JPH03236791A - ホスホペプチド含有新素材の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、カゼインをプロテアーゼで分離したときに生
じるペプチド混合物の中から、酸性ペプチド、特にホス
ホセリン残基を有するホスホペプチドを分取する方法に
関する。

更に詳細には、本発明は、エチルアルコール等の有機溶
媒を用いることなく、そしてまたカルシウムや鉄等を添
加することなく、これらのペプチドを分取する方法に関
するものであり、しかも。

カゼインの＋リプシン加水分解物であってホスホセリン
残基を含有する複数種のペプチドと通常定義されるカゼ
インホスホペプチド（ｃｐｐ）のみに限定されることな
く、トリプシン以外のプロテアーゼ加水分解物にも広く
本発明は適用できるものである。

（従来の技術） 実験室規模でカゼイン由来のホスホペプチドを調製する
方法については、１９７０年前後にいくつかの方法が確
立された。

例えば、　Ｍ、　Ｍａｎｓｏｎ及びＬ　Ｄ、　Ａｎｎａ
ｎは、β−カゼインをｐＨ８，２０℃でトリプシンによ
って分解した液中のＰＨ４，６可溶画分に、塩化バリウ
ムとエチルアルコールを加えてホスホペプチドを沈殿１
分取している（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ＋、、　
１４５．１５−２６（１９７１））。

またＶｅｓｔは、トリプシン処理したα−カゼイン溶液
のＰＨを２に調整して沈殿を除いた後、濾液をゲル濾過
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５Ｍ）にかけ、Ｖｏｉｄ　
Ｖｏｌｕｍｅに溶出した大分子量画分を次に陰イオン交
換体（ＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ａ３０）に通し
てホスホペプチドを吸着させている。

一方、大規模生産を目的とした方法については、カゼイ
ンのプロテアーゼ分解によって生成したペプチドの内、
ホスホペプチドが、カルシウム等ミネラルの添加により
沈殿はしないものの大きな会合体を形成することを利用
して、他のペプチドから限外濾過膜で分離することが提
案されている（特開昭５６−１２３９２１号）。

また、カゼインのトリプシン分解物にカルシウムとエチ
ルアルコールを加えて又は塩化第２鉄を加えてホスホペ
プチドを沈殿１分離することが知られているにすぎない
（特開昭５８−１７０４４０号、特開昭５９−１５９７
９３号）。

（発明が解決しようとする問題点） ホスホペプチドを食品用素材ないし医薬用素材として使
用するには、バリウム塩が含有されることは避けなけれ
ばならないから、上記した従来技術において、塩化バリ
ウムを使用するＭａｎｓｏｎとＡｎｎａｎの方法は不適
当である。

また、エチルアルコールを使用する方法は高価なエチル
アルコールを多量に使用する必要があるため、大規模処
理の場合、特に経済性及び安全性の点で問題がある。更
に、ＣＰＰはカルシウム吸収促進因子としても知られて
いるので（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ。

ｏｆ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、　４３．４５７−４６７（
１９８０））、ホスホペプチドをカルシウム吸収促進因
子として食品素材等において使用する場合には、カルシ
ウム等ミネラルは別途併用することが多いため、ホスホ
ペプチド中にカルシウム等ミネラルが含有されていない
方が好都合であり、したがってこのような場合にはカル
シウムフリーないし鉄フリーの状態でホスホペプチドを
市場に供給した方が適用範囲が広くなり、商品価値が高
まる。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、これらの欠点を解決するためになされたもの
であって、　Ｂａ、　Ｃａ、　Ｆｅ等有害ないし不要ミ
ネラル類を含まずまたエチルアルコール等高価な原料も
使用することなく、ホスホペプチドを効率よく分離回収
できる大規模な方法を開発する目的でなされたものであ
る。

そこで、カルシウム、鉄以外の可食性凝集剤をスクリー
ニングした結果、キチン誘導体であるキトサン溶液をカ
ゼインのプロテアーゼ加水分解物の混合物に混合したと
ころ、キトサンがホスホペプチドを中心とする酸性ペプ
チドと選択的に不溶性の複合体を形成する　という新規
にして有用な知見を得、そしてキトサン−酸性ペプチド
複合体を容易に分離回収できることを確認し、本発明の
完成に到達したのである。　本発明において使用するキ
トサンは、キチン誘導体を広く指すものであって、通常
、グルコサミン、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グル
コース を主成分とする多糖類をすべて包含するものであるが、
現在市販されている通常の商品が充分使用に耐え得る０
例えば、分子量１０　、０００〜５０，０００のキトサ
ン試作品（日本農産化工（株））や試作品フローナック
Ｃ（共和油脂工業（株））も有利に使用することができ
るが、過度に粘度が高い製品でなければすべてのキトサ
ンないしキトサン製品が自由に使用できる。ただ本発明
においては、酸性ペプチドに対して一定量以上のキトサ
ンを使用する方が有利であるので、酵素分解等によって
若干低分子化したキトサンの方が工業的処理には好適で
ある。

本発明において使用する原料であるカゼインとしては、
各種酸カゼイン、カゼインナトリウム、カゼインカルシ
ウム等のカゼインが最も良いが、牛乳、スキムミルク等
の未精製のものも使用することができる。またそれらの
限外濾過残留物等濃縮物ないし処理物も有利に使用でき
るし、未精製のホスホペプチドあるいは各種のホスホカ
ゼイネート等も使用することができ、カゼインを含有な
いしベースとする各種原料が広く使用できる。

本発明においては、このような原料をプロテアーゼ処理
して蛋白分解物を生成せしめるのであるが、この工程は
プロテアーゼとしてトリプシンを用いるＣＰＰの製造工
程に準じて行えばよい０例えば、酸カゼインを中和した
後、またはナトリウムカゼイネートを溶解して１〜１０
％程度の溶液とし、これにプロテアーゼを添加し、ｐｌ
＋　８．０、温度３０〜４５℃で３〜２４時間静置すれ
ばよい。なお、酵素反応終了後のｐＨを４．６、可溶性
Ｎ／全Ｎ比が０．８以上となるようにするのが経済上好
適である。

プロテアーゼとしては、本発明においては、ＣＰＰの場
合のように精製トリプシンのみに限定されることなく１
例えば次のようなプロテアーゼが広く利用される：パン
クレアチン、ペプシン、キモトリプシン等動物起源の酵
素；パパイン、プロメレイン、フィシン等植物起源の酵
素；糸状菌、酵母、細菌プロテアーゼ等微生物起源の酵
素。

このようにしてプロテアーゼ処理することによって得た
酸性ペプチド（ホスホペプチド含有）は、上記したキト
サンと反応させることにより、酸性ペプチド−キトサン
複合体を形成せしめる。

その際のキトサンの添加量は、カゼイン１０ｇ（カゼイ
ン原料ではなく純カゼインとして）当り０．０１〜ｌｏ
ｇ、好適には０．０５〜２ｇとなるように調整する。

キトサンの添加量が上記範囲よりも少ない場合には酸性
ペプチドの回収率が大幅に低下し、上記範囲よりも多い
場合には複合体中のペプチド含有が低くなりすぎるので
好ましくない。

キトサン溶液、混合ペプチド溶液の濃度については、格
別の制限はないが、一応の濃度の基準としては、キトサ
ンについては酢酸溶液の場合は０．１〜２％程度及び乳
酸溶液の場合は０．０５〜１％程度とするのが好ましい
、また混合ペプチド溶液の濃度としては、酵素反応終了
時の濃度そのままでもよいし、必要ある場合には若干こ
れを稀釈して固形分率０．１〜５％程度とするのも好適
である。

キトサンと酸性ペプチドを結合させるＰＨは。

３．０〜７．０より望ましくは、３．７〜５．５とすべ
きである。ＰＨ３未満、７超ではキトサン−酸性ペプチ
ドの複合体を形成しない、　ｐ）１３．０〜３．７、ｐ
Ｈ５，５〜７の範囲では、一応、複合体は形成するが、
小さな凝集体にとどまっており、遠心分離法で複合体の
５０％以上を回収することが困難である。また膜濾過法
で濃縮液側でこれを回収しようとしても、微粒子の存在
の為流速低下が著るしい、またｐＨ５，５〜７では、キ
トサンの一部が単独で沈殿するという問題がある。した
がって、ｐＨは３．０〜７．０とするのが良く、特に工
業的大規模処理においては３．７〜５．５に調整するの
がより好適である。

このようにして生成したキトサン−酸性ペプチド複合体
は、通常の固液分離法によって容易に分離、回収するこ
とができる。固液分離法としては。

遠心分離法、デカンテーション、濾過法、膜濾過法等が
例挙されるがこれらのみに限定されるものではない。

分離回収した複合体は、そのままでも使用できるが、常
法にしたがって濃縮したりあるいは乾燥して粉体として
もよい。

次に本発明の実施例及び試験例について述べる。

実施例１ 乳酸カゼイン５ｋｇを水９０ｋｇに分散し、これに粒状
水酸化ナトリウムを溶解してｐＨを８．０に調整した。

結晶豚トリプシンを０．２ｇ添加し、ＩＮ水酸化ナトリ
ウム溶液でｐＨを８．０に保ちながら４０℃で２４時間
保持した。これを８０℃に５分間加熱してトリプシンを
失活させた後、７０℃に冷却し、塩酸でｐＨを４．６と
して未分解のカゼインを沈殿せしめた。この段階で、沈
殿乾物量は約７５０ｇ、ペプチド態の混合物は乾物量で
約３．５ｋｇ得られた。

沈殿を除いた濾液（約１００ｋｇ）に水１００ｋｇを加
えて稀釈し、冷却して液温を２５℃としたところへ、１
％キトサン溶液３０ｋｇ（１％酢酸溶液で）を混合して
ＰＨを５．０に調整した後、１時間静置し、ついでタラ
リファイア−で沈殿を回収した。

沈殿を高速遠心機にかけて水分を更に除去した後、風乾
してキトサン−酸性ペプチド複合体４００ｇを得た。複
合体中のホスホペプチド含量は約６０％であった。

試験例１ 実施例１で製造したキトサン−酸性ペプチド複合体のｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏでのカルシウム可溶化能を以下により試
験した。

２〇−塩化カルシウム液にホスホペプチドとして０．０
８％となるように実施例１で得た複合体を溶解した液１
．７５−と、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｉ４８．０）　
５　ｒａＱとを混合した場合の可溶性カルシウム化率を
測定したところ、３５％の結果を得た。

一方、対照として該複合体にかえて、カルシウム−エチ
ルアルコール法によるホスホペプチドを溶解した液を用
いて同様に可溶性カルシウム化率を測定した場合は、５
０％の結果を得た。

したがって本法によるカルシウム可溶化能は、対照の７
０％となった。

（発明の効果） 本発明によれば、アルコールを使わずに、ＣａやＦｅを
含まないそしてまた有害なりａも含まないカゼインホス
ホペプチド含有素材を製造することが可能になる。

この発明によって得られるホスホペプチドの一部又は全
ては、キトサンとの静電的相互作用により結合した状態
で回収されるが、試験例１で述べたように、　ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏの実験によるカルシウム可溶化能は、カルシウ
ム−エチルアルコール沈殿法によるホスホペプチドの７
０％位となっている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カゼインからなる及び／又はカゼインをベースとし
   た原料にプロテアーゼを作用せしめ、得られた蛋白分解
   物をキトサンで処理して酸性ペプチド−キトサン複合体
   を生成せしめ、これを分離することを特徴とするホスホ
   ペプチド含有新素材の製造法。 ２、キトサンの使用量がカゼイン１０ｇ当り０．０１〜
   １０ｇ、好適には０．０５〜２ｇであることを特徴とす
   る請求項１に記載の製造法。 ３、酸性ペプチド−キトサン複合体を遠心分離及び／又
   は濾過によって回収することを特徴とする請求項１又は
   ２のいずれかに記載の製造法。