CN109793717A

CN109793717A - 一种明胶微球的制备方法与应用

Info

Publication number: CN109793717A
Application number: CN201711146584.3A
Authority: CN
Inventors: 孙广炜; 刘洋; 张英; 赵姗
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2017-11-17
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2019-05-24

Abstract

本发明提供一种明胶微球的制备方法与应用，步骤为：(1)在搅拌条件下将预热的明胶溶液滴加到预热的含有span80的液体石蜡中，制备稳定的油包水液滴；(2)使用冰浴降温，使液滴形成固化的微球；(3)加入京尼平溶液进行交联；(4)加入异丙醇破乳，使用异丙醇及纯净水离心洗涤，并冷冻干燥，最后获得干燥的明胶微球。该明胶微球球形度高、分散性好、细胞毒性小，并具有网状结构，可吸附并缓释生长因子，可用于体内注射治疗。

Description

一种明胶微球的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及再生医学领域，特别涉及一种缓释生长因子明胶微球的制备方法。

背景技术

明胶微球是一种注射型载体，由于明胶分子带有电荷，可以通过静电作用吸附生长因子，因此明胶微球可以携带生长因子注射到体内受损部位，并原位缓释生长因子，具有广泛的应用前景。未交联的明胶微球强度低，体内降解过快，交联微球强度好，降解时间长，可满足长时间体内原位生长因子释放的需要。戊二醛是被广泛使用的交联剂，戊二醛交联的明胶微球制备时间短、球形度高、分散性好，但是戊二醛具有细胞毒性，尽管可以用甘氨酸等来中和未参加反应的戊二醛，但是残余的戊二醛可以渗透出来，对细胞活性造成很大影响。为了改善戊二醛细胞毒性高的问题，京尼平被用来做为新型交联剂应用于明胶微球制备。京尼平是一种植物天然提取物，是一种生物交联剂，比戊二醛毒性低1000倍，有效降低了明胶微球的细胞毒性。但是京尼平交联过程比戊二醛缓慢，通常需要12-72h，而戊二醛只需要1-2h，在京尼平交联过程中即使短暂发生相互接触的明胶微球也会由于微球表面没有交联完全而相互黏连，这导致京尼平交联的微球比戊二醛交联微球的球形度低、分散性差。目前常规的京尼平交联微球的制备方法是未交联微球冻干后浸泡在京尼平溶液中进行交联，然而未交联明胶微球在冷冻干燥期间很容易发生黏连，并且在静态条件下交联反应加剧了微球之间的黏连，这导致交联后产生了很多黏连的微球。尽管有研究者在搅拌形成油包水液滴时加入京尼平溶液进行交联，但是在搅拌条件下液滴相互碰撞，京尼平较慢的交联速度仍然产生了较多黏连的微球。

为了改善目前京尼平交联明胶微球制备方法造成微球黏连的缺陷，本发明公开了一种改进的京尼平交联明胶微球的制备方法，即先在搅拌条件下制备稳定的油包水明胶液滴，之后添加了冰浴，利用明胶溶液在低温下形成凝胶的特性，使其形成明胶凝胶微球，之后再在搅拌速率不变的条件下加入京尼平溶液，从而大大减低了交联过程中微球之间的黏连，之后通过破乳、清洗及冻干步骤获得干燥的京尼平交联微球。本发明方法做制备的明胶微球球形度高、分散性好、细胞毒性小，并具有网状结构，可吸附并缓释生长因子，可用于体内注射治疗，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明公开了一种缓释生长因子明胶微球的制备方法。

本发明的缓释生长因子明胶微球的制备方法通过以下具体技术方案予以实现：(1)在搅拌条件下将预热的明胶溶液滴加到预热的含有span80的液体石蜡中，制备稳定的油包水液滴；(2)使用冰浴降温，使液滴形成固化的微球；(3)加入京尼平溶液进行交联；(4)加入异丙醇破乳，使用异丙醇及纯净水离心洗涤，并冷冻干燥，最后获得干燥的明胶微球。

所述明胶包括碱性明胶及酸性明胶；

所述明胶的胶冻强度为大于100Bloom g，优选120～200Bloom g；

所述明胶溶液的浓度为10-25％(w/v，g/ml)；

所述预热的明胶溶液是指明胶溶液在50-60℃水浴中加热超过1h，优选加热时间为1.5～2.5h；

所述液体石蜡的密度比重为0.89-0.90；

所述预热的液体石蜡是指液体石蜡在50-60℃水浴中加热超过1h，优选加热时间为1.5～2.5h；

所述液体石蜡与span80的体积比为30:1-50:1；

所述搅拌条件为700-1200rpm；

所述制备稳定的油包水液滴的搅拌时间为9-15min；

所述使用冰浴降温是指在搅拌速度不变的条件下在四周加冰来降低温度；

所述形成固化的微球的搅拌时间为15-30min；

所述京尼平溶液的浓度为2-5％(w/v，g/ml)，其交联时终浓度为0.03-0.3％(w/v，g/ml)；

所述京尼平溶液进行交联的时间为12-72h；

所述异丙醇破乳是指加入与以上混合液体体积比0.4-0.8的异丙醇搅拌4-10min；

所述洗涤次数为1-5次，所述离心的条件为1800-2300rpm，时间4-6min，温度2～8℃，优选4℃；

一种按照上述任一权利要求制备方法制备而得的明胶微球；

所述明胶微球在作为药品载体的应用，其特征在于，作为注射型载体，通过静电作用吸附生长因子，明胶微球携带生长因子注射到体内受损部位，并原位缓释生长因子。

本发明的优点

1.本发明在油包水明胶液滴形成之后添加了冰浴，利用明胶溶液在低温下形成凝胶的特性，使其形成明胶凝胶微球，之后再在搅拌速率不变的条件下加入京尼平溶液，从而大大减低了交联过程中微球之间的黏连；

2.本发明未引入新物质，操作简单，成本低，可大规模制备，具有很大的应用潜力。

附图说明

图1为未加冰浴的实验对照组微球；

图2为加冰浴的实验组微球；

图3为未加冰浴的实验对照组微球；

图4为加冰浴的实验组微球；

图5为京尼平终浓度0.4％(w/v，g/ml)时所制备的微球；

图6为京尼平终浓度0.03％(w/v，g/ml)时所制备的微球；

图7为京尼平终浓度0.3％(w/v，g/ml)时所制备的微球；

图8为8min冰浴搅拌条件下制备的微球；

图9为9min冰浴搅拌制备的微球；

图10为30min冰浴搅拌制备的微球。

具体实施方式

实施例1：

配制25％(w/v，g/ml)碱性明胶(120Bloom g)水溶液20g，并在53℃水浴中预热1.5h。另外，配制含有span80的液体石蜡(液体石蜡密度比重为0.9，液体石蜡与span80的体积比为50:1)，混合均匀，并在53℃水浴中预热1.5h。之后，在1200rpm搅拌条件下将明胶溶液缓慢滴加到液体石蜡中，明胶水溶液与含有span80的液体石蜡的体积比为1:10，搅拌时间为15min，制备稳定的油包水液滴。然后，在搅拌速度不变的条件下加冰浴降温，搅拌30min形成固化的微球。之后，加入5％(w/v，g/ml)京尼平溶液，其交联时终浓度为0.3％(w/v，g/ml)，搅拌反应72h。然后，缓慢加入与上一步操作所得混合液体体积比0.8的异丙醇，搅拌10min，进行破乳。然后，使用异丙醇及纯净水在4℃离心洗涤各3次(1800rpm)每次4min，最后冷冻干燥，获得干燥的京尼平交联的明胶微球。同时制备不加冰浴的实验对照组，其它步骤同上所述。将上述两组微球均配制成1mg/ml的水溶液，混匀，在显微镜下进行观察，发现未加冰浴的实验对照组微球出现了很多结块(图1)，而使用冰浴的微球未发生明显粘连，球形度高，分散性较好(图2)，说明添加了冰浴的制备工艺显著改善了京尼平微球容易粘连、结块的问题。

实施例2：

配制10％(w/v，g/ml)酸性明胶(180Bloom g)水溶液20g，并在53℃水浴中预热2h。另外，配制含有span80的液体石蜡(液体石蜡密度比重为0.89，液体石蜡与span80的体积比为30:1)，混合均匀，并在53℃水浴中预热2h。之后，在700rpm搅拌条件下将明胶溶液缓慢滴加到液体石蜡中，明胶水溶液与含有span80的液体石蜡的体积比为1:10，搅拌时间为9min，制备稳定的油包水液滴。然后，在搅拌速度不变的条件下加冰浴降温，搅拌15min形成固化的微球。之后，加入2％(w/v，g/ml)京尼平溶液，其交联时终浓度为0.03％(w/v，g/ml)，搅拌反应12h。然后，缓慢加入与上一步操作所得混合液体体积比0.4的异丙醇，搅拌4min，进行破乳。然后，使用异丙醇及纯净水在4℃离心洗涤各4次(2300rpm)，每次5min，最后冷冻干燥，获得干燥的京尼平交联的明胶微球。同时制备不加冰浴的实验对照组，其它步骤同上所述。将上述两组微球均配制成1mg/ml的水溶液，混匀，在显微镜下进行观察，发现未加冰浴的实验对照组微球出现了很多结块(图3)，而使用冰浴的微球未发生明显粘连，球形度高，分散性较好(图4)，说明添加了冰浴的制备工艺显著改善了京尼平微球容易粘连、结块的问题。

实施例3：

配制18％(w/v，g/ml)碱性明胶(200Bloom g)水溶液30g，并在53℃水浴中预热2.5h。另外，配制含有span80的液体石蜡(液体石蜡密度比重为0.9，液体石蜡与span80的体积比为40:1)，混合均匀，明胶水溶液与含有span80的液体石蜡的体积比为1:10，并在53℃水浴中预热2.5h。之后，在1000rpm搅拌条件下将明胶溶液缓慢滴加到液体石蜡中，搅拌时间为12min，制备稳定的油包水液滴。然后，在搅拌速度不变的条件下加冰浴降温，搅拌20min形成固化的微球。之后，加入5％(w/v，g/ml)京尼平溶液，其交联时终浓度分别为0.02％(w/v，g/ml)、0.03％(w/v，g/ml)、0.3％(w/v，g/ml)及0.4％(w/v，g/ml)，搅拌反应48h。然后，缓慢加入与上一步操作所得混合液体体积比0.6的异丙醇，搅拌10min，进行破乳。然后，使用异丙醇及纯净水在4℃离心洗涤各5次(2000rpm)，每次6min，最后冷冻干燥，获得干燥的京尼平交联的明胶微球。在制备过程中发现京尼平终浓度0.02％(w/v，g/ml)的微球由于交联强度低而在离心过程中破碎了，而京尼平终浓度0.4％(w/v，g/ml)的微球在搅拌期间发生了微球结块(图5)。在显微镜下观察，发现京尼平终浓度0.03％(w/v，g/ml)及0.3％(w/v，g/ml)的微球球形度高，分散性较好(图6和图7)，没有结块现象，此实验说明京尼平终浓度在0.03-0.3％(w/v，g/ml)能够制备得到较好的微球。

实施例4：

配制15％(w/v，g/ml)酸性明胶(150Bloom g)水溶液30g，并在53℃水浴中预热2h。另外，配制含有span80的液体石蜡(液体石蜡密度比重为0.89，液体石蜡与span80的体积比为38:1)，混合均匀，并在53℃水浴中预热2h。之后，在1100rpm搅拌条件下将明胶溶液缓慢滴加到液体石蜡中，明胶水溶液与含有span80的液体石蜡的体积比为1:10，搅拌时间为12min，制备稳定的油包水液滴。然后，在搅拌速度不变的条件下加冰浴降温，分别搅拌8min、9min、30min及35min形成固化的微球。之后，加入3％(w/v，g/ml)京尼平溶液，其交联时终浓度分别为0.2％(w/v，g/ml)，搅拌反应30h。然后，缓慢加入与上一步操作所得混合液体体积比0.7的异丙醇，搅拌6min，进行破乳。然后，使用异丙醇及纯净水在4℃下离心洗涤各4次(2100rpm)，每次6min，最后冷冻干燥，获得干燥的京尼平交联的明胶微球。在制备过程中发现8min冰浴搅拌微球由于固化时间不够而发生了结块(图8)，35min冰浴搅拌由于未交联状态下搅拌时间过长而发生了破碎。在显微镜下观察，发现9和30min冰浴搅拌制备的微球球形度高，分散性较好(图9和图10)，此实验说明冰浴搅拌9-30min能够制备得到较好的微球。

Claims

1.一种明胶微球的制备方法，其特征在于：

步骤为：

(1)在搅拌条件下将预热的明胶溶液滴加到预热的含有span80的液体石蜡中，明胶溶液与含有span80的液体石蜡的体积比为1:10-1:40，制备稳定的油包水液滴；

(2)使用冰浴降温，使液滴形成固化的微球；

(3)加入京尼平溶液进行交联；

(4)加入异丙醇破乳，使用异丙醇及纯净水离心洗涤，并冷冻干燥，最后获得干燥的明胶微球。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述明胶包括碱性明胶及酸性明胶；

所述明胶的胶冻强度为大于100Bloom g，优选120～200Bloom g；

所述明胶溶液的浓度为10-25％(w/v，g/ml)；

所述预热的明胶溶液是指明胶溶液在50-60℃水浴中加热超过1h，优选加热时间为1.5～2.5h。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述液体石蜡的密度比重为0.89-0.90；

所述液体石蜡与span80的体积比为30:1-50:1。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述搅拌条件为700-1200rpm；

所述制备稳定的油包水液滴的搅拌时间为9-15min。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述使用冰浴降温是指在搅拌速度不变的条件下在四周加冰来降低温度；

所述形成固化的微球的搅拌时间为9-30min，优选搅拌时间为15-30min。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述京尼平溶液的浓度为2-5％(w/v，g/ml)，其交联时终浓度为0.03-0.3％(w/v，g/ml)；

所述京尼平溶液进行交联的时间为12-72h。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述异丙醇破乳是指加入与步骤(3)得到的混合液体体积比0.4-0.8的异丙醇搅拌4-10min。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述洗涤离心次数为1-5次，所述离心的条件为1800-2300rpm，时间4-6min，温度2～8℃，优选4℃。

9.一种按照上述任一权利要求制备方法制备而得的明胶微球。

10.一种权利要求9所述的明胶微球在作为药品载体的应用，其特征在于，作为注射型载体，通过静电作用吸附生长因子，明胶微球携带生长因子注射到体内受损部位，并原位缓释生长因子。