CN112569399A - 一种双层皮肤结构水凝胶复合支架的光交联/静电纺丝制备和应用 - Google Patents

一种双层皮肤结构水凝胶复合支架的光交联/静电纺丝制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双层皮肤结构水凝胶复合支架的光交联/静电纺丝制备和应用。所述复合支架以明胶静电纺丝纤维膜为基底，在其一面经光交联作用制备圆柱状明胶水凝胶，即为双层皮肤结构水凝胶复合支架。本申请所述复合支架具有双层结构，其中纤维膜相当于皮肤的表皮层，能够能阻挡异物和病原侵入，并能防止组织液丧失；图案化圆柱状明胶不仅可以支持细胞生存力和细胞粘附，还可以促进细胞迁移和增殖，促进皮肤组织的再生和形成；且其独特的形状，在保证复合支架与创伤贴合度良好的同时，还具有很好的透气性，较大的孔隙率和孔径，有利于伤口氧气及营养物质的运输，此外还能够促进创伤处血管的生成，其降解速度与创伤愈合周期接近，有利于创伤愈合。

Description

一种双层皮肤结构水凝胶复合支架的光交联/静电纺丝制备 和应用
技术领域
本发明涉及生物组织支架技术领域，更具体地，涉及一种双层皮肤结构水凝胶复合支架的光交联/静电纺丝制备和应用。
背景技术
皮肤是人体中最容易受到外界刺激的器官。它在周围环境和人体内部器官之间提供了天然屏障。从组织工程学的角度来看，皮肤的最重要特征是其自我重塑和再生以及替换不断丢失的组织的能力。从解剖学上讲，皮肤组织可分为三层:表皮、真皮以及皮下组织。多年来，组织工程师一直在尝试在体外条件下构建适当的全厚度皮肤等效物，但是，仍然存在许多限制。
理想的皮肤支架应该是具有良好生物相容性和适当的多孔微结构可生物降解的三维支架，以促进细胞粘附，迁移，增殖和分化，并进一步为组织工程构建物提供形式和形状。同时模拟皮肤结构的支架，应该具备传输氧气和营养，清除代谢废物和降低感染风险作用。
基于明胶的支架已被广泛用于皮肤组织再生，具有良好的生物相容性，适当的多孔结构和较低的免疫原性。因此，已有用明胶作为支架材料，制备的伤口敷料。但是，其差的机械性能和快速降解极大地限制了其进一步的应用。且对于无关节的支架而言，快速的血管生成是皮肤再生的巨大挑战，尤其是糖尿病患者的伤口环境，其伤口的快速愈合更难，对于敷料的要求更多。但是，当前大多数用于伤口愈合的敷料，功能较单一，只能满足上述要求的部分功能，不能达到良好的愈合效果。
虽然目前已有双层支架类的敷料，但是其在生物相容性、降解性、细胞粘附性、透气性，以及与伤口的贴合度、营养物质运输、伤口愈合等方面的作用，仍然存在较大的提升空间。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的伤口敷料，其功能单一，且生物相容性、降解性、细胞粘附性、透气性、与伤口的贴合度、营养物质运输、伤口愈合方面存在的缺陷和不足，提供一种光交联/静电纺丝制备的双层皮肤结构水凝胶复合支架。本文采用静电纺丝和光交联方法制备双层皮肤结构水凝胶复合支架，其中以生物相容性良好的明胶经静电纺丝制备的纳米纤维膜具有和细胞外基质相类似的结构，能最大程度上模拟细胞外结构，为细胞的黏附和增殖提供依据；光交联明胶在纳米纤维膜上形成一定间隔的柱状水凝胶，使得复合支架材料具有良好的透气性，较大的孔隙率和孔径，有利于伤口氧气及营养物质的运输；同时，所述复合支架是通过光交联和京尼平进行交联制备得到，既避免了水凝胶的快速降解，同时也避免了交联剂高的细胞毒性。
本发明的另一目的在于提供所述双层皮肤结构水凝胶复合支架的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述光交联/静电纺丝制备的双层皮肤结构水凝胶复合支架制备敷料中的应用。
本发明的还一目的在于提供所述光交联/静电纺丝制备的双层皮肤结构水凝胶复合支架在负载细胞和/或药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种双层皮肤结构水凝胶复合支架，所述复合支架以明胶静电纺丝纤维膜为基底，将明胶光交联溶液经光交联作用在基底一面制备圆柱状明胶水凝胶，即为双层皮肤结构水凝胶复合支架。
明胶是胶原蛋白经过酸法或碱法水解得到的一种衍生蛋白质，由18种氨基酸组成的两性高分子聚电解质，其与胶原的组成相似、性质相近。明胶无抗原性，具有优良的生物相容性、降解性及细胞粘附性，在血浆膨胀剂、止血剂及创伤处理和组织工程等领域有广泛的应用。但是其直接作为敷料应用时，其机械性太差，以及降解速度过快，导致其应用受到限制。本发明通过组合使用光交联/静电纺丝方法制备具有可调节的物理和生物学特性的三维光交联明胶图案化支架(即明胶静电纺丝一面交联圆柱状明胶水凝胶)，图案化明胶支架不仅可以支持细胞生存力和细胞粘附，还可以促进细胞迁移和增殖，促进皮肤组织的再生和形成。类似ECM(细胞外基质)的纳米纤维结构提供了高的表面体积比，不仅可以实现最大的细胞-材料相互作用和材料介导的信号传导，还可以促进快速血管化。
其中，所述复合支架的明胶静电纺丝纤维膜相当于皮肤的表皮层，能够能阻挡异物和病原侵入，并能防止组织液丧失。在模拟糖尿病的伤口环境中，图案化明胶(即圆柱状明胶)降解后，明胶静电纺丝纤维膜还可以维持较长时间，进一步保护伤口，克服了明胶快速降解的缺陷。同时，图案化明胶提高了比表面积，能与皮肤很好的贴合，同时避免伤口的二次伤害。此外，所述复合支架在制备过程中，可以通过调节光交联的时间，以及掩膜的孔径大小，可调节水凝胶的物理性能，包括保水性、降解性等，以适用不同患者的需求。
目前已有类似双层结构的复合支架公开，但是现有技术中其纤维膜采用的与本申请完全不同，其为了保证纤维膜的机械性能，通常采用聚已内酯或聚乙烯醇等材料经纺丝得到纤维膜，这种纤维膜虽然提高了复合支架整体的机械性能，但是其生物相容性以及可降解性能较差，其作为敷料进行应用时，其与伤口的贴合性、透气性能等方面明显差于本申请所述采用明胶静电纺丝纤维制备的复合支架。
另外，本申请采用光交联的方式，在明胶静电纺丝纤维膜上交联圆柱状的明胶，一方面是过程简单，条件不苛刻，适于所述复合支架负载活细胞；另一方面，圆柱状的明胶水凝胶，在保证复合支架与创伤贴合度良好的前提下，增加了复合支架的透气性，同时也便于所述复合支架向机体输送负载的活细胞、其他药物或营养物质等。
虽然现有技术中，明胶静电纺丝纤维膜作为敷料的应用较多，但通常是作为载体，负载其他的有利因子(例如维生素类物质、纳米银或其他抗菌类物质)，但是单独采用明胶制备纤维膜的较少，且单独将其制备成为敷料的应用更少，也并有将其制备成为本申请所述双层皮肤结构的的复合支架状。
优选地，圆柱状明胶水凝胶的直径为600-800μm，其直径可根据需要，控制掩膜孔径的大小，进行调节；其厚度为300-600μm。
更优选地，所述圆柱状明胶水凝胶的直径为600μm，厚度为300μm。
优选地，所述明胶静电纺丝纤维膜以明胶为原料，采用静电纺丝设备纺丝得到纤维膜，然后将所得纤维膜置于京尼平-酒精溶液中进行交联固化制备得到。为了保证明胶纤维膜成型固化，此处采用京尼平进行交联反应时，必须采用京尼平-酒精溶液，而不能是京尼平-水溶液。
优选地，所述明胶静电纺丝纤维膜纺丝时，电压为14-18kV，针头到接收装置的距离为18-22cm，推进速度为16-18μL/min。
更优选地，所述明胶静电纺丝纤维膜纺丝时，电压为16kV，针头到接收装置的距离为20cm，，推进速度为16.7μL/min。
优选地，所述京尼平-酒精溶液中，京尼平的质量浓度为1-2％。更优选地，所述京尼平的质量浓度为1％。
优选地，所述纤维膜交联固化过程为：将含有所述纤维膜的玻片置于京尼平-酒精溶液中，没过纤维膜，并置于4-8℃环境下静置24-48h，然后转移到32-37℃环境下静置36-48h，最后用酒精溶液清洗即得。
更优选地，所述纤维膜交联固化过程为：将含有所述纤维膜的玻片置于京尼平-酒精溶液中，没过纤维膜，并置于4℃环境下静置24h，然后转移到37℃环境下静置36h，最后用酒精溶液清洗即得。
优选地，用于清洗的酒精溶液的体积浓度为75-90％；更优选地，酒精的体积浓度为90％。
优选地，所述明胶静电纺丝纤维膜制备过程为：将明胶溶于六氟异丙醇中，制备得到静电纺丝溶液，然后在室温、湿度低于50％条件下，静电纺丝设备的正极高压喷射头采用8#平头针头(长度20cm)，调电压16kV，针头到接收装置的距离为20cm，推进速度为16.7μL/min，静电纺丝溶液体积为320μL；在自行组装的大小为10cm×10cm的平台上平铺铝箔纸，放置若干15mm的玻片，用于收集纺丝纤维膜。
优选地，所述静电纺丝溶液中，明胶的质量体积浓度为0.1-0.15g/mL；更优选地，明胶的质量体积浓度为0.1g/mL。
优选地，所述明胶光交联溶液为：质量浓度10-30％Type A型明胶PBS溶液、联吡啶钌PBS溶液、过硫酸钠PBS溶液和质量浓度0.05～0.2％胭脂红PBS溶液，按照体积比为8:1:1:6配置而成。
优选地，Type A型明胶PBS溶液的质量浓度为30％。
优选地，所述联吡啶钌PBS溶液中溶质的浓度为16～32mM；所述过硫酸钠PBS溶液中溶质的浓度为160～320mM。
优选地，所述光交联作用在PDMS模具及掩膜存在下进行，其过程为：将所述明胶静电纺丝纤维膜置于PDMS模具中，然后加入所述明胶光交联溶液，盖上掩膜，并经过光照进行交联反应，加PBS溶解未交联的部分，最后再浸泡于京尼平-PBS溶液中进一步固化，清洗后即得所述双层皮肤结构水凝胶复合支架。
优选地，所述光照条件为：光源为冷光源LED白光，光照时间为8～20min，光源距离为7～20cm。
优选地，所述京尼平-PBS溶液中京尼平的体积比例为0.5％；所述PBS溶液的pH为7.4。
本发明同时还保护一种双层皮肤结构水凝胶复合支架的制备方法，包括如下步骤：
S1.制备明胶静电纺丝纤维膜：将明胶溶于六氟异丙醇中，制备得到静电纺丝溶液，然后在室温、湿度低于50％条件下，经静电纺丝设备制备，收集纺丝纤维膜，并在京尼平-酒精溶液中进行交联固化，洗净后得到明胶静电纺丝纤维膜；
S2.制备PDMS模具及掩膜：采用PDMS模具产品制备所需形状的上层模具和下层模具；所述掩膜为PET膜，可按照需要设计其图案；
S3.光交联作用：配置光交联溶液，然后将S1制备好的明胶静电纺丝纤维膜置于S2中制备好的PDMS上层模具中，然后加入光交联溶液，静置，然后盖上掩膜，并经光照进行交联反应；
S4.待光交联反应结束后，加PBS溶解未交联的部分(由于未进行光交联的明胶溶液在37℃条件下能够很好的荣誉PBS溶液，因此这一过程，优选在37℃条件下进行)，最后再浸泡于京尼平-PBS溶液中进一步固化，清洗后即得所述双层皮肤结构水凝胶复合支架。
优选地，步骤S1中，所述明胶静电纺丝纤维膜纺丝时，电压为14-18kV，针头到接收装置的距离为18-22cm，推进速度为16-18μL/min。
更优选地，步骤S1中，所述明胶静电纺丝纤维膜纺丝时，电压为16kV，针头到接收装置的距离为20cm，推进速度为16.7μL/min。
优选地，步骤S3中，所述光交联溶液为：质量浓度10-30％Type A型明胶PBS溶液、联吡啶钌PBS溶液、过硫酸钠PBS溶液和质量浓度为0.05～0.2％胭脂红PBS溶液，按照体积比为8:1:1:6配置而成。
优选地，Type A型明胶PBS溶液的质量浓度为30％。
优选地，所述联吡啶钌PBS溶液中溶质的浓度为16～32mM；所述过硫酸钠PBS溶液中溶质的浓度为160～320mM。
优选地，所述纤维膜交联固化过程为：将含有所述纤维膜的玻片置于京尼平-酒精溶液中，没过纤维膜，并置于4-8℃环境下静置24-48，然后转移到32-37℃环境下静置36-48h，最后用酒精溶液清洗即得。
更优选地，所述纤维膜交联固化过程为：将含有所述纤维膜的玻片置于京尼平-酒精溶液中，没过纤维膜，并置于4℃环境下静置24h，然后转移到37℃环境下静置36h，最后用酒精溶液清洗即得。
优选地，步骤S3的过程为：将所述明胶静电纺丝纤维膜置于PDMS模具中，然后加入所述明胶光交联溶液，盖上掩膜，并经过光照进行交联反应，加PBS在37℃环境下溶解未交联的部分，最后再浸泡于京尼平-缓冲溶液中进一步固化，清洗后即得所述双层皮肤结构水凝胶复合支架。
优选地，步骤S3中，所述光照条件为：光源为冷光源LED白光，光照时间为8～20min，光源距离为7～20cm。
所述双层皮肤结构水凝胶复合支架在制备创伤敷料中的应用也在本发明的保护范围之内。
所述双层皮肤结构水凝胶复合支架作为载体，负载细胞和/或药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
更优选地，所述细胞为脂肪干细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本申请以明胶为原料，通过静电纺丝和光交联作用，制备得到所述双层皮肤结构水凝胶复合支架，其中以明胶静电纺丝纤维膜为基底，在其一面通过光交联作用形成圆柱状图案化的明胶水凝胶。所述复合支架具有双层结构，其中纤维膜相当于皮肤的表皮层，能够能阻挡异物和病原侵入，并能防止组织液丧失；图案化圆柱状明胶不仅可以支持细胞生存力和细胞粘附，还可以促进细胞迁移和增殖，促进皮肤组织的再生和形成；且其独特的形状，在保证复合支架与创伤贴合度良好的同时，还具有很好的透气性，较大的孔隙率和孔径，有利于伤口氧气及营养物质的运输，此外还能够促进创伤处血管的生成，其降解速度与创伤愈合周期接近，有利于创伤的愈合。
再者，所述复合支架在制备过程中，可以通过调节光交联的时间，以及掩膜的孔径大小，可调节水凝胶的物理性能，包括保水性、降解性等，以适用不同患者的需求。
附图说明
图1为复合支架的直观图。
图2为复合支架经冻干后的SEM照片。
图3为所述复合支架的降解结果。
图4为3T3细胞在复合支架表面增殖情况
图5为糖尿病大鼠创面愈合宏观结果图。
图6为糖尿病大鼠创面血流血流分析的结果。
图7为糖尿病大鼠创面光学相干断层扫描OCT成像分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1光交联/静电纺丝制备双层皮肤结构水凝胶复合支架
一、明胶静电纺丝纤维膜的制备
配制静电纺丝溶液：用微量电子天平称取明胶0.5g溶于5mL六氟异丙醇(HFIP)于玻璃瓶(10mL)中，加磁力搅拌子，置于磁力搅拌器，磁力搅拌24h，待用。
静电纺丝方法：静电纺丝实验在室温、湿度低于50％条件下进行。正极高压喷射头采用8#平头针头(长度20cm)，调电压16kV，针头到接收装置的距离为20cm，推进速度为16.7μL/min，静电纺丝溶液体积为320μL。在自行组装的大小为10cm×10cm的平台上平铺铝箔纸，放置若干15mm的玻片，以便样品收集。
实验过程中用光学显微镜观察纤维膜形貌。
纤维膜交联：将含有纤维膜的玻片从铝箔剪下放在孔板中，每孔加1％京尼平溶液(溶于90％酒精)，没过纤维膜，放在4℃冰箱24h后，转移到37℃培养箱放置36h，吸出原来的溶液，用90％酒精清洗三遍，在超净台上风干，储存在4℃冰箱待用。
二、PDMS(聚二甲基硅氧烷)模具制备
采用道康宁DC184硅橡胶进行制备PDMS模具。将其中的本组分与固化剂按10:1重量比完全混合，并按照说明书内容进行制备模具。
(1)上层模具
在35mm的培养皿中加2mL的PDMS，抽真空30min，在室温下，平的实验台上放置12小时，最后放在80℃烘箱30min固化，模具用15mm打孔器在中间打孔。
(2)下层模具
在60mm的培养皿中加1.5mL的PDMS，抽真空30min，在室温下，平的实验台上放置12小时，最后放在80℃烘箱30min固化，模具剪成正方形。
(3)掩膜的制备
使用纳秒激光器在PET膜上按照设计的图案：400μm的圆，圆心间距离为800μm进行激光加工直径为2cm的圆形膜，打标次数为50次。将所得圆形PET膜喷不透光的黑色漆，晾干。
三、复合支架的制备
主要溶液配制
(1)30％Type A型明胶溶液：称取6g明胶颗粒置于50mL离心管中高温高压蒸汽灭菌后加入20mL无菌PBS溶液，50℃烘箱使其充分溶解，溶解后密封置于4℃冰箱保存。
(2)0.5％京尼平溶液：称量5g京尼平溶于100mL PBS溶液中，600rpm磁力搅拌2h充分溶解后，过滤灭菌置于4℃保存。
制备过程：
1、将上述所得的PDMS模具、掩膜，酒精浸泡4h灭菌后，在超净台风干；
2、用镊子将下层模具放到60mm培养皿中，保持平整；将步骤一制备的明胶静电纺丝纤维膜放在模具中间(模具中打的孔中)，放置上层模具后，加适量细胞培养基或甘氨酸溶液至没过明胶静电纺丝纤维膜，37℃培养箱放置1.5h；这一过程保证明胶静电纺丝纤维膜完全停止交联反应，同时保证明胶静电纺丝纤维膜呈水凝胶状；
其中细胞培养基为本领域常规使用的细胞培养基，本实施例所采用的细胞培养基的成分为：DMEM低糖培养基、胎牛血清、双抗，具体的制备过程为：89％DMEM,10％胎牛血清，1％双抗。
上述甘氨酸溶液的质量浓度为0.015-0.02g/mL。
3、配制光交联溶液：取上述配置好的30％Type A型明胶溶液0.5mL，16～32mM联吡啶钌PBS溶液62.5μL，160～320mM过硫酸钠PBS溶液62.5μL，质量浓度为0.05～0.2％胭脂红PBS溶液375μL至EP管中，吹打使其混合均匀；上述溶液均为pH为7.4的PBS溶液进行配置；
4、将70～200μL的光交联溶液滴加到PDMS模具中明胶静电纺丝纤维膜上，然后避光静置2min，待光交联溶液凝固后，加掩膜，冷光源LED白光光照8～20min，LED光源距离明胶静电纺丝纤维膜距离7～20cm；
5、待光照结束后，再加入PBS至没过支架，然后置于37℃培养箱中静置10min，溶解未交联的部分，吸去PBS，加1mL 0.5％上述配好的京尼平(溶液是无色的)溶液，放到培养箱30～60min，吸去京尼平溶液，加PBS洗两遍后，加培养基，停止交联。即制备得到双层皮肤结构水凝胶复合支架。
实施例2双层皮肤结构水凝胶复合支架性能和作用测试
1、制备的双层皮肤结构水凝胶复合支架的外观如图1所示。
从图1中可知，制备的双层皮肤结构水凝胶复合支架呈水凝胶状，其中明胶静电纺丝纤维膜为基底层，其上均匀排列着圆柱状的明胶水凝胶，且圆柱状水凝胶之间保持一定的间隔。
实施例1中制备的复合支架，其整体厚度为350μm；其中圆柱状的水凝胶的直径为600μm；高度为300μm。
所述水凝胶的直径大小，可通过控制掩膜中孔径的大小，进而进行调节。但是为了保证所述复合支架的透气性和皮肤的贴合情况，因此将圆柱状的水凝胶的直径控制在600-800μm，其高度控制在300μm左右，其中圆柱水凝胶的高度可通过控制光交联溶液的用量进行控制。
所述水凝胶经京尼平交联后，材料呈蓝色。
2、所述复合支架冻干后的SEM照片如图2所示。
将实施例1制备的复合支架经冻干后，其SEM照片如图2所示，从图中可知，下层圆柱状水凝胶(由于所述复合支架作为敷料应用时，圆柱状这一面是贴合伤口的一侧，因此称为下层)冻干后，呈现大孔的网格状结构，如图2中的右图所示；上层明胶静电纺丝纤维膜(由于所述复合支架作为敷料应用时，这一面类似于皮肤表层，因此称为上层)，具有良好的纤维形貌，纤维丝粗细均匀，具有较大的孔隙率，有利于伤口氧气及营养物质的运输，如图2中的左图所示。冻干后圆柱水凝胶周围的纤维膜扔保持其良好的纤维形貌，如图2中的右图所示。
3、测试所述复合支架的降解性能
使用胶原酶(10μg/ML，溶于PBS)测试支架的降解性能。测得结果如图3所示。其中所述复合支架中，下层水凝(圆柱状水凝胶)完全降解大概需要27h，且所述复合支架中，即使圆柱状水凝胶降解后，纤维膜仍然可以继续稳定存在至少七天，使其继续保护伤口。
4、测试3T3细胞在复合支架的增殖情况
将3T3细胞铺板在复合支架上，在第一、二、三天，使用CCK-8溶液测其吸光值。测得结果如图4所示，细胞在第二天增殖缓慢，在第三天增殖速度较快，说明该材料具有良好的生物相容性，适合细胞粘附和增殖。
5、测试所述复合支架对于创面的影响作用
Ⅰ型糖尿病大鼠(TIDM)建模
(1)取SD大鼠(8周龄，体重200～250g，雄性)10只诱导TIDM造模，造模前禁食24小时。造模前称量每只大鼠体重，并取尾静脉血液测量每只大鼠的空腹血糖值。
(2)1％STZ溶液按50mg/kg的剂量，腹腔注射。造模后，尾静脉采血测量大鼠血糖。若诱导前血糖值<8.9mmol/L，诱导后连续三日血糖值≥16.7mmol/L，即认为是造模成功。如诱导TIDM造模失败，正常饮食饲养大鼠并监测血糖值，待大鼠血糖恢复至正常值且无明显异常后继续按50mg/kg的剂量，注射1％STZ溶液重新诱导TIDM建模。
全层皮肤切除创伤模型的建立
上述成功造模的TIDM大鼠，正常饮食饲养四周，每隔三天测量体重及血糖值。取TIDM大鼠，腹部局部消毒，使用10％水合氯醛溶液，按4.5mL/kg剂量腹腔注射麻醉。显效后，剔除大鼠前肢及背侧毛发，并涂一层脱毛膏，10分钟后去除脱毛膏并使用酒精棉球擦拭消毒。以大鼠脊椎为中线，各创面间隔距离为2cm，使用直径为15mm的活检打孔器建立2个全层皮肤切除创伤模型，深至大鼠肌层，最后用手术剪将皮肤层与肌肉组织连接的筋膜剪掉。用无菌棉球擦干创面，采用自身对照，以左侧为空白(无治疗)，右侧敷水凝胶支架；然后用PI透明敷料(含直径20mm垫圈)覆盖上述伤口，并进一步用自粘绷带固定。
术后各时间点各组伤口宏观照片记录了18天内伤口愈合情况如图5所示，各组创面均有收缩，复合支架组伤口收缩明显，第8天到第18天伤口持续愈合，图中明显观察到18天时，与空白组相比，复合支架组愈合效果优于对照组。
采用血管显像仪检测大鼠创面其血管的生成情况。血管显像仪的工作原理是当红外光线照射人体组织时，静脉血管中的血红蛋白比周围组织对红外光线有更明显的吸收效果，在用红外摄像头摄取时会形成很明显的静脉血管图像，经专门的软硬件图像处理系统转换后，显示到屏幕显示器上，形成静脉血管的可见图像，辅助静脉定位显示。
给药三天后，糖尿病大鼠创面血流血流分析的结果如图6所示。从图6中可知，与空白组相比，复合支架组伤口的新生血管生成的更多，几乎整个创面有血流迹象，进一步证明了材料能够促进伤口的血管生成。
给药三、八、二十天后，糖尿病大鼠创面光学相干断层扫描OCT成像分析结果如图7所示。光学相干断层扫描仪利用生物组织不同深度层对入射弱相干光的背向反射或几次散射信号进行扫描后得到重新构建的组织截面断层图像。从图7中可以看到，第三天复合支架材料中的水凝胶仍呈现图案化(即仍然呈圆柱状)，且材料与伤口能很好的贴合，新生组织向创面处生长。第八天可以观察到圆柱水凝胶长到新生组织中(虚线框中)，促进伤口愈合，在第十八天完全降解，且新生皮肤组织凹陷明显小于对照组。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种双层皮肤结构水凝胶复合支架，其特征在于，所述复合支架以明胶静电纺丝纤维膜为基底，将明胶光交联溶液经光交联作用在基底一面制备圆柱状明胶水凝胶，即为双层皮肤结构水凝胶复合支架。
2.根据权利要求1所述双层皮肤结构水凝胶复合支架，其特征在于，所述圆柱状明胶水凝胶的直径为600-800μm，厚度为300-600μm。
3.根据权利要求1所述双层皮肤结构水凝胶复合支架，其特征在于，所述明胶静电纺丝纤维膜以明胶为原料，采用静电纺丝设备纺丝得到纤维膜，然后将所得纤维膜置于京尼平-酒精溶液中进行交联固化制备得到。
4.根据权利要求3所述双层皮肤结构水凝胶复合支架，其特征在于，所述明胶静电纺丝纤维膜纺丝时，电压为14-18kV，针头到接收装置的距离为18-22cm，推进速度为16-18μL/min。
5.根据权利要求1所述双层皮肤结构水凝胶复合支架，其特征在于，所述明胶光交联溶液为：质量浓度10-30％Type A型明胶PBS溶液、联吡啶钌PBS溶液、过硫酸钠PBS溶液和质量浓度为0.05～0.2％胭脂红PBS溶液，按照体积比为8:1:1:6配置而成。
6.根据权利要求5所述双层皮肤结构水凝胶复合支架，其特征在于，所述光交联作用在PDMS模具及掩膜存在下进行，其过程为：将所述明胶静电纺丝纤维膜置于PDMS模具中，然后加入所述明胶光交联溶液，盖上掩膜，并经过光照进行交联反应，加PBS溶解未交联的部分，最后再浸泡于京尼平-PBS溶液中进一步固化，清洗后即得所述双层皮肤结构水凝胶复合支架。
7.根据权利要求6所述双层皮肤结构水凝胶复合支架，其特征在于，所述光照条件为：光源为冷光源LED白光，光照时间为8～20min，光源距离为7～20cm。
8.一种双层皮肤结构水凝胶复合支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制备明胶静电纺丝纤维膜：将明胶溶于六氟异丙醇中，制备得到静电纺丝溶液，然后在室温、湿度低于50％条件下，经静电纺丝设备，收集纺丝纤维膜，并在京尼平-酒精溶液中进行交联固化，洗净后得到明胶静电纺丝纤维膜；
S2.制备PDMS模具及掩膜：采用PDMS模具产品制备所需形状的上层模具和下层模具；所述掩膜为PET膜，可按照需要设计其图案；
S3.光交联作用：配置光交联溶液，然后将S1制备好的明胶静电纺丝纤维膜置于S2中制备好的PDMS上层模具中，然后加入光交联溶液，静置，然后盖上掩膜，并经光照进行交联反应；
S4.待光交联反应结束后，加PBS溶解未交联的部分，最后再浸泡于京尼平-PBS溶液中进一步固化，清洗后即得所述双层皮肤结构水凝胶复合支架。
9.权利要求1至7任一所述双层皮肤结构水凝胶复合支架在制备创伤敷料中的应用。
10.权利要求1至7任一所述双层皮肤结构水凝胶复合支架作为载体，负载细胞和/或药物中的应用。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113667631A (zh) * 2021-08-26 2021-11-19 清华大学 一种用于培养体外皮肤模型的支架及其制备方法
CN113781880A (zh) * 2021-06-28 2021-12-10 中山大学 一种动脉粥样硬化斑块模型及其制备方法
CN114028603A (zh) * 2021-11-02 2022-02-11 太原理工大学 促进皮肤伤口修复的双层不对称敷料及其制备方法
CN114146227A (zh) * 2021-10-09 2022-03-08 昆明理工大学 一种可促进血管再生的柔性定向纳米纤维复合膜的制备方法
CN114191599A (zh) * 2021-11-29 2022-03-18 西北工业大学 一种水凝胶/纳米纤维仿生双层敷料及制备方法
CN115569230A (zh) * 2022-09-14 2023-01-06 东华大学 一种高保湿且快速自愈合的双层纳米纤维复合水凝胶敷料
CN115590521A (zh) * 2022-12-15 2023-01-13 季华实验室（Cn） 一种高导电性透气水凝胶干电极及其制造方法
CN115869453A (zh) * 2021-09-26 2023-03-31 中国科学院理化技术研究所 一种负载抗菌分子的双层抗菌敷料、制备及应用

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1785444A (zh) * 2005-12-07 2006-06-14 浙江大学 胶原－壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架及其制备方法
CN102600018A (zh) * 2012-03-31 2012-07-25 华南理工大学 具有降温和促进伤口愈合作用的医用敷料及其制备方法
US20120231038A1 (en) * 2011-03-08 2012-09-13 The Johns Hopkins University Wound Healing Compositions Comprising Biocompatible Cellulose Hydrogel Membranes and Methods of Use Thereof
KR101429857B1 (ko) * 2013-06-19 2014-08-13 순천향대학교 산학협력단 골 지혈작용을 위한 복합이중층 섬유매트의 제조방법
CN104487103A (zh) * 2012-05-15 2015-04-01 泰克尼恩研究和发展基金有限公司 纤维增强水凝胶复合材料和形成纤维增强水凝胶复合材料的方法
CN104491914A (zh) * 2014-12-25 2015-04-08 中国人民解放军第四军医大学 一种多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料及其制备方法
WO2017165389A2 (en) * 2016-03-24 2017-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Alginate hydrogel compositions
CN109125799A (zh) * 2018-09-05 2019-01-04 张强 GelMA水凝胶人脱细胞羊膜三维双层辅料的制备方法
CN109876193A (zh) * 2019-04-01 2019-06-14 西安交通大学 一种基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料及其制备方法
CN109876186A (zh) * 2019-03-21 2019-06-14 福州大学 一种用于神经修复的生物医用可降解双层支架及其制备方法
CN110124086A (zh) * 2019-05-23 2019-08-16 中山大学 一种复合纳米纤维垫、水凝胶/海绵敷料及制备方法和应用
CN110944654A (zh) * 2017-07-14 2020-03-31 武汉市康创科技有限公司 一种包含脱细胞羊膜的复合膜及其制备方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1785444A (zh) * 2005-12-07 2006-06-14 浙江大学 胶原－壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架及其制备方法
US20120231038A1 (en) * 2011-03-08 2012-09-13 The Johns Hopkins University Wound Healing Compositions Comprising Biocompatible Cellulose Hydrogel Membranes and Methods of Use Thereof
CN102600018A (zh) * 2012-03-31 2012-07-25 华南理工大学 具有降温和促进伤口愈合作用的医用敷料及其制备方法
CN104487103A (zh) * 2012-05-15 2015-04-01 泰克尼恩研究和发展基金有限公司 纤维增强水凝胶复合材料和形成纤维增强水凝胶复合材料的方法
KR101429857B1 (ko) * 2013-06-19 2014-08-13 순천향대학교 산학협력단 골 지혈작용을 위한 복합이중층 섬유매트의 제조방법
CN104491914A (zh) * 2014-12-25 2015-04-08 中国人民解放军第四军医大学 一种多孔复合凝胶-纳米纤维透氧敷料及其制备方法
WO2017165389A2 (en) * 2016-03-24 2017-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Alginate hydrogel compositions
CN110944654A (zh) * 2017-07-14 2020-03-31 武汉市康创科技有限公司 一种包含脱细胞羊膜的复合膜及其制备方法
CN109125799A (zh) * 2018-09-05 2019-01-04 张强 GelMA水凝胶人脱细胞羊膜三维双层辅料的制备方法
CN109876186A (zh) * 2019-03-21 2019-06-14 福州大学 一种用于神经修复的生物医用可降解双层支架及其制备方法
CN109876193A (zh) * 2019-04-01 2019-06-14 西安交通大学 一种基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料及其制备方法
CN110124086A (zh) * 2019-05-23 2019-08-16 中山大学 一种复合纳米纤维垫、水凝胶/海绵敷料及制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAN-FENG PAN ET AL: "Preparation and Characterization of Electrospun PLCL/Poloxamer Nanofibers and Dextran/Gelatin Hydrogels for Skin Tissue Engineering", 《PLOS ONE 》 *
ROSE ANN FRANCO ET AL: "Preparation and characterization of electrospun PCL/PLGA membranes and chitosan/gelatin hydrogels for skin bioengineering applications", 《J MATER SCI: MATER MED》 *
XIN ZHAO ET AL: "Photocrosslinkable Gelatin Hydrogel for Epidermal Tissue Engineering", 《ADV. HEALTHCARE MATER》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113781880A (zh) * 2021-06-28 2021-12-10 中山大学 一种动脉粥样硬化斑块模型及其制备方法
CN113781880B (zh) * 2021-06-28 2022-11-11 中山大学 一种动脉粥样硬化斑块模型的制备方法
CN113667631A (zh) * 2021-08-26 2021-11-19 清华大学 一种用于培养体外皮肤模型的支架及其制备方法
CN115869453A (zh) * 2021-09-26 2023-03-31 中国科学院理化技术研究所 一种负载抗菌分子的双层抗菌敷料、制备及应用
CN114146227A (zh) * 2021-10-09 2022-03-08 昆明理工大学 一种可促进血管再生的柔性定向纳米纤维复合膜的制备方法
CN114028603A (zh) * 2021-11-02 2022-02-11 太原理工大学 促进皮肤伤口修复的双层不对称敷料及其制备方法
CN114191599A (zh) * 2021-11-29 2022-03-18 西北工业大学 一种水凝胶/纳米纤维仿生双层敷料及制备方法
CN115569230A (zh) * 2022-09-14 2023-01-06 东华大学 一种高保湿且快速自愈合的双层纳米纤维复合水凝胶敷料
CN115569230B (zh) * 2022-09-14 2023-11-21 东华大学 一种高保湿且快速自愈合的双层纳米纤维复合水凝胶敷料
CN115590521A (zh) * 2022-12-15 2023-01-13 季华实验室（Cn） 一种高导电性透气水凝胶干电极及其制造方法

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