TWI771840B - 具有可自癒合性的水凝膠及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明透過酚類官能基化之殼聚醣，賦予該殼聚醣具水溶性以及黏附力，並與長鏈狀或微胞型的雙官能交聯劑進行反應，用以製備具有自癒合性、黏附性質、以及長降解時間的自癒合水凝膠。

Description

具有可自癒合性的水凝膠及其用途

本發明係關於一種具有自癒合性的水凝膠及其用途，特別係關於一種以酚類官能基化的殼聚糖與雙官能之交聯劑所組成之具有自癒合性的水凝膠，以及其用於生物三維列印、細胞培養基質、藥物載體、及生物膠的用途。

水凝膠(hydrogel)是高含水量的三維聚合物網絡，並且因為具有與生物軟組織類似的機械性質而有生物相容性，其中智能型水凝膠能順應諸如壓力、溫度、pH值、電場及磁場的變化或其他刺激給出反應，例如光敏感性水凝膠可以快速且高度精確的方式形成可調節的交聯結構，而適合用於生醫工程領域，包括傷口修復、微創手術、及三維列印。

構成水凝膠的聚合物依據來源可分為天然或合成聚合物。天然聚合物包括膠原蛋白、纖維蛋白(fibrin)、殼聚醣(chitosan)、及明膠(gelatin)；合成聚合物包括聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚己內酯(polycaprolactone，PCL)、聚乳酸(polylactide，PLA)、及聚胺酯(polyurethane，PU)等。天然聚合物之水凝膠具有優異的生物相容性，但機械強度與結構穩定性差。

其中殼聚醣具有止血及抗菌的特性，因此被廣泛用於生物醫學領域，然而，殼聚醣在水中溶解度有限，使得對其進一步應用構成了挑戰。以殼聚醣製備之自癒合水凝膠的降解時間約在數日至1週內，因過短的降解時間導致其在長期細胞培養中的應用受到限制，且多數高含水量(>95wt%)之殼聚醣水凝膠的凝膠時間約在10至60分鐘的範圍內，無法提供良好的組織黏附與止血材料的性質，因此降低其在組織工程中的可利用性。

目前已知可用於三維列印的水凝膠大多是熱敏感性及光敏感性水凝膠，但此類水凝膠鮮少具有自癒合力，且直接將目前具有自癒合性水凝膠用於三維列印則會產生低解析度及無法堆疊等問題，自癒合水凝膠若要進一步 用於三維列印，就需要有穩定的模量(modulus)才能確保列印的機能與列印後交聯的不可逆性，以能抑制自癒合並固定列印之結構。動態亞胺鍵(Dynamic imine bond)已被用於自癒合水凝膠的應用，然而此種自癒合型水凝膠仍因長期模量增加與結構易塌陷，而難以有效的應用於三維列印。

再者，當需要以更大的尺寸及更複雜的結構來構建結構時，習知的水凝膠用於三維列印通常皆會受到限制，因為水凝膠製成的結構在典型的添加劑層之製造過程中難以維持設計的結構。為了增加三維列印的實用性，非常需要開發新的水凝膠生物墨水及列印技術。

綜上所述，為了製備兼具結構穩定性、高生物相容性、高黏附性、且降解時間長之具有自癒合性生物膠以應用於生醫領域，特別是用於生物三維列印之應用，實有其必要。

緣此，本發明之一目的在提供一種具有自我癒合性的水凝膠，包含一酚類官能化殼聚醣(phenol-functionalized chitosan,Chi-Ph)、及一交聯劑。

在本發明之一實施例中，該交聯劑包含一雙苯醛基。

在本發明之一實施例中，該交聯劑係為雙官能聚乙二醇(difunctional polyethylene glycol)、雙官能多元醇(difunctional Pluronic,DF-PF)、或雙官能聚胺酯(difunctional polyurethane,DF-PU)。

本發明之又一目的在提供一種如前所述之具有自我癒合性的水凝膠用於三維列印的用途。

在本發明之一實施例中，該具有自我癒合性的水凝膠在三維列印後，係以光交聯進行固定。

在本發明之一實施例中，該光交聯係以可見光進行。

在本發明另一實施例中，該具有自我癒合性的水凝膠於三維列印後產生之複數個構建物，該複數個構建物進一步相互黏著組裝成一模塊化構建物，再以二次光交聯進行該模塊化構建物的固定。

本發明之又一目的在提供一種如前所述之具有自我癒合性的水凝膠用於製備一生物膠的用途。

本發明之又一目的在提供一種如前所述之具有自我癒合性的水凝膠用於製備一快速凝膠及長降解時間之水凝膠的用途。

在本發明另一實施例中，該水凝膠的凝膠時間係為2-3分及/或該水凝膠的降解時間係大於1週。

本發明之另一目的在提供一種如前所述之具有自我癒合性的水凝膠用於製備一細胞培養基質及/或一藥物載體的用途。

本發明透過酚官能基化之殼聚醣，以賦予該殼聚醣具水溶性以及黏附力，並與長鏈狀或微胞型的交聯劑進行反應，用以製備具有自癒合性、黏附性質、以及長降解時間的自癒合水凝膠。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1A顯示本發明之酚類官能化殼聚醣的合成式。

圖1B顯示本發明之酚類官能化殼聚醣的¹H NMR質譜圖。

圖1C顯示本發明之酚類官能化殼聚醣的UV-Vis光譜圖。

圖1D顯示本發明之酚類官能化殼聚醣的UV-Vis光譜圖。

圖1E顯示本發明之酚類官能化殼聚醣的酚取代度結果圖。

圖1F顯示本發明之酚類官能化殼聚醣的DTG曲線。

圖1G顯示本發明之酚類官能化殼聚醣的溶解狀態。

圖2A顯示本發明之CPF水凝膠結構示意圖。

圖2B顯示本發明之酚類官能化殼聚醣及雙官能多元醇F127的合成式。

圖3A顯示本發明之交聯劑雙官能多元醇F127於溶液中的自組裝形態。

圖3B顯示本發明之交聯劑雙官能多元醇F127的DLS結果圖。

圖3C顯示本發明之交聯劑雙官能多元醇F127的相干SAXS曲線圖。

圖4A顯示本發明之CPDP水凝膠的可注射性。

圖4B顯示本發明之CPDP水凝膠的自我癒合及自適應過程。

圖4C顯示本發明之CPDP水凝膠的G'及G"隨著凝膠時間的變化圖。

圖4D顯示本發明之CPDP水凝膠的在1-1000%的動態應變範圍內的模量變化圖。

圖4E顯示本發明之CPDP水凝膠的在連續應變誘導的損傷修復循環測試中的模量變化圖。

圖4F顯示本發明之CPDP水凝膠的膠凝過程之電腦分子模擬圖。

圖4G顯示本發明之CPDP水凝膠的Chi-Ph與DF-PEG之相互作用的作用能。

圖5A顯示本發明之CPDP水凝膠添加光起始劑並進行光交聯後的結構示意圖。

圖5B顯示本發明之CPDP水凝膠在經光交聯的結構穩定性。

圖5C顯示本發明之CPDP水凝膠在經光交聯後仍保留自癒合性。

圖5D顯示本發明之CPDP水凝膠在原位暴露於藍光下的流變行為。

圖5E顯示人類間質幹細胞嵌入本發明之CPDP水凝膠或經光交聯本發明之CPDP水凝膠的狀態。

圖6A顯示本發明之CPDP水凝膠可以進行三維列印之組裝模塊化。

圖6B顯示本發明之CPDP水凝膠可以進行生物三維列印。

圖7顯示本發明之CPF水凝膠的FTIR光譜圖。

圖8A顯示本發明之CPF水凝膠的G'及G"的變化圖。

圖8B顯示本發明之CPF水凝膠在交替的1%及300%動態應變下損傷修復的結果。

圖8C顯示本發明之CPF水凝膠的G'值隨溫度的變化圖。

圖8D顯示本發明之CPF水凝膠具有可注射性以及自癒合性。

圖9顯示本發明之CPF-、CPF、及CPF+水凝膠的流變性質。

圖10A顯示本發明之CPF水凝膠成兩劑膠的示意圖。

圖10B顯示本發明之CPF水凝膠在界面之間之結合強度測試方法的示意圖。

圖10C顯示本發明之CPF水凝膠在兩塊玻璃或人造皮膚之間的結合強度。

圖10D顯示透過注射器(22G、413μm)將預凝的水凝膠注入另一個支持水凝膠(30wt%的Pluronic F127)中，並用於書寫字母的狀態圖。

圖11A顯示嵌入本發明之CPF水凝膠中之人類間質幹細胞的明場相差圖像。

圖11B顯示嵌入本發明之CPF水凝膠中之人類間質幹細胞於顯微鏡下的圖像。

圖11C顯示嵌入本發明之CPF水凝膠之人類間質幹細胞的生存力及三維分佈。

圖11D顯示嵌入本發明之CPF水凝膠之人類間質幹細胞3小時後的活/死數量統計。

圖11E顯示嵌入本發明之CPF水凝膠之人類間質幹細胞在CPF或CS水凝膠中的增殖。

本發明提供一種透過酚官能基化之殼聚醣，以賦予該殼聚醣具水溶性以及黏附力，並與長鏈狀或微胞型的交聯劑進行反應，用以製備具有自癒合性、黏附性質、以及長降解時間的自癒合水凝膠。

定義

在本文中，所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

在本文中，用詞「Chi-Ph」係表示酚類官能化殼聚醣(phenol-functionalized chitosan)；用詞「DF-PEG」係表示雙官能聚乙二醇(difunctional polyethylene glycol)，該雙官能聚乙二醇係為二苯甲醛封端的遠螯聚乙二醇(Dibenzaldehyde-terminated telechelic poly(ethylene glycol)；用詞「DF-PF」係表示雙官能多元醇F127(difunctional pluronic)；用詞「DF-PU」係表示雙官能聚胺酯(difunctional polyurethane)。

在本文中，用詞「酚類官能化」係表示經單元酚官能基、二元酚官能基、多元酚官能基、及/或其任意組成之群組的其中之一者官能化的一化合物；舉例來說，可以係表示經鄰苯二酚(又稱兒茶酚)官能化的殼聚醣、或是經4-(2-乙胺基)苯-1,2-二酚(又稱多巴胺)官能化的殼聚醣。

在本文中，用詞「雙官能」或「Difunctional」可以係指所述之化合物含有雙醛基、或雙苯醛基，例如雙官能聚乙二醇可以係指含有雙苯醛基的聚乙二醇。

材料及方法 使用原料

殼聚醣(Chitosan，100kDa~190kDa，脫乙醯度：75%至85%)係購自冰島Sigma公司、乙二醇殼聚醣(Glycol chitosan簡稱GC，410kDa，脫乙醯度：78.2%)係購自日本Wako公司、鹽酸(HCl，35wt%)係購自日本Showa公司、4-嗎啉乙烷磺酸(4-morpholine ethane sulfonic acid簡稱MES)係購自美國Sigma公司、3-(4-羥苯基)丙酸(3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid)係購自英國Alfa Aesar公司、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)係購自英國Alfa Aesar公司、N-羥基琥珀醯亞胺 (N-hydroxysuccinimide)係購自日本Sigma、氫氧化鈉(Sodium hydroxide)係購自美國Sigma、Pluronic F127係購自美國Sigma、4-甲醯基苯甲酸(4-formylbenzoic acid)係購自中國Sigma、N,N'-二異丙基碳二亞胺(N,N'-diisopropylcarbodiimide)係購自中國Sigma、4-(二甲基胺基)吡啶(4-(dimethylamino)pyridine，簡稱DMAP)係購自美國Sigma、N,N'-二環己基碳二亞胺(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide，簡稱DCC)係購自中國Sigma、二甲醚及乙醚(購自台灣Echo公司)則係直接使用、蒸餾去離子水(distilled deionized water簡稱DDW，電阻率=18.2MΩcm)係由去離子水機(TKA，購自匈牙利GenPure公司)供應、四氫呋喃(Tetrahydrofuran簡稱THF，購自台灣Echo公司)係透過無水系統(英國LC Technology Solutions公司)進行純化，以將水含量降至20ppm以下。

幹細胞的培養、活力測試及增殖

在本發明之實施例中，係使用人類間質幹細胞(MSCs)來進行幹細胞培養測試，其中該人類間質幹細胞可以係誘導自多能幹細胞，也可以係為商業所購得。Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM-LG)，含1g L^-1葡萄糖，3.7g L^-1碳酸氫鈉(NaHCO₃；美國西格瑪)，1%青黴素-鏈黴素(美國Gibco)，1%L-谷氨醯胺(Gibco)(美國)和10%的胎牛血清(FBS；美國Caisson實驗室)用於培養MSC。將細胞保持在37℃的5%CO₂恆溫箱中，每週刷新培養基3次。對於三維細胞培養，在24孔組織培養板上製備了MSC負載(2.5×10⁶細胞/mL)的水凝膠(0.2mL)。此後，將MSC包封的水凝膠浸入培養基中，並在37℃下在含有5%CO₂的濕潤環境中溫育。

活/死細胞成像分析使用活/死細胞活力試劑盒(鈣素AM和乙二胺均二聚體-1，Invitrogen，美國)進行。載有MSC的CPF和CS水凝膠是在Lab-Tek 4孔室蓋玻片(Thermo Scientific Nunc，美國)製成的，細胞密度為2.5×10⁶細胞/mL。培養3小時後，將水凝膠用TBS緩衝液洗滌3次。分別用鈣黃綠素AM與乙錠均二聚體1對活和死的MSC進行染色。樣品在488及514nm處激發，並透過共聚焦激光掃描顯微鏡(Leica TCS SP5，德國)觀察。分別在610-750nm與510-550nm範圍內收集了綠色與紅色螢光。用於掃描的樣品厚度為100μm，並且總共收集了20張紙，即每張紙5μm。

透過明視野/螢光圖像追踪細胞形態14天。對於螢光圖像，在嵌入水凝膠之前，先用Cell Linker Kit(PKH26，紅色螢光)對MSC進行染色。此後，透過細胞計數試劑盒8測定法(CCK-8，Sigma-Aldrich，Japan)評估細胞增殖。MSC封裝的水凝膠在37℃的含5%CO₂的潮濕環境中孵育。培養3小時(0天)、1天、3天、7天、及14天後，在每個孔中將培養基替換為200μLCCK-8溶液，並將24孔板孵育1小時。之後，將反應的CCK-8溶液轉移到96孔板中，並透過SpectraMax M5板讀數器(Molecular Devices，USA)在450nm的波長處吸收。

統計分析

所有的實驗樣品皆獨立製備三次，且所有實驗皆獨立重複進行至少三次以驗證其再現性。各實驗組之間在統計學上的差異係使用市售統計軟體GraphPad Prism 4及Student't檢驗進行與決定。實驗數據皆表示為平均值±標準偏差(S.D.)，其中數據的p值小於0.05，則視為二組間具有統計學上的顯著差異，並以*標記。

實施例1 酚類官能化殼聚醣(phenol-functionalized chitosan,Chi-Ph)的製備及特性分析

首先，將500.0mg的殼聚醣(50-190kDa)溶解於20mL的鹽酸(0.25N)中，再將25mL的MES緩衝溶液(pH 4.5，100mM)加入至該殼聚醣溶液中，並用1N的氫氧化鈉將pH調節至4.5，接著將249.3mg的3-(4-羥苯基)丙酸溶解在400mL的MES緩衝溶液(pH 4.5，50mM)中，再依次將287.5mg的EDC及173.0mg的NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)添加到該3-(4-羥苯基)丙酸溶液中，隨後將該殼聚醣溶液加入至該混合物中，並在室溫攪拌下，於黑暗中進行反應24小時。接著在劇烈攪拌下，使用透析膜(MWCO 12~14kDa，購自美國Cellu Sep公司)對合成的產物用水進行透析，再透過冷凍乾燥獲得本發明之Chi-Ph的固體產物。

本發明之Chi-Ph是透過將3-(4-羥苯基)丙酸以碳二亞胺化學法(carbodiimide chemistry)耦合在殼聚醣上製備而成的(如圖1A所示)。首先使用NMR光譜儀(AVIII-500MHz FT-NMR，Bruker，美國)來分析該Chi-Ph之特性，其係將本發明之Chi-Ph以10mg/mL的濃度，溶解於氧化氘(D2O，購自美國Sigma-Aldrich公司)溶液中，以進行NMR光譜的測量；結果如圖1B之¹H NMR的 質譜圖所示，其中在6.8及7.1ppm位置處出現高峰，而由此可以證實酚官能基係有效地共軛在本發明之Chi-Ph。

另外，亦使用UV-Vis光譜儀(SpectraMax M5，Molecular Devices，美國)來分析本發明之Chi-Ph的特性，在200nm至600nm的波長下掃描本發明之Chi-Ph溶液(溶於水中濃度為1mg/mL)、以及殼聚醣溶液(溶於0.005N鹽酸中濃度為1mg/mL)，於該UV-Vis光譜中，本發明之Chi-Ph在275nm處顯示出有吸收峰，而在殼聚醣中則未檢測到該吸收峰值(如圖1C所示)，顯示該275nm的吸收峰值係歸因於本發明之Chi-Ph上的酚官能基。且透過¹H NMR及UV-Vis光譜的測定，可以得知以上述方法製備的本發明之Chi-Ph上，酚在殼聚醣骨架的取代度約為5%。

本發明之Chi-Ph中的酚取代度可以調整為例如將200.0mg的殼聚醣溶解於2.0mL的鹽酸(1N)中，再將6.0mL的MES緩衝溶液(100mM)加入至該殼聚醣溶液中，接著將99.7mg的3-(4-羥苯基)丙酸溶解在96mL的MES緩衝溶液(50mM)中，再將69.2mg的NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)溶解在2mL MES溶液中，將上述溶液混合均勻後以上述方式攪拌、透析、及冷凍乾燥，則能夠獲得芬取代度約為3.5%的本發明之Chi-Ph，其酚取代度的結果如圖1D所示，顯示其在275nm處觀察到強吸收峰，並經內插法估計Chi-Ph的酚取代度約為3.5%，如圖1E所示。其中，藉由調整本發明之Chi-Ph的酚取代度，能夠調整該Chi-Ph的水溶性，而能夠應用於調節水凝膠的黏著力、凝膠時間、降解時間等等性質。

再者，將以上述經調整之方法製備的本發明之Chi-Ph及殼聚醣的熱重分析(thermogravimetric analysis,TGA)數據以微分曲線(differential curves,DTG曲線)顯示在圖1F中，該熱重分析係使用TGA分析儀(Q50，TA Instrument，美國)在100至800℃的升溫範圍下，以10℃/min的升溫速率進行，其中可以得知殼聚醣在~270℃時會發生顯著的熱分解，而在經酚修飾後，其熱分解的峰值會移至~217℃，此結果指出本發明之Chi-Ph會在較低的溫度下熱分解，顯示酚官能基能夠降低原始殼聚醣鏈的分子間及分子內相互作用。最後，如圖1G所示，本發明之Chi-Ph能夠以20mg/mL的濃度，溶解於Tris緩衝食鹽水(TBS，pH 7.4)中，且沒有任何的沉澱，相對於此，殼聚醣在相同情況下是不溶於水的，此結果顯示酚官能基的共軛，能夠使得本發明之Chi-Ph在中性pH下具有水溶性。其中本發明之酚類官能化的殼聚醣，可能係因為胺基被酚基部分取代，而破壞分 子-分子間的氫鍵並降低殼聚醣的結晶度，從而導致在中性pH值下於水及緩衝液中具有高溶解度。

實施例2 含有雙醛基之雙官能交聯劑的製備與特性分析 2-1 雙官能聚乙二醇(Difunctional polyethylene glycol,DF-PEG)的製備

在本發明之實施例中，DF-PEG是將PEG及4-甲醯基苯甲酸以~85%的苯甲醛取代而進行酯化來合成的。首先，將2.0g的聚乙二醇(PEG，平均分子量為8kDa，購自美國Sigma-Aldrich)溶解在100mL的無水四氫呋喃中，接著將375.0mg的4-甲醯基苯甲酸、170.0mg的4-(二甲基胺基)吡啶、及1.0g的N,N'-二環己基碳二亞胺，依次加入到該四氫呋喃溶液中，並在室溫下進行反應48小時後，藉由過濾除去白色的沉澱物，並在乙醚中沉澱與在四氫呋喃中溶解反覆三次後，則能夠從溶液中獲得白色固體狀的DF-PEG，其包含有雙苯醛基。

2-2 雙官能多元醇F127(difunctional pluronic,DF-PF)的製備

在本發明之實施例中，係透過Steglich酯化反應來合成本發明之DF-PF，如圖2所示；其中，係將0.24g之1.6mmol的4-甲醯基苯甲酸、0.025g之0.2mmol的4-(二甲氨基)吡啶、0.4g之3.2mmol的N,N'-二環己基碳二亞胺、及2g之0.16mmol的多元醇Pluronic F127依次加入100mL的無水四氫呋喃溶液中，並室溫攪拌48小時進行反應，接著透過在300mL的乙醚中沉澱與在100mL的四氫呋喃中溶解反覆進行至少三次來分離及純化本發明之DF-PF產物，其包含有雙苯醛基。

2-3 雙官能聚胺酯(difunctional polyurethane,DF-PU)的製備

首先，將聚己內酯二元醇(polycaprolactone diol,PCL diol)及聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇(polyethylene butylene adipate diol,PEBA diol)(或僅有PCL diol)加入四頸反應瓶內，調至75~80℃之預聚合溫度，然後以一介於150~180rpm的機械攪拌速度混合均勻，使聚己內酯二元醇呈現均相液體。在本發明的另一實施例中，聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇亦可以聚左旋乳酸二元醇(poly(L-lactide)(PLLA)diol)或聚(D,L-乳酸)二元醇(poly(D,L-lactide)(PDLLA)diol)取代。接著，加入催化劑二辛酸亞錫及異佛爾酮二異氰酸鹽(isophorone diisocyanate,IPDI)，俾以對聚己內酯二元醇進行催化反應3小時。之後，加入二 羥甲基丙酸(dimethylol propionic acid,DMPA)及丁酮(butanone)至反應瓶內並反應1小時，接而降溫至50℃並加入三乙基胺(trimethylamine,TEA)以進行中和反應0.5小時。反應完全後，降溫至45℃，然後以提高轉速至1100rpm的攪拌速度進行攪拌，且迅速加入二次蒸餾水，待水分散後，加入以水稀釋之第一鏈延長劑乙二胺(ethylene diamine,EDA)並反應1小時，得到聚胺酯奈米粒子(polyurethane nanoparticle,PU NP)，接而加入以水稀釋之乙二醛(glyoxal)並反應0.5小時，得到本發明之DF-PU產物。

2-4 含有雙醛基之雙官能交聯劑的特性分析

本發明之含有雙苯醛基交聯劑的DF-PEG及DF-PF各自顯示出透過NMR光譜計算的~80%及~90%的取代度(結果未顯示)；另外，使用NMR光譜儀之¹H NMR來分析本發明之DF-PF的特性，尤其是確認鏈末端苯甲醛基團的取代狀態；其中雙官能基團的比例係透過NMR積分進行計算。並透過透射電子顯微鏡(TEM，Hitachi H-7100，日本)觀察本發明之DF-PF溶液中膠束的形態，其中係使用蒸餾水將本發明之DF-PF溶液稀釋至10000ppm，並滴落在銅網上1分鐘後以濾紙除去多餘的該DF-PF溶液後，將磷鎢酸滴在該銅板上30秒後除去以進行測量。再者，透過光散射光譜儀(LS光譜儀，LS Instruments，瑞士)來測定2.5wt%本發明之DF-PF溶液中膠束的流體力學半徑(hydrodynamic radius,R_h)，其中樣品架是外徑為5mm且壁厚為0.4mm的圓柱形玻璃比色杯，而樣品的溫度則係在溫控浴中進行調節。

透過TEM、DLS、及相干SAXS分析來評估溶液中本發明之DF-PF的膠束大小與形態。如圖3A中所示的TEM圖像顯示球形膠束的半徑約為10±5nm，其中比例尺表示200nm，如圖3B中所示的DLS結果證實溫度相關的流體動力學半徑(Rh)，發現在25℃、28℃、31℃、34℃、及37℃的溫度下，膠束的Rh分別為9.8±2.1nm、11.2±0.9nm、11.8±0.6nm、12.8±0.7nm、及12.5±0.4nm，如圖3C中所示的相干SAXS曲線顯示在25℃時，該2.5wt%的DF-PF溶液在q~0.02Å^-1處有一個小的凸起，而當溫度升高到37℃時，該凸起會變得更加明顯，此外，在q~0.06Å^-1處還出現另一個小凸起，此曲線的變化表明該DF-PF膠束在37℃時具有較大的球形形狀因子，顯示單個膠束的數量增加或膠束的尺寸變得更均勻。

當濃度高於臨界膠束濃度時，Pluronic F127會形成半徑為7-12nm的均勻膠束，然而可以經由功能化，使該膠束的大小或形態發生變化。在本發明中，苯甲醛封端的Pluronic膠束(即本發明之DF-PF)具有增加的Rh(約9.5nm)，並且保持球形形態，同時隨著溫度從25℃升高到37℃，DF-PF膠束的Rh從9.5nm增加到13nm，此些結果證實經功能化修飾之本發明DF-PF具有熱響應性。

透過膠體滲透層析儀(gel permeation chromatography,GPC)及動態光散射儀(dynamic light scattering,DLS)在25℃下測定本發明之DF-PU的性質，包括數目平均分子量(Mn,10⁵Da)、重量平均分子量(Mw,10⁵Da)、聚合度分佈性(polydispersity,PDI)(Mw/Mn)、界達電位(zeta potential)(mV)及流體動力直徑(nm)。另外，PU被使用作為比較組並進行相同測定。結果顯示於下表1。由表1可見，PU經過改質形成本發明之DF-PU，且可形成穩定分散的懸浮液而不沉澱(可由界達電位看出)，其他資訊則是表示改質前後的基本資訊。在本發明的另一實施例中，本發明之DF-PU中的聚胺酯奈米粒子具有一介於10至50nm的粒徑。

實施例3 CPDP水凝膠的製備以及特性分析與應用

本發明之一實施例係以Chi-Ph為主鏈及含有雙醛基交聯劑為DF-PEG來製備本發明之具有自我癒合性的CPDP水凝膠(Chi-Ph及DF-PEG)，其中該CPDP水凝膠具有可注射性以及自我癒合性。

3-1 CPDP水凝膠的製備

首先，將Chi-Ph及DF-PEG分別溶於pH 7.4的Tris緩衝生理食鹽水(Tris-buffered saline,TBS)中，並且將2%的該Chi-Ph溶液、及2%的該DF-PEG溶液 以1：1的體積比例混合，以製備本發明之CPDP水凝膠。且在本發明之一些實施例中，該水凝膠係使用水性染料染成藍色以進行觀察。

為了製備可光交聯的CPDP水凝膠，將六水合三(2,2'-聯吡啶基)二氯釕(II)(tris(2,2’-bipyridyl)dichlororuthenium(II)hexahydrate,Ru(bpy)₃Cl₂，購自美國Sigma-Aldrich公司)及過硫酸鈉(sodium persulphate,Na₂S₂O₈，購自德國Sigma-Aldrich公司)添加到濃度分別為0.6mM及6mM的2%DF-PEG溶液中以作為光起始劑，將此種DF-PEG溶液與2%的Chi-Ph溶液以等體積混合後，即可以形成可光交聯的水凝膠；其中，將該可光交聯的水凝膠在藍色發光二極管(blue light-emitting diode即LED，440-460nm，7W，Vitalux，台灣)下距離5cmt持續照射60秒，來進行該水凝膠的光交聯反應。

3-2 CPDP水凝膠的特性分析 1.CPDP水凝膠具有自我癒合性(self-healing)及自適應性(self-adapting)

為初步測試本發明之CPDP水凝膠是否能夠作為生物墨水，並用於生物三維列印，首先瞭解該CPDP水凝膠之可注射性以及自我癒合性；其中，本發明之CPDP水凝膠可以便利地預先形成在1mL注射器中，並透過26號注射器針頭手動注入以形成連續的細長絲狀，如圖4A所示，此結果顯示本發明之CPDP水凝膠具有用於印刷的潛力。

再者，本發明之CPDP水凝膠的自我癒合及自適應過程如圖4B所示；其中，如圖4B之i所示，先將無色及藍色的CPDP水凝膠分別製備在注射器中，並透過26號針頭擠出到一心形模具中，經過10分鐘後，如圖4B之ii所示，可以用刮鏟拾取該無色部分及該藍色部分所集成的水凝膠，且再經過6小時後，如圖4B之iii所示，該水凝膠會變得更加地光滑，並且具有均勻的外觀，隨後如圖4B之iv所示將該水凝膠切成小碎片，並將該些碎片裝入星形的模具中進行重新塑形，如圖4B之v所示，該些水凝膠碎片會在10分鐘內變成星形，且經過6小時後，如圖4B之vi所示，該些水凝膠的小碎片會完全恢復成塊狀水凝膠的特性，顯示該水凝膠能夠在損壞後被反覆的重新塑造成不同的形狀。此結果表示本發明之CPDP水凝膠同時具有自我癒合及自我適應的特性。

2.CPDP水凝膠具有快速凝膠的特性及獨特的流變性質(Rheological properties)

為進一步評估本發明之CPDP水凝膠的流變性質，使用具有平行板幾何形狀(parallel plate geometry)的流變儀(HR-2，TA Instruments，美國)進行測量，其上板直徑為20mm，設定溫度為25℃。首先，將剛製備好的CPDP水凝膠立即添加到珀耳帖板上，並將環境溫度控制在25℃，當水凝膠之溫度達到25℃後，先進行隨時間變化的分析，即在0.1Hz頻率及1%動態應變下測量該CPDP水凝膠的儲存模量(storage modulus，G')與損耗模量(loss modulus，G")。接著，在0.1Hz頻率下，於1%至1000%之動態應變幅度範圍內，觀察該CPDP水凝膠之剪切應變所引起的模量變化。

再者，為了評估該CPDP水凝膠的流變性質對其自癒合性的影響，透過觀察該CPDP水凝膠在交替的高應變及低應變下的損傷癒合循環來進行，而在每個階段中，會以0.1Hz的頻率分別在1%及500%的動態應變下進行連續步進應變測量(Continuous step strain measurement)共120秒。另外，為進一步瞭解可見光交聯對本發明之CPDP水凝膠之流變性質的影響，使用光導附件及水銀燈(320-500nm，~50mW/cm²，Omnicure S2000，購自加拿大Exfo公司)，在0.1Hz頻率及1%動態應變下，透過通過時間掃描實驗，原位測量該CPDP水凝膠在曝光後的流變特性，其中係在1200秒的膠凝時間之後再施加可見光照射共60秒。

本發明之CPDP水凝膠的儲能剪切模量及損失剪切模量隨著膠凝時間的變化如圖4C所示，其中該CPDP水凝膠在短時間內(~50秒)即可達到凝膠點(G'與G'的交集點)。而在初始膠凝階段急劇增加後，G'在膠凝時間3600秒後回持續的約略增加直到514.36±18.79Pa(n=4)；而本發明之CPDP水凝膠在1%至1000%的動態應變範圍內由剪切應變所引起的模量變化如圖4D所示，其中該CPDP水凝膠在1%至290%的應變中表現出應變硬化的現象，而當應變超過290%時，模量會突然降低，且此後該CPDP水凝膠會表現出具可撓性的現象，並在較高的應變(>570%)下變成溶膠狀(G'<G')，而該CPDP水凝膠在360%至550%的大應變範圍內卻會表現得接近於臨界凝膠(G'>G'，tan δ接近1)。

因此，具有苯酚類官能化之本發明CPDP水凝膠能夠迅速地達到凝膠點及平衡模量，並在廣泛的剪切應變下表現得像臨界凝膠，而相比之下，以1%乙二醇殼聚醣(glycol chitosan)及1%DF-PEG製備而成之習知慣用的GCDP水凝膠作為對照組，其具有更長的膠凝時間(~500s)、更低的G'值(3600秒後為~360Pa)與明確的破壞應變(~390%)，以及在延長之膠凝期間持續增加的G'值 (結果未顯示)。另外，本發明之CPDP水凝膠在連續應變誘導的損傷修復循環測試中，如圖4E所示，於交替的1%及500%應變下會顯示出可逆的凝膠-溶膠-凝膠轉變，且在該測試中，本發明之CPDP水凝膠在較高應變(500%)時會成為臨界凝膠(易於流動)，並在較低應變(1%)時立即恢復到初始凝膠狀態(G'>G')，顯示本發明之CPDP水凝膠具有自我癒合性。

3.CPDP水凝膠的原子層面分析

為了探討酚官能基化如何導致本發明之CPDP水凝膠具有快速膠凝及獨特的流變性質，構建原子模型來研究本發明之CPDP水凝膠的膠凝過程。其中，該原子模型係使用Material Studio Amorphous Cell建立聚合物鏈的原子模型，在該模型中，建立具有20聚合度及5%酚取代的Chi-Ph鏈、聚合度為20且乙二醇被100%取代的乙二醇殼聚醣鏈、以及具有12聚合度及100%苯甲醛末端取代的DF-PEG鏈以進行計算，並建立了本發明之CPDP水凝膠以及作為對照組之GPDP水凝膠的原子模型。其中，為了建立本發明之CPDP水凝膠的原子模型，在包含水分子的矩形模擬箱中以等重量且總固含量為3wt.%的方式，隨機生成Chi-Ph與DF-PEG鏈，並使用該方法同樣建立了由乙二醇殼聚醣鏈、DF-PEG鏈、及水分子組成的GCDP水凝膠模型作為對照組。該些原子模型在300K下運行15ns，且原子模型中的相互作用係透過固定價力場(consistent valence force field,CVFF)計算。

在所模擬之膠凝過程中，如圖4F所示，可以看到Chi-Ph的酚官能基團、及DF-PEG的苯甲醛官能基團之重疊結構；其中，該重疊現象可能係透過π-π的重疊作用來縮短酚類官能化殼聚醣與DF-PEG之間的距離而得以促進交聯反應。而在凝膠化過程中，本發明之CPDP水凝膠(來自酚類官能化殼聚醣與DF-PEG的相互作用)及習知慣用之GCDP水凝膠(來自乙二醇殼聚醣與DF-PEG的相互作用)的相互作用能如圖4G所示，其中在本發明之CPDP水凝膠中的相互作用能中顯示從初始時期即開始迅速下降的趨勢，接著在建模10ns後出現相對穩定的時期。

同時，與本發明之CPDP水凝膠相比，GCDP水凝膠的相互作用能具有較小的負值及較慢的下降速率；其中，負的相互作用能越強，表示本發明之CPDP水凝膠或GCDP水凝膠當中分子間的吸引力越高。本發明之CPDP水凝膠 中酚及苯甲醛之間的相互作用能在初始膠凝階段迅速增加到總相互作用能值的10%，接著會下降並穩定到總相互作用能值的4%左右(結果未顯示)。

該些數據結果顯示本發明之CPDP水凝膠中，酚-苯甲醛的相互作用會加速分子間的吸引力，特別是在初始膠凝階段，因而得以實現快速之膠凝速率。同時，雖然基於殼聚醣主鏈上的胺與DF-PEG上的苯甲醛之間的動態亞胺鍵，來製備本發明之CPDP及習知慣用的GCDP水凝膠，但是僅有本發明之CPDP水凝膠能夠在廣範圍之應變中表現為臨界凝膠，並在反覆破壞後仍保持自癒合性，此些結果表示獨特的酚-苯甲醛相互作用與動態亞胺鍵相互配合，能夠改善本發明之CPDP水凝膠的性能。

4.CPDP水凝膠可以進行二次光交聯

為測試本發明之CPDP水凝膠的可光交聯性，尤其係以二次可見光交聯性，並以此增強本發明之CPDP水凝膠的結構穩定性，如圖5A所示，在存在有六水合三(2,2'-聯吡啶基)二氯釕(II)(tris(2,2’-bipyridyl)dichlororuthenium(II)hexahydrate,Ru(bpy)₃Cl₂)及過硫酸鈉(sodium persulphate,Na₂S₂O₈)的情況下，於藍光(~450nm)下照射，可以形成酚類官能化殼聚醣鏈之間的酚-酚鍵結。經光交聯之本發明CPDP水凝膠與未經光交聯之本發明CPDP水凝膠的結構穩定性如圖5B所示，其中先將具有不同濃度之光促進劑的水凝膠製成圓柱形，並用藍光照射60秒後，隨著時間進展，未經光交聯的該CPDP水凝膠在玻璃表面會迅速擴散使得圓柱的高度顯著降低，而經光交聯的該CPDP水凝膠(CPDP’)在24小時內良好得維持了該圓柱結構，且隨著光促進劑的濃度增加，結構的穩定性也會增加，但是當該CPDP水凝膠中六水合三(2,2'-聯吡啶基)二氯釕(II)含量超過0.3mM且過硫酸鈉含量超過3mM時，則會發生溶脹現象。因此，在以下光交聯的測試中，主要係使用0.3mM六水合三(2,2'-聯吡啶基)二氯釕(II)及3mM過硫酸鈉的光促進劑。

經光交聯後的本發明CPDP水凝膠仍保留自癒合性之結果如圖5C所示，其中將該圓柱形的經光交聯的該CPDP水凝膠切成四個類似的片狀，儘管有明顯的切口痕跡，但將該些水凝膠碎片的界面接觸10分鐘後，仍可以拾取已修復成一體化之水凝膠，且再經過6小時後，所回收之該水凝膠已沒有明顯的切口痕跡。而可交聯之本發明CPDP水凝膠在原位暴露於藍光下的流變行為的結果 如圖5D所示，其中使用光導附件及水銀燈(320-500nm，~50mW/cm²)進行60秒的光照射後，當含有0.3mM六水合三(2,2'-聯吡啶基)二氯釕(II)及3mM過硫酸鈉的本發明CPDP水凝膠暴露於光下時，光交聯會迅速地發生，並導致G'值在60秒內立即顯著增加至約1.6倍，且伴隨著G"的急劇增加，而在60秒之後，G'會出現輕微的下降，接著再逐漸增加，而G"則會立即急劇下降，接著再出現短暫的平穩並逐漸增加。而在曝光的前20分鐘內，該CPDP水凝膠的平均G'值約為600Pa，未經光交聯的初始水凝膠的G'值約為460Pa。同時，經曝光後，tanδ會顯著增加。該些流變學數據結果支持本發明之CPDP水凝膠能夠成功被誘導二次光交聯；此外，曝光後G'及G"值的獨特變化模式也顯示與該二次光交聯有關的水凝膠網絡可能會發生重新排列。

5.CPDP具有良好的生物相容性

為瞭解本發明之CPDP水凝膠的生物相容性，將人類間質幹細胞嵌入本發明之CPDP水凝膠或經光交聯之CPDP水凝膠中，並透過3D共聚焦顯微鏡觀察，結果如圖5E示，其中以鈣黃綠素AM與乙錠均二聚體-1分別進行活與死細胞的染色，可以觀察到在本發明之CPDP水凝膠或經光交聯之CPDP水凝膠中大多數細胞為存活狀態，僅有少量的死細胞，而經定量後，人類間質幹細胞在本發明之CPDP水凝膠(~86.7%)與經光交聯的CPDP水凝膠(~88.7%)中均具有很高的活力(數據未顯示)。此些結果皆顯示本發明之CPDP水凝膠及經光交聯之該CPDP水凝膠具有良好的細胞相容性與生物相容性。

6.CPDP水凝膠可以用於三維列印

再者，為了將該水凝膠進行三維列印，先在注射器中預先形成前述之可光交聯的水凝膠，並透過23號針頭(內徑340μm)進行列印。並在列印後，用約5cm的距離照射藍光輻射該水凝膠構建物60秒。

為進一步測試可光交聯尤其是可二次光交聯之本發明CPDP水凝膠，是否能夠做為包含細胞的生物墨水以進行三維列印，特別是用於模塊化之三維列印的生物墨水，在初步測試中，發現兩個三維列印的本發明CPDP水凝膠構建物構造之間的界面能夠瞬時黏附與癒合(結果未顯示)，此結果顯示將本發明之CPDP水凝膠用於三維列印之組裝模塊化的可能性。而在進一步之模塊化三維列印的測試中，如圖6A所示，本發明之CPDP水凝膠的構建體係透過23號針頭作 為單獨之構建基塊進行列印，並再將個別之單獨構建基塊相互黏著以組裝成更大且更複雜的構建體，其中係先將本發明之CPDP水凝膠列印為三個管狀的單獨構建基塊，其具有相同5mm的高度，而直徑則分別為5mm、5.5mm、及6mm，接著將該些管狀的單獨構建基塊相互黏著以組裝成一Y型的構建體，在作用數秒鐘後，該些單獨構建基塊之間的所有接觸界面都會癒合，並且透過於藍光下暴露60秒進行二次光交聯，得以增強組裝後的該Y型結構，且最終形成之該Y型結構即使在劇烈搖動後也能很好地保持穩定的結構(結果未顯示)。

本發明之CPDP水凝膠於三維生物列印則係透過23號針頭，將該CPDP水凝膠擠壓到培養皿上，如圖6B i及ii所示，以構建帶有人類間質幹細胞之具有晶格結構的該CPDP水凝膠結構，並透過列印後之光交聯進行結構的增強；其中，由垂直長絲組成的生物列印結構(1.3×1.3cm²)顯示出較高的結構強度，能夠以用鑷子拾取，而不會喪失其完整性(結果未顯示)，且該些人類間質幹細胞均勻地分佈在該細絲中(結果未顯示)。並且如圖6B iii及iv所示之在該生物列印之構建體中人類間質幹細胞的活/死染色結果，顯示內部幾乎沒有任何的死細胞，僅在邊緣可見少數的死細胞，而進一步調節列印之參數(例如擠出速率、印刷速度、及針頭尺寸)並降低材料的屈服應力，將能夠在列印之過程中有更多的活細胞。

本發明之CPDP水凝膠係由Chi-Ph及DF-PEG所組成，其具有快速的膠凝速率、出色的自癒合能力、與長距離的臨界凝膠行為，以及可列印的結構與光交聯性，其中由於酚類官能化的殼聚醣與二苯甲醛封端的遠螯交聯劑之間發生相互作用，因此所形成之CPDP水凝膠具二次光交聯的機會。本發明之CPDP水凝膠完全降解所需的時間更長，且具有持久的穩定性與完整性，可作為細胞移植的長期培養基質/載體、或藥物釋放的長期載體。

再者，透過更改Chi-Ph的含量，可以輕鬆調整CPDP水凝膠的流變行為，以使本發明之CPDP水凝膠能適合各種不同用途，其中隨著Chi-Ph含量的增加，本發明之CPDP水凝膠會有更快的凝膠速度與更高的硬度，舉例而言，含有1%的Chi-Ph與1%D的F-PEG之本發明CPDP水凝膠在凝膠化之前有足夠的時間與細胞均勻混合，並具有最佳的可注射性，可以滿足三維列印的條件，此外，即使透過26號注射器針頭形成連續的細絲，本發明之CPDP水凝膠仍可以供長時間列印。

可以根據光交聯度並透過調節光促進劑的濃度、曝光時間、及酚類官能化的含量來調整本發明之CPDP水凝膠的最終硬度及強度。且經光交聯的CPDP水凝膠仍可以透過界面接觸來癒合該切割表面，此發明開發之可控制且可調整之二次交聯，為固定本發明之具有自癒合性之CPDP水凝膠的形狀、以及三維列印水凝膠結構提供了一種更為便利的方法。

另外，在本發明中，首次使用具有自癒合性的可光交聯水凝膠製造模塊化三維列印水凝膠組件，並將其組裝成更大、更複雜之具有大尺寸結構的構建物。零件(類似於樂高的積木)的組裝係基於動態亞胺鍵之快速界面自癒合，隨後透過光引發的酚-酚鍵之二次交聯得以更加穩定。此種基於可自我癒合的可光交聯CPDP水凝膠的模塊化三維列印平台具有構建具有多尺度、複雜與異質結構的水凝膠結構以及嵌入細胞的潛力。

因此，本發明揭露一種具有廣泛用途之CPDP水凝膠，可以作為可注射之自癒合水凝膠、以及可見光交聯的生物墨水，且相較於習知慣用的以殼聚醣為主鏈之自癒合水凝膠，同為高含水量(>95wt%)之殼聚醣水凝膠的本發明之新穎CPDP水凝膠顯示出更快的膠凝速率、更高的模量、及長期穩定性。本發明之CPDP水凝膠具有很寬的應變範圍，使得其凝膠作用得以產生可列印性及可堆疊性，且Chi-Ph上的酚及DF-PEG上的苯甲醛之間的協同作用，能夠增強本發明之CPDP水凝膠的性能，又透過二次可見光交聯，可以使其基於酚-酚鍵的形成而更進一步穩定該水凝膠。由於此些獨特的特性，本發明之CPDP水凝膠可以進行生物列印。此外，由於本發明之CPDP水凝膠的黏附性及自癒合性，可以將單獨印刷的構造體組裝成整體構造體。

實施例4 CPF水凝膠的製備以及特性分析與應用

本發明之一實施例係以DF-PF作為交聯劑，並以如實施例1所述之酚類官能化殼聚醣作為主鏈，來製備本發明之具有自我癒合性的CPF(Chi-Ph及DF-PF)水凝膠，其中該CPF水凝膠具有可注射性以及自我癒合性。

4-1 CPF水凝膠的製備

首先將前述本發明之酚類官能化殼聚醣溶於pH值為7.4的Tris緩衝生理食鹽水中，製備出濃度為2wt%的酚類官能化殼聚醣溶液，並另外將本發明之DF-PF粉末溶解於溶於pH值為7.4的Tris緩衝生理食鹽水中，以製備濃度為3、5、及7wt%的交聯劑溶液，接著將該酚類官能化殼聚醣溶液與該三種不同濃度之交聯劑溶液以1：1之體積比例混合，即可得到本發明之具有自癒合性之水凝 膠，以下簡稱CPF水凝膠，圖2B顯示本發明之Chi-Ph及DF-PF的合成式，其中可以看出Chi-Ph的酚官能基團上的苯環、及DF-PF的苯甲醛官能基團上的苯環之間具有π-π的重疊作用；CPF水凝膠同為一種高含水量(>95wt%)之殼聚醣水凝膠，並以CPF-、CPF、及CPF+分別代表以濃度3、5、及7wt%的交聯劑溶液製備之該CPF水凝膠，以區別於優化的CPF水凝膠；其中，使用相同的製備方法，將2wt%市售常用之乙二醇殼聚醣與3wt%的DF-PEG以1：1的比例混合，來製備水凝膠以作為對照組，以下簡稱CS。

本發明之CPF水凝膠的溶解度如圖2A所示，其中表2總結本實施例中所使用之各種水凝膠的組成、膠凝時間、以及剪切儲存模量，而為了調節該CPF水凝膠的凝膠時間及剪切模量，可以用較高(例如7wt%)或較低(例如3wt%)濃度的本發明DF-PF溶液製備本發明之CPF水凝膠。

4-2 CPF水凝膠的官能基特性與孔徑分析

透過傅立葉變換紅外光譜儀(FTIR，Perkin Elmer，美國)鑑定本發明之CPF水凝膠中的官能基團以及其相互作用，其中係將該CPF水凝膠乾燥成薄膜以進行FTIR的分析，且以1cm^-1的分辨率記錄從400到4000cm^-1的吸光度。

如圖7所示之水凝膠的FTIR光譜，在芳族基團的指紋區域(即波數為1400~1600cm^-1)中，CPF-、CPF、及CPF+水凝膠均呈現出比對照CS水凝膠具有更高的吸收強度，顯示此三種水凝膠中的苯均富含化學成分，而在凍乾之該些水凝膠橫截面的掃描電子顯微鏡圖像中，CPF-、CPF、CPF+及CS水凝膠的孔徑分別為~80μm、~100μm、~120μm、及~120μm，而CPF-、CPF、CPF+、及CS水凝膠之孔壁厚度分別為~3μm、~5μm、~8μm、及~2μm(結果未顯示)。對於具有較大固體含量(即CPF+)的水凝膠，該孔徑的尺寸及孔壁的厚度較大；此外，CPF-、CPF、或CPF+水凝膠的孔徑表面比CS水凝膠的孔相對粗糙。

4-3 CPF水凝膠具有可注射性及自我癒合性

為測試本發明之CPF水凝膠是否具有可注射性及自我癒合性，以亞甲藍將該CPF水凝膠染色後放入單注射器中，並透過22號針頭(413μm)注入一心形模具中，以觀察該CPF水凝膠之注射與自癒合的過程。

結果顯示即使在凝膠化30分鐘後，也可以透過22號注射器針頭(413μm)注射所有CPF-、CPF、及CPF+水凝膠。且如圖8D所示，將本發明之CPF水凝膠透過22號針(413μm)的針頭注入以填充心形模具，於1小時後，該CPF水凝膠形成了邊緣粗糙的心形塊狀水凝膠，且可以用鑷子將其拾取而不會破裂，而24小時後，可以觀察到具有光滑且均勻外觀的心形CPF水凝膠。接著，將該光滑的水凝膠進一步切成兩片，並將兩片放置成切面接觸在一起共60分鐘，該回收的水凝膠再經第二次拉伸時，第二次的斷裂是發生在不同的位置。此些結果顯示本發明之CPF水凝膠確實具有可注射性以及自癒合性。

4-4 CPF水凝膠的流變性質分析

為進一步瞭解本發明之CPF水凝膠的流變性質，透過具有平行板幾何形狀的流變儀(HR-2，TA Instruments，USA)進行分析，其中上板的直徑為20mm，並分別測量以三種不同模式進行。首先，在恆定頻率為1Hz且振盪應變為1%的情況下測量儲能剪切模量(G')及損耗剪切模量(G“)與時間的關係，即時間掃描測試。其次，G'及G"在較高應變(300%)及較低應變(1%)下，透過損傷修復循環(1Hz)進行測量，即自癒合測試，上述兩個測試係將溫度設置為25℃，再者確定G'及G”(1Hz，1%應變)，並以3℃/min的增減速率相對於溫度變化(25℃至37℃之間)作圖，即溫度掃描實驗。

如圖8A及圖9所示之膠凝過程中本發明之CPF水凝膠之剪切儲存模量(G')及剪切損耗模量(G")的變化；其中，CPF-、CPF、及CS水凝膠在25℃時的流變凝膠點(G'=G")分別為30秒、15秒、及500秒，而在37℃下，該些水凝膠的凝膠點分別縮短為20秒、10秒、及240秒，其中，在該二種溫度下，CPF+水凝膠的膠凝點會在開始流變分析之前就已發生。具體而言，CPF-、CPF、及CPF+水凝膠的G'值達到了平衡，並且在500秒之後沒有太大變化，而CS水凝膠的G'值則隨著時間的推移而持續增加。在500秒後CPF-、CPF、及CPF+水凝膠的G'值分別為~400Pa、~1000Pa、及~1800Pa，而2000秒後CS水凝膠的G'值為~ 1000Pa。同時，所有水凝膠的G”都具有振盪值，此現象可能與水凝膠中動態之席夫鹼鍵的斷裂與重建相關。且該三種CPF水凝膠(300秒)的振盪G”的起始時間較早於CS水凝膠(1000秒)，此現象可能與該三種CPF水凝膠的網絡構建時間較短於CS水凝膠。

在交替的1%及300%動態應變下，損傷修復實驗的結果如圖8B及圖9顯示之；其中，CPF-、CPF、CPF+、及CS水凝膠在較高應變(300%)時均表現出溶膠的現象(即G”>G')，並在應變恢復到較低值(1%)後，凝膠化為回復成凝膠的現象(即G'>G”)。在重複的損傷修復循環後，每種水凝膠均表現出良好的自我修復效率(>95%)。G’值隨溫度的變化如圖8C及圖9所示，其中CPF-、CPF、及CPF+水凝膠的G'值以對數尺度線性增加，分別從25℃時的0.4kPa、1kPa、及1.8kPa上升到37℃時的1kPa、2.2kPa、及3.6kPa。而在25℃至37℃之間，CS水凝膠的值僅在1.5kPa至1.7kPa之間變化。且經過三個重複的加熱-冷卻循環後，CPF水凝膠的G'值在兩個溫度之間仍保持有顯著的差異性，CS水凝膠則沒有。此些結果顯示本發明之CPF水凝膠具有能在15秒左右就開始凝膠，並在2-3分鐘內完成凝膠之快速凝膠的特性，且具有自癒合性及熱響應性，作為對照組之習慣用的CS水凝膠則未有該些特性。

4-7 CPF水凝膠的雙針注射及承重測試

為瞭解本發明之CPF水凝膠的承重力，透過使用兩個載玻片(2cm×2cm×0.2cm)及砝碼組(1000g、500g、200g、及100g)的組合進行水凝膠之承重實驗。首先，將商購之人造皮(Hartmann，德國)固定於載玻片上，並將2wt%的酚類官能化殼聚醣/5wt%的DF-PF、或2wt%的CS/3wt%的DF-PEG之混合物溶液，分別有0.2mL、0.1mL、及0.05mL裝入載玻片之間，並在室溫下等待10分鐘後，在37℃環境中等待5分鐘，接著再進行測量；其中，承重黏合強度計算為最大載荷除以接觸面積。

由於本發明之CPF水凝膠具有快速膠凝性及黏合性，因此可以設計成兩劑膠，如圖10A所示，透過將2wt%的酚類官能化殼聚醣溶液及5wt%的DF-PF溶液分別放入雙注射器的針筒中，以測試兩劑量膠的形成，其中在兩個針筒之連接部分形成的預凝水凝膠可以透過22-34G(413μm至80μm)大小的針注 入。再者，該DF-PF溶液係以亞甲藍染色。並將藍色之預水凝膠透過針頭注入支持性水凝膠(DF-PF，30wt%)，以模擬生理狀況。

本發明之CPF水凝膠顯示出不同與表面之間具有優異的黏合性，特別是與玻璃之間，如圖10B所示，可以使用本發明之CPF水凝膠來黏貼接觸面積為2×2cm²的載玻片。即使將其浸入37℃水中，該組合仍可以抵抗覆蓋4cm²區域之3.8kg的重量，而CS水凝膠在相同面積下卻只能夠承受1.4kg的重量。除了玻璃外，如圖10C所示，人造皮膚也能夠被本發明之CPF水凝膠黏合。此外，如圖10D所示，可以將兩劑量膠水注入另一支持水凝膠以書寫字母。此些結果顯示本發明之CPF水凝膠具有優異之生物黏附性、以及凝膠注射性。

水凝膠或膠水的黏合性在很大程度上取決於內聚力及黏合力的平衡與協同作用，有許多策略能夠用來增強其黏合性，例如貽貝啟發式水凝膠與奈米結構生物黏合劑，其中貽貝的水凝膠對豬皮膚的黏合強度為5kPa至210kPa，而市售纖維蛋白膠的平均黏合強度為5kPa至50kPa。在本發明中，該CPF水凝膠的黏附性可以歸因於酚官能基所引入之黏附性與分層結構增強的內聚性。由承重測試證明，人造皮予本發明之CPF水凝膠的結合強度約為~7±0.6N/cm²(~70±6kPa)，且本發明之CPF水凝膠作為組織膠時，即使基於較弱的機械性能(~2kPa的儲存模量)，也可以具有優異的結合強度，即便其浸入水中也可以保持該結合強度。

4-8 CPF水凝膠可以作為細胞培養載體

為測試本發明CPF水凝膠，是否能夠作為細胞培養載體，以進行諸如幹細胞球培養等應用，如圖11A之明場相差圖像所示，將人類間質幹細胞包埋後均勻分散在本發明之CPF水凝膠中，並在的7天開始聚集。而在第14天，該些人類間質幹細胞形成平均直徑為100μm的球體，且還能觀察到一些較大的球體(>150μm)。為了進一步追踪，使用紅色螢光標記人類間質幹細胞以觀察球的形成，如圖11B所示，結果顯示在第14天時顯示出橢球體(~190μm)，且在第16天時繼續增長到更大的尺寸(~220μm)(結果未顯示)。此外，在細胞培養兩週後，觀察到了該水凝膠中一些降解的空心區域沒有經螢光標記的人類間質幹細胞，於16天後，觀察到一些球體從水凝膠中掉出來。

人類間質幹細胞嵌入本發明之CPF水凝膠的生存力及三維分佈如圖11C所示之死/活共聚焦圖像，其中可以發現在整個該CPF水凝膠中，人類間質幹細胞均勻地分佈，而在作為對照組之CS水凝膠中，有約90%的人類間質幹細胞分佈在水凝膠的下半部分。如圖11D所示之培養3小時後的活/死數量統計的百分比，在CPF及CS二種水凝膠中，活的人類間質幹細胞均佔總數的80%以上。如圖11E所示之人類間質幹細胞在CPF或CS水凝膠中的長期增殖，於第1天及第3天時，本發明之CPF水凝膠中的人類間質幹細胞數量高於CS水凝膠中的人類間質幹細胞數量，且在本發明之CPF水凝膠中，細胞在第7天時仍保持增長至~645%，在第14天時更保持至~1240%，而在CS水凝膠中，由於CS水凝膠的降解，完全無法確定細胞數量，且由於大的球狀體傾向於從水凝膠中掉出來，因此很難量化第16天後水凝膠中的細胞數。

與CS水凝膠相比，本發明之CPF水凝膠促進人類間質幹細胞在水凝膠中更快的增殖且更均勻的分佈。且本發明之CPF水凝膠中的細胞比起CS水凝膠中的細胞具有更長的培養時間。此外，充滿膠束的本發明CPF水凝膠網絡可提供更緊湊的(Df~2.7)結構，具有中尺度異質性，可在長期細胞培養過程中保持凝膠穩定性。

本發明之DF-PF係透過Steglich酯化合成出來的，其係為具熱響應膠束形式的新型交聯劑。此種類型的交聯劑用於交聯CP所製備具刺激響應性的自癒合CPF水凝膠。透過動態及膠束網絡，由奈米級分層結構所構建的本發明CPF水凝膠表現出稀有的快速膠凝、熱響應性、自我修復能力、可注射性、黏合性、及較長的降解時間。本發明之CPF水凝膠的降解期能超過16天，從而允許在水凝膠中形成並維持幹細胞球體，且本發明之CPF水凝膠的熱誘導機械增強可以促進其在生理條件下的應用。

因此，透過引入酚官能基並結合膠束結構，本發明開發一種具有多功能的智能水凝膠，本發明之CPF水凝膠不僅具有生物降解性、黏附性、及熱響應性，且還具有快速凝膠化、可注射性、自癒合性、及細胞相容性。本發明之智能CPF水凝膠是一種潛在的雙注射器組織黏合劑與幹細胞的培養基質/載體。

綜上所述，以本發明之酚類官能化殼聚醣作為主鏈，並引入本發明之雙官能交聯劑後，能夠製備出本發明之具有自我癒合性的水凝膠，而此種 高含水量的殼聚醣水凝膠具有生物可降解性與生物可相容性，且還具有快速凝膠及常降解時間的特性，使得本發明之具有自我癒合性的水凝膠能夠作為組織黏合劑、以及細胞培養基質或藥物載體，且因為具有可二次光交聯的特性，還能夠用於生物三維列印的用途，特別係以本發明之水凝膠所三維列印出的構建體，能夠進行組裝以形成大物件。

Claims (11)

1. 一種具有自我癒合性的水凝膠，包含一酚類官能化殼聚醣(phenol-functionalized chitosan,Chi-Ph)、及一交聯劑；其中，該交聯劑包含一雙苯醛基，且該酚類官能化殼聚醣與該交聯劑各自具有一苯環結構。
2. 如請求項1所述之具有自我癒合性的水凝膠，其中該交聯劑係為雙官能聚乙二醇(difunctional polyethylene glycol)、或雙官能多元醇(difunctional Pluronic,DF-PF)。
3. 一種如請求項1所述之具有自我癒合性的水凝膠用於三維列印的用途。
4. 如請求項3所述之用途，其中該具有自我癒合性的水凝膠進一步包含一光起始劑。
5. 如請求項4所述之用途，其中該具有自我癒合性的水凝膠在三維列印後，係以光交聯進行固定。
6. 如請求項5所述之用途，其中該光交聯係以可見光進行。
7. 如請求項4所述之用途，其中該具有自我癒合性的水凝膠於三維列印後產生之複數個構建物，該複數個構建物進一步相互黏著組裝成一模塊化構建物，再以二次光交聯進行該模塊化構建物的固定。
8. 一種如請求項1所述之具有自我癒合性的水凝膠用於製備一生物膠的用途。
9. 一種如請求項1所述之具有自我癒合性的水凝膠用於製備一快速凝膠及長降解時間之一水凝膠的用途。
10. 如請求項9所述之用途，其中該水凝膠的凝膠時間係為2-3分及/或該水凝膠的降解時間係大於1週。
11. 一種如請求項1所述之具有自我癒合性的水凝膠用於製備一細胞培養基質及/或一藥物載體的用途。

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