CN111777773B - 一种儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备方法、产品及应用 - Google Patents

一种儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备方法、产品及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备方法、产品及应用，所述制备方法包括儿茶酚功能化壳聚糖的制备以及儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备；本发明制备的儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶无细胞毒性，生物相容性好，能够促进L929细胞迁移，溶血率小于5％，符合国家安全标准。

Description

一种儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备方法、产 品及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽 温敏水凝胶的制备方法、产品及应用。
背景技术
创伤是现代社会最常见的一种疾病，具有很高的发病率和致残率。迄今为止， 各种原因导致的出血、皮肤创伤及其愈合形成的疤痕组织依然严重威胁着人类的 健康和生活质量。因此，研制能够加速创面愈合，减少病理性疤痕生成的药物及 相应的制剂一直是皮肤创伤治疗领域的重点和难点，具有非常重大的社会意义。
水凝胶是指一类由物理或化学交联形成的三维网状聚合物，可以吸收大量的 水分并能保持其三维结构。其主要特点有：(1)高分子基质以物理或化学交联 形成网络结构，网络中充满不能自由流动的溶剂，表现出弹性或黏弹性的半固体 性质；(2)对温度及外界条件敏感；(3)具有溶胀性、脱水收缩性、触变性、 粘合性；(4)具有易涂展、舒适感、无油腻、易去除，能吸收组织渗出液，不 妨碍皮肤的正常生理作用，具有一定的保水作用而促进药物透皮吸收。天然有机 材料制备的水凝胶在生物体内不会引起免疫排斥反应，表现出良好的生物相容 性，同时细胞在水凝胶中可以正常黏附生长，代谢产物可以通过水凝胶的孔隙排 出。相比其它人工合成的材料，天然有机材料制备的水凝胶结构更接近活体组织， 在性质上与细胞外基质部分相似，可减少对周围组织的摩擦，显著改善材料的各 项生物学性能。
温敏性水凝胶是众多环境敏感水凝胶中被研究最多的水凝胶之一，主要特点 是可以响应温度变化而发生溶胶－凝胶转变。近年来，将温敏性水凝胶作为凝胶 体系的研究越来越多，在生物医学领域受到广泛的关注。相比传统的水凝胶，温 敏水凝胶应用于组织工程、药物缓释等领域具有明显的优越性。
发明内容
基于上述内容，本发明提供一种儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的 制备方法、产品及应用；以牡蛎肽、儿茶酚功能化壳聚糖等海洋生物活性物质为 主要原料制备出一种改性壳聚糖/活性肽复合材料，其在皮肤创伤修复、止血、 抗菌等方面具有极好的应用效果，是一种天然无毒的生物复合材料，为实现海洋 生物资源的高值化利用提供技术指导和理论基础。
为实现上述目的，本发明的技术方案之一，一种儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎 肽温敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将壳聚糖经儿茶酚功能化后制备成儿 茶酚功能化壳聚糖溶液，然后向其中加入牡蛎肽，再滴入β-甘油磷酸钠溶液搅 拌混合得到。
优选的，包括以下步骤：
(1)儿茶酚功能化壳聚糖的制备
将碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(DEC/NHS)溶液滴加到壳聚糖溶液 /3、4-二羟基苯丙酸(CS/HCA)溶液中反应，反应完成后，透析，冷冻干燥得 儿茶酚功能化壳聚糖(CS-C)；
(2)儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽(CS-C/OP/β-GP)温敏水凝胶的制备
取步骤(1)制备的儿茶酚功能化壳聚糖(CS-C)配制儿茶酚功能化壳聚糖 溶液，加入牡蛎肽(OP)，搅拌条件下将β-甘油磷酸钠(β-GP)溶液滴加到 制备的儿茶酚功能化壳聚糖溶液中，得儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽(CS-C/OP/ β-GP)温敏水凝胶；
优选的，所述步骤(1)包括以下步骤：
①将壳聚糖溶于乙酸中配制壳聚糖溶液，将3、4-二羟基苯丙酸(HCA)溶 于水中得到3、4-二羟基苯丙酸溶液；将3、4-二羟基苯丙酸溶液加入到壳聚糖 溶液中得到壳聚糖/3、4-二羟基苯丙酸溶液(CS/HCA)；
②将碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于乙醇水溶液中得到碳二亚胺 盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液(EDC/NHS)；
③将步骤②制备的碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液滴加到步骤 ①溶液中反应，反应完成后透析冷冻干燥得到儿茶酚功能化壳聚糖(CS-C)。
优选的，所述步骤①中，壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为2％，3、4-二羟 基苯丙酸溶液中3、4-二羟基苯丙酸的浓度为1mol/L，3、4-二羟基苯丙酸溶液和 壳聚糖溶液的混合体积比为1∶10；
步骤②中，碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合摩尔比为1∶1，乙 醇水溶液中乙醇和水的体积比为9∶1，溶液中碳二亚胺盐酸盐的浓度为1mol/L；
步骤③中，反应时间10h，反应pH值4.5-5.5，反应完成后在pH为5的盐 酸水溶液中透析3天，再在蒸馏水中透析4h，冷冻干燥得儿茶酚功能化壳聚糖。
优选的，所述步骤(2)中：
牡蛎肽的加入量为1g/L；
儿茶酚功能化壳聚糖溶液的溶剂为水，质量分数为2％；β-甘油磷酸钠溶液 的溶剂为水，质量分数为30％；
儿茶酚功能化壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的混合体积比为7∶3或8∶ 2；
β-甘油磷酸钠溶液滴加完成后，搅拌2min，置于37℃恒温环境中恒温放置， 得所述温敏水凝胶。
优选的，所述步骤(2)中的牡蛎肽在加入前制备成壳聚糖/牡蛎肽微球 (M-OP)，具体包括以下步骤：
a.将牡蛎肽和壳聚糖溶于乙酸溶液中得牡蛎肽/壳聚糖混合溶液，搅拌条件下 逐滴滴入含有乳化剂的液体石蜡中，搅拌；
b.滴入交联剂溶液，搅拌离心，洗涤，冷冻干燥得壳聚糖/牡蛎肽微球。
优选的，所述步骤a中：
所述乙酸溶液中乙酸的质量分数1％；
牡蛎肽/壳聚糖混合溶液中，壳聚糖的质量分数1％，牡蛎肽的加入量 0.4-1.4mg/mL；
在800rpm和60℃下将牡蛎肽/壳聚糖混合溶液滴入含有乳化剂的液体石蜡 中，搅拌1.5h；所述乳化剂为吐温80和Span-80的混合物，牡蛎肽/壳聚糖混合 溶液和和液体石蜡的体积比为1∶10；
所述步骤b中：
交联剂溶液的质量分数为25％，交联剂溶液的加入量和液体石蜡的体积比为 1∶50，30min滴完，滴完后继续搅拌30min，离心收集，用石油醚和乙醇反复 洗涤沉淀物，然后冷冻干燥得所述壳聚糖/牡蛎肽微球；
所述交联剂为戊二醛。
优选的，所述儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备包括以下步骤： 将壳聚糖经儿茶酚功能化后制备成儿茶酚功能化壳聚糖溶液，然后向其中加入牡 蛎肽后，再依次滴入β-甘油磷酸钠溶液和NaHSO3溶液搅拌混合得到所述儿茶 酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶。
优选的，加入NaHSO3溶液的条件下，β-甘油磷酸钠溶液的溶剂为水，质 量分数为10％，NaHSO3溶液的质量分数为3％；β-甘油磷酸钠溶液滴加完成后， 滴加等体积的NaHSO3溶液。
本发明还提供上述儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备方法制备 的儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶。
本发明还提供上述儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶在制备创伤修复 药物方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)CS经过HCA接枝改性，引入了新的亲水基团，使其水溶解度提高 到5g/100mL以上，大大扩大CS-C的应用范围，抗氧化性能分析结果表明，CS-C 能很好的清除DPPH自由基和羟基自由基，细胞活力，细胞凋亡和红细胞溶血率 检测结果表明，CS-C具有很好的生物相容性。
(2)CS-C与β-GP以一定比例混合制备CS-C/β-GP温敏水凝胶，该温敏 水凝胶的凝胶温度为37℃，凝胶时间为12-18min。该水凝胶具有较强的粘附特 性，持久粘附于创伤组织，避免脱落引发二次感染，利于创伤修复。水凝胶冻干 后的微观结构呈现出多孔网状结构，有利于水及小分子药物自由通过，有利于伤 口愈合，药物释放等。
(3)NaHSO3的引入，提高了水凝胶的温敏性，使得该水凝胶在生理温度 下只需要较低浓度的β-GP就可快速凝胶化，克服了所需高浓度β-GP可能导致 潜在的毒性，同时NaHSO3的引入使凝胶时间缩短到3-7min。
(4)牡蛎肽是以牡蛎肉为原料，经酶解、分离、精制和干燥等加工而制得 的分子量在200-800Da的小分子低聚肽，由2-6个氨基酸组成的；牡蛎肽可快 速被人体吸收，不仅含有丰富的蛋白质、维生素、比例合适的微量元素和牛磺酸， 而且还含有海洋生物所特有的多种营养成分，以及低聚肽具有较高的生物活性功 能。
(5)本发明制备的M-OP呈完整球形，粒径1-10μm，包封率72.8％，载 药量为11.9％，具有良好的体外释放行为，累计释放率达70.8％。
(6)复合温敏水凝胶CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/β-GP具有多孔结 构，孔径大小均匀，吸水率都在550％以上，能保持湿润的微环境，复合水凝胶 无细胞毒性，生物相容性好，并能促进L929细胞迁移，溶血率均小于5％，符 合国家安全标准。
(7)全血凝血指数、体外凝血时间、血小板粘附、红细胞吸附等实验表明 CS-C/OP温敏水凝胶能够促进凝血；小鼠肝脏止血、断尾止血模型表明CS-C/OP 水凝胶能加速止血，与市售的明胶海绵止血效果相当；CS-C/OP温敏水凝胶能 够保持创面伤口湿润环境，加速伤口愈合速度，缩短愈合时间，减轻创面伤口多 种炎症细胞聚集，加速胶原纤维和加速新血管的生成来促进肉芽组织中总蛋白的 合成和伤口的修复，同时证明加速创面愈合作用与Ki-67和VEGF的表达量。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP的SEM分析图；
图2为本发明实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP的吸水率性能图；
图3为本发明实施例1制备的不同浓度CS-C/β-GP对L929细胞活力影响 图；
图4为本发明实施例1制备的不同浓度CS-C/OP/β-GP对L929细胞活力影 响图；
图5为本发明实施例1制备的不同浓度CS-C/M-OP/β-GP对L929细胞活力 影响图；
图6为本发明实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP活/细胞染色应该显微镜像图；
图7为本发明实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP对L929的细胞凋亡影响；
图8为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP在细胞迁移实验中对L929细胞划痕实验模型；
图9为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品处理划痕模型12h、24h、36h和48h后细胞的迁移 情况图；
图10为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品溶血率图；
图11为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品红细胞显微镜图；
图12为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品溶血实验结果图；
图13为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品敷料小鼠皮肤创面愈合图片；
图14为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品敷料小鼠皮肤创面愈合百分率；
图15为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品敷料各实验组伤口总蛋白浓度；
图16为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品敷料各实验组伤口TNF-α和IL-6表达情况；
图17为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品敷料H&E染色评估各实验组皮肤病理学变化；
图18为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品敷料各组样品Masson染色结果各组样品Masson染色 结果；
图19为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品敷料各组样品处理创面中胶原蛋白含量的平均光密度；
图20为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品敷料各组皮肤创面VEGF(A)和Ki-67(B)免疫组化 染色；
图21为实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP样品敷料各组样品处理创面中VEGF(A)和Ki-67(B)表达的 平均光密度；
图22为效果验证3中水凝胶进行粘结强度测试示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明 的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式 做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书 得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅 是示例性的。
实施例1
(1)CS纯化：将CS溶于1wt％的乙酸中搅拌过夜得到2wt％CS溶液，用 1μm微孔尼龙滤膜抽滤，收集滤液，再用10％NaOH调pH值至8-9析出CS 固体，在200目的尼龙网上用蒸馏水洗涤至中性，收集沉淀物，冷冻干燥即得 纯化CS；
(2)儿茶酚功能化壳聚糖(CS-C)的制备：将2g纯化CS溶于100mL 1％ 乙酸中，得到2％CS溶液，将1.82g 3.4-二羟基苯丙酸(HCA)溶于10mL蒸馏 水中，得到HCA溶液，将1.92gEDC和1.15g NHS溶于90mL乙醇/水(体 积比为1:1)中。将HCA溶液加到CS溶液中，得到CS/HCA溶液，再将EDC/NHS 溶液滴加到CS/HCA溶液中，反应10h，pH保持在4.5-5.5之间，反应完成后， 在pH为5的盐酸水溶液中透析三天，再用蒸馏水透析4h，冷冻干燥即得CS-C；
(3)将CS和OP溶于1％的乙酸中配制成1％的CS/OP溶液，在800rpm 和60℃下将5mLCS/OP溶液逐滴滴入50mL含有乳化剂(吐温-80和Span-80) 的液体石蜡中搅拌1.5h，然后将1mL25％的戊二醛逐滴滴入上述溶液中，30min 滴完，继续搅拌30min，离心收集，用石油醚和乙醇反复洗涤沉淀物3次，然后 冻干，得壳聚糖/牡蛎肽微球(M-OP)。
(4)称取2gCS-C溶于100mL蒸馏水中，得到2％的儿茶酚功能化壳聚糖 溶液，再加入0.1g牡蛎肽(OP)或者壳聚糖/牡蛎肽微球(M-OP)。在磁力搅 拌下，以8:2(CS-C:β-GP)的体积比将30％的β-GP溶液滴加到CS-C溶液中， 滴加完成，继续搅拌2min后，放入37℃恒温水浴锅中，即得CS-C/OP/β-GP、 CS-C/M-OP/β-GP温敏水凝胶。
(5)同步骤(4)，区别在于，不加入0.1g牡蛎肽(OP)或者壳聚糖/牡蛎 肽微球(M-OP)，制备CS-C/β-GP。
效果验证例1
1.1实验方法
1.1.1扫描电镜分析
方法：将冷冻干燥的样品取小块喷金制样，后将样品置于S-4800扫描电镜 中，在加速电压10kV下进行观察拍照；
1.1.2吸水性分析
精确称取冷冻干燥后的水凝胶，记为m1，在蒸馏水中浸泡10min，去除吸 水后的水凝胶，用滤纸吸取表面游离水，称重，记为m2，每组实验平行3次， 取平均值，质量溶胀吸水率(SR)的计算公式：
Figure BDA0002563828000000081
式中，SR为溶胀率，％；m1为浸泡前水凝胶质量，g；m2为浸泡后水凝胶 质量，g。
1.1.3对L929细胞增殖率分析
常规方法培养细胞，待细胞融合率达到90％后，消化，制悬，收集L929细 胞，细胞计数后调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔100μL接种于96孔培养板上， 37℃、5％CO2培养箱中培养24h，分别加入50μL含有不同浓度样品的DMEM培 养基，不含样品的DMEM培养基为对照组，继续培养24h或者48h。MTT法 检测各种细胞活力。
1.1.4对L929细胞凋亡分析
在6孔培养板中，不同浓度的样品作用细胞完成后，用不含EDTA的胰蛋白 酶消化，850rpm 4℃离心5min，收集细胞，用预冷的PBS洗涤两次，每次均 用850rpm 4℃离心，收集1-5×105个细胞，吸弃PBS，加入100μL 1×Binding Buffur重悬细胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI Staining Solution，轻 轻摇匀，避光，室温反应10-15min，加400μL 1×Binding Buffur，轻轻混匀， 置于冰上，避光，样品在1h内用流式细胞仪检测.
1.1.5Calcein-AM/PI活/死细胞双染分析
在24孔培养板中，不同浓度的样品作用细胞完成后，吸弃培养液，并用PBS 缓冲液清洗两遍，每孔加入500μL Calcein-AM/PI溶液(5μL CalceinAM和15 μLPI混合在5mL 1×assay Buffer中)，在黑暗条件下染色20min后，吸弃染 色液，用PBS缓冲液清洗一遍，再加入500μL培养液，在荧光显微镜下，使用 490nm和545nm发射滤光片检测活死细胞情况，并拍照记录。
1.1.6对L929细胞迁移分析
L929细胞浓度调整为5×104个/mL，每孔2mL接种于6孔培养板上，37℃、 5％CO2培养箱中培养，待细胞融合为单层后，用100μL无菌枪头划痕，并用无 菌PBS缓冲液清洗两遍，将划痕区域的细胞碎片清洗干净。每孔加入2mL含有 不同浓度样品的DMEM培养基，不含样品的DMEM培养基为对照组，每隔12h 拍摄划痕区域面积。LAS处理并计算L929细胞融合率：
Figure BDA0002563828000000091
式中：S0为0h时，划痕区域面积，St为t h时划痕区域面积。
1.1.7溶血率分析
(1)红细胞准备：新鲜抗凝小鼠血液，在4℃2000rpm离心15min，移去 上清液，下层为红细胞，用PBS将红细胞稀释至体积浓度为2％，得到红细胞悬 液备用；(2)共混培养：将500μL样品溶液或水凝胶浸提液加入1.5mL离心 管中，37℃恒温水浴30min，再加入500mL红细胞悬液，密封，轻轻摇匀，37℃ 恒温水浴培养1h，加入500μL水为阳性对照，500μLPBS为空白对照，每组平 行3次；(3)结果检测：①共混液在4℃2000rpm离心15min，取上清液100μL于96孔板中，540nm处酶标仪测定其吸光度，溶血率计算公式如下：
Figure BDA0002563828000000092
式中：H为样品吸光度；H0为空白PBS组吸光度；H100为阳性组水的吸光 度；
②离心后，不同样品、不同浓度处理的离心管放入试管架上，对比观察，拍 照；③共混培养后观察红细胞的形态变化，收集离心后的底层红细胞，PBS重 悬，光学显微镜下观察、记录红细胞形态。
1.2结果分析
1.2.1微观结构研究
见图1；可以得出冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/ β-GP为多孔网状结构，孔径100-200μm，孔径大小较为均匀，有利于保持湿 润的微环境，为水凝胶创面在创面愈合的应用中提供合适的环境；同时冻干的样 品因其均匀的多孔结构，可以大量吸收水分，浓缩血液，达到快速止血的功效；
1.2.2吸水性能
对实施例1制备的冻干水凝胶CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/ β-GP进行吸水率性能检测；结果见图2；从图可以看出水凝胶冻干样品的吸水 率都在550％以上，表明该水凝胶能很好吸收液体，并锁住水分，施用于伤口时 能很好的保持伤口湿润，有助于创伤修复；
1.2.3细胞活力
L929细胞经不同浓度的CS-C/β-GP水凝胶浸提液样品处理后，用MTT法 检测细胞活性，结果如图3所示。CS-C/β-GP水凝胶浸提液在浓度为1000μg/mL 的范围内对L929细胞无毒性，对细胞活力有一定的提高作用。将L929细胞与 不同浓度的CS-C/OP/β-GP水凝胶浸提液共培养24h或者48h，MTT法检测其 细胞活力，结果如图4所示，可以得出该水凝胶浸提液对L929细胞无细胞毒 性，并对L929细胞的细胞活力有明显的提高。这可能是多肽中含有丰富的营 养物质，并且能很好的被细胞利用。将L929细胞用不同浓度的CS-C/M-OP/β -GP水凝胶浸提液处理，MTT法检测细胞活力，从图5可以得出CS-C/M-OP/ β-GP水凝胶浸提液对L929细胞的细胞活力有明显的提高，并且一定浓度下 培养48h的细胞活力较24h的更显著。
1.2.4AM/PI对活/死细胞双染结果
CS-C/β-GP，CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/β-GP水凝胶的细胞毒性也可 通过荧光显微镜图像进行分析，L929细胞经钙黄绿素-AM/PI对活/死细胞进行 双重染色，绿色代表活细胞，红色代表死细胞，结果见图6。选用浓度为500μg/mL的CS-C/β-GP，CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/β-GP水凝胶浸提液进 行实验，如图中的荧光图像显示，各组水凝胶培养的细胞数量都在增加，并且水 凝胶组和对照组中的死细胞都很少，细胞形态正常，这表明在存在水凝胶的情况 下，细胞可以连续生长。
1.2.5细胞凋亡结果
采用Annexin FITC/PI双染色法，利用流式细胞仪对L929细胞的凋亡情况 进行了定量分析。同样选用浓度为500μg/mL的CS-C/β-GP，CS-C/OP/β-GP 和CS-C/M-OP/β-GP水凝胶浸提液进行细胞凋亡实验。实验结果如图7所示， 对照组24h与48h的细胞凋亡率(凋亡细胞率＝Q2+Q4)为7.6％与6.4％。处 理24h组的细胞凋亡率分别为4.5％、5.8％和6.2％；处理48h组的细胞凋亡 率分别为5.5％、6.2％与5.1％，细胞凋亡率较对照组要稍稍低一点，但无显著 差异，表明样品对L929的细胞凋亡无明显影响。
1.2.6细胞迁移
L929细胞划痕实验模型如图8所示。图9为各组样品处理划痕模型12h、 24h、36h和48h后细胞的迁移情况，图9可以看出各组细胞都向划痕区域 迁移。样品组的细胞迁移数量明显高于对照组，并且样品促进L929细胞迁移 的能力为CS-C/β-GP<CS-C/M-OP/β-GP<CS-C/OP/β-GP。从图可以看到 CS-C/M-OP/β-GP、CS-C/OP/β-GP在48h内迁移率可达到90％及以上。细胞活 力及细胞凋亡结果都表明样品对L929细胞无细胞毒性，对照细胞迁移结果可得，水凝胶样品的浸提液有刺激L929细胞迁移的作用，这表明水凝胶样品在 不过度提高细胞活力的前提下能很好促进细胞迁移。
1.2.7溶血率研究
溶血率实验是通过评估材料的生物相容性来评价材料是否安全的方式之一。 创伤修复材料通常需要直接接触伤口及血液，为了防止这类材料与血液接触后 出现溶血现象，材料必须符合安全标准，即材料溶血率小于5％(GB/T 16886.4-2003标准)。材料的溶血率越低，对红细胞的破坏能力越小，表明材料 血液相容性好，安全性高。图10是不同浓度的CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP、 CS-C/M-OP/β-GP、阴性对照组PBS及阳性对照组水的溶血率结果。CS-C/β-GP、 CS-C/OP/β-GP、CS-C/M-OP/β-GP溶血率都低于5％，表明材料的生物相容性好。 同时发现随着水凝胶材料浓度的升高，溶血率也出现一定的升高。这可能是随着 样品浓度的增加，对红细胞产生了一定的破坏，但浓度在1000μg/mL以内，其 溶血率都低于5％，材料安全。
另外，通过显微镜进一步观察经过样品处理后的红细胞的形态来评其估溶血 性质(图11)。可以看到阳性对照组水中的红细胞几乎全部被破坏，而阴性对 照组PBS中的保持完整，而样品组的红细胞形态与PBS组很一致。同时，通 过记录各组样品溶血率结果的图片(图12)，红细胞悬浮液经过离心后，阳性 组水为血红色，出现明显溶血现象，而PBS组和样品组的上清液澄清或微弱的 粉红色，表明未出现明显溶血现象。红细胞溶血率结果、溶血实验图片(图12) 及红细胞显微形态(图11)，这些结果，都证明样品无明显溶血现象，符合国 家安全要求。
效果验证2创伤修复实验方法
2.1实验方法
2.1.1水凝胶样品制备同3.1.1；
2.1.2小鼠皮肤创伤模型的建立和给药
体重为30-40g的SPF级KM雄性小鼠，购于广东省医学实验动物中心， 许可证号为SCXK(粤)2018-0002，实验动物质量合格证号：44007200068645。 实验前，新购买的小鼠需在实验室饲养一周，以适应环境，为其提供自由饮水， 定量鼠粮喂食，饲养环境温度维持在24-26℃，并昼夜交替照明，无不良反应 即可进行试验。实验前一天，将小鼠分组标记，每组18只，分为4组，分别为 CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP、CS-C/M-OP/β-GP和空白对照组。在实验手术当天， 腹腔注射10％的水合氯醛(0.04mL/10g)麻醉小鼠，麻醉后小鼠背部剃毛，用 酒精对小鼠背部剃毛区域进行消毒后，用直径为1.2cm的管沾印泥在小鼠背 部进行标记，然后根据圆形印记在其背部剪去一个直径为1.2cm的圆形全层皮 肤伤口，造模完成。然后将各组水凝胶样品涂敷在皮肤伤口处，并每天固定时间 段换药。
2.1.3实验分组给药及创面愈合情况分析
在造模后第1、2、4、6、8、10、12、14天对伤口拍照，观察创面的修复 情况；并用透明膜描记创面形状大小，利用photoshop软件计算创面面积及愈 合百分率；
创面面积＝圈内灰度值/标准面积单位灰度值；
创面愈合率＝所测面积/初始面积×100％；
在术后第五天、第九天、第十四天分别每组取6只小鼠，切取创伤处皮肤 组织，分成两部分保存，用于实验指标检测。第一部分组织固定于4％的多聚 甲醛溶液中，用于病理切片染色分析；第二部分组织取样后准确称取组织重量， 按重量(g)：生理盐水体积(mL)＝1：9的比例，低温匀浆，并低温离心取 上清液进行肉芽组织中总蛋白的含量以及炎症因子(TNF-α、IL-6等)等检测。
2.1.4肉芽组织中总蛋白含量测定
采用考马斯亮蓝法测定肉芽组织中总蛋白含量。取低温匀浆并离心后的上清 液50μL 5倍稀释，按表1进行检测：
表1肉芽组织中总蛋白含量测定方法
Figure BDA0002563828000000131
总蛋白计算公式：
Figure BDA0002563828000000132
式中，蛋白浓度单位为gprot/L，标样浓度为0.524mgprot/mL。
2.1.5肉芽组织中炎症因子TNF-α、TL-6含量的测定
取低温匀浆离心的10％组织匀浆上清液50μL待测。测试过程中，严格 按照试剂盒的说明进行操作。
具体操作步骤如下：
1)测定前将试剂盒放置室温40分钟，所有试剂在使用前都轻轻摇匀；
2)标准品稀释：用标准品稀释液把480ng/L的标准品原液稀释成15、30、 60、120、240ng/L不同浓度的标准品应用液；
3)加样：空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。标准品孔 每孔加入50μL稀释好的标准品，零孔加入50μL标准品/样品稀释液，然后加 入50μL酶标试剂。样品孔加入50μL样品，然后加入50μL酶标试剂；
4)轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min；
5)将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释25倍后备用；
6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒 后弃去，如此重复5次，拍干；
7)显色：每孔先加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻震 荡混匀，37℃避光显色10分钟；
8)终止：每孔加50μL终止液，终止反应；
9)测定：以空白孔调零，酶标仪450nm波长处测量各孔的吸光度，测定 应在加终止液后10分钟以内进行；
10)计算：根据标准品浓度与OD值拟合的标准曲线的回归方程进行计算。
3.1.6组织切片染色分析
(1)组织包埋切片
取材：新鲜组织用4％的多聚甲醛固定24h以上。将组织从多聚甲醛固定 液中取出，在通风橱内用手术刀将目的部位组织修理平整，并放入贴有对应标签 的脱水盒内。
脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精脱 水4h、85％酒精脱水2h、90％酒精脱水2h、95％酒精脱水1h、无水乙醇I脱水 30min、无水乙醇II脱水30min、醇苯脱水5-10min、二甲苯I脱水5-10min、 二甲苯II 5-10min、蜡I1h、蜡II1h、蜡III 1h。
包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框， 待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应 的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊 片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。 待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
(2)H&E染色步骤石蜡切片脱蜡至水二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20 min、无水乙醇Ⅰ10min、无水乙醇Ⅱ10min、95％酒精5min、90％酒精5min、 80％酒精5min、70％酒精5min、蒸馏水洗。
苏木素染细胞核：切片放入Harris苏木素染3-8min，自来水洗涤，1％的 盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。
伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。
脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min、95％酒精II 5min、无水乙醇 Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、二甲苯Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切 片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。
(3)Massom染色步骤
石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min、 无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、75％酒精5min、自来水洗。
重铬酸钾染色：切片入重铬酸钾浸泡过夜，自来水洗涤。
铁苏木素染色：铁苏木素A液与B液等比混合成铁苏木素染液，切片入 铁苏木3min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。
丽春红酸性品红染色：切片入丽春红酸性品红浸染5-10min，自来水漂洗。 磷钼酸染色：磷钼酸水溶液浸染1-3min。
苯胺蓝染色：磷钼酸之后不用水洗涤，直接入苯胺蓝染液染3-6min。分化： 切片用1％冰醋酸分化，两缸无水乙醇脱水。
透明封片：切片放入第三缸无水乙醇5min，二甲苯5min透明，中性树胶 封片。显微镜采集图像并分析，采用Image-pro Plus图像分析软件对胶原蛋白 光密度进行分析。
2.1.7免疫组化分析
通过免疫组化分析检测创面组织上的相关蛋白的表达，检测的蛋白包括 Ki-67和VEGF两个指标。具体实验步骤如下：
(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15min、二甲苯Ⅱ 15min、二甲苯III 15min、无水乙醇Ⅰ 5min、无水乙醇Ⅱ 5min、85％酒精5min、 75％酒精5min、蒸馏水洗涤；
(2)抗原修复：选择两个蛋白表达作为指标，不同的蛋白表达对应各自的抗 原修复液；Ki-67抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0) 的修复盒放于有一定量水的高压锅内，电磁炉加热至气孔开始喷气，停止加热， 释放压力，将切片置于修复盒内，电磁炉加热至气孔开始喷气，5min后关闭电 磁炉，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片；自然冷却后将玻片置于PBS (pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
VEGF抗原修复：组织切片置于盛满EDTA(pH9.0)抗原修复液的修复 盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火 7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS (pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
(3)阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；
(4)血清封闭：在组化圈内滴加3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min； (一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭)
(5)加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一 抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)；
(6)加二抗：玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖 组织，室温孵育50min；
(7)DAB显色：玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次， 每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制 显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色；
(8)复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化 数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗；
(9)脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min、85％酒精5min、无水乙 醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯 拿出来稍晾干，中性树胶封片；
(10)显微镜镜检，图像采集分析。胞浆或胞膜上出现的棕黄色或浅黄色颗 粒即为阳性表达；
采用Image-pro Plus图像分析软件，随机选择3个视野，采用半定量的方 法计算每个视野下的平均光密度值来估计Ki-67和VEGF的表达情况。
2.1.8统计方法试验各组数据均以均值±标准差(X±S)表示。试验数据 用Excel2016整理，以SPSS 17.0统计分析软件进行统计学分析。*p<0.05表 示差异显著，**p<0.01表示差异极显著。
2.2结果分析
2.2.1创面愈合情况研究
将实验小鼠背部皮肤进行造模，分别在造模后5、9、14天对小鼠伤口进行 拍照图片采集，宏观评价样品对小鼠皮肤创面愈合的作用，结果如图13。由图可 以得到，在实验周期内，所有创面伤口都呈现逐渐愈合的趋势，但是各实验组的 愈合率不一致。与对照组相比，在第5天可以明显看到样品组能很好地收缩伤 口，加速伤口处的结痂，第9天样品组的伤口基本上皮化，疤痕也比较小。第14 天上皮化基本完成，接近愈合。同时对小鼠术后第2、4、6、8、10、12、14天 的伤口，使用PS软件进行愈合率统计，评价样品组对伤口愈合的作用，结果如 图14所示。结果证明样品组伤口愈合率较对照组有显著差异，含有多肽的水凝 胶效果更明显，这与宏观观察结果一致。
2.2.2伤口处肉芽组织中总蛋白含量研究
受伤的创面容易滋生大量的细菌，细菌会破坏肉芽组织中的蛋白，影响上皮 的形成，进而影响创面愈合的速度。创面肉芽组织中总蛋白质的含量也反映了创 面组织中细胞的增殖状况，蛋白质总含量越高说明创面“生肌”情况越好。各组 肉芽组织中总蛋白的含量如图15所示，创面肉芽组织中总蛋白含量随着愈合时 间的增加而慢慢增加。皮肤创伤后的第5天，CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP组的总蛋白含量都比空白对照组高，其中，CS-C/M-OP/β-GP 组的总蛋白含量最高；在第9天，各组的含量差不多；但在第14天，空白对 照组的总蛋白含量变化不大，而CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/β-GP组则显 著升高，与空白对照组相比，具有显著性差异(p<0.05)，这说明，CS-C/OP/ β-GP和CS-C/M-OP/β-GP组可加速创面肉芽组织中蛋白质的合成，加速伤口 愈合。
2.2.3创面伤口炎症因子含量研究
TNF-α是一种由单核细胞和巨噬细胞产生单核炎症因子，是炎症反应发生 时第一时间出现的炎性介质，它能激活淋巴细胞和中性粒细胞，刺激血管内皮 细胞来调节机体内部细胞的新陈代谢，促进组织释放细胞因子。IL-6是活化的 T细胞和成纤维细胞产生的一种淋巴因子。可激活急性反应蛋白，发挥促炎性作 用，在激活宿主局部与全身防御机制的同时，也直接影响成纤维细胞与内皮细 胞的生长。在正常创面愈合过程中，TNF-α和IL-6等炎症因子水平会显著增高， 加剧基体炎症反应。体内存在过高水平的TN-α和IL-6，会导致炎症细胞的毒 性作用增强，并使相关的炎症介质诱导力增强，最终导致更多的组织细胞损伤 并坏死。在皮肤创伤修复的过程中，TNF-α和IL-6等炎性因子的表达水平会显 著升高。通过检测创面皮肤匀浆上清液中的TNF-α和IL-6的表达量，来评价 创面组织的炎症情况(图16)。由图可见，在创伤修复的前期阶段各组炎症因 子的表达水平都明显升高，后期慢慢逐渐减少到和正常水平差不多。从第5天的 结果可以看到，各组炎症因子表达量都较高，但对照组表达量与样品CS-C/OP/ β-GP和CS-C/M-OP/β-GP组相比，具有显著性差异(P<0.05)，说明样品组 可以减少伤口愈合过程中的炎症反应。第9天各组TNF-α和IL-6的表达量均在 下降，CS-C/OP/β-GP组与CS-C/M-OP/β-GP组的更明显，说明可以通过减少 伤口局部处的炎症反应来加速伤口愈合。第14天，CS-C/β-GP、CS-C/OP/β-GP 和CS-C/M-OP/β-GP组TNF-α和IL-6与正常组基本平衡，说明伤口已经基本 愈合。
2.2.4创面H&E染色结果分析
在第5、9、14天里，通过收集创面伤口的组织块，进行处理切片，并用H&E 染色评估伤口的愈合情况(如图17)。从第5天的H&E染色结果可以看到， 创面处有炎症细胞的浸润，样品CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/β-GP组处理 的伤口已经产生少量的胶原纤维蛋白，明显可以看到CS-C/M-OP/β-GP组出 现再上皮化现象，而空白对照组和CS-C/β-GP组则伴有广泛的炎性坏死。在第 9天，各种的炎性细胞已经不再明显，成纤维细胞大量增殖，与空白对照组相比， 样品组少量新血管形成，表皮逐渐形成，样品组的表皮厚度明显比对照组的薄，表明样品可以促进创面处表皮的形成，CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/β-GP组 更为明显。第14天，各组均有很多新血管形成，表现出明显的再上皮化，但 CS-C/M-OP/β-GP组组织更致密，成纤维细胞排列更有序，创面愈合更完整。 伤口创面愈合是一个复杂的过程，样品组，特别是CS-C/OP/β-GP和 CS-C/M-OP/β-GP组在伤口愈合过程中表现出良好的促进作用
2.2.5伤口处胶原蛋白含量研究
胶原纤维的沉积及逐渐增加是创伤修复过程中细胞外基质沉积，组织从塑和 成熟的主要标志。Masson染色是对胶原纤维的经典染色，取创面部分组织进行 Masson染色分析，评估不同样品干预治疗后对创伤组织的愈合效果及对创面 组织结构的影响(图18)，其中胶原纤维呈蓝色，肌纤维、细胞质和红细胞呈红 色，同时使用Image-Pro Plus软件计算各组创面真皮层胶原蛋白的含量，用平 均光密度表示(图19)。第5天各组胶原纤维沉积都比非常少，但CS-C/OP/ β-GP和CS-C/M-OP/β-GP组有一定的胶原纤维沉积，与空白对照组相比具有 显著性。第7天，胶原纤维明显增生，胶原蛋白含量测定结果表明，CS-C/β -GP、CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/β-GP组与空白对照组相比，具有极显著 性差异。第14天，各组胶原纤维表达更多，从图18可以看出，CS-C/OP/β-GP 和CS-C/M-OP/β-GP组中的胶原纤维为比空白对照组和CS-C/β-GP排列更 加密集、有序，密度相对均匀。CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/β-GP组的平 均光密度含量基本没有差异，样品组与空白对照组比较，均具有显著性差异。因此，含有多肽的水凝胶CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/β-GP是一种良好创面 修复材料，对创面伤口的愈合具有积极作用。
2.2.6创面组织中VEGF和Ki-67表达的研究
体外细胞实验结果显示CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/β-GP组可以通过 增加细胞迁移来加速伤口愈合过程。为了探索CS-C/OP/β-GP和CS-C/M-OP/ β-GP水凝胶促进小鼠创面伤口愈合的机制，对组织进行免疫组化分析，伤口组 织的Ki-67染色用于研究水凝胶是否促进伤口部位的细胞增殖(图20)。Ki-67 阳性细胞在各种样品中均有表达，在样品组肉芽组织中的表达量较空白对照组 高，与CS-C/β-GP组相比，具有显著性差异(p<0.05)，与CS-C/OP/β-GP 和CS-C/M-OP/β-GP组相比具有极显著性差异(p<0.01)。VEGF的表达水平 可作为新血管生成的依据，在本研究中，VEGF在不同样品处理的创面伤口中 均有表达，如图21，CS-C/OP/β-GP水凝胶组的表达量明显高于对照组，具有 极显著性差异(p<0.01)，CS-C/β-GP与CS-C/M-OP/β-GP与空白对照组具 有显著性差异(p<0.05)，推测水凝胶样品可能通过上调VEGF的表达来促进了 创面伤口的血管生成和组织再生。实验结果表明，应用水凝胶样品组疗效提高， 可通过诱导血管生成，促进细胞增殖和增强伤口部位的胶原蛋白形成来加速伤口 愈合过程，从而促进皮肤组织再生。
实施例2
同实施例1，区别在于，步骤(4)中β-GP溶液的质量分数为10％。
实施例3
同实施例2，区别在于，滴加完10％的β-GP溶液后再滴加等体积的质量分 数为3％的NaHSO3溶液。
实施例4，同实施例1，区别在于，壳聚糖不经过步骤(2)的儿茶酚功能化， 采用1％醋酸溶解直接制备壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶。
效果验证3
对实施例1-4制备的水凝胶进行粘结强度测试，测试方法如下：
取2块洁净猪皮(10mmⅹ15mm)放置水平台面上，中间放置水凝胶(10mm ⅹ10mm)进行粘结，粘结形式见图22，在猪皮与水凝胶接触区域上放置20g砝 码，10min后，采用拉力试验机以10mm/min的速度进行剪切测试，直到两块猪 皮被拉开。每组样品测试3次，取平均值。粘结强度的计算公式为：σ＝P/S， 式中σ为粘结强度，MPa；P为最大拉伸作用力，N；S为水凝胶粘结的面积， mm2。
在生理温度(37℃)下不同组分的成胶情况及粘结强度见表2；
表2
Figure BDA0002563828000000201
Figure BDA0002563828000000211
结果显示，实施例2在低浓度的β-GP溶液中制备而成的温敏凝胶并不具备 极好的温敏性能；而在加入等体积的质量分数为3％的NaHSO3溶液的实施例3 制备的则很好的克服了实施例2所存在的温敏性不佳的技术问题，表明NaHSO3的引入，提高了水凝胶的温敏性，使得该水凝胶在生理温度下只需要较低浓度的 β-GP就可快速凝胶化，克服了所需高浓度β-GP可能导致潜在的毒性。
将实施例3制备的温敏水凝胶按照上述效果验证例1和效果验证例2进行相 同的效果验证实验，结果显示，其性能并不受NaHSO3的加入以及β-GP用量减 少的影响，仍然具有和实施例1制备的水凝胶相同的创伤修复性能。
另外，将实施例4制备的温敏水凝胶按照上述效果验证例1和效果验证例2 进行相同的效果验证实验，结果显示：由于未功能化的水凝胶实施例4粘结性能 差，在动物实验过程中容易从创伤面脱落，产生二次创伤和感染，创伤修复效果 差。由此可见，壳聚糖儿茶酚的功能化，改善了壳聚糖水溶性，简化制备工艺； 同时在一定程度提高了温敏性能，缩短了成胶时间；特别值得一提的是，增强了 水凝胶材料的粘结性能，有利于创伤修复，避免了二次创伤和感染。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范 围之内。

Claims (7)

1.一种儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)儿茶酚功能化壳聚糖的制备
将碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺溶液滴加到壳聚糖溶液/3、4-二羟基苯丙酸溶液中反应，反应完成后，透析，冷冻干燥得儿茶酚功能化壳聚糖；
(2)儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶的制备
取步骤(1)制备的儿茶酚功能化壳聚糖配制儿茶酚功能化壳聚糖溶液，加入牡蛎肽，搅拌条件下再加入β-甘油磷酸钠溶液，得儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶；
所述步骤(2)中的牡蛎肽在加入前制备成壳聚糖/牡蛎肽微球，具体包括以下步骤：
a.将牡蛎肽和壳聚糖溶于乙酸溶液中得牡蛎肽/壳聚糖混合溶液，搅拌条件下逐滴滴入含有乳化剂的液体石蜡中，搅拌；
b.滴入交联剂溶液，搅拌离心，洗涤，冷冻干燥得壳聚糖/牡蛎肽微球；
加入牡蛎肽后，再依次滴入β-甘油磷酸钠溶液和NaHSO3溶液搅拌混合得到所述儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶；
加入NaHSO3溶液的条件下，β-甘油磷酸钠溶液的溶剂为水，质量分数为10％，NaHSO3溶液的质量分数为3％；β-甘油磷酸钠溶液滴加完成后，滴加等体积的NaHSO3溶液；
儿茶酚功能化壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的混合体积比为7∶3或8∶2。
2.根据权利要求1所述的儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：
①将壳聚糖溶于乙酸中配制壳聚糖溶液，将3、4-二羟基苯丙酸溶于水中得到3、4-二羟基苯丙酸溶液；将3、4-二羟基苯丙酸溶液加入到壳聚糖溶液中得到壳聚糖/3、4-二羟基苯丙酸溶液；
②将碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于乙醇水溶液中得到碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液；
③将步骤②制备的碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液滴加到步骤①溶液中反应，反应完成后透析冷冻干燥得到儿茶酚功能化壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，
所述步骤①中，壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为2％，3、4-二羟基苯丙酸溶液中3、4-二羟基苯丙酸的浓度为1mol/L，3、4-二羟基苯丙酸溶液和壳聚糖溶液的混合体积比为1∶10；
步骤②中，碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合摩尔比为1∶1，乙醇水溶液中乙醇和水的体积比为9∶1，溶液中碳二亚胺盐酸盐的浓度为1mol/L；
步骤③中，反应时间10h，反应pH值4.5-5.5，反应完成后在pH为5的盐酸水溶液中透析3天，再在蒸馏水中透析4h，冷冻干燥得儿茶酚功能化壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中：
牡蛎肽的加入量为1g/L；
儿茶酚功能化壳聚糖溶液的溶剂为水，质量分数为2％；
β-甘油磷酸钠溶液滴加完成后，搅拌2min，置于37℃恒温环境中恒温放置，得所述温敏水凝胶。
5.根据权利要求1所述的儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，
所述步骤a中：
所述乙酸溶液中乙酸的质量分数1％；
牡蛎肽/壳聚糖混合溶液中，壳聚糖的质量分数1％，牡蛎肽的加入量0.4-1.4mg/mL；
在800rpm和60℃下将牡蛎肽/壳聚糖混合溶液滴入含有乳化剂的液体石蜡中，搅拌1.5h；所述乳化剂为吐温80和Span-80的混合物，牡蛎肽/壳聚糖混合溶液和液体石蜡的体积比为1∶10；
所述步骤b中：
交联剂溶液的质量分数为25％，交联剂溶液的加入量和液体石蜡的体积比为1∶50，30min滴完，滴完后继续搅拌30min，离心收集，用石油醚和乙醇反复洗涤沉淀物，然后冷冻干燥得所述壳聚糖/牡蛎肽微球；
所述交联剂为戊二醛。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶的制备方法制备的儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶。
7.一种根据权利要求6所述的儿茶酚功能化壳聚糖/牡蛎肽温敏水凝胶在制备创伤修复方面的应用。
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