CN101530765B - 一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球，是以天然酪蛋白与壳聚糖为原料，以戊二醛，甲醛为交联剂进行聚合反应而得。本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。本发明的复合生物微球体呈表面多孔蜂窝状结构，形态均一，粒径在0.8×102～3.1×102um；微球表面含有-NH2和-OH功能基团；分解温度在380～430℃；溶胀系数为0.60～0.93ml/g，在pH 1～14环境中稳定，无毒、生物相容性良好，可以作为酶或其它生物活性分子的载体。本发明原料来源充足广泛，制备工艺简单，在低温、常压下制备，安全性好，设备投资少，成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种生物活性分子的载体——复合生物微球，尤其涉及一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球；本发明同时还涉及该复合生物微球的制备方法。
背景技术
天然高分子物质(如壳聚糖、淀粉等)及合成聚合物(如藻酸钙、聚丙烯酰胺等)，由于表面具有功能基团而被广泛地用作载体材料。酪蛋白是一种天然高分子化合物，其分子具有双亲性和良好的柔韧性。以蛋白质和生物多糖为材料制备的内部多孔、表面有特殊功能基团的耐酸碱的酪蛋白复合高分子微球，可以作为酶或其它生物活性分子的载体。
中国专利CN101070401提供了一种具有核壳结构的糖基化聚丙烯微球的制备方法，是以聚丙烯微球为载体材料，在紫外光辐照下接枝带羟基的丙烯酸酯类单体，得到羟基化的聚丙烯微球；再将乙酰基保护的糖结合到此微球表面的羟基上；然后把乙酰基保护的糖基化聚丙烯微球浸入甲醇钠/甲醇溶液中，脱去乙酰基，得到糖基化的聚丙烯微球。该方法是将糖基结合在微球表面，可直接装填成柱(高效液相色谱的固定相)或用作流化床的固体相，用于蛋白质的分离、浓缩或靶向清除。由于糖基稳定存在于微球表面，易于回收并可重复使用。但是，该方法制备的核壳结构的糖基化聚丙烯微球，在酸碱性溶液中稳定性较差，而且生产工艺较复杂，成本高，从而影响了其作为生物载体的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。
本发明的另一目的是提供一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备方法。
本发明酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)酪蛋白溶液的制备
将酪蛋白以(1～8)∶(100～200)的质量(g)/体积(ml)比加入到体积分数为2～6％的冰乙酸水溶液中，在50℃～60℃水浴中搅拌，得到酪蛋白 溶液。
(2)复合胶体溶液的制备
在室温下，将酪蛋白质量0.3～1倍的壳聚糖加入到上述制备的酪蛋白溶液中，搅拌，使壳聚糖溶解，得到酪蛋白与壳聚糖的复合胶体溶液。
(3)乳化溶液的制备
在40℃～50℃水浴中，将吐温80或司盘80，上述复合胶体溶液加入到石蜡-乙酸乙酯的混合溶液中，在搅拌下，乳化10～20min，得乳化溶液。
所述吐温80或司盘80、复合胶体溶液、石蜡-乙酸乙酯混合溶液的体积比为(1.5～4.0)∶(30～60)∶(50～90)。
所述液体石蜡-乙酸乙酯混合溶液中石蜡与乙酸乙酯的体积比为(40～60)∶(10～30)。
(4)分散微球的制备
在上述制备的乳化溶液中，加入质量浓度40～60％的戊二醛水溶液和质量浓度37～40％的甲醛水溶液，升温到50～60℃，在搅拌下反应1～2h；反应完成后静置8～10分钟，离心分离，固体部分依次用石油醚、无水乙醇或丙酮洗涤，抽滤，得到分散的微球。
所述乳化溶液、戊二醛水溶液、甲醛水溶液的体积比为(80～150)∶(1.5～3)∶(0.5～3)。
(5)酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备
室温下，将上述制备的分散微球用蒸馏水洗涤，在30～40℃，0.02～0.09MPa条件下真空干燥4～10h，得酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。
本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的性能测试：
1、利用扫描电镜
经扫描电镜检测，本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球呈表面粗糙且多孔的蜂窝状结构，微球形态均一，比表面积大，易于与生物活性物质发生反应，粒径在0.8×102～3.1×102um；其扫描电镜图见图1、2、3。
2、红外光谱分析
本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的红外光谱见图2。红外光谱显示，在3404.35cm-1处为O-H的伸缩振动的特征峰，可能与N-H的伸缩振动峰发生了重叠；在2930.86cm-1、2874.03cm-1处的吸收峰是C-H(CH，CH2和CH3)伸缩振动引起的；1448.54cm-1是C-H的弯曲振动引起的，在1061.48cm-1处有一个强的糖环特征吸收峰，在840cm-1左右无吸收，说明不含α-糖苷键，而含β- 糖苷键，这些均为多糖的吸收峰；在1527.62cm-1处出现了-NH2的吸收峰，在1658.78cm-1处的为-C＝N的吸收峰，并且O-H的变角振动引起1236.71cm-1吸收峰。红外光谱图表明，酪蛋白复合微球表面含有-NH2和-OH等功能基团。
3、DSC热分析图
DSC热分析图显示，分解温度在380～430℃。84℃为复合微球上残留有机溶剂挥发时的吸热峰，在404℃开始分解，而壳聚糖微球的分解温度一般为200℃。表明所制得微球的耐热性能较好。
4、溶胀性测试
室温下，溶胀性测试结果：微球溶涨系数为0.60～0.93ml/g，在pH 1～14环境下稳定，耐酸碱性优良。
从以上试验证明，本发明酪蛋白复合生物微球具有-NH2和-OH表面功能基团，在ph 1～14环境下稳定，耐酸碱性强，使用范围广，溶胀系数小、无毒、生物相容性良好，可以作为酶或其它生物活性分子的载体。微球表面的功能基团能与酶和其它生物活性物质发生反应，将它们固定在微球的内部或外表面，固定化了的这些活性分子的微球在多种反应中可以重复使用，且回收率较高，可以节约成本。
本发明以酪蛋白与壳聚糖复合物为原料，以戊二醛和甲醛为交联剂聚合而成。原料来源充足广泛，其操作工艺简单，制备方法为常压、低温操作，安全性好，设备投资少，成本低，是一种天然蛋白质复合微球的理想制备工艺。
附图说明
图1为本发明酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的扫描电镜图
图2为酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的扫描电镜表面放大图
图3为酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的扫描电镜截面放大图
图4为本发明酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的红外光谱图
图5为本发明酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的热分析图
具体实施方式
实施例1、酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备
(1)取2g的酪蛋白加入到100ml体积分数为2％的冰乙酸水溶液中，冰乙酸水溶液与酪蛋白比为体积(ml)∶质量(g)＝100∶2，在50℃水浴中、在600rpm/min的搅拌下，得到酪蛋白溶液。
(2)将1g壳聚糖加入到上述制备的酪蛋白溶液中，在室温、600rpm/min的搅拌转速下，使壳聚糖溶解，得到酪蛋白与壳聚糖的复合胶体溶液。
(3)在40℃水浴中、在600rpm/min的搅拌转速下，将1.5ml吐温80和35ml复合胶体溶液先后加入到50ml的液体石蜡-乙酸乙酯混合溶液中(液体石蜡和乙酸乙酯的体积比为4∶1)，乳化10min，得乳化溶液。
(4)在乳化溶液中同时加入质量浓度为40％的戊二醛水溶液1.5ml，质量浓度为37～40％的甲醛水溶液1ml，升温到60℃，在600rpm/min的搅拌转速下反应1h；反应完成后静置8分钟，离心5分钟，弃去上层清液，剩余部分依次用石油醚、无水乙醇或丙酮各浸泡30min，于0.06MPa下抽滤，得到分散的微球。
(5)室温下，将所得分散的微球用蒸馏水洗涤微球若干次，在40℃，0.08MPa条件下真空干燥5h，得酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。
扫描电镜检测，本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球呈表面粗糙且多孔的蜂窝状结构，微球形态均一，粒径在0.9×102～2.6×102um。
红外光谱图表明，酪蛋白复合微球表面含有-NH2和-OH等功能基团。
DSC热分析显示，其分解温度在392℃，具有较好的耐热性能。
溶胀性测试结果：室温下，微球溶涨系数为0.71ml/g，在pH 1～14环境下稳定，耐酸碱性优良。
实施例2、酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备
(1)取4g的酪蛋白加入到150ml体积分数为4％的冰乙酸水溶液中，冰乙酸水溶液与酪蛋白比为体积(ml)∶质量(g)＝150∶4，在55℃水浴中、800rpm/min搅拌转速下，得到酪蛋白溶液。
(2)2.5g壳聚糖加入到上述制备的150ml酪蛋白溶液中，在25℃、600rpm/min的转速下，使壳聚糖溶解，得到酪蛋白与壳聚糖的复合胶体溶液。
(3)在45℃水浴、800rpm/min的转速下，将3ml司盘80和45ml复合胶体溶液先后加入到70ml液体石蜡-乙酸乙酯混合溶液中(液体石蜡和乙酸乙酯的体积比为50∶20)，乳化15min，得乳化溶液。
(4)在乳化溶液中同时加入质量浓度为50％的戊二醛水溶液2ml，质量浓度为37～40％的甲醛水溶液1.5ml，升温到60℃，在800rpm/min的搅拌转速下反应1.5h，反应完成后静置9分钟，离心8分钟，弃去上层清液，剩余部分依次用石油醚、无水乙醇或丙酮各浸泡40min，0.06MPa下抽滤，得到分散的微球。
(5)室温下，将所得分散的微球用蒸馏水洗涤微球若干次，在40℃，0.08MPa条件下真空干燥7h，得酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。
扫描电镜检测，本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球呈表面粗糙且多孔的蜂窝状结构，微球形态均一，粒径在1.1×102～2.7×102um。
红外光谱图表明，酪蛋白复合微球表面含有-NH2和-OH等功能基团。
DSC热分析显示，其分解温度在404℃，具有较好的耐热性能。
溶胀性测试结果：室温下，微球溶涨系数为0.80ml/g。在pH 1～14环境下稳定，耐酸碱性优良。
实施例3、酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备
(1)取6g的酪蛋白加入到200ml体积分数为6％的冰乙酸水溶液中，冰乙酸水溶液与酪蛋白比为体积(ml)∶质量(g)＝200∶6，在60℃水浴中、1000rpm/min搅拌转速下，得到酪蛋白溶液。
(2)将4g壳聚糖加入到上述制备的200ml酪蛋白溶液中，在室温下搅拌(搅拌转速600rpm/min)，使壳聚糖溶解，得到酪蛋白与壳聚糖的复合胶体溶液。
(3)在50℃水浴、1000rpm/min的搅拌转速下，将3.5ml司盘80和55ml复合胶体溶液先后加入到90ml液体石蜡-乙酸乙酯的混合溶液中(液体石蜡和乙酸乙酯的体积比为60∶30)，乳化20min，得乳化溶液。
(4)在乳化溶液中同时加入质量浓度为40％的戊二醛水溶液2.5ml，质量浓度为37～40％的甲醛水溶液2ml，升温到60℃，在1000rpm/min的搅拌转速下反应2h，反应完成后静置10分钟，离心10分钟，弃去上层清液，剩余部分依次用石油醚、无水乙醇或丙酮各浸泡30min，0.06MPa下抽滤，得到分散的微球。
(5)室温下，将所得分散的微球用蒸馏水洗涤微球若干次，在40℃，0.08MPa条件下真空干燥9h，制得酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。
扫描电镜检测，本发明制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球呈表面粗糙且多孔的蜂窝状结构，微球形态均一，粒径在1.3×102～3.1×102um。
红外光谱图表明，酪蛋白复合微球表面含有-NH2和-OH等功能基团。
DSC热分析显示，其分解温度在420℃，具有较好的耐热性能。
溶胀性测试结果：室温下，微球溶涨系数为0.79ml/g。在pH 1～14环境下稳定，耐酸碱性优良。
Claims (3)
1.一种酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备方法，包括以下工艺步骤：
(1)将酪蛋白以(1～8)∶(100～200)的质量/体积比加入到体积分数为2～6％的冰乙酸水溶液中，在50℃～60℃水浴中搅拌，得到酪蛋白溶液；所述质量/体积比的单位为：g/ml；
(2)在室温下，将酪蛋白质量0.3～1倍的壳聚糖加入到上述制备的酪蛋白溶液中，搅拌，使壳聚糖溶解，得到酪蛋白与壳聚糖的复合胶体溶液；
(3)在40℃～50℃水浴中，将吐温80或司盘80，上述复合胶体溶液加入到石蜡-乙酸乙酯的混合溶液中，在搅拌下，乳化10～20min，得乳化溶液；所述吐温80或司盘80、复合胶体溶液、石蜡-乙酸乙酯混合溶液的体积比为(1.5～4.0)∶(30～60)∶(50～90)；所述石蜡-乙酸乙酯混合溶液中石蜡与乙酸乙酯的体积比为(40～60)∶(10～30)；
(4)在上述制备的乳化溶液中，加入质量浓度40～60％的戊二醛水溶液和质量浓度37～40％的甲醛水溶液，升温到50～60℃，在搅拌下反应1～2h；反应完成后静置8～10分钟，离心分离，固体部分依次用石油醚、无水乙醇或丙酮洗涤，抽滤，得到分散的微球；所述乳化溶液、戊二醛水溶液、甲醛水溶液的体积比为(80～150)∶(1.5～3)∶(0.5～3)；
(5)室温下，将上述制备的分散微球用蒸馏水洗涤，在30～40℃，0.02～0.09MPa条件下真空干燥4～10h，得酪蛋白/壳聚糖复合生物微球。
2.如权利要求1所述酪蛋白/壳聚糖复合生物微球的制备方法，其特征在θ于：所述搅拌速度为500～1000rpm。
3.如权利要求1所述方法制备的酪蛋白/壳聚糖复合生物微球，其特征在于：微球体呈表面多孔蜂窝状结构，表面含有-NH2和-OH功能基团；粒径在0.8×102～3.1×102μm，分解温度在380～430℃，在室温下溶胀系数为0.60～0.93ml/g，在pH1～14环境中稳定。
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