CN102988964A - 一种复合生长因子及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血小板来源的复合生长因子及其制备方法与应用。采用富血小板血浆为原料,首先通过S/D法病毒灭活后,去除其中的有机溶剂和去污剂等试剂,然后加入钙剂或/和凝血酶激活,提取激活后的上清液,即得到符合人体天然比例的复合生长因子,克服了临床上的单一重组生长因子制品价格昂贵、纯化困难、涉及基因重组的生物安全性等问题。本发明还公开了利用上述复合生长因子通过添加壳聚糖微球载体加工获得复合生长因子凝胶剂,使用过程中可以缓慢释放生长因子,对于急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口具有显著的促进作用,而且使用方便,安全性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合生长因子及其制备方法,同时还涉及利用该复合生长因子加工获得的凝胶剂。本发明还涉及该复合生长因子及复合生长因子凝胶剂在急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口等中的治疗作用。
背景技术
慢性难治性溃疡,其定义为在各种内在或外界因素作用下,创面不能通过正常的创面愈合进程达到愈合,进入一种病理性炎症反应状态,导致创面经久不愈。随着我国逐渐进入老龄化社会,老年人口增多,尤其是在合并糖尿病、脉管炎及下肢静脉回流障碍的老年人群更为常见。这类患者伤口愈合较慢,需要长期住院,长期换药,往往经过多次清创手术却疗效不佳,甚至要截肢手术等,严重影响患者的生活质量。慢性难愈合伤口修复缓慢甚至修复停止主要有以下四种原因:1、伤口感染或有坏死组织存在;2、伤口血供微循环差;3、局部生长因子数量减少,活性降低或多种生长因子网络调节失控;4、修复细胞支架改变和过度凋亡,细胞膜上受体结构变化,导致生长因子与受体之间失耦联。传统的伤口换药和清创手术仅能清除局部感染灶或坏死组织,无法解决难愈合伤口的其他因素:如重建供血,提高局部生长因子数量和活性,防止细胞过度换药多次清创后伤口往往越来越大。皮瓣移植能较好地修复慢性难愈合伤口,重建供血、对创伤后感染的慢性难愈合伤口有较好的修复效果。然而,对于糖尿病溃疡、褥疮、血管源性、神经源性或放射性慢性伤口,由于生长因子少,活性低,与受体失耦联增加,皮瓣移植在这些创面不易存活。
慢性难愈合伤口治疗现状:(1)手术治疗:由于慢性溃疡患者大多同时合并有全身性疾患,手术治疗受到了很大限制。对可以耐受手术、术式可采用溃疡切除后游离植皮术或溃疡切除后局部皮瓣、肌皮瓣转移术。(2)物理治疗:激光照射,目前选用He-Ne激光,也有用CO2激光或两者联用的;微波治疗,微波是一种超高频定向电磁波,对于改善局部血循环,增强机体免疫力有显著作用;封闭负压吸引、负压吸引给创口施加局部机械牵引力,使创面局部血运增加,促进肉芽组织健康生长。另外,还有高压氧疗法、离子导入法等物理疗法。(3)单一生长因子类治疗:表皮细胞生长因子,表皮细胞因子作为主要的修复生长因子,调控创面修复的多个环节,影响创面修复质量和修复后重建。重组表皮细胞生长因子对老年人皮肤溃疡有明显的促进愈合作用,尤其是糖尿病患者。血管内皮细胞生长因子。血管内皮细胞生长因子是一种糖蛋白,能特异性地作用于血管内皮细胞,促进血管内皮细胞分裂、增殖和迁移,直接调节血管的新生、促血管生成的作用。同时,血管内皮细胞生长因子还能够促进血管内皮细胞产生降解血管外基质的蛋白酶类,降解细胞外基质,有利于新生血管长入,利于内皮细胞迁移和趋化,诱使汇聚的微血管内皮细胞侵入胶原凝胶,促进肉芽组织的生成;碱性成纤维细胞生长因子,碱性成纤维细胞生长因子促进毛细血管形成,可以加速慢性溃疡创面愈合。(4)组织工程皮肤,组织工程皮肤不仅提供能促进创面愈合所需的基质成分,而且通过不断分泌生长因子和细胞因子来加速创面愈合。组织工程皮肤为临床治疗各类型的皮肤缺损提供了新的途径,但仍没有一种产品可以满足创面修复在功能和外观上的需要。免疫排斥问题一直是组织工程皮肤的难题之一。(5)骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞具有很强的自我复制和多向分化的潜能。
血小板凝胶(platelet gel,PG)是富血小板血浆(platelet rich plasma, PRP)按照一定比例与激活剂混合凝固而成凝胶状物质。近年来研究发现,血小板经凝胶酶/钙剂激活后,其α颗粒可释放出多种生长因子,这些生长因子对于治疗急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口具有显著促进作用。同源异体的血小板来源广泛,可以充分利用无偿捐献的血液这一宝贵的资源,不用采集病人的自体血液,临床上可以广泛推广,同时解决了重组的生长因子价格昂贵,纯化困难,涉及基因重组的生物安全性等问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种血小板来源的复合生长因子,所述的复合生长因子包含多种符合人体比例的天然生长因子,血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)和类胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。
本发明的另一个目的在于提供由上述复合生长因子添加壳聚糖微球载体加工获得复合生长因子凝胶剂。
本发明的又一个目的在于提供上述复合生长因子和复合生长因子凝胶剂在制备治疗急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口等药物中的应用。
本发明的再一个目的是提供上述复合生长因子和复合生长因子的制备方法或加工程序。
本发明所采取的技术方案为:复合生长因子的制备方法,以浓度800×109-1500×109/L,优选为1000×109/L的血小板为原料制备,具体包括以下步骤:
(1)血小板浓缩液的病毒灭活:采用S/D法病毒灭活对血小板浓缩液(PC)进行病毒灭活处理;
(2)去除病毒灭活处理后的血小板浓缩液中的有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液);
(3)血小板浓缩液的激活:处理后的血小板浓缩液中加入钙剂或/和凝血酶激活,将混合物旋转混合,形成血小板凝胶,至上清析出,即得复合生长因子。
所述钙剂为CaCl2或葡萄糖酸钙。
所述凝血酶为人血凝血酶。
本发明复合生长因子凝胶其制备方法为:
(1)制备空白壳聚糖微球;
(2)精确称取空白壳聚糖微球,置于EP管中,加入乙酸缓冲液及富含血小板生长因子的溶液,充分振荡均匀,超声振荡,置于4℃、135rpm的摇床,6h后离心并用纯水洗涤,微球沉淀,冷冻冻干,得到壳聚糖复合生长因子缓释微球;
(3)取80%重量的纯化水,加入氯化钠、抑菌剂,加热使溶解;
(4)将上述溶液放在室温,加入PH调节剂,使其溶解;
(5)在上述溶液中加入氢氧化钠、增稠剂,溶胀过夜,高压灭菌(在121.6℃,0.1Mpa下灭菌20分钟),得凝胶A;
(6)将步骤(2)所制备的壳聚糖复合生长因子缓释微球精确称重后,放在EP管中,加入PBS缓冲液中,充分振荡,使其充分溶胀,然后加入保湿剂、蛋白稳定剂,搅拌使其溶解,微孔滤膜过滤后得混合溶液B;
(7)将混合溶液B与凝胶A混合,搅拌均匀,调节PH值到6.5~7.5;
(8)加入余量的纯化水,灭菌,即得复合生长因子凝胶剂。
本发明所获得的复合生长因子符合人体天然比例,克服了临床上的单一重组生长因子制品价格昂贵、纯化困难、涉及基因重组的生物安全性等问题。本发明利用上述复合生长因子通过添加壳聚糖微球载体加工获得的复合生长因子凝胶剂,使用过程中可以缓慢释放生长因子,有明显促进糖尿病慢性难愈合创面肉芽组织增殖、毛细血管增殖、巨噬细胞增殖和创缘新生上皮生长移行的作用。可应用于治疗急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口等,而且使用方便,安全性高。
附图说明
图1 是不同血小板浓度对于ECV304细胞增殖的影响。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1 适合临床治疗的生长因子浓度的确定
富血小板血浆(PRP)中不同浓度血小板制备的血小板凝胶(PG)上清对ECV304细胞增殖实验:对照组血小板浓度为0×109/L,实验组浓度分别为500×109/L、1000×109/L、1500×109/L、2000×109/L、2500×109/L、3000×109/L六种浓度;激活剂选择含有1000U/ml人血凝血酶的10%葡萄糖酸钙溶液,PRP与激活剂比例为10:1,在24h检测细胞增殖情况。
结果显示在血小板浓度范围1500~2500×109/L时,随着血小板浓度的增高,所制备的血小板凝胶(PG)上清促进细胞的增殖效果明显;当血小板个数达到1000~2500×109/L时,其细胞增殖能力缓慢增加,但增加效果不够明显;而当血小板个数达到3000×109/L时,其增殖能力反而有所下降(附图1)。临床实际制备的机器单采血小板浓度波动于1000×109/L上下,并且血小板浓度增加,成本将大大增加,效果却增加不显著,故我们实验中选用1000×109/L作为血小板的使用浓度来制备血小板凝胶(PG)较为经济、实用。
实施例2复合生长因子的制备方法
(1)血小板浓缩液的病毒灭活:将血小板浓缩液装在含有有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)的容器中,所述有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)选用1%的TnBP和1%TritonX-45的混合物,将有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)与血小板浓缩液的混合物振荡一分钟使其充分混合,然后放置于31℃的水槽中,不断振荡至少一小时;
(2)油的萃取:在步骤(1)振荡后的有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)与血小板浓缩液的混合物中加入适量(10%(v/v))大豆油中,摇匀,然后放到旋转的振荡器上振荡20分钟,血小板部分(下层)从油(上层)中倒出来,在重力作用下放入另一个容器中,进行第二次油萃取;油萃取后使得TnBP和TritonX-45均减少至低于10-100p.p.m.;
(3)柱层析:将步骤(2)油萃取后的有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)与血小板浓缩液的混合物在室温下离心,经疏水作用色谱处理,色谱材料填充在柱里,并用5倍体积的1M的氯化钠和20%的酒精以一定流速注入,流出物就是富含生长因子的血小板浓缩液;
(4)血小板的激活释放物的制备:100ml的富含生长因子的血小板浓缩液通过添加1M CaCl2,至CaCl2终浓度为23mM,产生内源性的凝血酶,诱导纤维蛋白原聚合和血小板的激活,轻柔旋转混合物,直到血小板凝胶形成,1h后,上清恢复,即得复合生长因子。
所述步骤(1)中血小板浓缩液(PC)是用全自动血液成份分离机通过白膜法制备,用计数仪计数,所述血小板浓缩液的浓度为1000×109/L,所述血小板浓缩液(PC)要在制备的24小时之内用有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)处理。
实施例3 生长因子的测定
分别从原始的血小板浓缩液中、油萃取后的血小板浓缩液中、柱层析之后的血小板浓缩液中各提取1ml样本,均进行以下处理:将样本在10000×g的离心力下离心15min,获得血小板和细胞裂解的上清,然后迅速冰冻在-80℃的冰箱。用ELISA试剂盒测定,按照ELISA试剂盒的说明书操作即可,在37℃融化,1h之内分析。标准品和样本都是测定双份,计算平均值。结果乘以样本的稀释倍数。
采用上述方法测定实施例2所制备的复合生长因子,检测得知,实施例2制备得到的复合生长因子中,每1L血小板浓缩液中含有血小板生长因子(PDGF)为7~33μg,血管内皮生长因子(VEGF)为0.2~0.6μg,转化生长因子-β1(TGF-β1)为31~113μg,表皮生长因子(EGF)为0.2~0.5μg,类胰岛素样生长因子-1(IGF-1)为33~65μg。
实施例4 复合生长因子凝胶剂的制备
(1)制备空白壳聚糖微球:参照Berthold方法并加以改进。将0.2g壳聚糖溶解于80ml 2%冰乙酸溶液中,加入吐温-80 1ml,磁力搅拌1.0~2.0h,超声振荡除去气泡,得澄清液体。室温磁力搅拌下缓慢滴加2.5g/L三聚磷酸钠溶液16ml,至溶液浑浊,继续磁力搅拌1h,在10000rpm离心15min,所得沉淀纯水反复离心洗涤3次,收集送冷冻冻干;
(2)制备壳聚糖复合生长因子缓释微球:精确称取壳聚糖冻干微球20mg于EP管中,加入乙酸缓冲液0.9ml及富含血小板生长因子的溶液0.1ml,充分振荡均匀,超声振荡,置于4℃摇床(135rpm),6h后离心并用纯水洗涤3次,微球沉淀,冷冻冻干,收集离心液和洗涤上清液;
(3)复合生长因子凝胶剂的制备
每1000g复合生长因子凝胶剂中含有:
血小板衍生生长因子 7.71~32.75μg
血管内皮生长因子 0.29~0.59μg
转化生长因子-β1 31.81~112.57μg
表皮生长因子 0.23~0.43μg
类胰岛素样生长因子-1 33.1~64.08μg
壳聚糖 10~20g
增稠剂 10~20g
蛋白稳定剂 0.25~0.45g
保湿剂 0.4~0.6g
PH调节剂 调节PH至6.6~7.0
抑菌剂 1.2~2.2g
加入纯化水至1000g
所用的原料来源如表1:
具体的制备工艺包括如下步骤:
A、取80%重量的纯化水,加入氯化钠、抑菌剂,加热使溶解;
B、将上述溶液放在室温,加入PH调节剂,使其溶解;
C、在上述溶液中加入氢氧化钠、增稠剂,溶胀过夜,高压灭菌(在121.6℃,0.1Mpa下灭菌20分钟),得凝胶A;
D、将步骤(2)所制备的壳聚糖复合生长因子缓释微球精确称重后,放在EP管中,加入PBS缓冲液中,充分振荡,使其充分溶胀,然后加入保湿剂、蛋白稳定剂,搅拌使其溶解,微孔滤膜过滤后得混合溶液B;
E、将混合溶液B与凝胶A混合,搅拌均匀,调节PH值到6.5~7.5;
F、加入余量的纯化水,灭菌,即得复合生长因子凝胶剂。
实施例5 凝胶剂指标评价
按照表2的配方制作对照组凝胶剂和发明组凝胶剂:
一.质量评价
分别对对照组和发明组两种凝胶剂进行评价,评价指标包括:外观、pH、无菌、活度等方面。评价结果见表3。
外观性状:直接目视观察。
pH值:取本品,参照中国药典2005年版二部附录VApH值测定法测定。
无菌:取本品,依法(中国药典2005年版二部附录XIIA,薄膜过滤法)检查,应符合规定。
色谱法测定含量:取本品,采用高效液相色谱法进行测定。
活度:采用MTT测定细胞增殖的方法。
由表3看看出,发明组的凝胶剂色谱法测定含量及活度远远高于对照组。
实施例6 凝胶剂对慢性难愈合创面的修复实验
一、实验材料
1、动物模型:用STZ溶液造模,糖尿病Wistar大鼠24只,雌雄各半;
2.凝胶剂:采用实施例4制备所得。
3.凝胶基质:不加入血小板来源的复合生长因子,其余物质用量与实施例4相同。
二.实验步骤
1.制备全层皮肤缺损创面
在实验前糖尿病Wistar大鼠单笼喂养1周,自由饮水与摄食。大鼠试验当日禁食,用水合氯醛腹腔注射麻醉,背部剃毛,75%酒精常规消毒。用外科手术刀在大鼠背部各制成四个直径1.5cm圆形全层皮肤缺损创面,止血备用。
2.试验分组
将上述24只糖尿病Wistar大鼠的四个创面随机分成四组:
1)空白对照组:创面涂以0.9%生理盐水;
2)基质对照组:创面涂不含血小板复合生长因子的凝胶基质;
3)单一生长因子对照组:创面涂以重组人表皮生子因子凝胶;
4)复合生长因子凝胶治疗组:创面涂以血小板来源的复合生长因子凝胶剂。
3.换药方法
将糖尿病Wistar大鼠每个创面滴注试剂,并涂布均匀,用3M透明膜和3~5层无菌纱布覆盖,用3M胶带固定。动物单笼喂养,自由饮水进食,每天换药一次,至伤后两周。
三.评价指标及方法
1.测定血糖
血糖测定仪测定糖尿病Wistar大鼠血糖。分别于伤后1、2、3、5、7、10、12、14d,剪鼠尾将血吸入血糖测试条内,即可显示血糖读数(mmol/L)。
2.称体重
用电子秤分别于伤后1、2、3、5、7、10、12、14d对各组糖尿病Wistar大鼠称重(g)
3.创面定时照相
分别于伤后1、2、3、5、7、10、12、14d定期照相,观察各组在不同时期的创面愈合情况。
4.测定创面面积
分别于伤后1、2、3、5、7、10、12、14d用平整厚度均匀的透明塑料膜覆盖创面,并用记号笔沿创面边缘描绘出创面,剪下该创面图样,以万分之一电子分析天平称取透明塑料膜图样的质量,并换算成相应创面的面积。
5.创面愈合率:Cn=An/A0
Cn=创面愈合百分率;An=伤后某天的开放创面面积;A0=伤后当天的创面面积。
6.组织学观察
分别于伤后1、3、5、7、10、14d活检各组创面组织,进行组织学观察。处死大鼠,切取整个创面,包括5mm无损伤的正常皮肤,切至筋膜,放入5%甲醛溶液中固定。组织脱水,石蜡包埋固定,苏木精和伊红染色,切片。用光学显微镜观察组织肉芽组织、新生上皮生长、炎症细胞和成纤维细胞生长变化。
7.免疫组化
分别于伤后5、7、10、12、14d活检各组创面组织,进行组织学观察。处死大鼠,切取整个创面,包括5mm无损伤的正常皮肤,切至筋膜,放入5%甲醛溶液中固定。组织脱水,石蜡包埋固定,石蜡切片脱蜡,水化,阻断内源性过氧化物酶,抗原的修复,滴加一抗,二抗,DAB显色,苏木素速染,乙醇脱水,二甲苯透明,树脂封片。观察CD31标记的血管内皮细胞和CD68标记的巨噬细胞的增殖情况。
四 实验结果
本实验研究结果显示本发明凝胶剂治疗组对糖尿病Wistar大鼠慢性创伤有良好的促进愈合的作用。观察伤后1天,空白对照组,基质对照组,单一生长因子对照组创面肉芽组织生长不明显,但复合生长因子凝胶治疗组创面新鲜,很容易出血,提示有肉芽组织生长;伤后3天,观察复合生长因子凝胶治疗组创面肉芽组织生长明显,创缘有新生上皮向创面中心生长移行;伤后7天复合生长因子凝胶治疗组创面肉芽组织生长很活跃,新生上皮向创面中心移行较快,与三个对照组相比有显著性差异(P<0.05);空白对照组,基质对照组,单一生长因子对照组4~7天创面肉芽组织生长缓慢,此后肉芽才逐渐生长起来,创面的上皮化比治疗组缓慢。
伤后5天创面开始出现明显收缩,复合生长因子凝胶治疗组愈合率与对照组相比差异显著(P<0.05);伤后7天三个对照组创面愈合率80%,本发明凝胶剂治疗组则为90%左右,差异有显著性(P<0.05);伤后12天各组创面愈合率都在98%以上,组间没有显著性差异。
创面组织学观察表明,本发明凝胶剂治疗组伤后3天在血管周围开始出现巨噬细胞,伤后5天肉芽组织、新生毛细血管和新生上皮比三个对照明显增多;伤后7天本发明凝胶剂和单一生长因子组新生毛细血管增殖明显,巨噬细胞增殖明显;伤后12天各组绝大多数创面基本愈合,完全被新生上皮覆盖,新生血管生长没有显著性差异。结果表明,本发明凝胶剂有明显促进糖尿病慢性难愈合创面肉芽组织增殖、毛细血管增殖、巨噬细胞增殖和创缘新生上皮生长移行的作用。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种血小板来源复合生长因子,其特征在于,是以浓度800×109-1500×109/L的血小板为原料首先通过S/D法病毒灭活后加入钙剂或/和凝血酶激活形成血小板凝胶,得到的上清。
2.根据权利要求1所述的复合生长因子,其特征在于,是以最佳浓度1000×109/L的血小板为原料首先通过S/D法病毒灭活后加入钙剂或/和凝血酶激活形成血小板凝胶,得到的上清。
3.根据权利要求1所述的复合生长因子,其特征在于,所述复合生长因子中包含血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)和类胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。
4.根据权利要求1或2所述的复合生长因子,其特征在于,所述钙剂为CaCl2或葡萄糖酸钙。
5.根据权利要求1或2所述的复合生长因子,其特征在于,所述凝血酶为人血凝血酶。
6.根据权利要求1-3任一项所述复合生长因子在制备治疗急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口药物中的应用。
7.一种复合生长因子凝胶,其特征在于,是由权利要求1-3任一项所述的复合生长因子添加壳聚糖微球、增稠剂、蛋白稳定剂、保湿剂、PH调节剂、抑菌剂和水等物质加工形成的。
8.根据权利要求1-3任一项所述的复合生长因子,其制备方法为:
(1)血小板浓缩液的病毒灭活:采用S/D法病毒灭活对血小板浓缩液(PC)进行病毒灭活处理;
(2)去除病毒灭活处理后的血小板浓缩液中的有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液);
(3)血小板浓缩液的激活:处理后的血小板浓缩液中加入钙剂或/和凝血酶激活,将混合物旋转混合,形成血小板凝胶,至上清恢复,即得复合生长因子。
9.根据权利要求7所述的复合生长因子凝胶,其制备方法为:
(1)制备空白壳聚糖微球;
(2)精确称取空白壳聚糖微球,置于EP管中,加入乙酸缓冲液及富含血小板生长因子的溶液,充分振荡均匀,超声振荡,置于4℃、135rpm的摇床,6h后离心并用纯水洗涤,微球沉淀,冷冻冻干,得到壳聚糖复合生长因子缓释微球;
(3)取80%重量的纯化水,加入氯化钠、抑菌剂,加热使溶解;
(4)将上述溶液放在室温,加入PH调节剂,使其溶解;
(5)在上述溶液中加入氢氧化钠、增稠剂,溶胀过夜,高压灭菌,得凝胶A;
(6)将步骤(2)所制备的壳聚糖复合生长因子缓释微球精确称重后,放在EP管中,加入PBS缓冲液中,充分振荡,使其充分溶胀,然后加入保湿剂、蛋白稳定剂,搅拌使其溶解,微孔滤膜过滤后得混合溶液B;
(7)将混合溶液B与凝胶A混合,搅拌均匀,调节PH值到6.5~7.5;
(8)加入余量的纯化水,灭菌,即得复合生长因子凝胶剂。
10.根据权利要求7或9所述的复合生长因子凝胶在制备治疗急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口药物中应用。
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