CN110200922A - 一种明胶微球的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种明胶微球的制备方法和应用。其制备过程为：S1.以明胶水溶液为内相；以油相为外相，通过微流控装置，分别控制内相和外相的流速为1～10μL/min和20～200μL/min；并以外相为收集相，收集微液滴；S2.将收集的微液滴置于4～12℃下成胶，并去除其表面的油相，然后再与京尼平溶液发生交联反应1h，待反应结束后，分离即可得到明胶微球。本发明所述明胶微球，不仅制备过程简单，对细胞安全，无毒性，且具有一定的机械强度，可很好的负载细胞，不影响细胞的活性，可作为细胞载体进行应用；同时，所述明胶微球对糖尿病创面的愈合和创面血管的形成具有一定的促进作用，同时还具有很好的降解作用，可制备成为创面愈合和血管形成的促进剂药物进行应用。
Description
技术领域
本发明涉及介入医学技术领域，更具体地，涉及一种明胶微球的制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)移植已经成为一种有前途的治疗策略。MSCs能够稳定地离体扩增，同时保持分化成表皮和真皮谱系细胞的能力，甚至皮肤附属物如毛囊、汗腺和微血管也可以在MSC治疗的伤口中快速再生。直接将细胞注射到修复部位可以将手术的侵袭性降到最低。然而，这种方式细胞与宿主组织的整合程度较低，且细胞存活率较低，导致临床移植成功率低。
针对上述问题，一种潜在的有吸引力的策略是将干细胞悬浮在水凝胶中，有望提高供体细胞的存活，并为成功移植建立良好的微环境。目前以报道的水凝胶如聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)、透明质酸(HA)、海藻酸、胶原蛋白、明胶等已应用于干细胞负载，但由于难愈合创面较大，片层状结构组织浸润性较差，影响细胞的存活和功能，且缺乏足够的氧气和营养供应，导致促进创面修复能力差，降低临床移植的成功率。另外，细胞与水凝胶材料之间有限的界面相互作用限制了组织长入。因此，目前的水凝胶难以适应于干细胞移植，需要开发新的水凝胶已适应于干细胞的移植。
微凝胶是一种微米级的亲水性聚合物三维网络，是一种理想的细胞载体，可以将细胞嵌入类似ECM的微环境中，将细胞传递到目标组织，从而保护细胞免受恶劣环境的伤害。微凝胶具有高表面体积比的特性，使微凝胶内部和外部之间实现快速的物质交换，从而维持了种子细胞的生存能力，因此，利用水凝胶微球包封干细胞具有很大的组织再生潜力。采用微流控方法制备出具有合适尺寸且均一、形状可控的凝胶微球，具有较高的细胞封装效率和细胞存活率。制备这些微球最常用的材料是PEGDA和海藻酸钠。然而，这些载体缺乏细胞黏附位点，极大地限制了细胞增殖、迁移和形成组织。在溶胶-凝胶转变过程中使用具有细胞毒性的引发剂或自由基聚合反应进行交联，降低了负载细胞的生物活性，从而限制了其生物应用。
因此，有必要提供一种微球，不仅制备简单，而且可很好的负载细胞，还不影响细胞的活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种明胶微球。本发明所述一种明胶微球，不仅制备简单，而且对细胞安全，无毒性，可很好的负载活细胞，不影响活细胞的活性；同时其对于创面的愈合、血管的形成具有一定的促进作用，且还具有很好的降解作用；可作为载体，负载活性细胞，制备成为促进创伤愈合、血管形成的药物进行应用，具有很好的临床治疗效果和应用价值。
本发明的另一目的在于提供所述明胶微球的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述明胶微球的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种明胶微球，通过如下步骤制备得到：
S1.以明胶水溶液为内相；以油相为外相，通过微流控装置，分别控制内相和外相的流速为1～10μL/min和20～200μL/min；并以8～12℃的外相为收集相，收集微液滴；
S2.将收集的微液滴置于4～12℃下成胶，并去除其表面的油相，然后再与京尼平溶液发生交联反应1h，待反应结束后，分离即可得到明胶微球。
优选地，步骤S1中，外相和内相的流速分别为5μL/min和100μL/min。
优选地，步骤S2中，微液滴置于4℃下成胶，成胶时间为10min。
优选地，步骤S2中，所述京尼平溶液中，京尼平的质量百分数为0.5～10％。
优选地，步骤S2中，所述京尼平溶液中，京尼平的质量百分数为0.5％。
本发明同时还保护所述明胶微球制备成为创面愈合药物的应用。
优选地，所述创面愈合药物为糖尿病创面愈合药物。
所述明胶微球作为细胞载体的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述明胶微球负载细胞后制备成为创面血管修复药物的应用。
优选地，所述明胶微球可负载的细胞为胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪干细胞。
优选地，所述药物的剂型为敷料、软膏剂或搽剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述明胶微球，不仅制备过程简单，对细胞安全，无毒性，且具有一定的机械强度，可很好的负载细胞，不影响细胞的活性，可作为细胞载体进行应用，也可负载活性细胞后制备成为药物进行应用；
同时，所述明胶微球对糖尿病创面的愈合和创面血管的形成具有一定的促进作用，同时还具有很好的降解作用，可制备成为创面愈合和血管形成的促进剂药物进行应用。
附图说明
图1为明胶微球交联前后宏观形貌光镜照片。
图2为NIH-3T3细胞在明胶微球表面粘附及增殖结果。
图3为MS对糖尿病大鼠创面愈合效果的宏观表征。
图4为对照组、MS组新生组织H&E染色结果。
图5为MS在伤口愈合初期对血管生成的影响。
图6为MS在创面愈合过程中的生物相容性和生物降解性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1明胶微球的制备
1、微流控装置的制作
准备长约35cm的PTFE管(内径0.3mm,外径0.6mm)，在PTFE管的一端插入26G针头，在距针头20cm处将31G针头平行插入PTFE管中，保持针尖处于管道中间位置；用AB胶密封连接处同时固定针头和PTFE管，做好装置后首先检查装置的连通性及密封性，用5mL注射器先吸取去离子水，插入31G针头，手动推动注射器，若PTFE管口有液体流出则内相联通性良好。将注射器同时与20G针头相连，将PTFE管的出口处堵住，同时手动挤压两个注射器，若无液体漏出，则装置密封性良好。将制备好的装置烘干备用。
2.明胶微球(MS)的制备
内相：10％明胶溶液，外相：花生油；内外相流速分别设置为5μL/min和100μL/min。收集相：5mL圆底EP管中加入1mL花生油，8℃冰水中预冷。
连接微流控装置，调节注射泵参数，将装有内相溶液的注射器37℃恒温加热防止明胶溶液冷凝成胶，待微液滴均匀流出时开始收集，将PTFE管的出口端紧贴EP管内壁，每组收集10min，转移至4℃冰水中继续冰浴10min使明胶微球成胶，此时收集3组，每组加入1mL0.5％的京尼平溶液置于室温(约23℃)交联1h；最后吸去上层花生油和京尼平溶液并加入完全培养基洗涤、冷冻离心，重复3次，以去除京尼平溶液和花生油，即可得到明胶微球(MS)。
显微镜下拍照观察微球形貌。将收集好的MS加入少量PBS保存，显微镜下拍照观察微球形貌。结果显示，使用微流控装置制备的明胶微球尺寸均一；10％明胶溶液在温度低于25℃时成胶，使用预冷的花生油作为收集相，使得流动的油包水的明胶液滴快速成胶，防止微球间粘连；对花生油中的微球显微镜拍照观察并使用image J软件进行粒径统计，结果如图1中a图所示微球平均粒径为281μm。
3、明胶微球(MS)的交联强度
明胶微球(MS)的交联强度决定了其机械性能，为了能够更好的负载细胞，为细胞提供良好的生长环境，需要保证明胶微球具有一定的机械性能；但由于京尼平具有一定的细胞毒性，交联时间过长不利于细胞存活；因此需控制交联时间来控制明胶微球的交联强度，保证细胞三维培养中的活性。
测得结果如图1中c图所示，室温交联1h置于37℃水浴锅内，微球不会溶解。
同时为了保证明胶微球的机械性能，以及其细胞安全性(减少京尼平交联反应对细胞的毒性)，选择交联为1h，交联后微球平均尺寸为361±7μm，如图1中b图所示。
实施例2成纤维细胞在明胶微球表面的粘附、增殖表征
测试成纤维细胞在明胶微球表面的粘附和增殖，具体过程为：
将明胶微球平铺于48孔板(非粘附板)底部，将NIH-3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞系)以5×104cells/well密度接种，每组三个平行样，对照组为TCP(粘附型)。在第1、3天，使用CCK-8溶液检测细胞活性；
染色结果如图2所示，其中图2a为微球接种2天后表面细胞死活染色结果，结果显示细胞在微球表面生长活性良好，视野内无死细胞。3天内，MS组增殖速率良好，如图2b所示，显示出与TCP组一致的增殖趋势。图中结果证明明胶微球可使NIH-3T3细胞很好的粘附和增殖，表明明胶微球具有良好的细胞相容性，对细胞安全，且细胞负载在MS上后，能够保证很好的活性，表明MS可作为细胞载体进行应用。
实施例3测试MS对全层皮肤切除创伤的效果
1、I型糖尿病大鼠(TIDM)建模
取SD大鼠(8周龄，体重200～250g，雄性)15只诱导TIDM造模，造模前禁食24小时。造模前称量每只大鼠体重，并取尾静脉血液测量每只大鼠的空腹血糖值；
1％STZ(链脲佐菌素)溶液按50mg/kg的剂量，腹腔注射。操作完成后大鼠分笼饲养。造模后，尾静脉采血测量大鼠血糖。若诱导前血糖值<8.9mmol/L，诱导后连续三日大鼠随机血糖≥16.7mmol/L，即认为成功造模。如诱导TIDM造模失败，正常饮食饲养大鼠并监测血糖值，待大鼠血糖恢复正常值且无明显异常后，继续按50mg/kg的剂量，予1％STZ溶液迅速进行腹腔注射，重新诱导TIDM造模。
血糖造模成功后，分为3组，每组5只(n＝5)分别进行周期为3、7、14天的实验，并在上述时间点记录大鼠的体重及血糖情况。
2、全层皮肤切除创伤模型的建立
取上述成功造模的TIDM大鼠，测量大鼠体重，腹部局部消毒。使用3％戊巴比妥钠溶液，按30mg/kg计量腹腔注射麻醉。显效后，剔除大鼠前肢背侧毛发，并涂一层脱毛膏，10分钟后去除脱毛膏并使用酒精棉球擦拭消毒。以大鼠脊椎为中线，以龙胆紫标出直径为8mm的2个圆型创面，各创面间隔距离分别为2cm，使用直径8mm皮钻建立2个全层皮肤切除创伤模型，深至大鼠肌层。
3、MS处理创面的过程
用无菌棉球擦干创面，采用自身对照，以A创面为空白(无治疗)，B创面敷空白明胶微球(MS组，质量约为50mg)；然后用PI透明敷料(含直径15mm垫圈)覆盖上述伤口，并进一步用自粘绷带固定。在第3、7、14天，用数码相机拍摄伤口，用Image J测量伤口面积。
伤口收缩率的计算：
伤口收缩率(％)＝(A0-At)/A0×100
其中A0为第0天创面面积，At为指定时间点创面面积。
rADSC/MS对糖尿病大鼠创面愈合效果的宏观表征结果如图3所示，其中图a为各组伤口照片记录了14天内伤口愈合情况；图b为14天内创面愈合率统计结果。
从图a中可知，术后3天两组创面均有收缩，但MS处理组的收缩趋势较为明显；第7天到第14天伤口持续愈合，图中明显观察到14天时，与对照组相比，MS组的愈合情况更佳，新生皮肤组织凹陷明显小于对照组，皮肤表面光滑平整。图b统计结果与图a相对应，结果显示明胶微球对创面愈合显示出一定的促进作用。
4、MS对组织微环境的改善情况
与其他慢性伤口不同，糖尿病创面，如糖尿病足是糖尿病常见的并发症，其胶原蛋白形成异常、末梢血管病变、红细胞糖化使氧结合率降低，使得创面缺氧，细胞坏死，逐渐形成慢性溃疡。糖尿病作为一种慢性代谢障碍疾病，持续的高血糖状态导致一些组织器官代谢异常，对血管及神经系统等造成损伤。对于糖尿病足，单纯控制血糖并不能完全阻止损伤组织的病理进程，如何将病变部位的血管重建，改良逐步恶化的组织微环境极为重要。
将相应时间节点获得的样品，石蜡包埋切片后进行H&E染色，Masson’s Trichrome染色，CD31免疫组化染色评估新生组织的炎症反应，胶原形成以及新血管的形成。组织学染色步骤按标准流程进行。
通过H&E染色，Masson染色和CD31的免疫组织化学染色，分析创面炎症反应浸润，胶原蛋白形成以及血管化再生及重建。
从图4中可知，术后第3天，两组均可见新生肉芽组织，其中包括炎症细胞和红细胞的广泛浸润，成纤维细胞的大量增殖；第7天，肉芽组织持续生长，MS组新生肉芽组织围绕微球生长并填满整个伤口区域，且肉芽组织较厚；第14天时，两组均已分化出完整的表皮层。与空白组相比，MS组伤口区域更接近正常组织。MS组真皮层中可见部分未降解的微球；但创面中毛囊、皮脂腺逐渐形成，表明创面交空白处理组愈合的更好。
以上结果表明，通过明胶微球敷料有望改善创面组织微环境。
5、MS对创面血管化的影响
作为创面修复的重要过程，血管再生对于创面愈合极为重要。基于CD31的免疫组织化学染色和新血管密度定量的结果如图5所示。术后第3、7天，创面浅层肉芽组织中，MS组微球周围均出现大量血管；与空白组相比，明胶微球敷料对创面血管再生显示一定促进作用。新血管的生成利于创面营养物质和氧气运输，改善创面微环境，促进伤口愈合。
6、MS体内相容性及降解行为结果
对明胶微球体内的生物相容性及降解行为进行初步评价。如图6所示，第7天时，MS组中，中性粒细胞聚集在微球表面，表明发生了一定程度的急性炎症反应，同时大量血红细胞出现；14天时，MS组炎症反应逐渐消退，微球出现一定程度降解。表明MS随着伤口的愈合，具有一定的降解作用；随着时间的延长，MS可基本上降解，降解周期为21天左右，对于伤口无负面影响。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种明胶微球，其特征在于，通过如下步骤制备得到：
S1.以明胶水溶液为内相；以油相为外相，通过微流控装置，分别控制内相和外相的流速为1～10μL/min和20～200μL/min；并以8～12℃的外相为收集相，收集微液滴；
S2.将收集的微液滴置于4～12℃下成胶，并去除其表面的油相，然后再与京尼平溶液发生交联反应1h，待反应结束后，分离即可得到明胶微球。
2.根据权利要求1所述明胶微球，其特征在于，步骤S1中，外相和内相的流速分别为5μL/min和100μL/min。
3.根据权利要求1所述明胶微球，其特征在于，步骤S2中，微液滴置于4℃下成胶，成胶时间为10min。
4.根据权利要求1所述明胶微球，其特征在于，步骤S2中，所述京尼平溶液中，京尼平的质量百分数为0.5～10％。
5.根据权利要求4所述明胶微球，其特征在于，步骤S2中，所述京尼平溶液中，京尼平的质量百分数为0.5％。
6.权利要求1至5任一所述明胶微球制备成为创面愈合药物的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述创面愈合药物为糖尿病创面愈合药物。
8.权利要求1至5任一所述明胶微球作为细胞载体的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述明胶微球负载细胞后制备成为创面血管修复药物的应用。
10.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述明胶微球可负载的细胞为胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪干细胞。
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