CN106924196A - 一种负载生长因子的明胶缓释微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种负载生长因子的明胶缓释微球及其制备方法，其以血小板复合生长因子为包裹对象，以明胶微球为载体，浸润膨胀后冷冻干燥制备所得。本发明制备的负载生长因子的明胶缓释微球能有效的应用复合生长因子，能在局部达到缓慢释放且作用长效的效果，能保持较持久的生物活性，更好的促进组织再生和创伤愈合，为初步实现载血小板复合生长因子明胶缓释微球冻干制品的研制提供参考。本发明提供的制备方法简单，操作方便，整个反应过程条件温和，市场前景广阔。

Description

一种负载生长因子的明胶缓释微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种负载生长因子的明胶缓释微球及其制备方法。
背景技术
难愈性创面是指在期望的时间内不能正常愈合，是与部位和宿主有关的一类创面。难愈性创面的特点与修复难点在于创面局部缺乏良好的血供，难以生成新鲜血管，而且周围组织长期反复炎症刺激，造成纤维组织增生，瘢痕组织形成。由于创面长期不能愈合，皮肤组织缺损易液化感染甚至坏死，常常给患者造成了很大的心理压力和经济损失，严重影响了患者的身体健康及生活质量。
近年来，使用单一生长因子或者复合生长因子进行治疗并制成缓释微球或制剂的常有报道，但是只针对某种疾病或创面进行愈合，使用范围局限，难以推广应用。富血小板血浆(platelet rich in plasma，PRP)在创伤修复领域的表现出色，其富含血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子β(transforming growthfactor beta，TGF-β)、血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)、表皮生长因子(epithe-lial growth factor，EGF)、胰岛素样生长因子(insulin-likegrowth factor，IGF)等促进创面愈合的生长因子。在PRP中加入凝血酶和钙离子后可形成血小板凝胶(PG)。PG具有与PRP相同的生长因子，且由血小板和纤维蛋白多聚体构成，其中的血小板激活后，可使血小板脱颗粒释放α颗粒内丰富的生长因子，分别和相互协同促进组织再生、对创面进行修复。传统PG降解快，支架不稳定；其包含的生长因子半衰期短、易变性、易酶解，在体内应用时局部扩散快、降解快，从而导致其有效浓度下降，有效作用时间缩短。
缓释制剂是将药物赋予一定的载体，通过载体缓慢非恒速释放药物的一种制剂。明胶是动物骨或皮中胶原蛋白部分水解的产物，系由18种氨基酸与多肽交联形成的直链聚合物，是一种制备微球的良好的天然聚合物材料，在医学、化工等领域应用广泛。明胶微球可作为多种药物的载体，提高药物的稳定性、控制药物释放、靶向给药、掩盖药物的不良气味，其用放射性元素或荧光物质标记后可注入体内用于医学显影、示踪研究。由于明胶自身具有溶胶-凝胶特性，因而明胶微球还可作为制备其他材料微球的模板，但目前国内尚无成熟的明胶微球制品。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种缓释效果好、成本低、无毒副作用、具有安全性和实用性、能克服血小板凝胶的相关缺陷的负载生长因子的明胶缓释微球，进一步提供操作简单、成本低的制备负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法。
为解决上述问题，采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供的一种负载生长因子的明胶缓释微球，其以血小板复合生长因子为包裹对象，以明胶微球为载体，浸润膨胀后冷冻干燥制备所得。
进一步地，本发明提供的一种负载生长因子的明胶缓释微球，其中负载的所述生长因子包括但不限于PDGF-BB、TGF-β、VEGF。
进一步地，本发明提供的一种负载生长因子的明胶缓释微球，其中负载的所述生长因子包括但不限于PDGF-BB、TGF-β、VEGF、IGF-1、bFGF、EGF等。
进一步地，本发明提供的一种负载生长因子的明胶缓释微球，所述明胶缓释微球的平均粒径为15.95±3.79μm，微球粒径分布于7～20.5μm。
另一方面，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，包括如下步骤：
1)制备空白明胶微球：向盛有液体石蜡的容器中加入Span 80，搅拌均匀后加热搅拌；再向容器中滴加明胶溶液，搅拌至乳化形成油包水型乳剂；将反应容器转入冰水浴中，待反应体系完全降温后，加入戊二醛预固化；预固化完成后，再补加戊二醛并于冰箱中静置；从冰箱中取出并倾倒出上层清液后，残余物进行后处理得到空白明胶微球；
2)制备血小板复合生长因子：取静脉全血，经离心后得PRP，向PRP中加入激活剂，混匀，离心取上层清液得血小板复合生长因子，保存备用；
3)制备明胶缓释微球：经步骤2)所得血小板复合生长因子加入装有步骤1)所得空白明胶微球的EP管中，充分浸润膨胀后进行冷冻干燥即得负载生长因子的明胶缓释微球。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)向容器中滴加明胶溶液时的搅拌速度为750～825r/min。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)中反应体系完全降温至0～5℃后，维持0～5℃继续搅拌；优选为4℃。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)中加入戊二醛预固化的时间为5～10min，优选5min；再补加戊二醛并于冰箱中静置12～36h，优选为24h。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)中明胶溶液的制备过程如下：取固体明胶，溶于40～60℃的蒸馏水中，搅拌溶解，配成质量分数为13％的明胶溶液，置于40～60℃的水浴箱中备用。
更进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)中明胶溶液的制备过程如下：取固体明胶，溶于50℃的蒸馏水中，搅拌溶解，配成质量分数为13％的明胶溶液，置于50℃的水浴箱中备用。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)中液体石蜡与Span 80的体积比为200:3。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)中液体石蜡的体积与明胶溶液的体积比为5:1。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)中预固化所用戊二醛和补加戊二醛的体积比为1:400。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)中所述戊二醛的质量分数为25％。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)中所述补加的戊二醛与液体石蜡的体积比为1:1。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤1)中所述后处理是指向残余物中加入异丙醇脱水，然后用丙酮、异丙醇、石油醚三种溶剂依次洗涤，循环1～5次，经洗涤后的产物用抽滤机进行抽滤后，置于50～70℃的干燥箱中进行干燥，过20μm孔径筛后，装瓶储备待用。优选地，循环3次，在60℃干燥箱中干燥。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤2)中经离心后所得PRP中血小板计数为1000×109/L。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤2)中激活剂为含有100U/mL凝血酶的10％葡萄糖酸钙溶液。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤2)中PRP与激活剂的体积比为10:1。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤2)中静脉全血离心是指采用两步离心法离心(两步离心法请参考文献(付维力李棋李箭富血小板血浆制备技术及其组分的研究进展中国修复重建外科杂志2014年12月第28卷第12期1546-1550页)中所记载的实验步骤)。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤2)中所述保存备用是指将所得产品置于-80℃的冰箱中保存。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤2)中PRP与激活剂混合均匀后，置于37℃水浴中30min再进行离心。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤3)中，将空白明胶微球分装入EP管，需经过1KGy 60Coγ照射30min消毒后再加入血小板复合生长因子。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤3)中，所述充分浸润膨胀是指在4℃环境下进行，所述充分浸润膨胀的时间为12～24h。优选为24h。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤3)中，所述血小板复合生长因子的体积与空白明胶微球的质量的比例为100μL/10mg。
进一步地，本发明提供一种如上所述的负载生长因子的明胶缓释微球或如上所述的制备方法制备的负载生长因子的明胶缓释微球在制备治疗组织再生或创伤愈合药物中的应用。
本发明制备的负载生长因子的明胶缓释微球通过明胶微球载体缓慢非恒速释放生长因子，具有不良反应小、用药次数少、患者的顺应性好、疗效高等优点；明胶微球具有无毒，可生物降解，活性官能团丰富，生物相容性、黏附性、靶向性好等优点；负载生长因子的明胶缓释微球能有效提高生长因子的稳定性有效控制降解速度、控制释放、能实现靶向给药、且包含的生长因子不易变形，局部扩散慢，在作用部位的有效作用时间长，能有效克服PG的缺陷。
本发明制备的负载生长因子的明胶缓释微球能有效的应用复合生长因子，能在局部达到缓慢释放且作用长效的效果，初步显示在一周内可以达到缓释率79.6％，能保持较持久的生物活性，更好的促进组织再生和创伤愈合，为初步实现载血小板复合生长因子明胶缓释微球冻干制品的研制提供参考。
本发明制备的负载生长因子的明胶缓释微球外观圆整，粒径均匀，分散度良好，吸附生长因子率、载生长因子量及体外缓释效果良好。
本发明提供的制备方法简单，操作方便，整个反应过程条件温和，市场前景广阔。
附图说明
图1负载生长因子的明胶缓释微球的光学显微镜(A)及扫描电镜(B)的照片；
图2负载生长因子的明胶缓释微球的扫描电镜(SEM)下所见的微孔结构(S-3700N15.0KV 5.0mm*50.0K)；
图3负载生长因子的明胶缓释微球的生长因子PDGF-BB体外累积释放曲线；
图4负载生长因子的明胶缓释微球的生长因子TGF-β体外累积释放曲线；
图5负载生长因子的明胶缓释微球的生长因子VEGF体外累积释放曲线。
具体实施方式
简要说明
Span 80司盘80
下面以具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不受下述实施例的限定。
实施例1负载生长因子的明胶缓释微球的制备
(1)空白明胶微球的制备
用电子天平精确称量3.0g固体明胶，溶于20mL 50℃蒸馏水中，搅拌溶解，配成质量分数为13％的明胶溶液，置于50℃水浴箱中待用。
向三口瓶中倒入100mL液体石蜡，再加入1.5mL Span 80，搅拌均匀后置50℃恒温磁力加热搅拌器中继续搅拌10min；
将搅拌器转速调至750～825r/min，向三口瓶中滴加配好的质量分数为15％的明胶溶液，边搅拌边滴加，滴加完毕后继续搅拌乳化10min，直至形成油包水型乳剂；
然后快速将三口瓶转入到冰水浴中，待反应体系完全降至4℃左右，维持4℃条件继续搅拌15min后，加入25％戊二醛0.25mL预固化5min；预固化完成后，补加入100mL25％戊二醛，并将反应瓶置于4℃冰箱放置24h；
24h后取出并倾倒出上层清液，向反应瓶中加入100mL异丙醇脱水2h；
脱水后的残余物用丙酮、异丙醇、石油醚依次循环洗3次，用抽滤机抽滤后，残余物置60℃干燥箱中干燥，即获得淡黄色粉末状的明胶微球，用20μm孔径筛筛选后，装瓶储存备用。
步骤(1)制备的空白明胶微球的粒径、均匀度、分散度等外观形态检测
将适量微球置于载玻片上，光学显微镜及扫描电镜下观察其粒径、外形、均匀度、分散度等指标，计算出微球的粒径88.23％分布于7～20.5μm范围内，平均粒径为(15.95±3.79)μm。
(2)空白明胶微球分装消毒
将步骤(1)所得的空白明胶微球分装到1.5mLEP管中，每管10mg，经1KGy 60Coγ照射30min消毒备用。
(3)血小板复合生长因子的制备
抽取静脉全血经两步离心法离心后获得血小板计数为1000×109/L的PRP；将所得PRP与激活剂按体积比10:1进行混合均匀，混匀后于37℃水浴中30min，再离心取PG上清即获得所需的血小板复合生长因子，将血小板复合生长因子置-80℃冰箱保存备用。
(4)明胶微球负载血小板复合生长因子
将100μl步骤(3)所得血小板复合生长因子分别加到经过步骤(2)处理的盛有10mg明胶微球的EP管中，于4℃条件下充分浸润膨胀24h后将所得粗产品冷冻干燥，即得负载生长因子的明胶缓释微球。
将获得的负载生长因子的明胶缓释微球通过光学显微镜及扫描电镜(SEM)观察到负载生长因子的明胶缓释微球呈圆球体，表面光滑，粒径均匀，分散度良好，且与空白微球无差别(表现均如图1所示)。在扫描电镜一定放大倍数下可看到微球的微孔结构(具体如图2所示)。采用SPSS20.0统计软件对微球粒径分布进行统计分析，可知，实施例1制备的负载生长因子的明胶缓释微球粒径存在88.23％分布于7～20.5μm范围内，平均粒径为(15.95±3.79)μm。
实施例2负载生长因子的明胶缓释微球对于相关生长因子吸附率和载生长因子率
采用溶剂提取法(根据《中国药典》二部附录XIXE的相关规定)并用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测。
具体步骤：取装有空白微球的EP管，向每个EP管中分别加入100μL的PG上清(实施例1步骤(3)制备的血小板复合生长因子)，4℃条件下充分浸润膨胀24h后，制得负载生长因子的明胶微球；将EP管以8090r/min离心15min，吸出全部上清(A)，用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测收集上清中PDGF-BB、TGF-β、VEGF、IGF-1、bFGF、EGF的含量，结合PG上清中生长因子总量的检测结果计算出微球的吸附率；计算公式为：吸附率＝(加入的血小板复合生长因子中生长因子总量-上清(A)液中生长因子总量)/加入的血小板复合生长因子中生长因子总量×100％；
吸出全部上清(A)的EP管中加入200μL PBS，混匀后以8090r/min离心5min，吸出全部上清(B)，重复洗3次，合并后，用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测收集上清中PDGF-BB、TGF-β、VEGF、IGF-1、bFGF、EGF的含量，结合PG上清中生长因子总量的检测结果计算出负载生长因子的明胶微球的载生长因子率。
载生长因子率(pg/mg)＝(上清(B)液中生长因子总量)/负载生长因子的明胶微球的总量
检测结果：血小板计数为(1019.13±10.93)×109/L的PG上清中PDGF-BB、TGF-β、VEGF、IGF-1、bFGF、EGF的含量分别为17.033±0.089ng/mL、8.716±0.804ng/mL、285.089±6.342pg/mL、275.80±1.00pg/mL、136.527±9.154pg/mL、80.113±2.156pg/mL。
制备的负载生长因子的明胶微球PDGF-BB、TGF-β、VEGF生长因子吸附率分别为72.58％、82.99％、87.84％；负载生长因子的明胶微球载PDGF-BB、TGF-β、VEGF量分别为123.63pg/mg、72.335pg/mg、2.50pg/mg；IGF-1、bFGF、EGF在上清(A)和上清(B)中含量低，在检测时无法测出。
结论，从实施例2的数据可以看出制备的负载生长因子的明胶缓释微球分散度良好，吸附生长因子率、载生长因子量良好，初步实现了载血小板复合生长因子明胶缓释微球冻干制品的研制。
实施例3负载生长因子的明胶缓释微球对于相关生长因子缓释率检测
用ELISA试剂盒检测在1～7天标记收集的负载生长因子的明胶缓释微球的样品、实施例1步骤(4)中未吸附的血小板复合生长因子样品、实施例1步骤(2)制备的血小板复合生长因子样品中的血小板复合生长因子的含量，计算微球缓释率，绘制体外缓释曲线。体外缓释结果如下表1，具体曲线如图3～5所示。
表1 ELISA检测VEGF缓释结果
从实施例3的数据可以看出，制备的负载生长因子的明胶缓释微球体外缓释效果良好，初步实现了载血小板复合生长因子明胶缓释微球冻干制品的研制。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种负载生长因子的明胶缓释微球，其特征在于，以血小板复合生长因子为包裹对象，以明胶微球为载体，经浸润膨胀后冷冻干燥制备所得；所述负载生长因子包括PDGF-BB、TGF-β、VEGF。
2.如权利要求1所述的负载生长因子的明胶缓释微球，所述明胶缓释微球的平均粒径为15.95±3.79μm，微球粒径分布于7～20.5μm。
3.一种如权利要求1～2所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，包括如下步骤：
1)制备空白明胶微球：向盛有液体石蜡的容器中加入Span 80，搅拌均匀后加热搅拌；再向容器中滴加明胶溶液，搅拌至乳化形成油包水型乳剂；将反应容器转入冰水浴中，待反应体系完全降温后，加入戊二醛预固化；预固化完成后，再补加戊二醛并于冰箱中静置；从冰箱中取出并倾倒出上层清液后，残余物进行后处理得到空白明胶微球；
2)制备血小板复合生长因子：取静脉全血，经离心后得PRP，向PRP中加入激活剂，混匀，离心取上层清液得血小板复合生长因子，保存备用；
3)制备明胶缓释微球：经步骤2)所得血小板复合生长因子加入装有步骤1)所得空白明胶微球的EP管中，充分浸润膨胀后进行冷冻干燥即得负载生长因子的明胶缓释微球。
4.如权利要求3所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)中明胶溶液的制备过程如下：取固体明胶，溶于40～60℃的蒸馏水中，搅拌溶解，配成质量分数为15％的明胶溶液，置于40～60℃的水浴箱中备用。
5.如权利要求3所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，所述步骤1)向容器中滴加明胶溶液时的搅拌速度为750～825r/min；所述步骤1)中反应体系完全降温至0～5℃后，维持0～5℃继续搅拌；所述步骤1)中加入戊二醛预固化的时间为5～10min；再补加戊二醛并于冰箱中静置12～36h；所述步骤1)中液体石蜡与Span 80的体积比为200：3；液体石蜡的体积与明胶溶液的体积比为5:1；预固化所用戊二醛和补加戊二醛的体积比为1:400；补加的戊二醛与液体石蜡的体积比为1:1。
6.如权利要求3所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤1)中所述后处理是指向残余物中加入异丙醇脱水，然后用丙酮、异丙醇、石油醚三种溶剂依次洗涤，循环1～5次，经洗涤后的产物用抽滤机进行抽滤后，置于50～70℃的干燥箱中进行干燥，过20μm孔径筛后，装瓶储备待用。
7.如权利要求3所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤2)中经离心后所得PRP中血小板计数为1000×109/L，步骤2)中激活剂为含有100U/mL凝血酶的10％葡萄糖酸钙溶液，步骤2)中PRP与激活剂的体积比为10:1，步骤2)中PRP与激活剂混合均匀后，置于37℃水浴中30min再进行离心，所述保存备用是指将所得产品置于-80℃的冰箱中保存。
8.如权利要求3所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤3)中，将空白明胶微球分装入EP管，经过1KGy 60Coγ照射消毒后再加入血小板复合生长因子；所述充分浸润膨胀是指在4℃环境下进行，所述充分浸润膨胀的时间为12～24h。
9.如权利要求3所述的负载生长因子的明胶缓释微球的制备方法，其中，步骤3)中，所述血小板复合生长因子的体积与空白明胶微球的质量的比例为100μL/10mg。
10.如权利要求1～2任一所述的负载生长因子的明胶缓释微球或如权利要求3～9所述的制备方法制备的负载生长因子的明胶缓释微球在制备治疗组织再生或创伤愈合药物中的应用。
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