白(即无负载)多孔微球(PHM)，负载角质细胞生长因子2的多孔微球(KGF-2-PHM)在无菌条件下用紫外灭菌30min(置于冰上),然后称量1g灭过菌的样品浸在10mL配制好的低糖DMEM培养介质中，4℃培养24h。最后用0.22μm滤膜过滤，将过滤得到的样品浸提液浓度稀释到50％做MTT测试。
将NIH-3T3细胞用0.25％的胰蛋白酶分离，加入96孔培养板中(每孔8×103个细胞)，37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱内培养，培养12h。撤去原有培养基，加入100μL饥饿培养基，饥饿。饥饿24h后，弃去旧饥饿培养基，加入100μL含药物饥饿培养基(分别为饥饿培养基，空白PHM提取液，含50μg/mLKGF-2饥饿培养基，KGF-2-PHM提取液)到96孔板中培养。每组样品加6个复孔，分别在24h之后弃去培养基，然后分别在每个孔中加入20μL MTT原液(5mg/mL，PBS，pH7.4)，培养4h，吸去培养基，并在每个孔中加入150μL DMSO，并将培养板振荡10min。最后用酶标仪测试样品在492nm的吸光度，并以DMSO空白样做对照组，细胞相对生存率通过以下公式计算：
Figure BDA0002356759580000101
4.溶血性测试
以无菌、无热源生理盐水为浸提介质，取10mg样品和4.5mL浸提介质加入到5mL离心管里，放在37℃恒温摇床中振荡浸渍24h，然后离心得到浸提液备用。然后取1mL样品浸提液，装在2mL的离心管中，放在37℃恒温水浴箱中预热30min，然后向离心管中加入200μL稀释血液，继续放置在37℃恒温水浴箱中培育60min。最后将离心管在3000rpm转速下离心10min，取上清液，用紫外分光光度计(Varioskan LUX,ThermoFisher)测定545nm波长的吸光度，分别以去离子水和生理盐水作为阳性对照组合阴性对照组。最后根据吸光度计算出溶血率，溶血率计算公式为：
Figure BDA0002356759580000102
其中，[A]s,[A]n,[A]p分别为样品组，阴性对照组合阳性对照组的吸光度。
本实验中，我们用细胞毒性和溶血性来研究KGF-2-PHM的生物相容性。在这里通过MTT试验来测试样品对于细胞生存率的影响。图6(a)显示了分别用PHM、KGF-2和KGF-2-PHM处理后3T3细胞的生存率，其中PHM组细胞生存率为95％，与对照组相比并没有太大的差异，而KGF-2和KGF-2-PHM组的细胞生存率分别为243％和185％，都明显大于对照组和PHM组。细胞毒性结果表明PHM、KGF-2和KGF-2-PHM都无细胞毒性(细胞生存率>70％表示无细胞毒性)，并且KGF-2和KGF-2-PHM都显示出促进细胞生长的效果。溶血率是测试材料血液安全性的一个简单常用的方法。图6(b)显示PHM、KGF-2和KGF-2-PHM对于稀释人血的溶血率分别为1.6％、1.2％和1.5％，都明显低于确保血液接触材料安全性的临界值5％，说明这几组样品都具有很好的血液相容性。
5.SD大鼠全层皮肤切割模型和给药
通过腹膜内注射用10％水合氯醛(剂量为3.5mL/kg，溶于生理盐水)麻醉SD大鼠。用脱毛剂脱毛背部，然后用手术刀片切割一个1.5cm×1.5cm方形伤口。没有覆盖伤口，并且将大鼠保持在单个笼子中，提供普通的大鼠食物。治疗开始于伤口形成当天，每3天一次。在治疗前，用消毒的碘伏适当地治疗伤口。第一组大鼠给予100μg/mL KGF-2水溶液，第二组给予含有100μg/mL KGF的微球并用生理盐水润湿，第三组大鼠给予空白微球并用生理盐水润湿，第三组大鼠给予0.9％盐水作为对照。治疗持续21天，在第7天，第14天和第21天，使用数码相机拍摄伤口，并通过软件Image Pro plus 6.0分析伤口愈合过程。在每个时间点计算伤口愈合率。
本实验用SD大鼠皮肤创伤模型对负载了KGF-2生长因子的止血微球的促愈合性能进行动物实验评价。图7A显示了KGF-2、PHM、KGF-2-PHM以及空白处理的大鼠皮肤伤口的愈合过程的变化情况，第7天各组都仍具有较大面积的创面；第14天各组创面面积都明显减少，但PHM组创面面积大于对照组；第21天时KGF-2-PHM和KGF-2组基本愈合，空白组也接近愈合，但PHM组仍具有明显的创面面积。然后我们使用创面的愈合率来评价处理组的疗效情况,(如图图7B所示)在第7，14，21天，与对照组相比，KGF-2和KGF-2-PHM组SD大鼠全层皮肤切割后愈合率显著的提高。然而，在第14，21天，单独PHM组创面愈合率显著低于对照组，其伤口愈合受阻。在第7，14天，KGF-2-PHM组显示出比单独KGF-2组更高的创面愈合率(P<0.05)。在第21天，两个治疗组间(KGF-2，KGF-2-PHM)没有统计学差异，但就愈合率而言，KGF-2-PHM组愈合率略高。值得注意的是，单独的PHM组在第14，21天显著阻碍伤口的愈合(P<0.01)。
6.苏木精-伊红(H&E)和Masson染色
在第7和21天，每组3只和7只SD大鼠用10％(w/v)水合氯醛以0.4mL/100g的剂量麻醉。沿着伤口愈合周长切割每只大鼠的伤口。在组织收获结束后，使用过量麻醉安乐死处理动物。将每个组织的固定在4％(w/v)多聚甲醛中，包埋在石蜡中，切片(5微米厚)，并安装在聚L-赖氨酸包被的载玻片上用于H&E(Beyotime，上海，中国)，Masson(Solarbio，中国上海)染色。用尼康立式显微镜(ECLPSE 80i，Tokyo，Japan)以40倍放大率拍摄切片以观察伤口区域。
H&E和Masson染色也证实了KGF-2，KGF-2-PHM组在组织病理学修复中的优越性(如图7C和图7D所示)。在第21天，Con组和PHM组仍显示上皮缺陷，而在KGF-2，KGF-2-PHM组中，可见完整的新生上皮(红色框)，真皮层细胞外基质分泌多(红色)。此外，由Masson染色可见，KGF-2-PHM组中的胶原含量(蓝色)及分布高于KGF-2组。与此同时，在KGF-2-PHM组中皮肤的附属器官毛囊的生长明显优于单独的KGF-2组。提示，KGF-2-PHM在组织病理学修复中具有更强的优越性。
7.免疫组织化学染色
将安装的石蜡切片置于65℃培养箱中5小时，然后用二甲苯脱蜡，并用一系列梯度乙醇水化。然后将切片置于3％(w/v)过氧化氢(用80％(w/v)甲醇稀释)中，在4℃下保持10分钟，以固定和消除内源酶活性。为了获得抗原修复,使用胰蛋白酶37℃修复45min，用PBS洗涤载玻片3次(洗涤5分钟)以除去胰蛋白酶。接下来，将载玻片置于湿盒中，用5％(w/v)山羊血清(Solarbio，中国上海，用0.01M PBS稀释)在37℃培养箱中封闭1小时，然后与其一起孵育。特异性一抗(胶原III型N-末端抗体，1：250；白细胞介素-6(IL-6)抗体，1：100；alpha平滑肌肌动蛋白(α-SMA)特异性抗体，1：250；增殖细胞核抗原(PCNA)，1：250,均购自Proteintech Biotech Co.，Ltd。)，其在1％(w/v)山羊血清中稀释，4℃，过夜。将山羊抗兔IgG-HRP和山羊抗小鼠IgG-HRP(1：100，TransGen Biotech Co.，Ltd。)在37℃培养箱中温育1小时。将切片用PBS洗涤4次，每次5分钟，然后用3,3N-二氨基联苯胺四氢氯化物(DAB)染色至出现阳性点。然后，将切片用苏木精染色5分钟，用0.5％(w/v)盐酸分化5秒，梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明，并用中性树脂密封以防止气泡。使用Nikon ECLPSE 80i(Nikon，Tokyo，Japan)显微镜，以400倍放大率从每个切片拍摄三个随机区域。用Image Pro Plus6.0软件计算平均免疫组织化学染色强度。
8.KGF-2和KGF-2-PHM调节IL-6表达以及诱导胶原蛋白3，α-SMA，PCNA的表达实验
为了研究PHM，KGF-2及KGF-2-PHM组是否可以调节受伤组织上的炎症，我们测量了促炎因子IL-6表达水平。如图8(b)和(c)所示，值得注意的是，KGF-2-PHM组中IL-6的阳性表达则与对照组，KGF-2组无统计学差异。然而，在第7，21天，PHM组中IL-6的阳性表达显着高于其他三组(P<0.01)。在第21天，KGF-2，KGF-2-PHM组与对照组相比，IL-6的阳性表达也显着降低(均P<0.01)，至于KGF-2和KGF-2-PHM组间IL-6阳性表达无显着差异(P>0.05)。
为了研究PHM，KGF-2和KGF-2-PHM是否能够在受伤组织中诱导增殖，我们测量了21天SD大鼠皮肤组织中胶原蛋白3，α-SMA，PCNA的表达水平。
就胶原蛋白3的表达而言，如图8(f)所示，与对照组相比PHM，KGF-2及KGF-2-PHM组中胶原蛋白3的阳性表达均显着增加(P<0.01，P<0.001，P<0.001，分别)。与PHM组相比，KGF-2和KGF-2-PHM胶原蛋白3的阳性表达存在显着差异(P<0.001)。此外，胶原蛋白3在KGF-2和KGF-2-PHM组中阳性表达也存在显著差异，KGF-2-PHM组显著高于KGF-2组(P<0.01)。
图8(d)和(e)总结了第21天伤口中α-SMA，PCNA的表达。与对照组相比PHM，KGF-2及KGF-2-PHM组中α-SMA，PCNA的阳性表达均显着增加(P<0.01)。与PHM组相比，KGF-2和KGF-2-PHM组中α-SMA，PCNA的阳性表达存在显着差异(P<0.01)。此外，α-SMA，PCNA在KGF-2和KGF-2-PHM组中阳性表达也存在显著差异，KGF-2-PHM组显著高于KGF-2组(P<0.01)。
9.实验结果分析
止血微球和生长因子在创口的止血和愈合领域都被广泛的研究和临床应用，在前期研究中，我们课题组研发了具有坑-孔结构的多孔止血微球PHM并应用于创面的止血。在这项研究中，我们以PHM为基材，通过简单的浸渍-冻干工艺制备了KGF-2-PHM，并研究了KGF-2和KGF-2-PHM对SD大鼠全层切割模型中皮肤创面愈合的修复作用。
通过形貌表征，我们发现KGF-2-PHM表面的坑被许多KGF-2蛋白(含蛋白制剂中的辅料)物质覆盖(图3e,f)，而PHM的表面仍保持比较清晰的坑结构(图3c,d)。体外生物相容性评价结果显示，KGF-2-PHM的溶血率很低，具有较好的血液相容性(图6b)；细胞毒性测试结果显示(图6a)，PHM、KGF-2和KGF-2-PHM都无细胞毒性，并且与单纯的PHM相比，KGF-2和KGF-2-PHM组都表现出促进细胞生长的能力，这可以归因于KGF-2的作用，KGF-2本身具有促进细胞增殖和生长的功能，用其培养的细胞生存率达到243％，而由于可以缓释KGF-2，因此KGF-2-PHM组的细胞生存率也高达185％。这里KGF-2-PHM组的细胞生存率低于KGF-2组可能是因为在浸提的过程中蛋白部分失活导致的。
动物实验结果表明KGF-2-PHM和单独使用KGF-2均可促进SD大鼠创面愈合，但KGF-2-PHM组在提高SD大鼠皮肤创面的愈合速度和修复质量具有更好的效果。如图图7(a)和(b)所示，可以看出，第7天时由于伤口还处于炎症期，因此每组伤口愈合都不太明显。第14天时，KGF-2、KGF-2-PHM和空白组伤口都明显变小了很多，并且KGF-2组和KGF-2-PHM组伤口面积都稍小于空白对照组，而PHM组伤口面积仍然要比对照组大。这是由于PHM组前期炎症反应较大，延缓愈合速度；而KGF-2具有促进细胞增殖的功能，因此伤口愈合较快；而KGF-2-PHM由于可以释放KGF-2，KGF-2大大的减少了炎症反应，又能够促进细胞增殖，也促进了伤口的愈合。因此，在第7天和第14天，KGF-2-PHM组显示出比单独的KGF-2组更高的伤口愈合率(图7(b))。第21天时KGF-2组与KGF-2-PHM组创面已基本愈合，但是PHM组仍具有明显的创面面积。H&E和Masson染色显示(图7(c))，与单独的KGF-2组相比，在用KGF-2-PHM处理的组中，毛囊的修复和胶原的含量均多于单独的KGF-2组。
在下面的特定蛋白分子测定中，我们发现KGF-2-PHM较优的促愈合疗效可归因于KGF-2的促进细胞增殖和下调创面的炎症反应的生物学功能。如图8(b)所示，在7天时，PHM组IL-6的表达显著高于对照组，考虑到PHM中存在着胺基，暗示其会导致组织过量的炎症反应，从而抑制伤口的愈合。而与PHM组相比，加载KGF-2的PHM组IL-6的表达则显著降低(P<0.01)，且与KGF-2组和对照组无统计学差异(P>0.05)。其暗示KGF-2减弱了这种炎症反应，改善了PHM的致炎作用，暗示了KGF-2-PHM整体具有更好的生物相容性，有助于创面的修复。
如图图7(b)所示，虽然PHM组的创面愈合率显著低于对照组，但其具有高水平表达的PCNA，α-SMA，Collange 3(P<0.01)(图8(d-f))。我们推测，单独的PHM组可能是由于微球特有的空间结构，促进成纤维细胞的迁移，但由于炎症因子的过多表达依然阻碍了伤口的愈合。KGF-2，KGF-2-PHM组中显著提高的PCNA，α-SMA，Collange 3表达水平，可能是由于加载了KGF-2，可能是促进了成纤维细胞和表皮细胞的增殖和生长。值得注意的是，KGF-2-PHM组中这些因子的表达也同样高于单独的KGF-2组。加载KGF-2的PHM首先KGF-2能够有效降低PHM带来的炎症反应，使得整体具有良好的生物相容性。而且，因为PHM独特的空间结构，有助于细胞的迁移。KGF-2-PHM还具有良好的缓释作用，可以使KGF-2长效缓慢释放(图6)，延长KGF-2发挥生物学作用的时间，有助于加快创面的修复。
总之，通过负载KGF-2赋予了KGF-2-PHM的抗炎和促愈合功能，同时通过PHM的缓释作用也提升了KGF-2的作用时间和使用效果。这项研究中所制备的KGF-2-PHM作用于创面，通过PHM和KGF-2的协同作用，既可以缓释KGF-2促进细胞的增殖，又能为细胞的生长和迁移提供支架，因此拥有更好的促进伤口愈合的功能。
在本申请的技术方案中，我们以多孔微球PHM为载体，通过浸渍工艺负载KGF-2制备了KGF-2-PHM微球。KGF-2-PHM既具有良好的生物相容性，又有抗炎功能。同时，在创伤愈合过程中，PHM和KGF-2的协同作用使KGF-2-PHM比单纯的PHM和KGF-2有更好的促进创面愈合的效果。加上PHM的止血性能，KGF-2-PHM可能可以有效地减少创伤患者的痛苦，在创口处理方面将有重要的临床应用价值和意义。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (8)

1.一种负载生长因子的多孔微球的制备方法，其特征在于：包括有以下步骤：
（1）制备多孔微球，其步骤是：将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠配置成混合水溶液，通过微量注射泵加入含有司盘80的液体石蜡中，搅拌乳化，得到均匀乳液，然后通过微量注射泵将CaCl2水溶液缓慢加入到上述乳液中，交联反应，最后将反应完的乳液分别用正己烷、无水乙醇和超纯水依次各洗至少1次，抽滤并冻干，得到多孔微球，多孔微球直径为10~1000 μm，微球表面具有直径为0.5~5 μm、深度100~500 nm的浅坑，该浅坑分布在多孔微球球面上整体呈陨石坑状，浅坑内壁及多孔微球内部又具有相互连通的孔径为0.05~1.5μm的微孔道，多孔微球的吸水倍率为200%~3000%；
（2）负载角质细胞生长因子2，其步骤是：将多孔微球装入角质细胞生长因子2水溶液中进行震荡培养，使得多孔微球充分吸收角质细胞生长因子2水溶液，然后在进行冷冻干燥，得到负载角质细胞生长因子2的多孔微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤（2）具体为：
用超纯水将生长因子配成浓度为10~500μg/mL 的水溶液，在4℃下，将1g微球倒入10mL 生长因子水溶液中，振荡培养1 ~ 4 h，使微球充分吸收生长因子溶液而溶胀，之后将吸收了生长因子溶液的微球在-80℃下冷冻2 h，然后放到冻干机中冻干。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中羧甲基壳聚糖、海藻酸钠与CaCl2水溶液中所含CaCl2的质量比为：1.5:1:2。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤（1）为：将1.5g羧甲基壳聚糖和1g 海藻酸钠溶于100mL超纯水，得到混合溶液，取30mL多糖混合溶液，通过微量注射泵缓慢的加入到90g含有0.4wt%司盘80的液体石蜡中，在30℃的水浴中600rpm的转速下机械搅拌乳化1h，得到均匀乳液，随后，将转速调到300rpm，通过微量注射泵将10mL质量体积浓度为20%的CaCl2水溶液缓慢加入到上述乳液中，交联反应4h，最后将反应完的乳液分别用正己烷、无水乙醇和超纯水各洗3次，抽滤并冻干。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）为：在4℃下，将1mg角质细胞生长因子2溶到10mL超纯水中得到10mL浓度为100μg/mL的角质细胞生长因子2水溶液，取所述多孔微球1g，在4℃条件下倒入10mL 浓度为100μg/mL的角质细胞生长因子2水溶液中，震荡培养60 min使微球充分吸收角质细胞生长因子2水溶液，将所得微球液放到-80℃冰箱中冷冻2h，然后放到冻干机中干燥。
6.一种如权利要求1-5之一所述的制备方法所制备的负载生长因子的多孔微球。
7.一种如权利要求6所述的负载生长因子的多孔微球在用于制备皮肤切口型创面治疗药物的应用，该生长因子为角质细胞生长因子2。
8.根据权利要求7的应用，其特征在于：该药物的形态为敷料形态。
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