CN108884437A - 用于伤口愈合的干细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种通过施用本申请中所述的细胞来处理伤口的方法。一方面，所述方法提供用于皮肤伤口的治疗。在一般的实施方案中，将所述细胞在不附着于递送载体中的功能化基质的情况下递送至伤口。

Description

用于伤口愈合的干细胞
技术领域
本发明提供一种通过施用本申请中所述的细胞来处理伤口的方法。一方面，所述方法提供用于皮肤伤口的治疗。在一般的实施方案中，将所述细胞在不附着于递送载体中的功能化基质的情况下递送至伤口。
背景技术
皮肤是身体抵御伤害和微生物的第一道防线并且其在身体功能中起到重要作用。创伤性损伤、烧伤和慢性溃疡可对皮肤造成严重损害，从而影响皮肤屏障的主要免疫功能，并然后可能伴有全身性风险。
皮肤伤口的最佳愈合需要以下过程：发炎、上皮再形成、肉芽组织形成、血管发生、伤口收缩和细胞外基质(ECM)重构，这有助于创伤性损伤后的皮肤组织再生。
伤口愈合是一种复杂的过程，其中皮肤组织在损伤后自我修复。在正常皮肤中，表皮(表层)和真皮(深层)形成抵御外部环境的保护屏障。当所述屏障被破坏时，迅速启动生化事件的协调级联反应以修复损伤。该过程分为以下可预测的阶段：血液凝结(止血)、发炎、新生组织的生长(增殖)以及组织的重塑(成熟)。有时血液凝结被认为是炎症阶段的一部分而不是其单独的阶段。
·止血(血液凝结)：在受伤的最初几分钟内，血液中的血小板开始粘附在受伤部位。这激活了血小板，导致一些事情的发生。它们变成更适合凝结的无定形形状，并且它们释放化学信号以促进凝结。这导致纤维蛋白的激活，其形成网状物并且充当将血小板彼此结合的“胶水”。这形成了用于堵住血管中破裂处的凝块，从而减缓/防止进一步出血。
·发炎：在该阶段期间，受损和死亡的细胞以及细菌和其他病原体或碎片被清除。这通过吞噬作用的过程发生，其中白细胞通过吞噬碎片来“吃掉”碎片。血小板衍生的生长因子被释放到伤口中，引起在增殖期期间的细胞迁移和分裂。
·增殖(新生组织的生长)：在该阶段，发生(淋巴)血管发生、胶原沉积、肉芽组织形成、上皮形成和伤口收缩。在血管发生中，血管内皮细胞形成新血管，而淋巴管内皮细胞有助于形成新的淋巴管。在纤维组织形成和肉芽组织形成中，成纤维细胞生长并通过分泌胶原蛋白和纤连蛋白而形成新的临时细胞外基质(ECM)。与此同时，发生表皮的恢复，其中上皮细胞增殖并在创面(wound bed)上“爬行”，为新组织提供覆盖物。在伤口收缩中，肌成纤维细胞使用类似于平滑肌细胞中的机制，通过抓住伤口边缘并收缩来减小伤口的大小。当细胞的作用接近完成时，不需要的细胞会发生凋亡。
·成熟(重塑)：在成熟和重塑过程中，胶原蛋白沿张力线重新排列，不再需要的细胞通过程序性细胞死亡或细胞凋亡而被除去。
伤口愈合过程不仅复杂而且脆弱，并且容易中断或失败，导致形成不愈合的慢性伤口。导致不愈合的慢性伤口的因素是糖尿病、静脉或动脉疾病、感染和老年代谢缺陷。
伤口可以由多种原因引起，包括例如创伤、疾病、微生物的作用和暴露于异物。伤口愈合不仅对于实现伤口闭合重要，而且对于恢复组织功能并提供抵抗感染的屏障功能也很重要。延迟的伤口愈合是受试者发病的重要原因。在一些情况下，伤口愈合过程是功能性失调的，导致慢性伤口的发生。慢性伤口对受影响个体的身心健康、生产率、发病率、死亡率和护理成本具有重大影响。
慢性伤口定义为3个月后无法愈合的伤口。静脉淤滞性溃疡、糖尿病溃疡、压力性溃疡和缺血性溃疡均是最常见的慢性伤口。很多企图治愈静脉停滞性溃疡的敷料选择是对标准的糊压绷带Unna's boot的改变。这些伤口有时会有大量需要经常清创的渗出物。在这种情况下可使用海藻酸盐、泡沫和其他吸收剂。由于慢性伤口通过与急性伤口略有不同的机制来愈合，因此正在研究使用生长因子的实验。和(CurativeHealth Services Inc.Hauppauge,N.Y.)是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的唯一药物。
伤口护理通过清洁和保护伤口使其免受再损伤或感染来促进和加速伤口愈合。根据每个患者的需求，范围可以从最简单的急救到全程专科护理(nursing specialties)，如伤口、造口术和节制护理以及烧伤中心护理。
每年有超过150万个皮肤伤口是因烧伤导致的和超过100万个皮肤伤口是因皮肤癌导致的。每年，皮肤伤口导致约75000例住院病例和12000例死亡，在2005年，约有33亿美元被花费在伤口护理上。
在体内，皮肤伤口愈合涉及成纤维细胞分泌临时基质，这是一个通常在损伤后7天开始的过程。然而，目前可用的组织工程皮肤替代品是脱细胞的人类皮肤，例如其在慢性皮肤创伤(如，由于糖尿病、血管炎、营养不良、感染所造成)、急性皮肤创伤(如，烧伤、皮肤癌)、皮肤畸形等情况下用于人类。这种脱细胞的皮肤替代品缺少皮肤附件结构(如，皮脂腺、毛囊、黑色素细胞)、表皮-真皮接合处的表皮嵴(rete ridgepattern)，以及促进伤口愈合的其他重要的活的成分。此外，在目前可用的皮肤替代品的异体移植过程中仍存在高的感染风险。
由于真皮和表皮皮肤层的再生对于具有有限的疤痕形成和感染的成功伤口愈合来说至关重要，因此，需要的是“真正的”皮肤替代品的新的模型。
最常用的辅助伤口愈合的常规方式涉及使用伤口敷料。许多不同类型的敷料被用于帮助伤口愈合。一些治疗还利用提供的矿物质和维生素来帮助伤口愈合。然而，这些类型的治疗方式几乎没有取得成功。因此，目前用于促进伤口愈合的临床方法包括：保护创面免受机械性创伤；通过抗生素、抗菌防腐剂和其他抗微生物化合物来控制表面微生物负荷；以及使用某些类型的生长因子。然而，这些方法都有一些缺点。
伤口的愈合是细胞的递送具有治疗潜力的一个实例。尽管在对伤口愈合过程的基本原理的理解方面取得了进展，但用于伤口治疗的治疗选择仍然有限。细胞递送策略提供了潜在的治疗途径。
虽然细胞的递送具有治疗潜力，但由于许多原因，细胞递送的使用仍然受到限制。例如，诸如细胞应如何递送、基质选择、细胞附着、细胞转移效率和/或细胞保持其治疗性质的能力的考虑因素对于治疗结果而言均是重要的。
研究人员已经利用不同来源的干细胞来治疗创伤性皮肤损伤，以加速皮肤缺损的再生和重建(Yaojiong et al.，Stem Cells,25(10):2648-59,2007)。然而，干细胞疗法仍存在一些问题，例如干细胞来源有限。因此，一直需要识别用于治疗目的的新细胞和/或递送细胞的手段。
尽管本领域有这些进展，但本领域仍需要新的和更好的方法和装置用于恢复损伤处伤口愈合的自然过程，所述损伤的修复需要组织重塑和恢复。
发明内容
本发明提供一种用于处理某些伤口的方法，所述方法通过将本文所述的用于愈合伤口的某些细胞施用于这些伤口。
递送的途径包括但不限于局部给药形式。局部给药形式的实例包括：通过以下方式的递送：凝胶剂、软膏剂、乳膏、洗剂、泡沫剂、乳剂、悬液剂、喷雾剂、气雾剂、溶液剂、液体、粉剂、半固体、凝胶剂、胶冻剂；固体、糊剂、酊剂、搽剂、可降解载体、可药用载体、流体、储液囊(reservoir)、液体、凝胶、植入物(如PVA负载的海绵)、胶原凝胶溶液、膜制品(如胎盘膜、羊膜)、胶原海绵、纤维蛋白或其他蛋白质胶、在流体连通悬液中、在可药用载体中(例如盐水、糖(如葡萄糖)、等渗的水稀释液)、粉剂、皮肤替代品(如蛋白质，如纤维蛋白或膜制品)、脱细胞的组织制品(例如脱细胞的皮肤制品)、支架(包括水凝胶、基质胶、可吸收明胶海绵、纤维蛋白、PLGA、胶原凝胶)、纤维蛋白喷雾剂或其他蛋白质喷雾剂或膜喷雾剂。
给药也可通过贴剂、绷带、纱布或敷料进行，其中所述贴剂、绷带、纱布或敷料不包含细胞附着的且细胞从其迁移至伤口的功能化基质，例如使用烷基基团(如烷基胺基团)的化学修饰。也可考虑其他形式的局部递送。
递送也可以是使用上述关于局部递送的任意形式的皮内或皮下递送。
关于局部给药，可以将细胞在任意合适的载体(例如上文提及的那些)中通过局部注射递送至伤口。
可根据需要使用上述递送载体(例如在PVA负载的海绵中)将细胞植入伤口。
在某些实施方案中，细胞不在绷带、纱布、贴剂或敷料中递送。在更具体的实施方案中，细胞不在任意这些载体中递送，其中所述载体包含功能化基质。在更具体的实施方案中，所述载体不包括其为化学修饰(例如使用烷基基团，如烷基胺基团的化学修饰)的功能化基质。
然而，细胞可通过不包含使用烷基基团的化学修饰的功能化基质递送。因此，细胞可以通过用蛋白质或其他生物材料功能化的基质递送，所述蛋白质或其他生物材料来源于组织或模拟组织中发现的那些，例如膜制品，包括但不限于羊膜。
在明确排除的实施方案中，细胞不通过使用烷基基团且特别是烷基胺基团化学修饰的装置(例如绷带、纱布、敷裹或贴剂)递送。
一方面，将细胞递送至伤口，但不在负载细胞的贴剂、绷带或敷料中。在一个具体的实施方案中，细胞不附着于功能化基质。
本文所述的细胞可在可药用载体中给药至伤口。药学上可接受的载体包括但不限于水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇、液体油如棕榈酸酯、聚乙二醇、吐温和SDS等。
在某些实施方案中，药物组合物适用于通过以下方式递送至受试者：一次或多次静脉内给药、雾化给药、肠胃外给药、植入物、皮下注射、关节内给药、经直肠给药、经鼻内给药、经眼内给药、经阴道给药或经皮给药。
在某些实施方案中，药物组合物包含其他化合物，所述其他化合物增强、稳定或维持细胞活性以用于递送和/或它们的递送或转移。
在某些实施方案中，药物组合物可能需要经肠胃外给药(例如直接给药至关节间隙)或腹腔内给药。例如，可在水中适当地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合来制备溶液或悬液。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇以及其在油中的混合物中制备。
在某些实施方案中，所述组合物可能需要通过注射给药。适于注射用途的形式包括无菌水溶液或分散液以及用于无菌注射溶液或分散液的即用制备的无菌粉末。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。
在某些实施方案中，所述组合物可能需要通过静脉内给药。包含本文所述的适用于静脉内给药的组成的组合物可由技术人员配制。
在某些实施方案中，所述组合物可以通过注射给药，例如以细胞悬液、以泡沫或糊剂的形式，即，通过由聚合物或其他分子、网状物或微载体组成的3D载体给药。
一方面，本发明提供一种用于处理皮肤伤口的方法，其包括将包含干细胞的组合物给药至皮肤伤口。皮肤的伤口可以是有限的或大面积的。它可以局限于表皮，也可以涉及真皮、脂肪层、肌肉并且甚至骨骼。因此，伤口可以延伸到皮肤和皮下组织。
伤口可选自撕裂伤、擦伤、烧伤、切口、穿刺、由弹丸引起的伤口和表皮伤口、皮肤伤口、慢性伤口、急性伤口、外部伤口、内部伤口、先天性伤口、溃疡、压力溃疡、糖尿病性溃疡、隧道伤、在手术过程中或作为外科手术辅助手术引起的伤口、静脉皮肤溃疡和无血管性坏死。
在一个实施方案中，伤口为由于血液和/或淋巴循环不足所引起的这一类伤口。在这类伤口中，尤其包括因这种循环不足引起的慢性伤口，如糖尿病溃疡、静脉性皮肤溃疡和无血管性坏死。特别是皮肤伤口可通过本发明的方法治疗。然而，应理解，这些皮肤伤口特别是慢性皮肤伤口可影响皮下层并且实际上可能会暴露更深的肌肉，甚至是骨组织。这可能是糖尿病足溃疡、静脉性腿部溃疡和烧伤的情况。
术语“伤口”包括例如组织的损伤，包括开放性伤口、延迟或难以愈合的伤口和慢性伤口。伤口的实例可包括开放性和闭合性伤口。术语“伤口”还包括例如皮肤和皮下组织的损伤，以及以不同方式引发并具有不同特征的损伤。
在某些实施方案中，伤口包含外部伤口。在某些实施方案中，伤口包含开放性伤口。在某些实施方案中，所述伤口包含慢性伤口。在某些实施方案中，所述伤口包含慢性伤口或溃疡。
对于外部伤口，通常这些伤口根据伤口的深度分为四个等级之一：i)I级，限于上皮的伤口；ii)II级，延伸至真皮的伤口；iii)III级，延伸到皮下组织的伤口；iv)IV级，其中暴露骨的伤口(或全层伤口)。
本发明涉及一种促进皮肤伤口愈合的方法，包括将有效量的干细胞给予患者，从而相对于未处理的对照产生至少一种以下效果：加速的伤口闭合、快速的上皮再形成、改善的(淋巴)血管发生和改善的组织重塑。
伤口愈合的积极结果包括但不限于增强的上皮形成、肉芽组织形成和血管发生、加速的伤口闭合、肉芽组织的沉积、随胶原含量增加而增加的伤口破裂强度、增加的伤口拉伸强度、减少的瘢痕形成和减小的伤口尺寸。
伤口包括皮肤伤口。它们也包括达到真皮的所有层的伤口，包括皮下层和脂肪层，即，还包括皮下组织。本发明适用于慢性伤口、由肥胖症或糖尿病引起的伤口、不愈合的糖尿病伤口、一般性的糖尿病伤口、糖尿病足溃疡、烧伤、神经性足溃疡、糖尿病性神经性溃疡和慢性皮肤溃疡。可能由于潜在的原因(如缺乏足够的血液循环或淋巴循环)而导致的皮肤和皮下组织中的伤口。因此，本发明的方法和本发明的组合物促进上皮再形成，即伤口全部或部分闭合。
根据本发明的另一方面，提供一种促进受试者伤口愈合的方法。该方法包括将有效促进受试者伤口愈合的量的干细胞给药至受试者。在一个实施方案中，受试者为人类。然而，本发明包括兽类受试者(如狗、猫、猪、马等)。
正常伤口愈合有三个阶段，包括出血和凝固、急性炎症、细胞迁移、增殖、分化、血管发生、上皮再形成以及细胞外基质的合成和重塑。所有这些事件都发生在三个重叠阶段，具体是发炎、增殖和重塑。本申请中的细胞可在这些阶段中的一个或多个阶段中使用。它们不需要但可以在所有这三个阶段中使用。
慢性伤口是无法经过愈合的三个正常阶段的那些。这导致在典型的时间段内无法修复的组织损伤。这可能是由各种潜在的病症引起，所述病症包括但不限于糖尿病、压力、血管功能不全、烧伤和血管炎(Borueet al.；Am J Pathol(2004)165：1767-1772)。本申请中的细胞可在这些阶段中的一个或多个阶段中使用。
将干细胞以有效促进动物伤口愈合的量给药至动物。所述动物可以是哺乳动物，且所述哺乳动物可以是灵长类动物，包括人和非人灵长类动物。通常，干细胞以约1x 105细胞/千克至约1x 107细胞/千克，优选约1x 106细胞/千克至约5x 106细胞/千克的量给药。在一个具体的实施方案中，以2-4x 107细胞/千克的量给药。待给药的干细胞的精确量取决于多种因素，包括患者的年龄、体重和性别以及所治疗的伤口的范围和严重程度。
干细胞可以与可药用载体一起给药。干细胞可以全身给药。干细胞可以直接给药至伤口，包含干细胞的流体或储液囊，例如PBS、缓冲盐、细胞培养基、PlasmaLyte。
在一些实施方案中，将所述细胞与其他因子一起递送。这些因子包括但不限于一种或多种抗炎或抗菌因子，包括防御素、N-Gal、IL-1RA、血管发生因子(如VEGF、bFGF、PDGF)、上皮细胞刺激蛋白(包括KGF和EGF)和抗瘢痕形成蛋白TGFβ3、IFNα2和HGF。
本发明涉及的细胞可表达多能性标记物，例如oct4。它们也可表达与长期复制能力相关的标记物，如端粒酶。多能性的其他特征可包括分化为一种以上胚层(如外胚层、内胚层和中胚层中的两种或三种)的细胞类型的能力。这样的细胞在培养中可以是或可以不是无限增殖的或转化的。所述细胞可以被高度扩增而不被转化并仍维持正常的核型。例如，在一个实施方案中，非胚胎干细胞、非生殖细胞可已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增，如50、60或更多次细胞倍增，其中所述细胞未被转化并具有正常的核型。所述细胞可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚细胞系中的两种中每一种的至少一种细胞类型，并可包括分化为所有的三种胚细胞系的细胞类型。此外，所述细胞可以是不致瘤的，例如不产生畸胎瘤。如果细胞是转化的或致瘤的，并且需要将它们用于输注，这样的细胞可以是有缺陷的，因此它们不能在体内形成肿瘤，如通过防止细胞增殖为肿瘤的处理。这样的处理在本领域中是公知的。
细胞包括但不限于以下编号的实施方案：
1.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，所述细胞已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增，其中所述细胞表达otc4，是未被转化的并具有正常的核型。
2.上述1的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
3.上述1的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚细胞系的至少两种中的至少一种细胞类型。
4.上述3的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
5.上述3的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚细胞系中的每一种的至少一种细胞类型。
6.上述5的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
7.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其是通过培养非胚胎、非生殖组织而获得，所述细胞已经在培养中经历至少40次细胞倍增，其中所述细胞是未被转化的并具有正常的核型。
8.上述7的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
9.上述7的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚细胞系中的至少两种的至少一种细胞类型。
10.上述9的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
11.上述9的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚细胞系中的每一种的至少一种细胞类型。
12.上述11的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
13.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，所述细胞已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增，其中所述细胞表达端粒酶，是未被转化的并具有正常的核型。
14.上述13的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
15.上述13的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚细胞系中的至少两种的至少一种细胞类型。
16.上述15的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达oct4、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
17.上述15的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚细胞系中的每一种的至少一种细胞类型。
18.上述17的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达oct4、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
19.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚细胞系中的至少两种的至少一种细胞类型，所述细胞已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增。
20.上述19的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
21.上述19的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚细胞系中的每一种的至少一种细胞类型。
22.上述21的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
上述细胞可由任意所需的组织源制备，其包括但不限于骨髓、脐带血、脐带基质、外周血、胎盘、胎盘血、肌肉、脑、肾和其他实体器官。它们也可以来自排泄液，例如尿液和经血。
在一个实施方案中，细胞来源于人类组织。
在特定的实施方案中，伤口含有上皮损伤。
在某些实施方案中，所述细胞本身不需要递送。治疗效果可以通过细胞分泌的因子来实现。例如，当培养细胞时，可以将有益因子分泌到细胞培养基中。因此，培养基本身可用于本申请中公开的各种实施方案。或者，可以使用条件培养基的提取物，所述提取物包含有益因子，所述细胞通过所述有益因子在如本申请所述的伤口愈合中提供治疗结果。因此，无论细胞可被递送到何处，均可以替换或添加所述条件培养基或其提取物。
附图说明
图1A-1M：图1A和B；该图代表一般的(右)和淋巴特异性(左)内皮细胞(EC)标记物的表达，其表示为未分化的mMAPC中％相对一般小鼠RNA(A)或未分化的hMAPC(d0，白色)中、第14天分化(d14、灰色)和第21天分化(d21、黑色)时％相对一般人RNA。数据代表5-6次独立分化的均值±SEM。通过具有Dunn’s事后检验的Kruskal-Wallis检验，相对于d0*P<0.05。图1C；FACS直方图(代表性的n＝3)表示第14天时mMAPC中LYVE1蛋白表达(实线)相对于同型对照(虚线)。APC：别藻蓝蛋白。图1D；该图代表LYVE1表达，其表示为相对于未分化的hMAPC(d0，白色)的倍数增加，或在d9时在VEGF-A(浅灰)、VEGF-C(深灰)或组合(黑色)存在下相对于未分化的hMAPC的倍数增加。数据代表n＝3的均值±SEM。通过具有Tuckey’s事后检验的单向方差分析，相对于d0*P<0.05。图1E-G；暴露于LEC培养基(E；‘L’)或来自mMAPC的条件培养基(‘mCM’；F)的人淋巴EC(hLEC)球的代表性图像，以及相应的定量(G；数据代表n＝4的均值±SEM；通过Mann-Whitney-U检验，相对于‘L’*P<0.05)。图1H；该图代表小鼠(‘mCM’)或人(‘hCM’)MAPC-CM对LEC增殖的影响，其表示为％相对于LEC培养基。数据代表n＝3-6的均值±SEM。通过Mann-Whitney-U检验，相对于‘LEC’*P<0.05。图1I-M；在非条件的mMAPC培养基(NCM；J)、mMAPC-CM(K)、非条件的hMAPC培养基(NCM；L)或hMAPC-CM(M)存在下迁移穿过transwell膜的LEC的代表性图像(通过Wright-Giemsa染色表示)，以及相应的定量(I；数据代表n＝4的均值±SEM；通过Mann-Whitney-U检验，相对于相应的NCM条件*P<0.05)。比例尺：50μm(E,F)；100μm(J-M)。
图2A-2P：图2A；用PBS(空心圆圈)或mMAPC(实心圆圈)处理的小鼠中的伤口宽度。数据代表均值±SEM，n＝5；通过重复测量方差分析和Fisher事后检验，相对于PBS*P<0.05。图2B；4天前移植了eGFP+mMAPC的小鼠的伤口(以箭头表示)区域的合并的明场/荧光图像。注意到mMAPC靠近导向创面的血管(以楔形表示)。图2C和D；用PBS(C)或mMAPC(D)处理的小鼠的10天伤口的CD31染色(褐色)横切面的代表性图像。图2E-G；用PBS(E)或mMAPC(F)处理的小鼠的10天伤口的LYVE1染色(红色)横切面的代表性图像，以及相应的定量(G；数据代表均值±SEM；通过Mann-Whitney-U检验，相对于PBS*P<0.05；n＝4-5)。图2H；10天前移植了eGFP+mMAPC的小鼠的横切面的共焦图像，表明eGFP与LYVE1(红色)的偶然共定位(楔形)。图2I和J；5天前用PBS(I)或hMAPC(J)处理、针对广谱细胞角蛋白(PCK；褐色；楔形表示伤口边界，水平线表示表皮覆盖的距离)进行染色的伤口的横切面的代表性图像。图2K和L；10天前用PBS(K)或hMAPC(L)处理的伤口的CD31染色的(褐色)横切面的代表性图像。图2M-O；用PBS(M)或hMAPC(N)处理的小鼠的10天伤口的LYVE1染色的(红色)的横切面的代表性图像，以及相应的定量(O；数据代表均值±SEM。通过不成对学生t检验，相对于PBS*P<0.05；n＝6-8)。图2P；10天前移植了hMAPC的小鼠的伤口横切面的图像，表明人波形蛋白(hVimentin)(绿色)与LYVE1(红色)的偶然共定位(楔形)。苏木精和DAPI分别用于显示在C、D、I-L和E、F、M、N中的核。比例尺：10μm(H、P)；100μm(E,F)；150μm(K,L)；400μm(C、D、I、J、M、N)；2mm(B)。
图3A-3D：图3A；该图像表示皮瓣(skin flap)模型。R1/R2表示图B-D中的图像所表示的区域。箭头/‘X’分别表示用于淋巴管造影术的荧光标记的葡聚糖或MAPC/PBS的注射点，楔形表示通过其保持向皮瓣的血液供应的区域。图3B-D；2周前注射了PBS(B)、mMAPCs(C)或hMAPCs(D)的小鼠的区域R1(左；以及相应的插图(i；中)的放大图像)和R2(右)在注射葡聚糖(B、D中为FITC标记的葡聚糖，C中为罗丹明B标记的葡聚糖)之后15min的明场/荧光图像的代表性合并图。楔形表示填充的向心淋巴管。LN：淋巴结。R1/R2中的虚线分别描绘了开放性皮肤的边界或皮瓣边界。比例尺：100μm(B；i1,C；i2+R2,D；i3)；250μm(B；R1+R2,C；R1,D；R1+R2)；和500μm(A)。
图4A-4L：图4A-D；用PBS(A)、mMAPC(‘mM’；B)或hMAPC(‘hM’；C)处理的小鼠的Flt4染色的(褐色)皮肤伤口横切面的代表性图像，以及相应的定量(D，数据代表均值±SEM；通过具有Dunn’s事后检验的Kruskal-Wallis，相对于PBS*P<0.05；n＝6)。图4E-H；用PBS(E)、mMAPC(‘mM’；F)或hMAPC(‘hM’；G)处理的小鼠的皮肤伤口横切面(葡聚糖注射位置的周围)的代表性图像，表明经细胞处理的小鼠中的功能性(葡聚糖灌注的)淋巴管(绿色或红色)，以及相应的定量(H；数据代表均值±SEM；通过具有Dunn’s事后检验的Kruskal-Wallis，相对于PBS*P<0.05；n＝5-10)。E中的插图(i1)示出了Prox1(红色)染色的相应区域。注意到E中散开的荧光信号，其代表未能被淋巴管吸收的FITC-葡聚糖。图4I；2周前移植了eGFP+mMAPC(通过楔形来表示注射点)的小鼠的伤口区域的合并的明场/荧光图像。图4J；4周前移植了eGFP+mMAPC(箭头)的小鼠的伤口区域的合并的绿/红荧光图像。注意到在移植细胞附近的罗丹明-葡聚糖填充的淋巴管(红；楔形)。图4K；穿过伤口周围区域的横切面，表明功能性(罗丹明-葡聚糖填充的，红色；管腔以星号表示)淋巴管附近的移植的eGFP+mMAPC。图4L；2周前移植了eGFP+mMAPC的伤口区域的高倍放大，表明这些细胞偶尔成为功能性(罗丹明-葡聚糖填充的，红色)淋巴管的内皮内衬(lining)(楔形)的一部分。苏木精和DAPI分别用于表示在A-C和E-G、K中的核。比例尺：25μm(L)；50μm(E-G)；100μm(A-C、J、K)；500μm(I)。
图5A-5G：图5A；16周前移植了eGFP+淋巴结(LN；楔形)并用包含hMAPC的处理的小鼠的右腋窝区的合并的明场/荧光图像。被凝结的覆盖的区域和开放性皮肤边界分别以虚白线和实白线表示。图5B；该图表示LN移植之后4周或16周，用包含PBS或hMAPC的处理的小鼠中右上肢中水肿的程度(通过MRI测定并表示为右/左比例(单位为AU))。通过不成对学生t检验，相对于w4*f<0.05(n＝4-9)。图5C和D；LN移植之后16周记录的用包含PBS(C)或hMAPC(D)的处理的小鼠的前臂区的代表性T2加权MR图像。高信号区(箭头)表示由于水肿而引起的流体累积。L：左；R：右。图5E和F；16周前移植了eGFP+LN(楔形)并用包含PBS(E)或hMAPC(F)的处理的小鼠的右腋窝区的合并的明场/荧光图像。插图(i1)在F中的框区上放大。注意到注射(注射点以箭头表示)后15分钟记录的hMAPC处理的小鼠中罗丹明标记的凝集素(红色)的显著改善的引流。开放性皮肤的边界以白线表示。图5G；16周前用包含hMAPC的处理的小鼠中移植的eGFP+LN(绿色)的放大的合并的明场/荧光图像，表明罗丹明标记的凝集素(红色)引流到LN中。箭头表示向心淋巴管。比例尺：200μm(G)；3mm(A,E,F)。
图6A-6N：图6A-C；通向小鼠的移植淋巴结(LN)的血管网的明场图像，所述小鼠在16周前用包含PBS(A)或hMAPC(‘hM’；B)的处理，以及相应的定量(C；数据代表均值±SEM；通过Mann-Whitney-U检验，相对于PBS*P<0.05；n＝6)。图6D；16周前用包含hMAPC的处理的小鼠中移植的eGFP+LN的合并的明场/荧光图像，表明LN被许多血管灌洗。图6E和F；8周前用包含hMAPC的处理的小鼠中移植的DsRed+LN的放大的合并的明场/荧光图像，表明LN血管网的广泛分支。插图(i1)对应于F中的框区。图6G；16周前用+hMAPC处理的小鼠中Prox1/eGFP染色的切片的合并IF图像，表明部分分支是淋巴性的(Prox1+，楔形)。插图(i2)对应于G中的框区。图6H-J；LN移植后8周时缝合处周围区域中PBS(H)或hMAPC处理(‘hM’；I)的小鼠的LYVE1染色(红色)的横切面，以及相应的定量(J；数据代表均值±SEM；通过学生t检验，相对于PBS*P<0.05；n＝5-8)。图6K-M；移植的eGFP+LN周围区域的荧光图像(K中以虚线标出；Prox1染成绿色的相邻切片如L所示；Prox1/平滑肌α-肌动蛋白(αSMA为红色，以楔形表示)；M中的双染色在K、L中的框区上放大；图6N代表LYVE1染成红色的相邻横切面上的相同区域)，表明16周前用包含hMAPC的处理的小鼠中的Prox1+αSMA+LYVE1-引流淋巴收集管(collector)。L-N中的星号表示淋巴(其在暴露于基于酪酰胺(tyramide)的放大之后人为地发出荧光)。A、B、E-L中的白色箭头表示用于固定移植的LN的缝合。比例尺：20μm(M、N)；50μm(G、K、L)；100μm(D)；150μm(F、i1)；200μm(E、H、I)；500μm(F)；1mm(A、B)。
图7A-7H：图7A；该图代表用PBS(n＝5；空心圆圈)或mMAPC(n＝5；实心圆圈)处理的小鼠中的伤口长度(单位：mm)，直至受伤后10天。数据代表均值±SEM。通过具有Fisher事后检验的重复测量方差分析，相对于PBS*P<0.05。图7B和C；受伤后10天用PBS(B)或鼠(m)MAPC处理的小鼠背部上线性伤口的代表性明场图像。图7D和E；用PBS(D)或mMAPC(E)处理的小鼠的10天伤口的横切面(用H&E染色)的代表性图像。注意到在mMAPC处理的小鼠中伤口裂口(其边缘以楔形表示)明显更小。图7F；伤口横切面的红色和绿色荧光图像的合并图，表明无CD45(绿色)与LYVE1(红色)的共定位。图7G；接种eGFP标记的hMAPC之后24小时创面的明场/荧光图像的合并图，表明eGFP+hMAPC在伤口区的均匀分布。图7H；10天前移植了hMAPC的小鼠的波形蛋白染色的(绿色)伤口横切面图像，表明大片hMAPC在整个创面的持续均匀分布。真皮-表皮接合处以虚线表示。在H中，DAPI被用作核复染剂。比例尺：F中为20μm；H中为100μm；D、E中为300μm；G中为1mm；B、C中为2mm。
图8A-8I：图8A-D；用PBS(A)、mMAPC(‘mM’；B)或hMAPC(‘hM’；C)处理的小鼠的皮肤伤口(图3A中以‘X’表示的移植位置的周围)的横切面(CD31染色(褐色))的代表性图像，以及相应的定量(D；数据代表均值±SEM；通过具有Dunn’s事后检验的Kruskal-Wallis检验，相对于PBS*P<0.05；n＝5)。图8E-H；用PBS(E)、mMAPC(‘mM’；F)或hMAPC(‘hM’；G)处理的小鼠的皮肤伤口(图3A中以箭头表示的葡聚糖注射位置周围)的横切面(LYVE1染色(E、G中为红色；F中为绿色))的代表性图像，以及相应的定量(H；数据代表均值±SEM；通过具有Dunn’s事后检验的Kruskal-Wallis检验，相对于PBS*P<0.05；n＝6)。图8I；2周前移植了hMAPC的小鼠的伤口区(图3A中以‘X’表示的移植位置周围)的绿色(FITC标记的葡聚糖)、红色(Prox1)和远红外(平滑肌细胞-α-肌动蛋白；αSMA)荧光显微图像的合并图，表明除两种小的功能性Prox1+/αSMA-淋巴毛细管(以白色虚线标出)之外的功能性αSMA包被的(楔形)Prox1+淋巴(前)收集管。筋膜的自发荧光肌细胞以红色虚线表示。比例尺：I中为10μm；A-C、E-G中为100μm。
图9A-9H：图9A和B；LN移植后16周记录的用包含PBS(A)或hMAPC(B)的处理的小鼠的前臂区的T2图(对应于图5C、D中所示的T2加权MR图像)。L：左；R：右。图9C；8周前移植了DsRed+LN并用包含hMAPC的处理的小鼠的右腋窝区的绿色和红色荧光显微图像的合并图。注意到被FITC标记的凝集素(绿色)填充的向心淋巴管，以楔形表示。图9D和E；16周前移植了eGFP+LN并用包含PBS(D)或hMAPC(E)的处理的小鼠的右腋窝区的明场和绿色荧光图像的合并图，表明更复杂的血管网灌洗hMAPC处理的小鼠的移植LN。图9F；16周前移植了eGFP+LN并用hMAPC处理的小鼠的右腋窝区横切面的红色和绿色荧光图像的合并图，表明移植的LN周围持续存在的波形蛋白染色的(红色)hMAPC。图9G；4周前移植了eGFP+LN并用包含hMAPC的处理的小鼠的右腋窝区的明场和绿色荧光图像的合并图，表明(淋巴)血管网络((lymph)vascularnetwork)的向外分支。图9H；16周前移植了eGFP+LN并用包含hMAPC的处理的小鼠的右腋窝区的eGFP染色横切面的合并图，表明(淋巴)血管网络的向外分支。在C-E中，固定移植LN的永久缝合以箭头表示。F-H中，LN体以白虚线标出。F、H中，DAPI用于表示核。比例尺：F中为25μm；H中为100μm；G中为150μm；C-E中为250μm。
具体实施方式
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，因而可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非意图限制所公开的发明的范围，所述范围仅由权利要求书限定。
在本文中，部分标题仅用于组织的目的，而不应理解为以任何方式限制所述主题。
除非另有说明，本申请的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法以及如本说明书全文中引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献所述进行。参见，例如，Sambrooket al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)和Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，以及Harlowand Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)。
定义
在本文中，“一个(a)”或“一种(an)”意指一个或多于一个；至少一个。当本文使用复数形式时，其通常包括单数形式。
本申请中使用的术语“绷带”与术语“敷料”或“贴剂”同义，因为它们是指其上附着有细胞的功能性基质。这些装置称为负载有细胞的绷带、负载有细胞的贴剂和负载有细胞的敷料。在这些实施方案中，当在伤口的可操作附近施用时，附着于基质的细胞离开贴剂、敷料或绷带并迁移到伤口处。在一些情况下，这些绷带/贴剂可包括血浆聚合物涂层。如上所述，其可包括附着有细胞的功能性基质。
“临床相关的”细胞数是指足以产生临床反应的细胞数；即受试者中不需要的病理病症的预防、减少、缓解等。特定实施方案涉及足以建立原始细胞库的细胞数。
“共给予”意指彼此结合、一起、配合地给予，包括同时或依次给予两种或更多种试剂。
在没有其他限制的情况下,“包含(comprising)”意指必须包括所述指示物，而对其他可包含的指示物没有任何限制或排除。例如，“包含x和y的组合物”涵盖含有x和y的任何组合物，而不管所述组合物中可存在何种其他组分。同样地，“包含步骤x的方法”涵盖在其中进行x(不管x是所述方法中的唯一步骤或仅是步骤之一)的任何方法，不管可能存在多少其他步骤，也不管x与它们相比多么简单或复杂。“包括(comprised of)以及使用词根“包含(comprise)”的类似短语”在本文中用作“包含”的同义词，并具有相同的含义。
“包括”是“包含”的同义词(参见上文)。
“条件细胞培养基”是本领域公知的术语，指已在其中培养细胞的培养基。在本文中，其意指将细胞培养足够的时间以分泌可有效地达到本申请中所述的任何效果的因子。
条件细胞培养基是指已在其中培养细胞，从而将因子分泌到培养基中的培养基。出于本发明的目的，可培养细胞历经足够数量的细胞分裂以产生有效量的所述因子，使得所述培养基具有效果。可通过本领域任何已知的方法将细胞从所述培养基中除去，所述方法包括但不限于离心、过滤、免疫耗竭(例如通过经标记的抗体和磁性柱)和FACS分选。
“有效量”通常意指提供所需的局部或全身效果的量。例如，有效量是足以实现有益或所需的临床结果的量。所述有效量可在单次给药中一次全部提供，或以在几次给药中提供所述有效量的分份量(fractional amount)形式提供。对什么量会被认为是有效量的精确确定可基于每个受试者的个体因素，包括其身材、年龄、损伤和/或正在治疗的疾病或损伤以及距损伤发生或疾病开始的时间。本领域技术人员能够基于这些本领域中常规的考虑因素来确定给定受试者的有效量。如本文中所使用的，“有效剂量”与“有效量”的含义相同。
“有效途径”通常意指确保将试剂递送至所需区室、系统或部位的途径。例如，有效途径是通过其可给予试剂以在所需的作用位点提供足够实现有益或所需的临床效果的试剂的量的途径。
使用术语“包括”并非意图进行限制。
“增加(increase)”或“增加(increasing)”意指在没有预先存在的地方完全诱导，或者增加其程度。
术语“分离的”指不与一种或多种细胞结合的一个或多个细胞，或者在体内不与一个细胞或多个细胞结合的一种或多种细胞组分。“富集的群体”意指相对于体内或原代培养物中的一种或多种其他细胞类型，所需细胞在数量上的相对增加。
然而，如本文中所使用的，术语“分离的”不表示仅存在干细胞。更确切地说，术语“分离的”表示将细胞从其天然组织环境中取出并相对正常组织环境以更高的浓度存在。因此，“分离的”细胞群体可进一步包括干细胞之外的细胞类型并可包括另外的组织组分。例如，这也可以细胞倍增来表示。细胞可在体外或离体进行10、20、30、40次或更多次的倍增，使其相对于其在体内或其原始组织环境(例如骨髓、外周血、脂肪组织等)中的原始数量被富集。
“MAPC”是“多能成体祖细胞”的首字母缩略词。它是指非胚胎干细胞或非生殖细胞、但具有这两种细胞的某些特征的细胞。MAPC可以许多替代的描述来表征，每一个描述在被发现时均赋予所述细胞以新特性。因此，它们可以用这些描述中的一个或多个来表征。第一，它们无需转化(发生肿瘤)而在培养中具有长期复制的能力并具有正常核型。第二，它们在分化时可以生成多于一个胚层如两个或所有三个胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)的细胞子代。第三，尽管它们不是胚胎干细胞或生殖细胞，但它们可以表达这些原始细胞类型的标志物，以使MAPC可以表达Oct 3/4(即Oct 3A或Oct 4)、rex-1和rox-1中的一种或多种。它们还可以表达sox-2和SSEA-4中的一种或多种。第四，像干细胞一样，它们可以自我更新，即无需转化而具有长期复制能力。这意味着这些细胞表达端粒酶(即具有端粒酶活性)。因此，以“MAPC”命名的细胞类型可由通过细胞的某些新特性来描述该细胞的替代基本特征来表征。
MAPC中的术语“成体”是非限制性的。它是指非胚胎体细胞。MAPC核型正常并且在体内不形成畸胎瘤或其他肿瘤。在美国专利No.7,015,037中第一次使用该首字母缩略词来描述从骨髓中分离的多能细胞。但是，随后发现了具有多能性标志物和/或分化潜能的细胞，出于本发明的目的，这些细胞可以等价于那些首次被命名为“MAPC”的细胞。上文“发明内容”中提供了对细胞的MAPC类型的描述。
MAPC代表比MSC更原始的祖细胞群(Verfaillie,C.M.,Trends Cell Biol 12:502-8(2002)；Jahagirdar,B.N.et al.,Exp Hematol,29:543-56(2001)；Reyes,M andC.M.Verfaillie,Ann N Y Acad Sci,938:231-233(2001)；Jiang,Y.et al.,Exp Hematol,30896-904(2002)；以及Jiang,Y.et al.,Nature,418:41-9.(2002))。
“祖细胞”是干细胞分化过程中产生的细胞，其具有它们的终末分化子代的一些而非全部特征。所确定的祖细胞，例如“心脏祖细胞”，形成谱系，而非具体的或终末分化的细胞类型。首字母缩略词“MAPC”中使用的术语“祖”并不将这些细胞限制于具体的谱系。祖细胞可形成比所述祖细胞更加高度分化的子代细胞。
可从组织中的细胞进行选择。例如，在这种情况下，将从所需的组织中分离细胞，在培养中扩增，就所需特征进行选择，并将所选细胞进一步扩增。
“自我更新”是指产生复制子代干细胞的能力，所述子代干细胞具有与产生其的那些细胞相同的分化潜能。本文中使用的类似术语是“增殖”。
“无血清培养基”是指这样的培养基，其中不存在血清，或者，如果存在的话，则处于血清组分对细胞的生长或变异没有影响的水平(即实际上不是必需的，例如残留量或痕量)。
“干细胞”是指可进行自我更新(即，具有相同分化潜能的子代)并还可产生在分化潜能上更受限制的子代细胞的细胞。
“受试者”意指脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于人、狗、猫、马、牛和猪。
如本文所使用的，术语“伤口”意指完整组织(例如皮肤)中的缺口(breach)，其可由急性创伤或潜在的病理原因引起，例如本申请中已描述的皮肤伤口和皮下伤口。
伤口可以源自多种来源，所述来源包括但不限于，自身免疫性疾病、移植器官排斥、烧伤、割伤、撕裂和溃疡，包括皮肤溃疡和糖尿病性溃疡。
可以将干细胞给予动物以修复由烧伤、割伤、撕裂和溃疡引起的上皮损伤，所述溃疡包括但不限于皮肤溃疡和糖尿病性溃疡。
伤口的实例可包括开放性伤口和闭合性伤口。在某些实施方案中，伤口包括外部伤口。在某些实施方案中，伤口包括开放性伤口。在某些实施方案中，伤口包括慢性伤口。在某些实施方案中，伤口包括慢性伤口或溃疡。
在某些实施方案中，所述组合物适合局部施用、局部给药或局部递送至受试者。局部用制剂如本文所述。可考虑其他的细胞递送形式。
局部给药的剂量和频率可由本领域技术人员确定。
用于局部给药的形式的实例包括通过以下剂型进行的递送：凝胶剂、软膏剂、乳膏、洗剂、泡沫剂、乳剂、悬液剂、喷雾剂、气雾剂、溶液剂、液体、粉剂、半固体、凝胶剂、胶冻剂、栓剂；固体、软膏剂、糊剂、酊剂、搽剂、贴剂，或从绷带、纱布或敷料中释放。可考虑其他的局部递送形式。
将基质纳入用于局部释放的产品中的方法是本领域已知的，例如Boateng J.S.etal.(2008)“Wound healing dressings and drug delivery systems:a review”J.PharmSci.97(8):2892-2923和“Delivery System Handbook for Personal Care and CosmeticProducts:Technology”(2005)by Meyer Rosen,published William Andrew Inc,NorwichNew York中所述。
在某些实施方案中，所述组合物适于通过以下方式递送至受试者：一次或多次静脉内给药、雾化给药、肠胃外给药、植入物、皮下注射、关节内给药、经直肠给药、经鼻内给药、经眼内给药、经阴道给药或经皮给药。
在某些实施方案中，所述组合物包含其他化合物，所述其他化合物增强、稳定或维持细胞活性以用于递送和/或它们的递送或转移。
在某些实施方案中，可能需要通过注射来给予所述组合物。适于注射用途的形式包括无菌水溶液或分散液以及用于无菌注射溶液或分散液的即时制备的无菌粉末。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)，其合适的混合物和植物油。
在某些实施方案中，可能需要经静脉内给予所述组合物。含有本文所述的适于静脉内给予的组成的组合物可由技术人员配制。
在某些实施方案中，受试者为人或动物受试者。在某些实施方案中，受试者为人受试者。
在某些实施方案中，受试者为哺乳动物受试者、家畜动物(例如马、牛、绵羊、山羊、猪)、家养动物(例如狗或猫)和其他类型的动物如猴子、兔子、老鼠、实验动物、鸟和鱼。可考虑其他类型的动物。考虑了本公开内容的兽医应用。还可考虑使用任何上述动物作为动物模型。
本公开内容提供了一种使伤口愈合或治疗伤口的方法，所述方法包括使用如本文所述的产品或组合物将细胞递送至伤口。
MAPC
人MAPC记载于美国专利7,015,037中。已经在其他哺乳动物中鉴定了MAPC。例如，美国专利7,015,037中还记载了鼠MAPC。美国专利No.7,838,289中还记载了大鼠MAPC。这些参考文献因记载MAPC、其表型和培养而以引用的方式纳入本文。
MAPC的分离和生长
MAPC分离方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利7,015,037，并且这些方法与MAPC的表征(表型)一起，以引用的方式纳入本文。MAPC可从多种来源中分离，所述来源包括但不限于骨髓、胎盘、脐带和脐带血、肌肉、脑、肝脏、脊髓、血液或皮肤。因此，可获得骨髓抽吸物、脑或肝脏活检样品(biospy)和其他器官，并根据这些细胞中表达(或不表达)的基因，使用本领域技术人员可获得的阳性或阴性选择技术(例如，通过功能性或形态学测定，例如上文引用的申请中公开的那些，所述申请以引用的方式纳入本文)分离所述细胞。
啮齿动物MAPC还已通过改进方法获得，所述改进方法记载于Breyer et al.,Experimental Hematology,34:1596-1601(2006)和Subramanian et al.,CellularProgramming and Reprogramming:Methods and Protocols；S.Ding(编辑),Methods inMolecular Biology,636:55-78(2010)中，所述文献因为这些方法而以引用的方式纳入本文。人MAPC已通过Roobrouck et al..Stem Cells 29:871-882(2011)中记载的改进方法获得，所述文献因为这些方法而以引用的方式纳入本文。
美国专利7,015,037中所述的来自人骨髓的MAPC
MAPC不表达共有的白细胞抗原CD45或成红血细胞特异性血型糖蛋白-A(Gly-A)。将细胞的混合群进行Ficoll Hypaque分离。然后使用抗-CD45和抗-Gly-A的抗体对细胞进行阴性选择，耗尽CD45+和Gly-A+细胞群，然后回收剩余的约0.1％的骨髓单核细胞。也可将细胞铺板于纤连蛋白包被的孔中并如下文所述培养2-4周以耗尽CD45+和Gly-A+细胞。在贴壁的骨髓细胞的培养物中，许多贴壁的基质细胞在细胞倍增约30次时经历复制性衰老，更同质的细胞群继续扩增并维持长的端粒。
或者，可通过细胞特异性标志物的组合而使用阳性选择来分离细胞。阳性和阴性选择技术都是本领域技术人员可获得的，许多适于阴性选择目的的单克隆抗体和多克隆抗体也是本领域中可获得的(参见，例如，Leukocyte Typing V,Schlossman et al.,编辑(1995)Oxford University Press)并且可从许多来源商购。
从细胞群的混合物中分离哺乳动物细胞的技术也已经记载于Schwartz等人的美国专利No.5,759,793(磁力分离)、Basch et al.,1983(免疫亲和层析)和Wysocki andSato,1978(荧光激活的细胞分选)中。
可以在低血清或无血清的培养基中培养细胞。用于培养MAPC的无血清培养基记载于美国专利7,015,037中。通常使用的生长因子包括但不限于血小板衍生的生长因子和表皮生长因子。参见，例如，美国专利No.7,169,610、7,109,032、7,037,721、6,617,161、6,617,159、6,372,210、6,224,860、6,037,174、5,908,782、5,766,951、5,397,706和4,657,866；其全部因教导在无血清培养基中培养细胞而以引用的方式纳入本文。
其他培养方法
在另外的实验中，接种MAPC的密度可从约100个细胞/cm2或约150个细胞/cm2至约10,000个细胞/cm2变化，包括约200个细胞/cm2至约1500个细胞/cm2至约2000个细胞/cm2。所述密度可随物种的不同而变化。此外，最佳密度可根据培养条件和细胞来源而变化。普通技术人员能够确定对于给定的一组培养条件的最佳接种密度。
同样，在培养中，在MAPC的分离、生长和分化过程中的任何时间都可使用少于约10％(包括约1-5％，尤其是3-5％)的有效大气氧浓度。
可在多种血清浓度(例如约2-20％)下培养细胞。可使用胎牛血清。更高的血清可与更低的氧张力结合使用，例如约15-20％。在贴壁于培养皿之前不需要对细胞进行选择。例如，在Ficoll梯度后，可将细胞以例如250,000-500,000/cm2直接铺板。可挑取贴壁集落，可能将其合并，并扩增。
在一个实施方案中，使用高血清(约15-20％)和低氧气(约3-5％)条件进行细胞培养。例如，将来自集落的贴壁细胞以约1700-2300个细胞/cm2的密度在18％血清和3％氧气(含PDGF和EGF)下进行铺板和传代。
在特异性针对MAPC的实施方案中，补充物是允许MAPC保持分化为多于一个胚细胞系(如所有三个胚细胞系)的细胞类型的能力的细胞因子或组分。这可通过未分化状态的特定标志物如Oct 3/4(即Oct4或Oct 3A)和/或具有高扩增能力的标志物(例如端粒酶)的表达来指示。
对于下文所列的所有组分，参见美国7,015,037，其因教导这些组分而以引用的方式纳入本文。
干细胞经常需要促进其附着于固体载体上的额外因子，例如纤连蛋白。本发明的一个实施方案使用纤连蛋白。参见，例如，Ohashi et al.,Nature Medicine,13:880-885(2007)；Matsumoto et al.,J Bioscience and Bioengineering,105:350-354(2008)；Kirouac et al.,Cell Stem Cell,3:369-381(2008)；Chua et al.,Biomaterials,26:2537-2547(2005)；Drobinskaya et al.,Stem Cells,26:2245-2256(2008)；Dvir-Ginzberg et al.,FASEB J,22:1440-1449(2008)；Turner et al.,J Biomed Mater ResPart B:Appl Biomater,82B:156-168(2007)；以及Miyazawa et al.,Journal ofGastroenterology and Hepatology,22:1959-1964(2007)。
一旦在培养中建立，细胞可被新鲜使用或使用例如含20％-40％FCS和10％DMSO的DMEM冷冻并储存为冷冻储液。在一个实施方案中，使用20％FCS。其他制备用于培养的细胞的冷冻储液的方法也是本领域技术人员可获得的。
出于本申请的目的，对于上述培养基组分和条件，所述另外的培养方法以及其他培养方法也适用于生物反应器方法。例如，在一个示例性实施方案中，氧气的浓度为5％，血清为约19％并向培养基中加入EGF和PDGF。
药物制剂
美国7,015,037因为对药物制剂的教导而以引用的方式纳入本文。在某些实施方案中，细胞群存在于组合物中，所述组合物被改造为用于并且适于递送，即是生理学上相容的。
在一些实施方案中，用于给予受试者的细胞(或条件培养基)的纯度为约100％(基本上同质)。在其他实施方案中，纯度为95％至100％。在一些实施方案中，纯度为85％至95％。特别地，在与其他细胞的混合物的情况下，所述百分比可以为约10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90％-95％。或者分离/纯度可以细胞倍增的方式表示，其中所述细胞已经历了例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多次的细胞倍增。
对于给定应用，用于给予所述细胞的制剂的选择将取决于多种因素。其中主要的因素是受试者的物种、正在治疗的病症的性质、其状态和在所述受试者中的分布、正给予的其他疗法和试剂的性质、用于给药的最佳途径、经所述途径的存活力、剂量方案以及对本领域技术人员来说显而易见的其他因素。例如，合适载体和其他添加剂的选择将取决于确切的给药途径和具体剂型的性质。
细胞/培养基的水性悬液的最终制剂通常包括将所述悬液的离子强度调节至等渗(即约0.1至0.2)并且至生理pH(即约pH 6.8至7.5)。最终制剂通常还包含流体润滑剂。
在一些实施方案中，细胞/培养基配制为单位剂量的可注射形式，例如溶液剂、悬液剂或乳剂。适于注射细胞/培养基的药物制剂通常是无菌水溶液和分散液。用于可注射制剂的载体可以是包含例如以下物质的溶剂或分散介质：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。
本领域技术人员可以容易地确定本发明方法中待给予的组合物中的细胞和任选的添加剂、赋形物(vehicle)和/或载体的量。通常，任何添加剂(除所述细胞之外)在溶液中(例如在磷酸盐缓冲盐水中)的存在量为0.001至50wt％。活性成分以微克至毫克的量级存在，例如约0.0001至约5wt％，优选地约0.0001至约1wt％，最优选地约0.0001至约0.05wt％或者约0.001至约20wt％，优选地约0.01至约10wt％，最优选地约0.05至约5wt％。
实施例
淋巴水肿中的MAPC支持淋巴管生长
MAPC具有淋巴管生成(lymphvasculogenic)和淋巴管发生(lymphangiogenic)潜能
本发明人研究了MAPC是否具有固有的产生LEC的能力。首先，他们确认了MAPC在VEGF-A暴露后获得一般EC标志物的表达(图1A、B)。Prox1(淋巴分化的主控开关)在2周的内皮分化时在MAPC中被显著诱导，并且其表达水平保持稳定直至1周后(图1A、B)。Prox1诱导还可引发其他淋巴基因的表达(即Pdpn和Itg9a)，所述淋巴基因已知被强制的Prox1表达上调(36)。暴露于VEGF-A的部分(21±6％)MAPC还表达LYVE1(在mMAPC的蛋白水平上表示；图1C)。值得注意的是，hMAPC中淋巴标记物基因表达的诱导在淋巴管发生的GF VEGF-C的存在下并未进一步提高(图1D中LYVE1所示；暴露于VEGF-A、VEGF-C或组合后，相对于d0的Prox1倍数-诱导相当：分别为26±10、26±14和26±11；n＝4)。COUP-TFII(共同决定ECs(36,37)的淋巴能力的转录因子)在整个分化过程中以高的相对恒定水平表达(未示出)。因此，MAPC具有固有的启动LEC分化程序的能力。
本发明人推断，MAPC可能通过与LEC相互通讯而对淋巴管发生产生影响，因为已知MAPC分泌对LEC产生MSC营养作用的VEGF-A。72小时的MAPC上清液显著刺激了LEC发芽、增殖和迁移(图1E-M)。因此，MAPC可通过直接作用和间接作用的结合来支持淋巴管形成。
MAPC在伤口愈合期间促使生理性淋巴管生成
伤口愈合需要新血管和淋巴管的生长(Maruyama,K.,et al.2007.Am J Pathol(2007)170:1178-1191)。与PBS注射相比，在C57B1/6小鼠中线性背部皮肤切开之后立刻移植来自广泛表达增强的(e)GFP的小鼠的mMAPC导致伤口闭合的显著加速(图2A和图7A)和出现更小的伤疤(图7B-E)。尽管全部注射mMAPC的伤口均实现完全上皮再生，第10天时60％的PBS处理的伤口仅部分覆盖了新表皮。体内荧光成像表明，注射后4天，eGFP+mMAPC位于非常接近朝向创面生长的血管的位置(图2B)。因此，mMAPC移植将伤口中心CD31+管的重新生长提高两倍(CD31+管的数量/面积(mm2)：
mMAPC处理的小鼠中为76±4，而注射PBS的小鼠中为36±16；n＝5，通过Mann-Whitney-U检验，P<0.05；图2C、D)。与较早的肢缺血研究一致(Aranguren,X.L.,et al.JClin Invest(2008)118:505-514)，在该伤口愈合模型中对CD31+EC的直接贡献适度，mMAPC还显著增加了LYVE1+淋巴毛细管生长(3倍)并且偶尔促使产生分化的LEC(图2E-H)。大多数LYVE1+细胞是淋巴内皮细胞(LEC)而非巨噬细胞中间物(之前表明其在移植肾中促使产生淋巴管(Kerjaschki,D.,et al.Nat Med(2006)12:230-234))，因为它们并没有与泛白细胞(panleukocytic)标志物CD45共定位(图7F)。
在无胸腺裸鼠中施用到圆形伤口上的hMAPC显著促使愈合。hMAPC移植后通过伤口区的横切片的活体成像表明它们在创面中的均匀分布(图7G、H)。hMAPC加速了上皮覆盖(第5天的％覆盖率：hMAPC处理的伤口中为46±5，而载体处理的伤口中为7±2；n＝6，通过Mann-Whitney-U检验P<0.05；图2I、J)。在hMAPC处理的小鼠中，所有伤口在第10天均实现完全上皮再生，而仅46％的PBS处理的小鼠伤口在第10天实现完全上皮再生。hMAPC移植将伤口血管化提高了约2倍(第5天伤口边界中和第10天整个伤口中的％CD31+面积：hMAPC处理的伤口中为11±1和13±1，而在注射PBS的伤口中为6±1和6±1；n＝6-8，通过学生t检验P<0.05；图2K、L)。hMAPC显著提高了淋巴管发生，如3倍增加的LYVE1+分数面积所证明的(图2M-O)。Prox1和平滑肌α-肌动蛋白(αSMA)的双重免疫荧光(IF)染色表明，在这个短期伤口模型中，在第10天肉芽组织中的绝大多数(97±2％)淋巴管是没有αSMA覆盖的毛细管。再次地，hMAPC的原位LEC分化仅偶尔发生，如hMAPC来源的波形蛋白信号和LYVE1染色的共定位所示(图2P)。因此，MAPC部分通过提高毛细淋巴管发生(主要间接通过对宿主LEC的营养作用)而显著加速伤口愈合。
MAPC在继发性淋巴水肿模型中再生淋巴管
为了测试在继发性淋巴水肿中MAPC恢复淋巴流的潜能，通过在腹部的全层皮肤切开来中断向腋窝淋巴结(LN)的淋巴引流(图3A)(Saaristo,A.,et al.FASEB J(2004)18:1707-1709)。这破坏了大多数(7/10)PBS处理的动物的正常淋巴引流，如皮肤切开后2周穿过伤口边界的荧光染料的缺乏所示(图3B；表1)。伤口边界周围的MAPC移植几乎完全(对于mMAPC或hMAPC处理的小鼠，分别为5/6和6/6例)恢复了穿过该边界的淋巴引流(图3C、D；表1)。尽管仅在1/10的注射PBS的小鼠中获得了向腋窝LN的引流，3/6的注射mMAPC的小鼠和6/6的注射hMAPC的小鼠在2周后表现出LN引流。在第二组注射PBS或mMAPC的小鼠中，5/5的mMAPC处理的小鼠中荧光染料穿过伤口边界，4/5的mMAPC处理的小鼠中恢复了LN引流，而在皮肤切开后4周，在任何注射PBS的小鼠中穿过伤口边界和进入腋窝LN的引流都没有恢复(表1)。移植点周围的皮肤伤口区的组织学分析表明，除CD31+血管1.8倍扩张以外(图8A-D)，注射MAPC的小鼠在皮肤切开后2周在伤口边界中的Flt4+(VEGFR3+)和LYVE1+分数面积具有约2-3倍增加(分别为图4A-D+8E-H)。2周时切口周围每个横切面的功能性淋巴管(填充了荧光标记的葡聚糖)的平均数目随着MAPC注射而显著增加(图4E-H)。值得注意的是，一些mMAPC持续存在直至2-4周，驻留在引流淋巴管附近并且偶尔成为它们的内皮内衬的一部分(图4I-L)。与伤口愈合模型相比，深的(稀疏地)αSMA包被的Prox1+(前)收集管在此处更频繁地被观察到(图8I)，但是大多数(67±5％)皮肤淋巴系统仍没有αSMA包被。然而，hMAPC移植使引流(前)收集管的数目显著增加了3倍(表1)。因此，MAPC通过连接伤口边界中预先存在的淋巴网的空隙来恢复继发性淋巴水肿中的淋巴功能性缺陷。
MAPC将移植的淋巴结重新连接至宿主淋巴网
因此，所述结果表明MAPC移植主要通过提高淋巴毛细管生长来增加淋巴管发生并恢复淋巴引流。然而，继发性淋巴水肿的潜在问题最通常涉及损伤的LN和淋巴毛细管通常连接的淋巴收集管。因此，恰当的治疗法必须不仅意味着毛细管扩张，还要恢复淋巴收集管。应用严格的模型，其中腋窝LN和它们周围的淋巴(收集管)网通过手术摘除，使得移植到该区域中的LN的引流严格地取决于淋巴收集管的恢复和它们与远端淋巴网的重新连接(Tammela,T.,et al.Nat Med(2007)13:1458-1466)。为了测试hMAPC的潜能，将它们于中施用到右腋窝中移植的LN周围，所述LN来自广泛表达dsRed或eGFP的小鼠(图5A)。单独的LN移植(以及用包含PBS的覆盖它)无法消退右上肢中炎症诱发的水肿，证据来自术后4周和16周用芥子油(一种炎症试剂)激发爪之后通过磁共振成像(MRI)测量的细胞间质液的累积(图5B、C+9A)。16周时，在移植的LN周围施用hMAPC之后流体累积的明显度显著降低，表明从前爪到腋窝区的淋巴引流的功能性恢复(图5B、D+9B)。实际上，淋巴管造影术表明，在hMAPC处理的小鼠中淋巴液引流显著增加，并且分别在移植后8周和16周在约35％和50-60％hMAPC处理的小鼠中注射的荧光染料到达移植的LN，该结果通过使用两种hMAPC克隆得到重复，使用PBS处理的小鼠则完全无法得到该结果(图5E-G+9C；表2)。这表明hMAPC移植能够在功能上将移植的LN重新连接到远端淋巴网。值得注意的是，尽管与hMAPC一起移植的全部LN均持续存在，其中一半在16周时在注射PBS的小鼠中无法找到，表明hMAPC移植对LN存活的积极作用(表2)。此外，与hMAPC处理的小鼠不同的是，PBS处理的小鼠中移植的LN的平均尺寸减小(表2)。通向移植LN的皮肤面积检查表明，与注射PBS的小鼠相比，hMAPC处理的小鼠中复杂血管网多2倍(图6A-C)，在紧邻LN的周围具有明显更多的血管(图6D+9D、E)。一些hMAPC持续存在至16周，并且存在于移植LN的附近(图9F)。在hMAPC处理的小鼠中所有移植LN均从第4周开始表现出它们的内部(淋巴)管网(向外)分支的迹象，而在PBS处理的小鼠中从未观察到这种现象(图6E-G+9G、H；表2)。第8周时，与PBS处理相比，hMAPC移植导致在围绕LN的区域中LYVE1+淋巴管明显扩张4倍(图6H-J)。最终，为了检验hMAPC的有益作用是否涉及淋巴收集管的重新连接，对取自移植LN周围区域的横切片进行αSMA/Prox1IF染色，并发现淋巴填充的Prox1+αSMA+收集管(图6K-M)。通过LYVE1的负染色来确定收集管种类(identity)(图6N)。总体上，hMAPC通过促使LN存活和向外分支以及通过将移植LN经由收集管重新连接到内源性管网而在LN移植之后恢复淋巴引流。
方法
MAPC衍生和分化
mMAPC克隆源自具有广泛eGFP表达的成年C57Bl/6小鼠(C57Bl/6-Tg-eGFP)的BM。将mMAPC在低O2(5％)和低血清(2％)条件下衍生和维持，如文献中所述(Aranguren,X.L.,et al.2008.J Clin Invest(2008)118:505-514)。根据之前记载的衍生和培养方法，建立hMAPC克隆(Roobrouck,V.D.,et al.Stem Cells(2011)29:871-882)。常规检验细胞培养物的支原体污染。通过暴露于重组的(r)hVEGF-A165或rhVEGF-C(R&D Systems)来进行内皮分化，如文献中所述(Roobrouck,V.D.,et al.Stem Cells(2011)29:871-882)。上述记载了MAPC衍生的文献因这些方法而以引用的方式纳入。
按照鲁汶大学医院的医学伦理委员会的指导获得知情同意之后，从经历整形手术的儿童(5-15岁)的骨碎片(股骨)分离人MAPC并且从骨骼肌碎片(股四头肌)分离hMab。通过以下方法产生hMAPC：冲洗骨碎片，并在培养基中以0.5×106细胞/平方厘米将总细胞级分铺板，所述培养基由60％达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)低葡萄糖(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA,www.invitrogen.com)、40％MCDB-201(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,www.sigmaaldrich.com)组成，其补充了50nM地塞米松(dexamethasone)、10-4M L-抗坏血酸、1x硒-胰岛素-转铁蛋白(ITS)、0.5x亚油酸-牛血清白蛋白(全部来自Sigma-Aldrich)、1％青霉素/链霉素(Gibco,Invitrogen)，以及2％优质血清(SerumSupreme)(LonzaBioWhittaker,Basel,Switzerland www.Lonza.com)、人血小板衍生的生长因子BB(PDGF-BB)(R&D Systems,Minneapolis,MN,www.mdsystems.com)和人EGF(Sigma-Aldrich)(都是10ng/ml)。将人MAPC培养物以400个细胞/平方厘米的密度维持在5.5％CO2加湿培养箱中的低氧条件(5％O2)下，并且每2-3天传代。通过在2代和12代之间在96孔板或48孔板中每孔铺板5个细胞而获得克隆群。
还可进行细胞分离和培养，如之前Reyes,M.,et al.J Clin Invest(2002)109:337-346中所述。从健康捐赠者获得骨髓。利用微磁珠将通过Ficoll-Paque密度梯度离心获得的骨髓单核细胞中的CD45+和血型糖蛋白A+细胞消耗掉。对于CD45和glyA而言，洗脱的细胞是99.5％阴性的。将细胞以5×103细胞/200μl的浓度铺板到96孔板中。在与上述相同的培养基中进行这一步骤。当细胞约50％汇合时，将其用胰蛋白酶处理并以2×103-8×103细胞/cm2的浓度传代到更大的板中，并进一步扩增。还可进行细胞分离和培养，如之前Reyeset al.Blood 98:2615-2625中所述。所述方法基本上与所记载的相同，除了在收集glyA-和CD45-细胞之后将细胞以5-10×103/ml的浓度铺板到96孔板中。在全部这些情况下，培养基是相同的。这些文献因报道细胞的分离和培养方法而以引用的方式纳入。
鼠细胞源自具有广泛GFP表达的C57BL/6小鼠的BM。将mMAPC在低O2(5％)和低血清(2％)条件下衍生和维持(Ulloa-Montoya,F.,et al.Genome Biol.(2007)8:R163.)。还可根据Breyer et al.Experimental Hematology 34:1596-1601(2006)来衍生mMAPC。这些文献因提供衍生细胞的方法而以引用的方式纳入。
RNA分离、cDNA制备、qRT-PCR和流式细胞术
使用试剂(Invitrogen)或RLT裂解缓冲液(Qiagen)提取来自细胞裂解物的总RNA。如所述(Aranguren,X.L.et al.,J CellSci(2013)126:1165-1175)，对于基于SYBR-Green的qRT-PCR，使用Superscript III逆转录酶(Invitrogen)来逆转录mRNA，并使cDNA在ABI PRISM 7700循环仪(PerkinElmer/Applied Biosystems上进行40轮扩增。使用GAPDH作为管家基因标准化mRNA水平。为了分析分化的mMAPC表面上的LYVE1表达，通过温和胰蛋白酶消化收集细胞，并如扩充方法(extended method)中所述通过FACS进行分析。
体外LEC功能测定法
细胞培养和CM收集。人肺LEC购自Lonza(Merelbeke，比利时)并在补充有EGM-2-MVbulletkit(Lonza)的EBM2中培养。对于CM收集，将MAPC以高密度接种在无血清基础培养基中，72h后收集CM，并在-80℃下等分冷冻直至进一步使用。
LEC增殖。将LEC在常规LEC生长培养基中以2,000个细胞/cm2接种到明胶包被的96孔板上。在它们贴壁后，将培养基替换为无血清LEC培养基和MAPC-CM的1:1混合物或100％无血清LEC培养基作为参照条件。24h后，用WST-1细胞增殖分析试剂盒(Cayman Chemical)评估细胞增殖。
LEC迁移。将Transwell插入皿(含有孔径为8μm的聚碳酸酯滤器；Costar，Corning)用明胶包被过夜。用非条件培养基(NCM)或MAPC-CM填充24孔板的底部隔室。再水化后，将插入皿置于24孔板中，每个都装载含有5×104LEC的EGM-2-MV/0.5％FBS。在37℃/5％CO2下孵育24h后，将细胞在甲醇中固定并用Wright-Giemsa’s染色溶液(Sigma WG32)染色。提起插入皿并除去膜上侧的细胞。拍摄插入皿的图片并手动计数转移的细胞。
LEC发芽。通过将25μl液滴(含有在20％甲基纤维素/EGM-2-MV混合物中的1,000个LEC)施加到非贴壁板上并将它们在37℃/5％CO2下倒置孵育来形成LEC球状体。第二天，在PBS/2％FBS中小心洗涤球状体，通过温和的离心进行收集，重悬于甲基纤维素/FBS/胶原(Purecol Advanced Biomatrix)中并接种到24孔板中。在37℃/5％CO2下孵育30min后，在胶原/球状体凝胶的顶部加入mMAPC-CM(与无血清LEC培养基1:1混合)或100％无血清LEC培养基作为参照条件。24h后拍摄照片，通过手动计数确定每个球状体的芽数。
小鼠模型
由于MAPC不表达MHC-I，因此MAPC对NK细胞介导的清除敏感，所有小鼠在移植前l-2h均腹膜内注射抗无唾液酸GM1的抗体(Wako Chemicals，大阪，日本)，然后每隔10天注射。这些抗体选择性地消除NK细胞而不影响巨噬细胞或淋巴细胞功能(Seaman,W.E.et al.JImmunol(1987)138:4539-4544)。
线性伤口模型：在第0天，在麻醉的12周龄C57B1/6雄性小鼠的背部施加12mm线性皮肤切口。在创伤后，立即将1×106mMAPC(重悬于PBS中)或单独的PBS注射到小鼠皮肤伤口下的肌肉筋膜中，分成三个等距注射点。为避免伤口感染，将小鼠单独圈养在没有被褥(bedding)的笼子中。使用数字卡尺(VWRI819-0012，VWR)在麻醉下每天测量伤口尺寸。在第4天，拍摄伤口区域的明场图像和荧光图像，并且在第10天，对小鼠实施安乐死，将残留的皮肤伤口和下面的肌肉组织解剖出来，固定并准备用于包埋。
圆形伤口模型：在第0天，将12周龄无胸腺裸Foxn1雄性小鼠(Harlan)麻醉并在无菌和温度控制(37℃)条件下，用0.5cm活检穿孔器(Stiefel Laboratories,Offenbach amMain,德国)在小鼠的背部制造标准化的全层伤口。在伤口周围缝合硅胶环，并用PBS或5×105hMAPC处理伤口。在小鼠的子组中，在移植前用编码eGFP的慢病毒转导hMAPC。使用闭塞性敷料(TegadermTM，3M，Diegem，比利时)使伤口保持湿润并且每隔一天更换一次。在创伤后第5天或第10天，对小鼠实施安乐死，解剖出皮肤伤口，冲洗并后固定。固定后，在伤口的中线处分开皮肤碎片(相等的两片)并进行包埋。
皮瓣模型：如所述(Saaristo,A.et al.FASEB J(2004)18:1707-1709)，在第0天，将12周龄的无胸腺裸Foxn1雄性小鼠(Harlan)麻醉，通过提升上腹部皮瓣并将其缝合回其原始位置来切断腹部皮肤中的淋巴网。通过保留血管蒂(vascular pedicle)来确保对皮瓣的连续血液供应(图3A)。在重新缝合皮瓣后一天，在伤口边缘周围注射1×106mMAPC、1×106hMAPC或PBS(分成4个注射点；图3A)。2周或4周后，暴露腋窝区域，并且在伤口边界下，在皮内注射FITC-葡聚糖(MW 2,000kDa，Sigma-Aldrich；hMAPC)或罗丹明-B-异硫氰酸酯-葡聚糖(MW 70kDa，Sigma-Aldrich；mMAPC)后通过微淋巴管造影监测腋窝LN引流(图3A)。在15min时拍摄明场图像和荧光图像，随后对小鼠实施安乐死，将细胞植入/微淋巴管造影区域周围的皮肤伤口区域切除、固定并进行包埋。
LN移植模型：在第0天，将12周龄无胸腺裸Foxn1雌性小鼠(Harlan)麻醉并使LN可见，暴露右腋窝区域并在右爪的掌中注射3％伊文思蓝溶液，然后除去LN(以及周围的淋巴(收集管)管)。准备好正好在腋窝血管尾部的袋(pocket)。从广泛表达DsRed的小鼠(B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J；针对接受hMAPC或PBS的小鼠并随后进行4周或8周)或增强的(e)GFP的小鼠(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J；针对接受hMAPC或PBS的小鼠并随后进行4周或16周)解剖供体LN，并通过淋巴结门(hilus)切成两半。随后将切割的LN植入受体袋中并用永久性缝合线(MonosofTM)固定在适当位置。将与0.5×106hMAPC或PBS混合的冷的GF-reduced(Beckton Dickinson)施加到袋中并使其固化。随后闭合皮肤并用TegadermTM敷料覆盖伤口。四周、八周或十六周后，将小鼠麻醉并在右爪的掌中注射FITC缀合的番茄(L.esculentum)凝集素(Vector Laboratories；在DsRed+LN受体中)或德克萨斯红缀合的番茄凝集素(在eGFP+LN受体中)后进行微淋巴管造影术。监测植入的LN的引流15min，最后拍摄明场图像和荧光图像。随后对小鼠实施安乐死，将含有移植的LN的腋窝区域切除、固定并进行包埋。如扩充方法中所述，通过注射芥子油(引起血管通透性过高并加重水肿)进行炎性刺激后，对另外两组小鼠进行体内MRI。
组织学和形态测定法
通过盲法观察者对7μm石蜡切片、10μm冷冻切片或暴露的皮肤区域的明场图像进行形态测定分析。每只小鼠在至少10个随机选择的视野上(覆盖700μm的距离)对淋巴(在LYVE1-、Flt4-或Prox1/aSMA-染色的切片上测定)或血液(在CD31-染色的切片上测定)管密度和上皮覆盖(在广谱细胞角蛋白(pancytokeratin)染色切片上测定)进行评分。每只小鼠在8-10个连续的切片上计数功能性淋巴管(在注射了荧光标记的葡聚糖的小鼠的冷冻切片上测定)，从而扫描每个切片上可见的整个伤口区域。在整个目的区域的数字重建图像上确定通向移植的LN的血管网络的分数面积。对于石蜡切片上的染色，将载玻片脱蜡并再水合，在染色程序之前将冷冻切片在PBS中孵育5min。如前所述进行H&E染色(Aranguren,X.L.etal.J Clin Invest(2008)118:505-514)。CD31、Flt4、广谱细胞角蛋白，LYVE1(与或不与CD45或波形蛋白结合)、Proxl/aSMA、波形蛋白和(Prox1/)eGFP的IF和IHC染色程序记载于补充部分中，并且表4中提供了第一抗体的列表。所有图像均在Zeiss Axiovert 200M显微镜、Zeiss Axio成像仪Z1或配备Zeiss MRc5照相机和Axio vision 4.8软件的ZeissLSM510共焦显微镜上记录。
统计学
结果文本和图/表图例中的n表示重复的数目(即，在给定的MAPC克隆的不同传代上进行的每一次；在体外)或单独的动物的数目(在体内)。通过Shapiro-Wilk检验测试数据正态性。两组之间的比较在正态分布情况下通过学生t检验进行，或者在数据未正态分布或无法假定正态性的情况下通过Mann-Whitney-U检验进行。多组比较通过单向ANOVA与Tuckey's事后检验(正态分布)或Kruskal-Wallis检验与Dunn's事后检验(无正态性假定)进行。通过重复测量ANOVA评估伤口尺寸，然后进行Fisher最小显著性差异检验。所有分析均使用Graphpad Prism(6.0版)进行。
扩充方法
MAPC衍生和分化
鼠(m)MAPC克隆衍生自具有广泛的eGFP表达的成年C57B1/6小鼠的BM(C57B1/6-Tg-eGFP)。如前所述(Aranguren,X.L.et al.JClin Invest(2008)118:505-514)，衍生mMAPC并保持在低O2(5％)和低血清(2％)条件下。根据前面描述的衍生和培养方法(Roobrouck,V.D.et al.Stem Cells(2011)29:871-882)，在KU Leuven(Endothelial CellBiology Unit的克隆1或hMAPC1；在干细胞研究所Leuven(Stem Cell Institute Leuven)的克隆2或hMAPC2)上建立人(h)MAPC克隆。常规检测细胞培养物的支原体污染。如所述(Roobrouck,V.D.et al.Stem Cells(2011)29:871-882)，通过将细胞暴露于重组(r)hVEGF-A165或rhVEGF-C(均来自R&DSystems)进行内皮分化。
RNA分离、cDNA制备、qRT-PCR和流式细胞术
使用试剂(Invitrogen)或RLT裂解缓冲液(Qiagen)提取来自细胞裂解物的总RNA。如所述(Aranguren,X.L.et al.,J Cell Sci(2013)126:1164-1175.)，对于基于SYBR-Green的qRT-PCR，使用Superscript III逆转录酶(Invitrogen)来逆转录mRNA，并使cDNA在ABI PRISM 7700循环仪(PerkinElmer/Applied Biosystems)上进行40轮扩增。使用GAPDH作为管家基因标准化mRNA水平。为了分析分化的mMAPC表面上的LYVE1表达，通过温和胰蛋白酶消化收集细胞，用FACS染色缓冲液(PBS+1mmol/L EDTA+25mmol/L HEPES+1％BSA)洗涤并与第一抗体(Upstate)或相应的兔IgG同种型在室温下避光孵育20min。用FACS缓冲液洗涤后，将细胞与生物素化的山羊抗兔第二抗体在室温下避光孵育20min。接下来，洗涤样品并避光与别藻蓝蛋白(APC)标记的抗生物素蛋白链菌素一起孵育20min。为了选择活细胞，在FACS Aria I(Beckton Dickinson)上运行样品之前10min加入7-AAD用于分析。
体外LEC功能测定法
细胞培养和条件培养基收集。人肺LEC购自Lonza(Merelbeke，比利时)并在补充有EGM-2-MV bulletkit(Lonza)的EBM2中培养。对于CM收集，将MAPC以高密度接种在无血清基础培养基中，72h后收集CM，并在-80℃等分冷冻直至进一步使用。
LEC增殖。为了测试MAPC-CM对LEC增殖的影响，将LEC在常规LEC生长培养基中以2,000个细胞/cm2的密度接种到明胶包被的96孔板上。在它们贴壁后，将培养基替换为无血清LEC培养基和MAPC-CM的1:1混合物或100％无血清LEC培养基作为参照条件。24h后，用WST-1细胞增殖分析试剂盒评估细胞增殖。简言之，向每个孔中加入10μl WST-1混合物，将细胞在37℃下孵育2h，并在Bio-Tek酶标仪(BRS，比利时)上在450nm波长下测量每个孔的吸光度。
LEC迁移。为了评价MAPC-CM对LEC迁移的影响，进行Boyden室测定。简言之，将Transwell插入皿(含有孔径为8μm的聚碳酸酯滤器；Costar，Corning)用0.2％明胶包被过夜。用0.3mlNCM或用0.3ml mMAPC或hMAPC-CM填充24孔板的底部隔室。用去离子水再水合1h后，将插入皿置于24孔板中，每个都装载0.3ml含有5×104LEC的EGM-2-MV/0.5％FBS。在37℃/5％CO2下孵育24h后，将细胞在-20℃下在甲醇中固定30min。接下来，用Wright-Giemsa’s染色溶液(Sigma WG32)对细胞染色7min，并用去离子水漂洗10min。提起插入皿并通过使用棉签轻轻摩擦除去膜上侧的细胞。使用安装在Axiovert200M显微镜上并装备有Axiovision 4.8软件的Zeiss MRc5照相机拍摄插入皿的图片并且以20倍放大倍数在每个插入皿的3个随机视野中手动计数转移的细胞。
LEC发芽。为了测试mMAPC-CM对LEC发芽的影响，通过将25μl液滴(含有在20％甲基纤维素/EGM-2-MV混合物中1,000个LEC)施加到非贴壁板上并将它们在37℃/5％CO2下倒置孵育来形成LEC球状体。第二天，在PBS/2％FBS中小心洗涤球状体，通过温和的离心进行收集，小心地重悬于甲基纤维素/FBS/胶原(PurecolAdvanced Biomatrix)中并接种到24孔板中(0.5ml/孔)。在37℃/5％CO2下孵育30min后，在胶原/球状体凝胶的顶部加入0.5mlmMAPC-CM(与无血清LEC培养基1:1混合)或100％无血清LEC培养基作为参照条件。24h后用安装在Zeiss Axiovert200M显微镜上的Zeiss MRm照相机拍摄照片，通过手动计数确定每个球状体的芽数。
小鼠模型
由于MAPC不表达MHC-I，因此MAPC对NK细胞介导的清除敏感，所有小鼠在移植前1-2h均腹膜内注射20μl抗无唾液酸GM1的抗体(Wako Chemicals，大阪，日本；在PBS中稀释20倍)，然后每隔10天注射。这些抗体选择性地消除NK细胞而不影响巨噬细胞或淋巴细胞功能(Seaman,W.E.et al.J Immunol(1987)138:4539-4544.)。
线性伤口模型：在第0天，在用100mg/kg氯胺酮和10mg/kg赛拉嗪的混合物麻醉后，用手术刀在12周龄C57B1/6雄性小鼠的背部施加12mm线性皮肤切口。在创伤后，立即将1×106mMAPC(重悬于PBS中)或单独的PBS注射到小鼠皮肤伤口下的肌肉筋膜中，分成三个等距注射点。为避免伤口感染，将小鼠单独圈养在没有被褥的笼子中。使用数字卡尺(VWRI819-0012，VWR)在异氟醚麻醉下每天测量伤口尺寸。在第4天，用安装在Zeiss Lumar显微镜上的Zeiss MRc5照相机拍摄伤口区域的明场图像和荧光图像。在第10天，对小鼠实施安乐死，将残留的皮肤伤口和下面的肌肉组织解剖出来，固定在锌-多聚甲醛中并准备用于包埋在石蜡中或最佳切割温度(OCT)并制成切片。
圆形伤口模型：在第0天，用腹膜内注射氯胺酮/赛拉嗪将12周龄无胸腺裸Foxn1雄性小鼠(Harlan)麻醉。腹膜内施用阿托品(0.01mg/kg)作为麻醉前用药。在无菌和温度控制(37℃)条件下，用0.5cm活检穿孔器(Stiefel Laboratories,Offenbach am Main,德国)在小鼠背部的背部中央区域中制造标准化的全层伤口。在伤口周围固定(使用氰丙烯酸丁酯组织粘合剂，Braun，Diegem，比利时)并缝合硅胶环，并用盐水或5×105hMAPC处理伤口。在小鼠单独的子组中，在移植前用编码eGFP的慢病毒转导hMAPC。使用闭塞性敷料(TegadermTM，3M，Diegem，比利时)使伤口保持湿润。将所有受伤的小鼠单独圈养以避免搏斗并防止除去闭塞性伤口敷料。每隔一天，在异氟烷麻醉下更换闭塞性敷料。在创伤后第5天或第10天，对小鼠实施安乐死并解剖出包括圆形伤口区域和正常皮肤边缘的正方形皮肤碎片，在PBS中漂洗并在4℃下使用锌-多聚甲醛后固定过夜。固定后，将皮肤碎片在伤口的中线处分成相等的两片，进行石蜡或OCT包埋并制成切片。
皮瓣模型：在第0天，用腹膜内注射氯胺酮/赛拉嗪将12周龄的无胸腺裸Foxn1雄性小鼠(Harlan)麻醉。如前所述(Saaristo,A.etal.FASEB J(2004)18:1707-1709.)，通过提升上腹部皮瓣并将其缝合回其原始位置来切断腹部皮肤中的淋巴网。通过保留包括右腹壁下动脉和静脉的血管蒂来确保对皮瓣的连续血液供应(图3A)。在重新缝合皮瓣后一天，在伤口边缘周围注射1×106mMAPC、1×106hMAPC或PBS(分成4个注射点；图3A)。2周或4周后，暴露腋窝区域，并且在伤口边界下，在皮内注射10μl FITC-葡聚糖(MW2,000kDa，Sigma-Aldrich；hMAPC)或10μl罗丹明-B-异硫氰酸酯-葡聚糖(MW 70kDa，Sigma-Aldrich；mMAPC)后通过微淋巴管造影监测腋窝LN引流15min(图3A)。在15min时用安装在Zeiss Lumar显微镜上的Zeiss MRc5照相机拍摄明场图像和荧光图像。随后对小鼠实施安乐死，将细胞植入/微淋巴管造影区域周围的皮肤伤口区域切除、固定，进行石蜡或OCT包埋并制成切片。
淋巴结移植模型：在第0天，用腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)将12周龄无胸腺裸Foxn1雌性受体小鼠(Harlan)麻醉。为了使淋巴结可见，暴露右腋窝区域并在右爪的掌中注射3％伊文思蓝溶液，然后除去淋巴结以及周围的淋巴(收集管)管。准备好正好在腋窝血管尾部，沿腋侧脂垫、胸大肌和背阔肌对齐的口袋。从广泛表达DsRed的小鼠(B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J；针对接受hMAPC或PBS的小鼠并随后进行4周或8周)或增强的(e)GFP的小鼠(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J；针对接受hMAPC或PBS的小鼠并随后进行4周或16周)解剖供体淋巴结，并通过淋巴结门切成两半。随后将切割的淋巴结植入受体袋(淋巴结门在中间定向，切面朝上)中并用两条永久性缝合线(使用9-0尼龙不可吸收缝合线，MonosofTM)固定在适当位置。将与0.5×106hMAPC或PBS混合的冷的生长因子浓缩的(100μl；Beckton Dickinson)施加到袋中并使其固化10min。随后闭合皮肤并用TegadermTM敷料覆盖伤口。四周、八周或十六周后，将小鼠用氯胺酮/赛拉嗪混合物麻醉并在右爪的掌中注射10μl FITC缀合的番茄凝集素(Vector Laboratories；在DsRed+受体淋巴结的受体中)或10μl德克萨斯红缀合的番茄凝集素(在eGFP+淋巴结的受体中)后进行微淋巴管造影术。监测植入的淋巴结的引流15min，最后用安装在Zeiss Lumar显微镜上的Zeiss MRc5照相机拍摄明场图像和荧光图像。随后对小鼠实施安乐死，将含有移植的淋巴结的腋窝区域切除、固定，进行石蜡或OCT包埋并制成切片。在淋巴结移植后4周或16周，使另外两组小鼠进行体内磁共振成像(MRI；如所述(Tammela,T.et al.Nat Med(2007)13:1458-1466))。简言之，将小鼠用异氟醚麻醉并将芥子油(在矿物油中1/5稀释)用棉签在两个前肢上施加2×15min以引起血管通透性过高并加重水肿。使小鼠在MRI记录前再恢复30min。在整个实验过程中监测温度和呼吸，并保持在37℃下以及每分钟100-120次呼吸。用装备有水平孔磁铁和每米600mT的有源屏蔽梯度组(内径117毫米)的9.4T Biospec小动物MR扫描仪(Bruker Biospin，Ettlingen，德国)获得MR图像，使用7cm线性极化谐振器用于传输和主动去耦专用2cm直径表面线圈用于接收(Rapid Biomedical，Rimpar，德国)。获得2D定位扫描后，获取3D T2加权图像、2D T2参数图和2D扩散加权图像以确定水肿水平。具体参数为：采用重聚焦回波(RARE)序列的3D快速采集，重复时间(TR)：1300ms，有效回波时间(TE)：22.9ms，稀有因子：6，矩阵尺寸：256×48×48，视场(FOV)：2.5×0.7×1.5cm，分辨率：98×146×312μm3；2D T2图：TR：3500ms，10TE之间：10-100ms，矩阵尺寸：256×256，FOV：2×2cm，15个横向切片，切片厚度：0.3mm且间隙0.3mm，面内(in plane)分辨率：78μm2；扩散加权MRI：自旋回波序列；b值为1500s mm2，TR：25ms，TE：3,000ms，基质尺寸：128×128，FOV：2×2cm，8个1mm厚的横向切片。通过使用由Mevislab(Mevis Medical Solutions，Bremen，德国)开发的自编软件确定具有高于共同阈值的信号强度的体积(volume)来处理3D T2加权图像，报告为淋巴结植入部位与对照位点之间的比率。使用Paravison 5.1(BrukerBiospin)计算手动描绘的爪的水肿(或相同尺寸并且在没有水肿的情况下位于相同区域中的区域)的T2参数图。
组织学和形态测定法
通过盲法观察者对7μm石蜡切片、10μm冷冻切片或暴露的皮肤区域的明场图像进行形态测定分析。每只小鼠在至少10个随机选择的视野上(覆盖700μm的距离)对淋巴(在LYVE1-、Flt4-或Prox1/aSMA-染色的切片上测定)或血液(在CD31-染色的切片上测定)管密度和上皮覆盖(在广谱细胞角蛋白染色切片上测定)进行评分。每只小鼠在8-10个连续的切片上计数功能性淋巴管(在注射了荧光标记的葡聚糖的小鼠的冷冻切片上测定)，从而扫描每个切片上可见的整个伤口区域。在整个目的区域的数字重建图像上确定通向移植的淋巴结的血管网络的分数面积。对于石蜡切片上的染色，将载玻片脱蜡并再水合，在染色程序之前将冷冻切片在PBS中孵育5min。H&E染色如前所述(1)进行。对于CD31、Flt4或广谱细胞角蛋白免疫组织化学染色，通过在靶标修复溶液s1699(Sigma)中煮沸来进行抗原修复。在TBS中冷却后，在0.3％H2O2的甲醇溶液中终止内源性过氧化物酶活性。将载玻片与第一抗体孵育过夜。表4中提供了第一抗体的列表。在TBS中洗涤后，将载玻片与生物素化的兔抗大鼠(CD31和Flt4)或山羊抗小鼠(广谱细胞角蛋白)抗体孵育2h，并用酪酰胺信号放大系统(Perkin Elmer，NEL700A)放大检测信号。通过苏木精复染显示细胞核，并用DPX封固剂(Sigma)封固载玻片。对于LYVE1免疫荧光(IF)染色，通过在靶标修复溶液s1699(Sigma)中煮沸来进行抗原修复。在TBS中冷却后，在0.3％H2O2的甲醇溶液中终止内源性过氧化物酶活性。将载玻片与第一抗体一起孵育过夜。在TBS中洗涤后，将载玻片与生物素化的山羊抗兔抗体孵育2h，并用酪酰胺-Cy3或酪酰胺-荧光素信号放大系统(Perkin Elmer、NEL704A或NEL701A)放大检测信号。当与CD45IF染色结合时，随后将载玻片与第一抗CD45抗体一起孵育过夜，然后与山羊抗大鼠-Alexa488孵育2h。对于GFP或波形蛋白IF染色，通过在柠檬酸盐缓冲液(pH＝6)中煮沸来进行抗原修复。与第一抗体孵育过夜后，将载玻片与Alexa缀合的驴抗鸡(GFP)或山羊抗小鼠(波形蛋白)抗体孵育1h。对于结合的LYVE1/波形蛋白IF染色，通过在柠檬酸盐缓冲液(pH＝6)中煮沸进行抗原修复，并通过在Triton 0.1％的PBS溶液中孵育使组织透化。与第一抗体一起孵育过夜后，将载玻片与山羊抗小鼠Alexa488和山羊抗兔Alexa568一起孵育1h。对于结合的Prox1/αSMA IF染色，通过在柠檬酸盐缓冲液(pH＝6)中煮沸进行抗原修复，并通过在Triton 0.1％的PBS溶液中孵育使组织透化。与Prox1第一抗体一起孵育过夜后，将载玻片与生物素缀合的山羊抗兔抗体一起孵育1h，并用酪酰胺-Cy3或酪酰胺-荧光素信号放大系统(Perkin Elmer、NEL704A或NEL701A)放大检测信号。随后将载玻片用Cy3-缀合的αSMA染色2h，或者用未缀合的SMA然后用山羊抗小鼠Alexa660染色。对于结合的Prox1/eGFP IF染色，通过在柠檬酸盐缓冲液(pH＝6)中煮沸进行抗原修复，并通过在Triton 0.1％的PBS溶液中孵育使组织透化。与Prox1和eGFP第一抗体孵育过夜后，将载玻片与生物素缀合的山羊抗兔抗体和Alexa488缀合的驴抗鸡抗体孵育1h，并用酪酰胺-Cy3信号放大系统(Perkin Elmer)放大Prox1检测信号。将IF染色的载玻片用ProLong GoldAntifadeReagent密封，使用DAPI(Life Technologies；P36931)或者在细胞核通过Hoechst染色显示的情况下不使用DAPI。所有图像均在ZeissAxiovert 200M显微镜、Zeiss Axio成像仪Z1或配备Zeiss MRc5照相机和Axiovision 4.8软件的Zeiss LSM510共焦显微镜上记录。
统计学
结果文本和图/表图例中的n表示重复的数目(即，在给定的MAPC克隆的不同传代上进行的每一次；在体外)或单独的动物的数目(在体内)。通过Shapiro-Wilk检验测试数据正态性。两组之间的比较在正态分布情况下通过学生t检验进行，或者在数据未正态分布或无法假定正态性的情况下通过Mann-Whitney-U检验进行。多组比较通过单向ANOVA与Tuckey's事后检验(正态分布)或Kruskal-Wallis检验，然后是Dunn's事后检验(无正态性假定)进行。通过重复测量ANOVA评估伤口尺寸，然后进行Fisher最小显著性差异检验。所有分析均使用Graphpad Prism(6.0版)进行。
表
表1.皮瓣模型中的淋巴管造影
数据表示显示出左栏中提到的功能特征的小鼠的分数或平均值±SEM。(PBS：每个时间点n＝10；mMAPC：14天n＝6，28天n＝5；hMAPC：n＝6)。ND，未测定。通过未配对的学生t检验，相对于PBS AP<0.05。
表2.LN移植模型中的淋巴管造影
数据表示显示出左栏中提到的移植LN的功能特征的小鼠的分数或平均值±SEM。(PBS：对于4周、8周和16周，n分别为10、6和6；hMAPC1：对于4周、8周和16周，n分别为10、6和8；hMAPC2：对于4周、8周和16周，n分别为6、8和4)；ND：未测定。通过Mann-Whitney-U检验，相对于PBS条件AP<0.05。
表4.组织学抗体列表
抗原 靶物种 供应商，目录编号
CD31 小鼠 Beckton Dickinson,557355
LYVE1 小鼠+人 Upstate Biotechnology,07-538
广谱细胞角蛋白(PCK) 小鼠 Sigma,C-2562
Flt4 小鼠 eBioscience,14-5988-82
平滑肌α-肌动蛋白(SMA) 小鼠+人 Sigma C-6148或A5228
CD45 小鼠 Beckton Dickinson,553076
Prox1 小鼠+人 Angiobio,11-022
波形蛋白 人 DAKO,Clone V9
eGFP 鸡 Abcam,ab13970

Claims (19)

1.一种通过以足以促进伤口愈合的有效量和时间给予细胞(I)来促进受试者伤口愈合的方法，其中所述细胞(I)不由功能化基质递送，其中所述细胞(I)是表达oct4或端粒酶的、未被转化的、不致瘤的且具有正常核型的非胚胎非生殖细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞(I)还表达rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞(I)可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚细胞系中的至少两种的至少一种细胞类型。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞(I)可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚细胞系中的每一种的至少一种细胞类型。
5.权利要求1的方法，其中所述伤口为皮肤和皮下组织的伤口。
6.权利要求1或2的方法，其中所述伤口为溃疡。
7.权利要求6的方法，其中所述溃疡选自在足部、手部、腿部或手臂中存在的皮肤溃疡和静脉性腿部溃疡。
8.权利要求7的方法，其中所述皮肤溃疡是由选自以下的疾病引起的：糖尿病和镰状细胞性贫血。
9.权利要求1或2的方法，其中所述细胞(I)未进行遗传操作。
10.权利要求1或2的方法，其中所述细胞(I)来源于骨髓。
11.权利要求1或2的方法，其中所述细胞(I)来源于人类。
12.权利要求1或2的方法，其中所述受试者为人类。
13.权利要求6的方法，其中所述伤口是由外周血液或淋巴系统的循环不足引起的。
14.权利要求1或2的方法，其中所述细胞(I)是局部给予至伤口。
15.权利要求1或2的方法，其中所述细胞(I)是经皮下递送。
16.权利要求1或2的方法，其中所述细胞(I)是通过注射给予至伤口。
17.权利要求1或2的方法，其中所述细胞(I)是以液体细胞悬液的形式给予。
18.权利要求1或2的方法，其中所述细胞(I)是使用储液囊给予至伤口。
19.权利要求1或2的方法，其中所述细胞(I)为同种异体的(allogeneic)。
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