CN104254341B - 药剂缓释载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使用了丝纤蛋白多孔质体的药剂缓释载体,其药剂缓释率高、药剂缓释速度可控、强度高、容易处理,还由于生物亲和性高从而对皮肤温和,且保水性高,能够有效保持药剂。
Description
技术领域
本发明涉及药剂缓释载体。
背景技术
一直以来,作为对患者给予药剂的方法,已知有经口给药。但是经口给药具有以下缺点:胃肠损害等副作用,无法绕过肝脏从而无法避免最初通过时的代谢,或者治疗浓度和毒性浓度间狭窄区域内的给药控制困难等。
作为解决上述缺点的手段,正在尝试以经皮用制剂形式来使用药剂。为了长期稳定地经皮吸收药效成分,经皮用制剂使用具有药理学活性的活性物质控制向皮肤的渗透。作为前述活性物质,也考虑过使用表面活性剂或其它渗透剂。但是这些活性物质大多存在实质上损伤皮肤组织、此外产生不良的副作用的可能。
此外,还存在泥罨剂这样的、在油剂等基材中混炼药剂从而控制缓释速度的包覆材料,但其保水性、吸水性差,存在闷捂患部而影响皮肤、难以用于存在渗出液的创面的问题。
作为控制药剂的缓释性的其它方法,提出了通过使药效成分保持在合成高分子、天然高分子的凝胶或多孔质体等药剂载体中从而控制药剂的经皮渗透的方法(专利文献1及2)。
此外,还提出了通过载体分解而具有缓释性的缓释载体(专利文献3~5)。另外,已知蚕丝是天然高分子中生物亲和性高的物质,一直以来用作缝合线等,安全性高。蚕丝由丝胶、丝心蛋白形成,已经提出了多种加工方法,例如提出了使用丝纤蛋白获得的水凝胶(专利文献6)。
专利文献1:日本特开平8-175981号公报
专利文献2:日本特表2007-520614号公报
专利文献3:日本特开平5-43453号公报
专利文献4:日本特开平9-192211号公报
专利文献5:日本特开平2004-123576号公报
专利文献6:日本专利第3412014号公报
附图说明
图1为实施例1中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图2为实施例2中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图3为实施例3中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图4为实施例4中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图5为实施例5中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图6为实施例6中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图7为实施例7中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图8为实施例8中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图9为实施例9中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图10为实施例10中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图11为实施例11中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图12为实施例12中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图13为实施例13中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图14为实施例14中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图15为实施例15中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图16为实施例16中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图17为实施例17中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图18为实施例18中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图19为实施例19中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图20为实施例20中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图21为实施例21中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图22为实施例22中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图23为实施例23中制造的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片。
图24为表示实施例28中的在平面培养的成纤维细胞培养皿中静置丝纤蛋白多孔质体的情况的图。
图25为表示实施例28中的在丝纤蛋白多孔质体的表面接种成纤维细胞并将细胞培养2周后的情况的图。
图26为表示实施例28中的在明胶海绵中接种成纤维细胞并将细胞培养2周后的情况的图。
图27为表示实施例28中的粘连性试验结果的图像。
图28为表示实施例29~32的缓释率的图。
图29为表示实施例33的血小板源性生长因子(PDGF)对培养液的缓释率的图。
图30为表示实施例34的碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对培养液的缓释率的图。
发明内容
发明要解决的课题
但是,将专利文献1及2所述那样的合成高分子作为药剂载体时,存在与皮肤的亲和性差以及保水性差、缓释速度难以控制、缓释效率低等问题。此外,将天然高分子作为药剂载体时,虽然具有与皮肤的亲和性高的优点,但存在强度低这一问题。因此,天然高分子的情况下,需要通过利用交联剂形成的交联体、使用补强材料、用纱布等包裹来确保强度。但是在为了确保强度而使用交联剂时,有残存的交联剂对皮肤带来不良影响之担忧。此外,使用补强材料时,有结构复杂、剥离时药剂载体的一部分残留在皮肤上之担忧。进而,用纱布等包裹而确保强度时,与皮肤接触的是纱布等现有类型的包覆材料,生物亲和性高、保水性高的凝胶、多孔质体并不接触皮肤,因此存在无法充分发挥效果的问题。
如专利文献3~5所述的缓释载体存在载体在体外难以分解、对皮肤等难以适用的问题。此外,在使用如专利文献6所述的水凝胶作为药剂缓释载体时,存在药剂缓释速度不可控的问题。
因此,本发明的目的在于,提供一种药剂缓释率高、药剂缓释速度可控、强度高、容易处理,还由于生物亲和性高从而对皮肤温和,且保水性高,能够有效保持药剂的药剂缓释载体。
用于解决课题的手段
本发明人等为了解决前述课题反复进行了深入研究,结果发现通过下述发明可以解决所述课题。
即,本发明的主旨如下。
1.一种药剂缓释载体,其使用了丝纤蛋白多孔质体。
2.根据前述1所述的药剂缓释载体,其中,所述丝纤蛋白多孔质体用水溶性高分子处理过。
3.根据前述2所述的药剂缓释载体,其中,所述水溶性高分子为包含选自多糖类及聚氨基酸中的至少一种的材料。
4.根据前述3所述的药剂缓释载体,其中,所述多糖类包含选自肝素及硫酸软骨素中的至少一种。
5.根据前述1~4中任一项所述的药剂缓释载体,其中,所负载的药剂包含生长因子。
6.根据前述5所述的药剂缓释载体,其中,所述生长因子为选自成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)及表皮生长因子(EGF)中的至少一种。
7.根据前述1~6中任一项所述的药剂缓释载体,其中,所述多孔质体的拉伸强度为0.1~400kPa。
发明的效果
根据本发明,可以提供药剂缓释率高、药剂缓释速度可控、强度高、容易处理,还由于生物亲和性高从而对皮肤温和,且保水性高,能够有效保持药剂的药剂缓释载体。
具体实施方式
〔药剂缓释载体〕
本发明的药剂缓释载体的特征在于使用了丝纤蛋白多孔质体。
这里,丝纤蛋白多孔质体是指含有丝纤蛋白的优选具有1~300μm的平均细孔径的多孔质体。
构成本发明的药剂缓释载体的丝纤蛋白多孔质体具有优异的缓释性,不实施处理即可直接使用,但为了控制缓释速度优选进行表面处理后使用。作为表面处理方法,没有特别限定,可以列举γ射线、电子束、等离子体处理等物理性处理。
此外,可以列举臭氧、盐酸等氧化剂处理;利用氢氧化钠水溶液等进行的碱处理;使用具有醛基、环氧基等反应性基团的试剂的化学修饰处理;使用水溶性高分子、低分子材料的处理等。这些中,为了保持丝纤蛋白多孔质体的性质,能够在温和条件下进行处理的方法是理想的,优选用水溶性高分子进行处理。
作为前述水溶性高分子,优选对生物体的安全性高的材料,具体而言优选多糖类、聚氨基酸。作为多糖类,可以优选列举淀粉、纤维素、几丁质、壳聚糖、琼脂糖、卡拉胶、肝素、硫酸软骨素、透明质酸、果胶等。此外,也可以使用对这些多糖类进行化学修饰而得的羧甲基纤维素等。
此外,作为聚氨基酸,可以优选列举聚赖氨酸、聚海藻酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸等。本发明中,这些多糖类、聚氨基酸可以单独使用或者将多种组合使用。
本发明中,通过使用实施了表面处理等的丝纤蛋白多孔质体,能够维持高药剂缓释率并使缓释速度容易控制。此外,通过使用前述多糖类或聚氨基酸等的浓度高的材料作为水溶性高分子,能够获得具有更快的缓释速度的药剂缓释载体。
这些多糖类或聚氨基酸优选溶解于例如水、缓冲液、生理盐水等中来使用,此时的浓度优选为0.05~50U/ml,更优选为0.1~45U/ml,进而优选为0.2~35U/ml。当浓度在前述范围内时,随着浓度增大,能够有效地获得更快的缓释速度。此外,通过调整该浓度还能够容易地控制缓释速度。
丝纤蛋白多孔质体的拉伸强度优选为0.1kPa~400kPa。当为0.1kPa以上时,具有充分的强度,作为药剂缓释载体时容易处理,药剂缓释载体在皮肤上的残留变少。另一方面,当为400kPa以下时,与皮肤的密合性得以保持。从以上观点出发,拉伸强度更优选为1kPa~300kPa,进而优选为5kPa~200kPa。
本发明的药剂缓释载体优选保持所吸收的水分的保水率高。保水率高则吸收的渗出液不易流出。更具体而言,通过下述方法计算的保水率优选为85~100%。当保水率为85%以上时,渗出液被保持而不会流出。从以上观点出发,丝纤蛋白多孔质体的保水率更优选为87~100%,进而优选为90~100%。
(保水率的计算方法)
保水率为按照下述方式计算而得到的值。将多孔质体成形为60×30×20mm作为测定试样,测定在纯水中充分浸渍后的试样的重量(Wc)。将其再次在纯水中充分浸渍,将表面被纯水润湿的玻璃制平板(松浪玻璃制,MSA coat microslide glass,76×52mm)倾斜45度地设置,在其上按照面积最大的面(60×30mm的面)处于下方且长度方向沿着上下方向的方式放置试样,静置10分钟。然后,测定试样的重量(Wd),用试样的重量(Wc)及(Wd)通过下述式计算,将获得的值作为保水率。
保水率(%)=100-(Wc-Wd)×100/(Wc)
多孔质体的吸水速度优选为0.1~1000μl/s,更优选为1~100μl/s,进而优选为20~30μl/s。当吸水速度为0.1μl/s以上时,能够迅速吸收渗出液,因此向药剂缓释载体之外的泄露少。当吸水速度为1000μl/s以下时,能够防止药剂缓释载体过度吸收渗出液,能够保持接触部的湿润状态。
此外,蒸发速度优选为0.01~0.2g/m2/s,更优选为0.03~0.15g/m2/s,进而优选为0.06~0.1g/m2/s。当蒸发速度为0.01以上时,可以保持药剂缓释载体能够持续吸收渗出液的状态。另一方面,当蒸发速度为0.2g/m2/s以下时,能够使本发明的药剂缓释载体有效地保持湿润状态。在此,吸水速度及蒸发速度为按照下述方式获得的值。当多孔质层的吸水速度及蒸发速度在前述范围内时,可以获得优异的本发明效果。
(吸水速度的计算方法)
将纯水100μl滴加至丝纤蛋白多孔质体,测定直至纯水被吸收为止的时间。吸水速度为用测得的时间通过下述式计算出的值。进行5次测定,将其平均值作为吸水速度。
吸水速度(μl/s)=纯水滴加量/吸水所需要的时间
对本发明的药剂缓释载体的形状没有限制,可以根据需要适当选择,从易于使用的观点出发优选为片状。此外,其尺寸可以任意设定,片的厚度可以根据药剂的给药量设定任意厚度。
对可包含于本发明的药剂缓释载体中的药剂没有特别限定,例如优选列举出动物体内的促进特定细胞的增殖、分化的内源性蛋白质,即,表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、酸性成纤维细胞生长因子(a-FGF)等成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)等生长因子,以及盐酸苯海拉明、氯苯那敏、二苯基咪唑等抗组胺剂;氢化可的松、泼尼松龙、对氟米松、丙酸倍氯米松、氟米松、倍他米松、丙酸倍氯米松、地塞米松、去炎松、曲安奈德、氟轻松、肤轻松、肤轻松醋酸酯、丙酸氯倍他索等皮质类固醇类;对乙酰氨基酚、甲芬那酸、氟芬那酸、吲哚美辛、双氯芬酸、阿氯芬酸、羟布宗、保泰松、布洛芬、氟比洛芬、水杨酸、水杨酸甲酯、L-薄荷醇、樟脑等镇痛消炎剂;青霉素、土霉素、硫酸新霉素、红霉素、氯霉素、头孢氨苄、四环素等抗生素;维生素A、麦角钙化醇、胆钙化醇、奥托硫胺、核黄素丁酸酯等维生素剂;苯佐卡因、利多卡因、氨基苯甲酸乙酯等麻醉剂等。这些药剂可以单独使用或将多种组合使用。
此外,除了前述药剂以外还可以根据需要配合吸收助剂,例如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、N,N-二乙基间三酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、透明质酸、水杨酸、克罗他米通(crotamiton)、癸二酸二乙酯、月桂醇、二甲基亚砜、去甲基亚砜(desmethyl sulfoxide)等。通过配合这些吸收助剂,能够促进皮肤本身所形成的屏障膜的药剂吸收,并对药剂赋予促进向血液中渗透的功能。
前述药剂的添加量根据所选择的药剂适当确定,作为标准,按照使药剂缓释载体吸收约1μg~300mg/12cm2(厚度2mm)的药剂的方式进行添加。
前述药剂通过浸渗或涂布于丝纤蛋白多孔质体从而可以保持于其中。此外,这些药剂可以使用1种或组合2种以上而使用。
前述药剂的配方中,可以使用溶剂。作为其中使用的溶剂,优选对人体无害且相对于所使用的药剂为化学惰性的溶剂,只要能够溶解或分散所使用的药剂则没有特别限定。具体而言,可以单独使用水、多元醇,或使用将2种以上组合而成的混合体系溶剂。从对人体的安全性的观点出发,最优选水。作为多元醇,可以优选列举例如甘油、丙二醇、山梨糖醇等。
此外,为了提高药剂在溶解于溶剂中的溶解性,可以添加水溶性聚合物。作为水溶性聚合物,可以优选列举例如明胶、海藻酸钠、黄芪胶、淀粉类、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠等。
本发明的药剂缓释载体如前所述优选为片状,作为其使用形态,可以优选列举例如:将片状的丝纤蛋白多孔质体用敷料膜(dressing film)、绷带、粘合带等固定的形态。通过使用敷料膜等,能够防止在对丝纤蛋白多孔质体施加压力时以及与其接触时与体液的接触和漏出等,能够提供适合于湿润疗法的环境。此外,也可以用作消化管内、体内的药剂缓释载体。
为了使药剂从药剂缓释载体缓慢释放,优选使该药剂缓释载体、即丝纤蛋白多孔质体预先呈湿润状态。例如在有渗出液的创面进行湿润疗法时,可以借助渗出液使缓慢释放出的药剂渗透患部。在无渗出液时,可以通过生理盐水等使其呈湿润状态后使用。
〔丝纤蛋白多孔质体的制造方法〕
以下说明丝纤蛋白多孔质体的制造方法。
本发明中使用的丝纤蛋白多孔质体例如可以通过在丝纤蛋白水溶液中添加特定的添加剂、使该水溶液冻结后再融解而制造。
这里使用的丝纤蛋白可以是家蚕、野蚕、天蚕等蚕所产生的任一者,对其制造方法没有特别限制。丝纤蛋白溶解性差,难以直接溶解于水。为了获得丝纤蛋白水溶液,可以使用公知的任何方法,将丝纤蛋白溶解于高浓度的溴化锂水溶液后,经历透析脱盐、风干浓缩的方法由于简便而优选。
丝纤蛋白多孔质体的制造方法中,优选丝纤蛋白的浓度在添加后述添加剂等而成的丝纤蛋白水溶液中为0.1~40质量%,更优选为0.5~20质量%,进而优选为1.0~12质量%。通过设定在该范围内,能够高效地制造具有充分强度的多孔质体。
作为前述添加剂,可以优选列举例如有机溶剂、脂肪族羧酸、氨基酸等。对添加剂没有特别限制,优选为水溶性的添加剂,更优选在水中的溶解度高的添加剂。此外,作为丝纤蛋白多孔质体的制造中使用的脂肪族羧酸,优选pKa为5.0以下者,更优选pKa为3.0~5.0者,进而优选pKa为3.5~5.0者。
作为前述有机溶剂,可以优选列举例如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、甘油、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶、乙腈、丙酮等。这些有机溶剂可以单独使用或者将2种以上组合使用。
作为前述脂肪族羧酸,可以优选使用例如碳原子数为1~6的饱和或不饱和的一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸,更具体而言,可以优选列举出例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、乳酸、丙烯酸、2-丁烯酸、3-丁烯酸等。这些脂肪族羧酸可以单独使用或者将2种以上组合使用。
作为前述氨基酸,可以优选列举例如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸等单氨基羧酸;天冬氨酸、谷氨酸等单氨基二羧酸(酸性氨基酸)等脂肪族氨基酸;苯丙氨酸等芳香族氨基酸;羟脯氨酸等具有杂环的氨基酸等,其中,从易于调整形状的观点出发,优选酸性氨基酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸等含羟基氨基酸(oxyamino acid)。从同样的观点出发,酸性氨基酸中更优选单氨基羧酸,特别优选天冬氨酸、谷氨酸,含羟基氨基酸中优选羟脯氨酸。这些氨基酸可以单独使用任一种或将2种以上组合使用。
另外,氨基酸中有L性和D型的光学异构体,由于使用L性和D型时所得到的丝纤蛋白多孔质体在结构、机械特性方面看不出差异,所以可以使用任一种类型的氨基酸。
丝纤蛋白水溶液中的添加剂的含量相对于丝纤蛋白水溶液的总量优选为0.1~18质量%,更优选为0.1~5.0质量%,进而优选为0.2~4.0质量%。通过设定在该范围内,能够制造具有充分强度的丝纤蛋白多孔质体。此外,当为18.0质量%以下时,将在丝纤蛋白水溶液中添加了前述添加剂而成的丝纤蛋白水溶液静置时,该水溶液不易凝胶化,可以稳定地获得优质的丝纤蛋白多孔质体。
然后,将添加了前述添加剂的丝纤蛋白水溶液流入模具或容器中,放入低温恒温槽中使其冻结,然后融解,经上述工序制造丝纤蛋白多孔质体。关于冻结温度,只要是使含有添加剂的丝纤蛋白水溶液冻结的温度即可,没有特别限制,优选为-10~-30℃左右。此外,关于冻结时间,为了充分冻结且能够使冻结状态保持一定时间,优选在规定的冻结温度下冻结4小时以上。
另外,作为冻结的方法,可以一次性将丝纤蛋白水溶液降温至冻结温度进行冻结,但从获得力学强度高的丝纤蛋白多孔质体的角度出发,优选暂时在-5℃左右保持2小时左右使其为过冷却状态,然后降温至冻结温度进行冻结。通过调整由-5℃至冻结温度所花的时间,能够在一定程度上控制丝纤蛋白多孔质体的结构、强度。
然后,将冻结的丝纤蛋白水溶液融解,从而可以获得丝纤蛋白多孔质体。对融解的方法没有特别限制,除了自然融解外,可以优选列举出在恒温槽内保管的方法等。
获得的丝纤蛋白多孔质体中含有前述添加剂,根据用途需要除去添加剂时,可以通过适当的方法从丝纤蛋白多孔质体中除去添加剂。例如,作为最简便的方法,可以列举出将丝纤蛋白多孔质体浸渍在纯水中除去添加剂的方法。或者,通过将丝纤蛋白多孔质体冷冻干燥,还能够同时除去添加剂和水分。
该丝纤蛋白多孔质体可以通过适当选择制作该多孔质体时的模具、容器而制成片状、块状、管状、球状等与目的相应的形状。本发明中,如前所述优选为片状。
作为模具、容器,只要是丝纤蛋白水溶液不会流出的形状、形态即可,没有限制,作为其材料,从获得结构均一的丝纤蛋白多孔质体的观点出发,优选使用铁、不锈钢、铝、金、银、铜等导热率高的材料。此外,关于模具、容器的壁厚,从其功能和防止冻结时膨胀等所致的变形等的观点出发,优选为0.5mm以上,从操作容易、冷却效率的观点出发,更优选为1~3mm。
此外,可以在这里所使用的模具、容器的内侧的与丝纤蛋白水溶液接触的内壁面设置片层。由此,能够在丝纤蛋白多孔质体的表面配置薄膜层。即,能够获得具有多孔质层和薄膜层的丝纤蛋白多孔质体。这里,多孔质层为具有存在多个细孔的海绵状多孔质结构的层,薄膜层为实质上不具有细孔的层。
可以通过设置在模具、容器的内壁面的片层的特性来控制薄膜层的结构、厚度。
作为片层中使用的片,可以优选列举由聚四氟乙烯(PTFE)、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(FEP)、四氟乙烯-全氟烷基乙烯基醚共聚物(PFA)等含氟树脂所形成的片,或由聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯(PP)等形成的经过脱模处理的片等。使用这些片时能够获得细孔少、平滑的薄膜层。此外,在不希望设置薄膜层时,也可以设置滤纸等表面粗糙的片。可以根据丝纤蛋白多孔质体的用途适当选择使用这些片。此外,片优选使用的是难以妨碍热传导的厚度为1mm以下的片。
可以在前述融解工序之后经历切削工序而获得丝纤蛋白多孔质体。在优选用作本发明的体外用药剂缓释载体的片形状中,在为仅包含多孔质层的多孔质体时,除了通过选择容器的材质以外,还可以通过切除薄膜层来选择表面结构。由此能够获得由仅包含多孔质层的多孔质体构成的片。具体而言,例如可以如下获得:使用其内壁面设置有特氟龙(注册商标)片等片的块状的模具或容器,从该模具或容器取出后,除去四个侧面的薄膜层,切削多孔质层的部分,从而获得。此外,使用在其内壁面的仅一面设置有特氟龙(注册商标)片等片、内壁面的其它面设置有滤纸的模具或容器,也能够获得仅一面具有薄膜层的多孔质体。
通过设置前述片层而使丝纤蛋白多孔质体具有前述薄膜层时,液状的药剂经由细孔移动的速度及蒸发、扩散的速度变慢,因此液体透过性变差。因此,作为具有薄膜层的丝纤蛋白多孔质体的使用方式,可以优选列举使多孔质层接触皮肤、与皮肤相对的对向面具有薄膜层的方式。这是由于,使用这样的体外用药剂缓释载体时,能够有效地保持液状的药剂,具有抑制该药剂的蒸发、扩散的效果。
此外,薄膜层的细孔数量是可以控制的,还可以根据需要制成具有少量细孔的薄膜层。此外,薄膜层由于细孔极少,因此与多孔质层相比表面平滑。因此,还可以使用该薄膜层作为皮肤侧,通过控制液体透过性来控制药剂的缓释速度。
这样,本发明的药剂缓释载体根据其制造方法可以获得如下的丝纤蛋白多孔质体,因此能够容易地应对各种用途,该丝纤蛋白多孔质体具有仅包含多孔质层的结构;具有多孔质层和薄膜层的结构,并且该薄膜层具有各种性状而具有各种结构。
实施例
以下通过实施例更具体的说明本发明,但本发明不受这些实施例任何限定。
实施例1
(丝纤蛋白水溶液的制备)
丝纤蛋白水溶液如下获得:将丝纤蛋白粉末(KB SEIREN,LTD.制造,商品名:“Fibroin IM”)溶解于9M溴化锂水溶液中,通过离心分离除去不溶物后,相对于超纯水反复透析,从而获得。将获得的丝纤蛋白水溶液在透析管中风干、浓缩。在该浓缩液中加入作为添加剂的甲酸水溶液,制备丝纤蛋白浓度为5质量%、甲酸浓度为2质量%的丝纤蛋白水溶液。
(丝纤蛋白多孔质体的制造)
使该丝纤蛋白水溶液流入用铝板制作的模具(内侧尺寸:80mm×40mm×4mm)中,放入低温恒温槽(EYELA公司制,NCB-3300),冻结保存。
(冻结条件)
就冻结而言,预先将低温恒温槽冷却到-5℃,将流入了丝纤蛋白水溶液的模具放入该低温恒温槽中并保持2小时,然后冷却到-20℃后在该温度下保持5小时。
通过自然解冻使冻结的试样恢复至室温后,将其从模具中取出,浸渍于超纯水中,1天交换2次超纯水,交换3天,从而除去使用的甲酸。
(力学特性的测定方法)
用INSTRON公司制微型试验机5548型对获得的丝纤蛋白多孔质体的力学特性进行评价。从制作的丝纤蛋白多孔质体切出40mm×4mm×4mm的试验片,在2mm/min的条件下拉伸该试验片,测定此时的最大断裂强度(拉伸强度)和最大应变(伸长率)。此外,由对强度和应变作图时的斜率求出弹性模量。其结果示于表1。此外,测定结果表示的是由制作的多孔质体制作5片试验片并从不同日期制作的多孔质体切出5片试验片、对这10片进行测定而得的平均值。
此外,用扫描电子显微镜观察获得的丝纤蛋白多孔质体的结构。扫描电子显微镜使用的是Philips公司制的XL30-FEG,在低真空无蒸镀模式、加速电压10kV下进行测定。此外,就丝纤蛋白多孔质体的结构而言,并非是观察多孔质体的表面,而是观察切断多孔质体露出的内部。获得的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片示于图1。
实施例2~23
在实施例1中分别使用表1所述的添加剂代替甲酸,除此以外与实施例1同样进行,获得丝纤蛋白多孔质体。此外,在实施例10~12中,将添加剂的浓度设为1质量%(参照表2)。获得的丝纤蛋白多孔质体的力学特性、保水率、及吸水速度的评价结果示于表1及表2。此外,获得的多孔质体的剖面的扫描电子显微镜照片分别示于图2~23。保水率、及吸水速度为按照前述方式测得的值。
比较例1
使用市售的聚氨酯海绵(住友3 M公司制)切出测定用样品(60mm×30mm×20mm),测定保水率,其结果示于表1。
[表1]
[表2]
由图1可以确认构成实施例1中获得的丝纤蛋白多孔质体的多孔质层具有较薄的壁和数十μm的细孔,由图2~23可以确认实施例2~23中分别获得的丝纤蛋白多孔质体也具有与实施例1中获得的多孔质体相同的结构。
由表1的结果可以确认实施例1~23中获得的丝纤蛋白多孔质体的保水率在97%~99%的较高范围,高于比较例1,所吸收的渗出液不易流出,具有保持性能。此外,由表2的结果可以确认实施例1~23中获得的丝纤蛋白多孔质体的吸水速度在20~40(μL/s)的范围,小于比较例1,渗出液向药剂缓释载体之外的泄露少,具有防止过度吸收渗出液、保持接触部的湿润状态的性能。
实施例24~26
作为与丝纤蛋白多孔质体的安全性相关的非临床试验的一个环节,进行了人体斑贴试验(皮肤致敏性斑贴试验)。该人体斑贴试验(皮肤致敏性斑贴试验)用于判断丝纤蛋白多孔质体对人体皮肤的刺激性或是否会引发过敏性接触皮炎。
实施例24~26中使用的丝纤蛋白多孔质体,是在实施例1中将用铝板制作的模具的内侧尺寸设为264mm×205mm×1mm、将添加剂由甲酸分别换成天冬氨酸(与实施例12相同)、乳酸(与实施例6相同)、及琥珀酸(与实施例5相同)且除此以外与实施例1同样操作而获得的丝纤蛋白多孔质体。为了将这些丝纤蛋白多孔质体片供于试验而切断为10mm×10mm×1mm厚度,分别设为实施例25~27的斑贴。
人体斑贴试验(皮肤致敏性斑贴试验)在试验开始时以50名健康的18岁~65岁的日本女性为对象来进行。将前述尺寸的斑贴用20mm×20mm的低刺激性胶带固定在后背,各斑贴间隔至少15mm地进行固定。此外,为了进行比较,用20mm×20mm的低刺激性胶带固定10mm×10mm的棉无纺布。在固定开始起48小时后摘除所固定的斑贴并观察皮肤反应。进而,在同一位置粘贴斑贴,48小时后进行观察。重复进行总计9次的粘贴和观察。此外,在2周后,每隔48小时在相同位置粘贴斑贴并观察,重复进行4次。
其结果是,试验过程中,实施例24及25中两名被检者各出现一次非常轻度的红斑,结果是试验中红斑也消失,可知片状的丝纤蛋白多孔质体刺激性非常低,无变应致敏性。
此外,实施例26在试验过程中,一名被检者出现一次非常轻度的红斑,结果是试验中红斑也消失,可知片状的丝纤蛋白多孔质体刺激性非常低,无变应致敏性。
实施例27
除了将用铝板制作的模具的尺寸设为130mm×80mm×12mm(内侧尺寸)以外,与实施例6同样操制作造丝纤蛋白多孔质体。
作为与丝纤蛋白多孔质体的安全性相关的非临床试验的一个环节,进行了皮肤一次刺激性试验及皮肤致敏性试验。此外,本试验以“申請資料の信頼性の基準(申请资料的可靠性的基准)”(薬事法施行規則第43号(药事法施行规则第43号))为基准,按照“医療用具の製造(輸入)承認申請に必要な生物学的安全性試験の基本的考え方について(关于医疗用具的制造(进口)认可申请所需的生物学安全性试验的基本考虑)”(2003年2月13日医药审发第0213001号)和“生物学的安全性試験の基本的考え方に関する参考資料について(关于生物学安全性试验的基本考虑的相关参考资料)”(2003年3月19日医疗仪器审查No.36)进行。
(皮肤一次刺激性试验)
将如前述那样获得的丝纤蛋白多孔质体切出5mm×5mm×5mm的尺寸,作为试验片(仅包含多孔质层的丝心蛋白多孔质体)。
然后,将丝纤蛋白多孔质体的生理盐水提取液及芝麻油液提取物涂布于兔子,研究有无局部刺激性(组织损害及炎症诱发性)。具体而言,在前述试验片上添加生理盐水或芝麻油并在高压釜内在120℃、1小时的条件下进行提取,作为各试验液。此外,仅将提取溶剂(生理盐水或芝麻油液)在相同条件下处理,作为对照液。关于给药,每种溶剂使用雄兔6只,对每只的背部的无伤皮肤、擦伤皮肤分别给药0.5mL试验液及对照液。
生理盐水提取的试验液中,6例中的3例在给药后1小时确认到极轻度或轻微的红斑。在作为对照液的生理盐水的情况下也观察到该红斑,与对照液为同等程度。另外,一次刺激性指数为0.3,判断为“可以忽略程度的刺激性”。
芝麻油液提取液中,6例中的4例在给药后1小时确认到极轻度的红斑。在作为对照液的芝麻油液的情况下也观察到该红斑,与对照液为同等程度。另外,一次刺激性指数为0.1,判断为“可以忽略程度的刺激性”。
(皮肤致敏性试验)
通过最大限度试验法(Maximization Test),使用10只雄性豚鼠对本实施例27制造的丝纤蛋白多孔质体的甲醇提取液研究对于豚鼠皮肤有无致敏性。
在皮肤致敏性试验前,为了确定适当的提取溶剂,使用丙酮和甲醇计算了提取率。其结果是,与丙酮相比,甲醇显示出更高的提取率,因此将皮肤致敏性试验中使用的提取溶剂设为甲醇。
对由本实施例27制造的丝纤蛋白多孔质体切出的前述试验片添加甲醇10mL,在室温下使用恒温渗透培养机进行提取。提取进行24小时以上。作为对照组,设置用橄榄油致敏的阴性对照组及用1-氯-2,4-二硝基苯致敏的阳性对照组。各对照组的动物数分别设为5只。
试验液给药组及阴性对照组均用提取液的6.25、12.5、25、50及100质量%液以及丙酮进行诱发,结果诱发后24、48及72小时的任一观察时期均未观察到皮肤反应。
另一方面,阳性对照组中,在0.1质量%的1-氯-2,4-二硝基苯的诱发下,5例全部于诱发后,在24、48及72小时后确认到明显的阳性反应。
由该试验结果可以判断,本实施例27制造的丝纤蛋白多孔质体中不存在显示皮肤致敏性的物质。
这样,本实施例27制造的丝纤蛋白多孔质体为“可以忽略程度的皮肤刺激性”,“不存在显示皮肤致敏性的物质”,因此可以确认安全性高,适合用作本发明的药剂缓释载体。
实施例28
为了确认丝纤蛋白多孔质体对细胞没有有害性,在预先进行平面培养的成纤维细胞培养皿中静置实施例2中获得的丝纤蛋白多孔质体。当丝纤蛋白多孔质体自身或由丝纤蛋白多孔质体溶出的成分对细胞具有毒性时,应当会以丝纤蛋白多孔质体为中心发生成纤维细胞的脱离、或培养的细胞全部脱落。但是,如图24所示,丝纤蛋白多孔质体的表面自身并不具有细胞毒性,细胞迁移、接近至静置的丝纤蛋白多孔质体周围,并未确认到形成抑制圈的现象。另外,图24中的上部(深色部分)为丝纤蛋白多孔质体侧。
在确认了无毒性后,在丝纤蛋白多孔质体的表面接种成纤维细胞,按照常规方法培养细胞2周。在确认了接种在丝纤蛋白多孔质体的表面的成纤维细胞在一定时期后迁移至培养皿、培养皿表面也培养了成纤维细胞后,取出丝纤蛋白多孔质体进行组织染色。
预测在之前的研究中不具有毒性的丝纤蛋白多孔质体的细胞亲和性优异,细胞在该丝纤蛋白多孔质体的细孔中和其表面迁移、伸展、增殖,但如图25所示,在该丝纤蛋白多孔质体的表面未确认到成纤维细胞的粘附和与此相伴的增殖、向多孔质体的孔中迁移和增殖。图25中,深色部分为成纤维细胞。
因此,对作为与丝纤蛋白多孔质体具有同等空隙率的由猪胶原精制得到的止血材料的明胶海绵(Astellas Pharma Inc.制,Spongel)也进行了同样的比较试验。其结果如图26所示,细胞亲和性极高、细胞在空隙内迁移伸展、增殖。可知,这种情况下明胶海绵虽然能够用于创伤面的止血、对缺损部位的填充,但由于其细胞粘附性,无法避免与创伤部周围的粘连。
另一方面,丝纤蛋白多孔质体由于无细胞毒性、同时富有组织亲和性但缺乏细胞粘附性,因此与周围组织没有相互作用,能够防止与损伤部位的组织修复相伴随的与周围正常组织的相互作用(粘连)。由此可知,丝纤蛋白多孔质体还发挥优异的防粘连材料的作用。另外,虽然被称为明胶薄膜的防粘连薄膜也有售,但该明胶薄膜的细胞粘附性高,因此两侧组织会介由明胶薄膜自身而粘连。
基于这些结果,在小鼠皮下埋植了由本发明中使用的丝纤蛋白多孔质体制成的蚕丝海绵盘,研究了异物和粘连性试验。如图27所示,本发明中使用的丝纤蛋白多孔质体虽然在动物实验中确认到与植埋部位的单侧发生粘附,但没有观察到对两侧粘膜的粘附(粘连),显示了优异的防粘连效果。
进而,研究了使用了丝纤蛋白多孔质体的药剂缓释载体的药剂缓释性。
实施例29
将丝纤蛋白多孔质体的浓度设为3质量%,将甲酸变更为醋酸,除此以外与实施例1同样制作了丝纤蛋白多孔质体(直径1mm、厚度2mm的圆筒形样品),将其在磷酸缓冲盐水(PBS)中浸渍约1小时,在25℃的室温下风干。然后,使在该磷酸缓冲盐水(PBS)中含有500ng的表皮生长因子(EGF)(和光纯药工业(株)制)的水溶液浸渗至丝纤蛋白多孔质体中至饱和。另外,调整为丝纤蛋白多孔质体片中包含500ng的生长因子。对于该丝纤蛋白多孔质体,在12孔培养皿(Becton,Dickinson and Company.制)中静置浸渗了生长因子的丝纤蛋白多孔质体,添加1mL达尔伯克氏改良伊格尔(Dulbeccos Modified Eagle,DME)培养基(株式会社GIBCO制),在湿度环境(条件:37℃、95%以上、5%CO2)下静置。24、48、96小时后经时采集培养基,在此后的测定之前在-80℃下保管。
表皮生长因子(EGF)的测定如下进行。
使用人EGF测定EIA试剂盒(R&D(株))。即,在抗EGF抗体固定化96孔微孔板中添加0.1mL所获得的培养基,37℃下反应2小时。然后,使用含有表面活性剂的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤各孔5次,然后添加过氧化物酶标记抗EGF第二抗体,室温下反应1小时。同样洗涤5次后,添加显色剂,室温下反应20分钟。添加反应终止剂并使用酶标仪在450nm下测定所获得的显色。利用同样制作的标准曲线计算缓释量(W1)。使用获得的缓释量(W1)由下述式计算的表皮生长因子(EGF)的缓释率的结果示于图28。
(EGF缓释率(%))=(培养液中的EGF缓释量(W1))/500ng×100
实施例30
实施例29中,除了预先在0.3U/mL的肝素(持田制药(株)制)的磷酸缓冲盐水(PBS)水溶液中浸渍约1小时后、在25℃的室温中风干使用,除此以外与实施例29同样制作丝纤蛋白多孔质体。对获得的丝纤蛋白多孔质体与实施例29同样进行了评价。其结果示于图28。
实施例31
除了将肝素浓度变更为3U/mL以外,与实施例30同样制作丝纤蛋白多孔质体并进行评价。其结果示于图28。
实施例32
除了将肝素浓度变更为30U/mL以外,与实施例30同样制作丝纤蛋白多孔质体并进行评价。其结果示于图28。
如图28所示,由实施例29~32的结果可以确认,预先用肝素的磷酸缓冲盐水(PBS)水溶液对丝纤蛋白多孔质体进行表面处理时,能够根据肝素的浓度对表皮生长因子(EGF)的缓释速度(缓释时间)进行控制。更具体而言,可以确认:虽然肝素的浓度越高越有些许达到上限的倾向,但缓释速度(缓释时间)有变得越快的倾向。此外,缓释率为98%以上。
实施例33
实施例29中,除了预先在30U/mL的肝素(持田制药(株)制)的磷酸缓冲盐水(PBS)水溶液中浸渍约1小时后、在25℃的室温中风干使用,除此以外与实施例29同样制作丝纤蛋白多孔质体。在获得的丝纤蛋白多孔质体(直径1mm、厚度2mm的圆筒形样品)中浸渗在磷酸缓冲盐水(PBS)中含有500ng的血小板源性生长因子(PDGF)(Sigma/Aldrich Japan(株)制)的水溶液至饱和。另外,调整为丝纤蛋白多孔质体片中包含500ng的生长因子。对于该丝纤蛋白多孔质体,在12孔培养皿(Becton,Dickinson and Company.制)中静置浸渗了生长因子的丝纤蛋白多孔质体,添加1mL达尔伯克氏改良伊格尔(DME)培养基(GIBCO株式会社制),在湿度环境(条件:37℃、95%以上、5%CO2)下静置。6、12、48、96小时后经时采集培养基,在此后的测定之前均在-80℃下保管。
血小板源性生长因子(PDGF)的测定如下进行。
使用人PDGF-BB测定EIA试剂盒(R&D(株)制)。即,在抗PDGF抗体固定化96孔微孔板中添加0.1mL所获得的培养基,37℃下反应2小时。然后,使用含有表面活性剂的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤各孔5次,然后添加过氧化物酶标记抗PDGF第二抗体,室温下反应1小时。同样洗涤5次后,添加显色剂,室温下反应20分钟。添加反应终止剂并使用酶标仪在450nm下测定所获得的显色。利用同样制作的标准曲线计算PDGF缓释量(W2)。将由下述式计算的缓释率的结果作为血小板源性生长因子(PDGF)向培养液的缓释率,并示于图29。
(PDGF缓释率(%))=(培养液中的PDGF缓释量(W2))/500ng×100
直至96小时后为止具有90.6%的血小板源性生长因子(PDGF)的缓释率,可以确认血小板源性生长因子(PDGF)释放了4天。
实施例34
实施例29中,除了预先在3U/mL的肝素(持田制药(株)制)的磷酸缓冲盐水(PBS)水溶液中浸渍约1小时后、在25℃的室温中风干使用,除此以外与实施例29同样制作丝纤蛋白多孔质体。在获得的丝纤蛋白多孔质体(直径1mm、厚度2mm的圆筒形样品)中浸渗在磷酸缓冲盐水(PBS)中含有500ng的碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)(科研制药(株)制)的水溶液至饱和。另外,调整为丝纤蛋白多孔质体片中包含500ng的生长因子。对于该丝纤蛋白多孔质体,在12孔培养皿(Becton,Dickinson and Company.制)中静置浸渗了生长因子的丝纤蛋白多孔质体,添加1mL达尔伯克氏改良伊格尔(DME)培养基(GIBCO株式会社制),在湿度环境(条件:37℃、95%以上、5%CO2)下静置。96小时后经时采集培养基,在此后的测定之前在-80℃下保管。
碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)的测定如下进行。
使用人b-FGF测定EIA试剂盒(R&D(株)制)。即,在抗b-FGF抗体固定化96孔微孔板中添加0.1mL所获得的培养基,37℃下反应2小时。然后,使用含有表面活性剂的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤各孔5次,然后添加过氧化物酶标记抗b-FGF第二抗体,室温下反应1小时。同样洗涤5次后,添加显色剂,室温下反应20分钟。添加反应终止剂并使用酶标仪在450nm下测定所获得的显色。利用同样制作的标准曲线计算b-FGF缓释量(W3)。将由下述式计算出的缓释率结果作为碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)向培养液的缓释率,并示于图30。
(b-FGF缓释率(%))=(培养液中的b-FGF缓释量(W3))/500ng×100
96小时后碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)的缓释量达到约75%,显示出高缓释率。
产业上的利用可能性
根据本发明,能够提供药剂缓释率高、药剂缓释速度可控、强度高、容易处理,还由于生物亲和性高从而对皮肤温和,且保水性高,能够有效保持药剂的药剂缓释载体。
Claims (8)
1.一种药剂缓释载体,其使用了丝纤蛋白多孔质体,所述丝纤蛋白多孔质体用水溶性高分子表面处理过,其中,所述水溶性高分子为包含选自多糖类及聚氨基酸中的至少一种的材料。
2.根据权利要求1所述的药剂缓释载体,其中,所述多糖类包含选自肝素及硫酸软骨素中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的药剂缓释载体,其中,所负载的药剂包含生长因子。
4.根据权利要求3所述的药剂缓释载体,其中,所述生长因子为选自成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)及表皮生长因子(EGF)中的至少一种。
5.根据权利要求1或2所述的药剂缓释载体,其中,所述多孔质体的拉伸强度为0.1~400kPa。
6.根据权利要求3所述的药剂缓释载体,其中,所述多孔质体的拉伸强度为0.1~400kPa。
7.根据权利要求4所述的药剂缓释载体,其中,所述多孔质体的拉伸强度为0.1~400kPa。
8.根据权利要求1或2所述的药剂缓释载体,其中,所述多糖类选自肝素及硫酸软骨素,所述聚氨基酸选自聚赖氨酸、聚海藻酸、聚天冬氨酸和聚谷氨酸。
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