CN107343969B - 一种复合神经导管及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合神经导管及其制备方法。该方法，包括如下步骤：(1)制备外层导管；(2)制备内层纳米纤维膜；(3)在引发剂的作用下，步骤(2)制备得到的内层纳米纤维膜与多肽生长因子发生反应，得到加载多肽生长因子的内层纳米纤维膜；(4)将步骤(3)制得的加载多肽生长因子内层纳米纤维膜套装在步骤(1)中所述外层导管中，即可得到所述复合神经导管。复合神经导管中，外层导管具有优异的力学性能，能为内部神经细胞的生长增殖提供稳定的微环境。内层纳米纤维膜为神经细胞的附着通过了物理支撑，内层纳米纤维膜上加载的多肽生长因子能够模拟神经细胞的发育生长环境，为神经突起的生长提供生化线索。

Description

一种复合神经导管及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学组织工程领域，具体涉及一种复合神经导管及其制备方法。

背景技术

神经损伤之后，周围神经系统在一定程度上能够实现自我修复，雪旺氏细胞反应性增殖形成细胞索，同时轴突枝芽生长，穿过损伤区后延伸入细胞索，在细胞索内轴突枝芽不断向靶细胞生长，最终与靶细胞形成突触联系。但若损伤距离过长，或由于周围结缔组织的阻碍作用，神经断端无法直接吻合，在神经损伤处形成增生的神经瘤样组织，则会影响肢体功能。

中枢神经损伤则会造成更加严重的后果，如脊髓损伤往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。目前国际上尚无有效的治疗脊髓损伤的方法，这是因为，在中枢神经系统中，存在着许多抑制再生的因素。首先由于胶质细胞包裹损伤区，形成再生轴突很难越过的胶质瘢痕；其次，损伤细胞周围存在着许多再生抑制因子(如硫酸软骨素蛋白多糖)；并且受损神经元自身再生能力有限，因此中枢神经被认为是无法完成自我修复的。

再生轴突生长足够长的距离以穿越损伤区，与靶细胞重新形成功能性连接是神经再生的关键条件。目前，通过组织工程支架，桥接神经缺损两侧是一种被广泛接受的治疗神经损伤的方法。通常使用的组织工程支架是神经导管。如中国专利CN1986006A，公布了一种生物型神经导管，该导管由经过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂及强氢键试剂去除抗原处理的生物膜材料，通过医用胶粘合而成。如中国专利CN101138656A，公布了一种壳聚糖复合神经导管，通过壳聚糖-明胶酸性复合溶液，在模具上层层固化制得。上述专利只能进行神经缺损断端的桥接，不能提供神经细胞再生和生长所需的神经营养因子等生化线索，并且其表面形貌不利于神经细胞的黏附和生长。

发明内容

本发明的目的是提供一种复合神经导管及其制备方法，该复合神经导管不但可以进行神经缺损断端的桥接，还能提供神经细胞再生和生长所需的神经营养因子。

本发明提供了一种复合神经导管的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备外层导管；

(2)制备内层纳米纤维膜；

(3)在引发剂的作用下，步骤(2)制备得到的内层纳米纤维膜与多肽生长因子发生反应，得到加载多肽生长因子的内层纳米纤维膜；

(4)将步骤(3)制得的加载多肽生长因子内层纳米纤维膜套装在步骤(1)中所述外层导管中，即可得到所述复合神经导管。

上述的制备方法，步骤(1)中，所述外层导管的制备方法如下：在用于导管成型的模具上蘸取用于制备外层导管的材料的溶液，并使所述模具自转至溶液干燥成膜；重复上述步骤，直至膜厚达0.05～0.5mm(如0.2mm)，经脱模后即可得到所述外层导管。

上述外层导管的制备方法中，所述模具的规格如下：长度为2～10cm，直径为2～10mm(如4mm)。所述自转的转速可为100～3000rpm，具体可为700rpm。所述脱模的步骤如下：将所述模具在碱性溶液(如氢氧化钠溶液)中浸泡即可。所述碱性溶液的质量浓度可为0.5％～5％，具体可为2％。所述浸泡的时间可为15分钟～2小时，具体可为30分钟。

上述的制备方法，步骤(2)中，所述内层纳米纤维膜的制备方法如下：将用于制备内层纳米纤维膜的材料的溶液作为纺丝液进行静电纺丝，然后采用戊二醛进行交联，即可得到所述内层纳米纤维膜。

所述静电纺丝的条件可如下：纺丝电压为10～30KV(如25KV)；纺丝接收距离为10～20cm(如15cm)；纺丝液的流速为0.2～1.0mL/h(0.5mL/h)；纺丝针头内径为0.2～0.5mm(如0.3mm)。

所述戊二醛可以质量浓度为10％～50％(如25％)的戊二醛水溶液的蒸汽的形态存在；所述蒸汽具体可在25℃～80℃(如37℃)水浴条件下加热所述戊二醛水溶液得到。所述交联的时间可为1～4h，具体可为3h。

上述的制备方法中，步骤(1)和步骤(2)中，用于制备外层导管和用于制备内层纳米纤维膜的材料为可降解的生物材料；所述可降解的生物材料可为壳聚糖、甲壳素、丝素蛋白、胶原蛋白、聚乳酸羟基乙酸、明胶、藻酸盐、聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚乙内酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯中的至少一种。优选地，所述可降解的生物材料可为质量比为1：(1～10)的壳聚糖和聚乙烯醇，不仅在体内可降解，还具有良好的机械性能。更优选地，所述可降解的生物材料可为质量比为1：2的壳聚糖和聚乙烯醇。

用于制备外层导管的材料的溶液以及用于制备内层纳米纤维膜的材料的溶液为可为壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液的混合液；所述壳聚糖溶液的质量浓度可为5％～10％(如6％)，溶剂可为酸，如醋酸；所述聚乙烯醇的质量浓度为10％～15％(如12％)，溶剂可为酸，如醋酸。

上述的制备方法，步骤(3)中，所述反应为交联反应，步骤(3)的操作可如下：将步骤(2)制备得到的内层纳米纤维膜浸泡在含有引发剂的多肽生长因子溶液中，得到加载多肽生长因子的内层纳米纤维膜；优选地，

所述多肽生长因子溶液的浓度可为10～300ng/mL(如3ng/mL)，溶剂可为pH为7.0～7.8(如pH7.4)的缓冲溶液(如磷酸盐缓冲溶液)、水或者生理盐水；和/或，

所述多肽生长因子包括但不限于：神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4、神经营养素-5、神经营养素-6、神经营养素-7、胶质细胞株源性神经营养因子、睫状神经营养因子、运动神经元营养因子-1、运动神经元营养因子-2或硫酸软骨素抗体；和/或，

所述多肽生长因子溶液中，所述引发剂的质量浓度可为0.1％～1％(如0.1％)，所述引发剂可为京尼平或者质量比为1：(0.1～1)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)；和/或，

所述浸泡的温度可为1℃～6℃(如4℃)，时间可为4h～48h(如24h)；和/或，

所述加载之后还包括采用所述多肽生长因子的溶剂对内层纳米纤维膜进行清洗的步骤。

上述的制备方法，步骤(4)中，所述加载多肽生长因子内层纳米纤维膜与所述外层导管的质量比可为1：(10～1000)，具体可为1：500。

所述复合神经导管的结构如下：它包括外层导管和加载多肽生长因子的内层纳米纤维膜，所述内层纳米纤维膜套装在所述外层导管的内部；所述外层导管和所述内层纳米纤维膜由可降解的生物材料制成。所述外层导管可为神经细胞的生长创建稳定的微环境，所述内层纳米纤维膜可为神经轴突的生长提供可附着的物理线索，所述多肽生长因子可为神经细胞的发育及再生提供生化线索。

所述外层导管和所述内层纳米纤维膜的长度可为0.1mm～100mm(如50mm)。所述外层导管的壁厚可为0.05～0.5mm(如0.2mm)，直径可为0.5～10mm(如4mm)。所述内层纳米纤维膜的厚度可为0.005～0.02mm(如0.01mm)。

由上述的制备方法制备得到的复合神经导管，也在本发明的保护范围内。

上述的复合神经导管在制备重建或修复组织或器官缺损的产品中的应用，也在本发明的保护范围内。所述组织包括但不限于神经组织。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供了一种复合神经导管的制备方法，该导管包含外层导管及加载多肽生长因子的内层纳米纤维膜。外层导管具有优异的力学性能，能为内部神经细胞的生长增殖提供稳定的微环境。内层纳米纤维膜为神经细胞的附着通过了物理支撑，内层纳米纤维膜上加载的多肽生长因子能够模拟神经细胞的发育生长环境，为神经突起的生长提供生化线索。

(2)内层纳米纤维膜的纤维尺寸接近天然细胞外基质尺度范围，能够模仿天然细胞外基质的结构和功能，有利于神经细胞的附着和神经突起的生长。

(3)通过设计的导管成型设备制备的外层导管壁厚均匀，力学性能强，并且该方法简单易行。

(4)通过静电纺丝技术制备内层纳米纤维膜高效灵活，便宜简便。

(5)本发明公开的复合神经导管制备方法简单，且具有多种直径和长度，能够适用于不同的脊髓损伤和外周神经损伤。

附图说明

图1为导管成型设备示意图，其中，a表示电机控制器，b表示无刷电机，c表示圆柱不锈钢模具，d表示支架。

图2为壳聚糖-聚乙烯醇静电纺丝纳米纤维膜的扫描电镜照片。

图3为外层壳聚糖-聚乙烯醇导管力学曲线图。其中外层导管的参数为：直径4mm，壁厚0.2mm。

图4为采用本发明复合神经导管培养鸡胚背根神经节的扫描电镜照片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所用神经生长因子的通用名为注射用鼠神经生长因子(Mouse Nerve Growth Fact forInjection)，商品名为恩经复，生产厂家为厦门北大之路生物工程有限公司，购自国药集团化学试剂有限公司，规格为18ug(≥9000AU)/支。

下述实施例中所用的设备等均可从市场购得或是本行业常用的。所用的导管成型设备的结构如图1所示，包括电机控制器(a)、无刷电机(b)、圆柱不锈钢模具(c)和支架(d)。使用时，使用不锈钢模具蘸取生物材料溶液，将不锈钢模具固定在无刷电机上，通过电机控制器控制模具转速，当溶液干燥后，重复蘸取，旋转模具，直至外层导管达到壁厚要求。

实施例1、制备复合神经导管

按照如下步骤制备复合神经导管：

(1)制备外层导管：

1)室温条件下，将一定量的壳聚糖溶于2wt％的醋酸中，配制质量分数为6wt％的溶液。将一定量的聚乙烯醇溶于相同浓度的醋酸中，95℃水浴加热1h，配制质量分数为12wt％的溶液。将上述两种溶液以不同比例混合，搅拌均匀，使用前离心去除气泡。混合液中壳聚糖与聚乙烯醇的质量比为1:2。

2)使用导管成型设备，在长度为5cm、直径为4mm的模具上蘸取壳聚糖-聚乙烯醇混合液，将不锈钢模具固定在无刷电机上，通过电机控制器控制模具以700rpm的速度水平自转。溶液干燥后，重复在溶液中蘸取，干燥，每次干燥后测导管的外层，直至外层导管的壁厚达0.2mm。将模具在2wt％的氢氧化钠溶液中浸泡30分钟即可脱模，得到外层导管。扫描电镜照片如图2所示。

(2)制备内层纳米纤维膜：

1)室温条件下，将一定量的壳聚糖溶于2wt％的醋酸中，配制质量分数为6wt％的溶液。将一定量的聚乙烯醇溶于相同浓度的醋酸中，95℃水浴加热1h，配制质量分数为12％的溶液。将上述两种溶液以不同比例混合，搅拌均匀，使用前离心去除气泡。混合液中壳聚糖与聚乙烯醇的质量比为1:2。

2)将混合液装入5mL规格的注射器中，注射器配有内径为0.3mm的毛细针头，在正负极静电压差25KV，接收距离15cm，推注速度为0.5mL/h的条件下，静电纺丝6h，制备壳聚糖-聚乙烯醇纳米纤维膜(膜厚为0.01mm)。

3)37℃水浴加热25wt％的戊二醛溶液，将纳米纤维膜置于铜网上，铜网放置在戊二醛溶液的培养皿上。利用戊二醛蒸汽对纳米纤维膜进行交联，交联时间为3h。

(3)在步骤(2)中制得的内层纳米纤维膜上加载多肽生长因子：

将神经生长因子溶解在无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，配置浓度为3ng/mL的溶液20mL，在其中加入20mg京尼平。4℃下，将交联后的壳聚糖-聚乙烯醇纳米纤维膜在该溶液中浸泡24h，取出后用PBS充分洗涤，得到加载神经生长因子的壳聚糖-聚乙烯醇纳米纤维膜。

(4)将步骤(3)中制得的加载多肽生长因子的内层纳米纤维膜裁剪至与外层导管相同的长度并卷成圆柱形套装在步骤(1)中外层导管(长度为50mm)中(加载多肽生长因子的内层纳米纤维膜和外层导管的质量比为1：500)，即可得到复合神经导管。

实施例2、性能测试

一、力学性能

将实施例1中步骤(1)中制备的外层导管通过万能力学拉伸试验机测试其力学性能，标定距离为30mm，拉伸速率为5mm/min。结果显示(图3)，外层导管力学性能优越，最大载荷达19N。

二、生物活性

以E8鸡胚背根神经节(DRG)为试验对象，用鸡胚背根神经节(DRG)培养法对实施例1中制备的复合神经导管的生物活性进行验证。具体操作如下：

从8日龄鸡胚中提取的鸡胚背根神经节放入复合神经导管中，将复合神经将导管与其共培养48h后，剪开复合神经导管，在扫描电子显微镜下观察背根神经节的生长情况。

结果显示(图4)，鸡胚背根神经节附着在纳米纤维膜表面，与材料形成紧密连接，并且在神经生长因子的作用下，背根神经节有明显的突起，突起从神经元出发，呈现放射状生长。该结果说明实施例2制备的加载神经生长因子的壳聚糖-聚乙烯醇外层导管及纳米纤维膜具有优异的生物相容性，在外层导管提供的稳定内环境中，神经细胞胞体及突起紧密附着在纳米纤维膜上，并且加载的神经生长因子能促进神经突起的生长。背根神经节的神经突起的生长长度大于胞体直径的两倍，证明了该复合导管能够促进神经突起生长足够长的距离，以与靶细胞形成功能性连接，这满足了神经再生的关键条件。

Claims (7)

1.一种复合神经导管的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备外层导管；

（2）制备内层纳米纤维膜；

步骤（2）中，所述内层纳米纤维膜的制备方法如下：将用于制备内层纳米纤维膜的材料的溶液作为纺丝液进行静电纺丝，然后采用戊二醛进行交联，即得到所述内层纳米纤维膜；

（3）在引发剂的作用下，步骤（2）制备得到的内层纳米纤维膜与多肽生长因子发生反应，得到加载多肽生长因子的内层纳米纤维膜；

步骤（3）的操作如下：将步骤（2）制备得到的内层纳米纤维膜浸泡在含有引发剂的多肽生长因子溶液中，得到加载多肽生长因子的内层纳米纤维膜；

所述多肽生长因子溶液的浓度为10~300ng/mL，溶剂为pH为7.0~7.8的缓冲溶液、水或者生理盐水；

所述多肽生长因子为神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4、神经营养素-5、神经营养素-6、神经营养素-7、胶质细胞株源性神经营养因子、睫状神经营养因子、运动神经元营养因子-1、运动神经元营养因子-2或硫酸软骨素抗体；

所述多肽生长因子溶液中，所述引发剂的质量浓度为0.1%~1%，所述引发剂为京尼平或者质量比为1：（0.1~1）的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；

所述浸泡的温度为1℃~6℃，时间为6h~48h；

（4）将步骤（3）制得的加载多肽生长因子内层纳米纤维膜套装在步骤（1）中所述外层导管中，即可得到所述复合神经导管；

所述加载多肽生长因子内层纳米纤维膜与所述外层导管的质量比为1：（10~1000）；

步骤（1）和步骤（2）中，用于制备外层导管和用于制备内层纳米纤维膜的材料为可降解的生物材料；

所述可降解的生物材料为质量比为1：（1~10）的壳聚糖和聚乙烯醇。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述外层导管的制备方法如下：在用于导管成型的模具上蘸取用于制备外层导管的材料的溶液，并使所述模具自转至溶液干燥成膜；重复上述步骤，直至膜厚达0.05~0.5mm，经脱模后即可得到所述外层导管。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述静电纺丝的条件如下：纺丝电压为10kv~30KV；纺丝接收距离为10~20cm；纺丝液的流速为0.2~1.0mL/h；纺丝针头内径为0.2~0.5mm；

所述戊二醛以质量浓度为10%~50%的戊二醛水溶液的蒸汽的形态存在；所述交联的时间为1~4h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述可降解的生物材料为质量比为1：2的壳聚糖和聚乙烯醇。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：用于制备外层导管的材料的溶液以及用于制备内层纳米纤维膜的材料的溶液为壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液的混合液，所述壳聚糖溶液的质量浓度为5%~10%，溶剂为酸；所述聚乙烯醇的质量浓度为10%~15%，溶剂为酸。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述外层导管和所述内层纳米纤维膜的长度为0.1mm~100mm；所述外层导管的壁厚为0.05~0.5mm，直径为0.5~10mm；所述内层纳米纤维膜的厚度为0.005~0.02mm。

7.权利要求1-6中任一项所述的制备方法制备得到的复合神经导管。