CN101838467B - 一种新型壳聚糖纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

一种新型壳聚糖纳米颗粒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明专利是一种可用于食品工业中制备新型壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒的方法。目前通常使用三聚磷酸钠交联壳聚糖的方法制备壳聚糖纳米颗粒。但作为口服输送载体，此壳聚糖纳米颗粒不耐强酸，导致被输送营养物在胃酸中遭破坏而不能被靶向输送至肠道吸收。本发明利用胰蛋白酶水解酪蛋白的产物经分离纯化得到酪蛋白磷酸肽，通过条件优化，将酪蛋白磷酸肽与壳聚糖相互交联形成“芯-壳”纳米颗粒结构。由于表面磷酸基团负电荷的作用，壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒在体内能够避免酸和酶的降解而具有很强的稳定性，具有一定的靶向和缓释性能，解决了目前壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒作为口服输送载体易被胃酸降解的问题。

Description

一种新型壳聚糖纳米颗粒及其制备方法
技术领域
本发明专利涉及一种可用于食品工业中制备新型壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒的方法。
背景技术
酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides，简称CPP)是以牛乳酪蛋白为原料，经单一酶或复合酶系水解，再经分离纯化而得到的含有成簇的磷酸丝氨酰基的肽，在动物小肠内能与Ca2+结合，阻止磷酸钙沉淀，使小肠对Ca2+的溶解度大大增加。钙、铁、锌在动物体内起着重要作用，由于饲料原料中含有大量植酸盐、纤维素、糖醛酸、藻酸钠和草酸等，从而阻碍了动物对钙、铁、锌等矿物质的吸收。CPP可提高钙、铁、锌等矿物质的溶解度从而促进矿物质的吸收。另外，CPP对动物免疫和繁殖也有着重要作用。
壳聚糖近年来被广泛用做生物医药输送载体，具有很好的生物可降解性、生物相容性和黏膜吸附性。壳聚糖纳米颗粒能够吸附到黏膜表面，并迅速打开上皮细胞之间紧密的黏结，避开肠道清除机制，在人体肠道中保留较长时间。完整的壳聚糖纳米颗粒能够被人体细胞吞噬，从而显著提高被其包封的活性分子的生物利用率。大量毒理学研究已经证明，壳聚糖对人体安全，无毒副作用。1992年日本将甲壳素及其衍生物列为功能性食品成分。因此，壳聚糖是非常理想的制备食品纳米材料的原料，可以作为食品功能因子的安全输送载体.目前通常使用三聚磷酸钠交联壳聚糖的方法制备壳聚糖纳米颗粒。但是，作为口服输送载体，壳聚糖纳米颗粒不耐强酸，在低pH值条件下会迅速解离、降解，导致被输送营养物在胃酸环境中遭破坏而不能被靶向输送至肠道吸收。
本发明专利解决其技术问题所采用的技术方案是：利用胰蛋白酶水解酪蛋白，通过pH值选择性沉淀以及阴离子交换分离、纯化得到的富含磷酸基团的酪蛋白磷酸肽。通过条件优化，选择合适的pH值条件、壳聚糖/酪蛋白磷酸肽质量比制备新型的壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒。由于表面磷酸基团负电荷的作用，壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒在体内能够避免酸和酶的降解而具有很强的稳定性，具有一定的靶向和缓释性能。
发明内容
本发明专利利用胰蛋白酶水解酪蛋白，通过等电点沉淀和阴离子交换树脂分离纯化功能性酪蛋白磷酸肽。由于表面磷酸基团负电荷的作用，酪蛋白磷酸肽在体内能够避免酸和酶的降解而具有很强的稳定性。本专利在国际上首次将制备得到的酪蛋白磷酸肽用于与壳聚糖相互交联作用形成以酪蛋白磷酸肽聚集体为核，过量壳聚糖反吸附到其表面的“芯-壳”纳米颗粒结构。这种方法一方面提供了制备壳聚糖纳米颗粒的新方法；另一方面，也为包封和保护生物活性多肽以及活性酶提供了一种温和、高效而便捷的高分子纳米材料。
附图说明
图1.随着壳聚糖/酪蛋白磷酸肽质量比升高过程中，形成的纳米颗粒透射电镜图
具体实施方式
1.称取50g酪蛋白，加入0.05M的NaOH溶液500mL，用磁力搅拌器持续搅拌，待其充分溶解后，调节pH至8.0。称取胰蛋白酶0.25g，溶于0.75mL去离子水中。将胰蛋白酶溶液加入酪蛋白-氢氧化钠溶液中，充分混匀，置于50℃水浴锅中恒温反应，并且不断以1M的NaOH溶液调节水解液的pH，使水解液的pH恒定8.0。当水解液的pH最后一次调回8.0后，保持半小时以上不再变化时，认为反应结束。反应结束后，将水解液以沸水浴5min灭酶。待水解液温度回到室温后，用1M的HCl将水解液的pH调至4.6，以2000r/min离心30min，取上清液，即为CPP粗提产物。调节CPP初产物pH值至pH8.9，通过HiPrep column(16/10 QXL，Amersham Biosciences)阴离子交换柱分离纯化，并冻干得到富含磷酸基团的酪蛋白磷酸肽。
2.将壳聚糖溶于1％的醋酸溶液，浓度为8mg/ml，用NaOH溶液调节pH值至6.0。
3.将酪蛋白磷酸肽以去离子水复溶，浓度为8mg/ml，以HCl溶液调节pH值至6.0。
4、在500ml酪蛋白磷酸肽溶液中逐滴滴加壳聚糖溶液，直至壳聚糖与酪蛋白磷酸肽的质量比为1/5，溶液呈现明显的乳光。
5、将纳米颗粒溶液以20000g离心30分钟，移除上清液，以含0.01M NaCl的10mMTris-HCl缓冲液将纳米颗粒冲洗三次之后，以pH2.5的HCl溶液将纳米颗粒重新分散开。
6、将纳米颗粒的盐酸溶液冻干，制成冻干粉。

Claims (1)

1.一种新型壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒的制备方法，通过壳聚糖与酪蛋白磷酸肽之间的离子交联反应在室温下合成，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)壳聚糖溶于1％的醋酸溶液中，调节pH值到6.0；
(2)将酪蛋白磷酸肽溶于去离子水中，调节溶液pH为6；
(3)搅拌条件下，在酪蛋白磷酸肽溶液中逐滴滴加壳聚糖溶液，使酪蛋白磷酸肽与壳聚糖互相交联，调节壳聚糖与酪蛋白磷酸肽最终质量比为1/5，形成纳米颗粒，此时溶液呈现乳光。
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