CN107260639A - 一种富含自体生长因子的凝胶修复面膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种富含自体生长因子的凝胶修复面膜及其制备方法，其主要成分为血小板生长因子溶液和激活剂；血小板生长因子溶液包括血小板源生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子中的至少一种。由血小板血浆进行冻干处理成冻干血小板，保留大量生长因子；使用生理盐水将冻干血小板复水化后，加激活剂激活血小板，倒入面膜模具中静置即可获得本发明所述面膜。本发明提供的面膜所采用的血小板生长因子来自使用者自体，可杜绝传染病的发生；使用的血小板生长因子丰富且能促进创面的愈合，对面部整形的修复、面部粉刺、疤痕的修复、面部除斑、甚至面部烧伤烫伤的恢复疗效良好，是一种安全可靠、有效的面部修复面膜。

Description

一种富含自体生长因子的凝胶修复面膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种富含自体生长因子的凝胶修复面膜及其制备方法。
背景技术
现代科学技术的飞速发展和广泛应用，给美容化妆品行业带来了全新的发展机遇，护肤品已经从化学美容、植物美容向生物美容、基因美容发展。生物护肤品的主要成分生物活性多肽大部分是细胞生长因子，它们在体内含量极微，但生物活性极高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，直接或间接地影响多种类型细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移，在美容护肤、整形外科、烧伤溃疡以及各种皮肤病的伤口修复与愈合中有重要作用。
现在市面的水凝胶面膜是一种采用天然植物精华，结合高分子生物融合技术而制成的新一代胶原体面膜。它以水为分散介质，当把凝胶贴到皮肤上时，受到体温的影响，凝胶内部的物理结构从固态变成液态后渗透到皮肤里。因此，在以水凝胶为基底材质的面膜里注入胶原蛋白、透明质酸、熊果苷、烟酰胺等有效成分，可制成多种功能的面膜，对皮肤起到保湿、美白、控油等作用，只能用于平时的护肤或激光美容后皮肤的消肿，远远起不到皮肤修复、促进创面愈合的作用。市面上也有一种含自体脂肪干细胞的生物美容面膜，对皮肤修复可以达到一定效果，但是使用时要取琼脂糖加入生理盐水后加热溶解，待温度降至40度时再加入富含血小板的血浆和自体脂肪干细胞，制备方法繁琐，不能让使用者在家庭就可自行操作使用，降低了此类面膜的实用性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种富含自体生长因子的凝胶修复面膜及其制备方法，该面膜的制备方法简单，适合使用者在家庭自行操作使用。
为解决上述问题，采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供的一种富含自体生长因子的凝胶修复面膜，主要成分为血小板生长因子溶液和激活剂；所述血小板生长因子溶液包括血小板源生长因子(PDGF-BB)、转化生长因子(TGF-beta1)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)中的至少一种生长因子。
所述激活剂包括葡萄糖酸钙和凝血酶。所述激活剂为用5ml葡萄糖酸钙溶解500U凝血酶所配制的溶液。
所述血小板生长因子溶液为用生理盐水将冻干血小板复水化后所得的溶液(具体可以是：4ml富血小板血浆冻干后成冻干血小板，4ml生理盐水复融冻干血小板即得)。
所述血小板生长因子溶液与激活剂的体积比为10:1。
所述血小板生长因子溶液中的生长因子来自于使用者自体的血液。
所述血小板来源生长因子(PDGF-BB)浓度为76.2991pg/ml；转化生长因子(TGF-beta1)浓度为6.3651pg/ml；血管内皮生长因子(VEGF)浓度为1327.2148pg/ml；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)浓度为1091.2374pg/ml。
一方面，本发明提供的一种富含自体生长因子的凝胶修复面膜的制备方法，具体包括如下步骤：
A)激活剂的配制：将葡萄糖酸钙和凝血酶配制成激活剂后分装到无菌试管内，保存；
B)面膜制备：将分装好的生理盐水注入装有冻干血小板的冻干瓶内，轻微振荡至完全溶解后得血小板生长因子溶液，注入激活剂，轻微振荡后倒入面膜模具中静置，获得富含自体生长因子修复凝胶面膜；所述冻干血小板富含血小板生长因子。
进一步地，所述血小板生长因子溶液为用4ml生理盐水将冻干血小板复水化后所得的溶液，其中，冻干血小板由4ml富血小板血浆冻干得到。
进一步地，所述激活剂保存于4℃的冰箱。
进一步地，所述静置的时间为10～15分钟。
进一步地，所述冻干血小板的制备过程如下：
1)采集面膜使用者全血，离心后取上层血清，继续离心取下层富血小板血浆汇集细胞，制备成富血小板血浆；
2)取富血小板血浆离心，弃上清，取与弃去上清同体积的预处理液，调pH，过滤后重悬血小板，振荡水浴后，将血小板悬液再次离心，弃上清留沉淀，用与弃去上清同体积的冻干液，调pH，过滤后，重悬血小板得血小板悬液；所述冻干液为冻干缓冲液与前列腺素混合制备而成；
3)将步骤2)所得血小板悬液转移到冻干瓶，置于超低温冰箱中预冻过夜，次日将冻干瓶移入冻干机进行真空干燥，制备成冻干血小板，密封保存。
进一步地，所述预处理液制备过程如下：将NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、NaHCO3、柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸钠、葡萄糖置于容器中，加超纯水溶解后并定容至1L，加入1ul/ml可逆性血小板激活抑制剂前列腺素E1(PGE1)，然后加入NaHCO3调节pH为6.6～6.8，然后用0.22um滤器过滤后备用。
进一步地，所述预处理液中，NaCl的浓度为3.214g/L、KCl浓度为0.157g/L、CaCl2浓度为0.078g/L、MgSO4浓度为0.271g/L、NaHCO3浓度为2.604g/L、柠檬酸浓度为0.714g/L、柠檬酸钠浓度为1.970g/L、乙酸钠浓度为1.230g/L、葡萄糖浓度为2.120g/L、海藻糖浓度为17.117g/L、PGE1浓度为1ul/ml。
进一步地，所述冻干缓冲液的制备过程如下：向预处理液中加入体积分数为30％的蛋白质保护剂后混匀制得冻干缓冲液。
进一步地，所述蛋白质保护剂与预处理液的体积比为3:10。
进一步地，所述激活剂为用5ml葡萄糖酸钙溶解500U凝血酶所配制的溶液；所述血小板生长因子溶液与激活剂的体积比为10:1。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1)本发明提供富含自体生长因子的凝胶修复面膜，其主要由取自自体血液制备而成的血小板血浆进行冻干处理成冻干血小板，保留大量生长因子；使用生理盐水将冻干血小板复水化后，加激活剂激活血小板，倒入面膜模具中静置即可获得富含自体生长因子修复凝胶面膜。该面膜所采用的血小板生长因子来自使用者自体，可杜绝传染病的发生；所使用的血小板生长因子丰富，且能促进创面的愈合，对面部整形的修复、面部粉刺、疤痕的修复、面部除斑、甚至面部烧伤烫伤的恢复具有良好的疗效，是一种安全可靠、有效的面部修复面膜。
2)本发明提供的制备方法简单，操作方便，使用者完全可以在家中自形操作使用，实用性强，制备过程简单，市场前景广阔。
附图说明
图1为冻干血小板样品；
图2为面膜模具的示意图。
图3为富含自体生长因子凝胶修复面膜的外貌随时间变化情况的图。
图4为FDP、PPP及红霉素对痤疮丙酸杆菌的抑菌实验效果图(纸片扩散法)：
图4中:1FDP；2红霉素；3PPP。
图5为FDP、PPP及红霉素组抑菌圈直径均数比较图。
图6为重复给药毒性试验中新西兰白兔FDP组涂敷区皮肤状况及其与对照组(BC组)比较图。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不受下述实施例的限定。
实施例1富含自体生长因子的凝胶修复面膜的制备
(1)溶液配制：
1)预处理液的配制：将3.214g NaCl、0.157g KCl、0.078g CaCl2、0.271g MgSO4、2.604g NaHCO3、0.714g柠檬酸、1.970g柠檬酸钠、1.230g乙酸钠、2.120g葡萄糖、17.117g海藻糖精确称量后于锥形瓶中，加超纯水溶解后以超纯水定容至1L，并加入1ul/ml可逆性血小板激活抑制剂前列腺素E1(PGE1)，然后加入NaHCO3来调节pH为6.6～6.8，然后用0.22um滤器过滤后备用；
2)冻干缓冲液的配制：往制备的预处理液中加入体积分数为30％(vol/vol)的蛋白质保护剂，蛋白质保护剂与预处理液的体积比为3:10，制成冻干缓冲液，然后加入NaHCO3来调节pH为6.6～6.8，然后用0.22um滤器过滤后备用；
(2)富血小板血浆采集：
用抗凝管采集面膜使用者全血30ml，将抗凝管在1500rpm速度下离心10min，离心后，抗凝管上层为血清，下层为白细胞、红细胞及部分血小板，提取上层血清约13ml，预留8ml血清后，将剩余5ml血清放入另一无菌试管内以3000rpm速度进行离心20min，二次离心后上层为贫血小板血浆，下层为富血小板血浆汇集细胞，将上层贫血小板血浆吸出后，用预留的血清重悬富血小板血浆汇集细胞，并调节血小板计数为1000×109/L(约为原始血小板计数的三倍)，制备成8ml富血小板血浆。按每瓶4ml富血小板血浆进行分装。
(3)血小板冻干前预处理：
将分装好的4ml富血小板血浆在速度3000rpm下离心20min，弃上清留沉淀，加入与弃去上清同体积的预处理液37℃振荡水浴4h，使血小板保持悬浮状态。水浴后，将血小板悬液再以3000rpm离心20min，弃上清留沉淀，加入与弃去上清同体积的冻干液。
(4)血小板悬液冻干：
将预处理后血小板悬液转移到冻干瓶(硅化玻璃瓶)中，每瓶4ml(厚度不超过1.5cm)，置于－80℃超低温冰箱中预冻过夜，次日将样品从冰箱取出移入已经降至-45℃的冻干机进行真空干燥，冷阱温度为-45±5℃，真空度为＜133mbar，真空干燥24h后取出，制备成冻干血小板(见图1)，将其密封后置于室温或冰箱4℃保存。
(5)富含自体生长因子凝胶修复面膜的制备：
激活剂的配制：用5ml葡萄糖酸钙溶解500U凝血酶所配制而成，每瓶0.4ml分装到无菌试管内，冰箱4℃保存。
生理盐水的配制：将生理盐水按每瓶4ml分装到无菌试管内，可常温或冰箱4℃保存。
将分装好的4ml生理盐水注入装有冻干血小板的冻干瓶内，轻微振荡至完全溶解，使其复水化。复水化后再注入0.4ml激活剂，轻微振荡后倒入面膜模具(面膜托)(见图2)中静置10～15分钟，即可获得富含自体生长因子修复凝胶面膜。
在实际生活中，可以直接购买分装好的激活剂和生理盐水。
实施例2
将本发明制备的富含自体生长因子的凝胶修复面膜通过酶标仪(Multiskan Mk3型)对其能促进创面愈合的相关生长因子浓度进行检测，
冻干前和冻干激活后，其血小板来源生长因子(PDGF-BB)、转化生长因子(TGF-beta1)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的浓度如下表1。富含自体生长因子凝胶修复面膜激活后放置时间与相关生长因子浓度关系的检测结果见表1：
表1：
从表1可知，凝胶面膜在60分钟内均能有效释放各种生长因子。
图3为放置10min、20min、30min、40min、50min、60min后的富含自体生长因子凝胶修复面膜，已形成凝胶并有富含生长因子的富血小板血浆持续释放。根据一般面膜的使用时间观察，敷在皮肤表面20分钟后皮肤仍保持水分，不干燥。
实施例3
一、冻干富血小板血浆对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌实验研究
1材料与方法
1.1实验菌株购自上海复祥生物科技有限公司的痤疮丙酸杆菌标准株(编号：ATCC6919)。
1.2仪器和试剂血细胞分类计数仪(深圳迈瑞)，HWS-250型恒温恒湿培养箱(上海精宏)，AG015厌氧罐(北京恒奥)，TA-XJ麦氏比浊仪(北京天安)，PC-420D磁力搅拌器(CORNING)，0114deli单孔打孔机(得力集团)，新华1号定性滤纸(杭州新华纸业)，脑-心浸萃液态培养基(广东环凯)，红霉素肠溶片(规格:0.125g，广东华南)。
1.3菌种培养、鉴定及保存将痤疮丙酸杆菌菌种接种于厌氧脑心浸液平板，放入厌氧罐(厌氧罐中的条件为：10％CO2，10％H2，80％N2)，置37℃恒温恒湿培养箱48h。取出细菌培养物，制备细菌涂片，进行革兰染色后在油镜下观察细菌基本形态，见到革兰阳性杆菌，棒状或略弯曲，染色不均，呈X、Y和V形排列，可初步确定为痤疮丙酸杆菌。挑取平板上单个菌落置于厌氧脑心浸液培养基混匀成菌悬液，取细菌悬液注射入厌氧血培养瓶，放入37℃摇床中摇动培养。待细菌充分生长后，取血培养瓶中的菌液和甘油混合，放置-80℃冰箱保存，备用。
1.4冻干富血小板血浆板(freeze-dried platelets，FDP)的制备：采集20例(男12例，女8例；年龄范围17-42岁)健康献血者全血，制备成冻干富血小板血浆，制备和激活具体操作同实施例1。
1.5红霉素溶液的制备将红霉素肠溶片去肠溶衣层后溶于纯水，配制成浓度为3.4mmol/L的红霉素溶液，过滤除去不溶物，高压蒸汽灭菌后，按1：2000比例用无菌水稀释为终浓度为0.0017mmol/L的红霉素溶液，置4℃冰箱保存，备用。
1.6药敏片的制备用打孔器将定性滤纸制成直径6mm的圆形纸片，高压蒸汽灭菌，备用。在超净台内，将圆形无菌滤纸片分别浸入激活后的冻干富血小板血浆(FDP)、激活后的冻干贫血小板血浆(PPP)和红霉素溶液中，30min后取出，阴干，备用。
1.7抑菌实验(纸片扩散法)用灭菌接种环挑取培养48h的厌氧脑心浸液平板上的痤疮丙酸杆菌菌落，置于无菌生理盐水中，制成细菌悬液。校正其浊度为0.5麦氏单位。用无菌棉签沾取菌液，均匀涂布于厌氧脑心浸液平板，干燥3-10min后分别贴上将红霉素药敏片、FDP药敏片和PPP药敏片。放入厌氧罐(厌氧罐中的条件为：10％CO2，10％H2，80％N2)，置于37℃恒温恒湿培养箱培养48h，取出，观察结果。
1.8结果判读用十字交叉法测量药敏片抑菌圈的直径，抑菌圈直径＝测量直径平均数-6mm，各测量3次取其平均值。参考抗生素药敏实验等级划分标准判断药敏实验结果。
1.9统计方法使用SPSS20.0统计软件进行统计分析，组间均数比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05有统计学意义。
2结果
2.1血小板浓度的检测用血细胞计数仪对20例全血、FDP和PPP中的血小板分别进行计数测定，其血小板浓度(×109/L)分别为246.05±45.52、1 072.55±83.23、9.9±11.14，与全血相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
2.2对痤疮丙酸杆菌的抑菌结果:FDP对痤疮丙酸杆菌标准株的抑菌效果明显，见图4、5。FDP、红霉素和PPP组的抑菌圈大小(mm)分别为为:15.37±0.7470、21.05±0.6226和4.55±0.3567。抑菌圈直径均数比较采用单因素方差分析(F＝196.581，P＜0.001)。两组间比较采用SNK-q检验组与FDP组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，与红霉素组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。可见FDP有抑制痤疮丙酸杆菌的作用(FDP、PPP及红霉素对痤疮丙酸杆菌的抑菌实验效果见图4；FDP、PPP及红霉素组抑菌圈直径均数比较见图5。)。参考抗生素药敏实验等级划分的判断标准，FDP对痤疮丙酸杆菌标准株的抑菌效果属于高敏。
二、冻干富血小板血浆用于动物创面治疗的初步安全性评价
1材料与方法
1.1实验动物：1)SPF级雄性SD大鼠10只，50-60(52.60±1.43)日龄，体重300-350(325.30±8.34)g[广东省医学实验动物中心提供，实验动物许可证号:SCXK(粤)2011-0015，合格证号:NO44002100003842，设施合格证号:SYXK(粤)2014-0100]。2)普通级雄性成年新西兰白兔32只，体重2.5-3.0(2.86±0.17)kg[广州市花都区花东信华实验动物养殖场提供，实验动物许可证号:SCXK(粤)2014-0023，合格证号:NO 44007600001848，设施合格证号:SYXK(粤)2014-0100]。实验符合动物伦理要求，10只SD大鼠实验前进入28℃恒温洁净实验室笼养1周，32只新西兰白兔实验前普通环境实验室笼养1周，由广州军区广州总医院动物实验室提供专用饲料喂养，自由饮水。
1.2实验药物冻干富血小板血浆的制备：采集20例(男15例，女5例；年龄范围17-42岁)健康献血者全血，制备成冻干富血小板血浆，制备和激活具体操作同实施例1。
1.3主要仪器及试剂血细胞计数仪(BC-300，深圳迈瑞)；模块全自动生化分析仪(MODULARP-800，瑞士罗氏):摊片烤片机(CS-VI)、生物组织机(孝感市宏业医用仪器有限公司)；全自动生物组织脱水机(LS-3050，沈阳市龙首电子仪器有限公司)；显微镜载玻片(10227105P，批号2014227，江苏世泰实验器材有限公司)；石蜡切片机(HM315R，德国Micro)；显微镜(BX-51，日本OLYMPUS)；中性树胶(批号2013112，上海懿洋仪器有限公司)；苏木素染液(CO132，500mL)、伊红染液(CO133，500mL)(上海倍卓生物有限公司)。
1.4单次皮肤刺激试验首次涂抹前24h对大鼠背部两侧皮肤做脱毛处理，消毒皮肤，在背部左侧皮肤涂抹复水化的FDP(FDP实验组，简称FDP组)，右侧皮肤涂抹0.9％生理盐水(NS)作为空白对照(简称BC组)；4h后用无菌生理盐水清洁动物皮肤，除去残留受试物。于除去残留受试物后1、24、48及72h在自然光线下观察皮肤是否出现水肿及红斑。对大鼠皮肤刺激反应评分，并计算各只大鼠每天的平均积分，通过积分值判断大鼠皮肤刺激强度。
1.5重复给药毒性试验试验前24h将新西兰白兔背部褪毛并清洁皮肤后随机均分为FDP与BC组。用手术刀在每只白兔背部皮肤沿垂直脊柱方向作两竖划痕，划痕深度以皮肤渗血为宜；直接在FDP组白兔皮肤破损处涂抹复水化的FDP，BC组涂抹生理盐水，涂抹1次/d，连续涂抹28d，每天观察涂抹后动物是否出现流涎、呕吐、粪便异常及体重减轻。首次涂抹前和涂抹后7、14、21及28d采血(3mL/只)做血常规、相关血液生化指标检查，并观察实验动物涂敷部位皮肤及其周围乃至全身皮肤变化。
1.6实验观察指标1)单次皮肤刺激试验观察指标:于除去残留涂抹物后1、24、48及72h在自然光线下观察2组动物涂抹区皮肤是否出现刺激反应，如水肿、红斑，并拍照。2)重复给药毒性试验指标:(1)一般观察及体重监测，于试验期间每日观察动物是否出现一般行为异常，如流涎、呕吐、粪便异常及死亡情况，分别于首次涂敷前和涂抹后d7、d14、d21及d28，称量体重，比较2组动物体重变化；(2)标本获取及处理，于涂敷前和试验周期d7、d14、d21及d30采血3mL/只，做血常规及血生化指标检测，血常规监测指标包括WBC、RBC、Hb、Hct及Plt；血生化监测指标包括谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。
1.7统计学处理采用SPSS20.0统计学软件，计量资料用“均数±标准差”表示，(表示平均值)，对白兔(非啮齿类动物)血常规和生化指标的重复测量资料，先用球对称检验判断资料之间的相关性，然后用重复测量方差分析做组间和各组内不同时间点的比较，注意不满足球对称的数据，组内差异F值需要校正，P＜0.05或＜0.01为差异有统计学意义。
2结果
2.1单次皮肤刺激试验试验中的SD大鼠涂敷区皮肤没有出现红斑、水肿及渗出等刺激反应，2组大鼠刺激反应分值均为0。FDP局部使用对实验动物皮肤没有明显刺激反应。
2.2重复给药毒性试验
2.2.1FDP对新西兰白兔一般行为及体重的影响试验中的新西兰白兔没有出现一般行为异常和死亡，涂敷区皮肤未出现明显红斑、水肿(具体参见图6)；FDP组及空白对照组白兔均未出现体重减轻(表2)。
表2重复给药毒性试验中新西兰白兔FDP涂敷后体重变化及其与对照组比较(n＝16，kg)
分组 d0 d7 d14 d21 d28
FDP组 2.95±0.12 3.11±0.12 3.17±0.20 3.10±0.13 3.14±0.12
BC组 2.78±0.18 3.08±0.15 3.12±0.22 3.08±0.14 3.03±0.12
2.2.2FDP对新西兰白兔血常规和生化主要指标的影响及其与对照组的比较见表3和表4。
表3 FDP组新西兰白兔血常规主要指标的变化(n＝16，kg)
d0 d7 d14 d21 d28
WBC(×109/L) 10.08±1.50 12.20±1.28 8.63±1.71 6.90±1.21 7.60±1.36
RBC(×1012/L) 5.88±0.28 6.98±1.3. 5.32±0.48 5.65±0.20 5.35±0.09
Het(％) 38.9±2.24 45.73±10.80 34.28±2.10 38.83±1.89 36.38±0.43
Hb(g/L) 132.25±8.66 150.75±32.78 115.75±6.45 130.25±6.70 126.25±2.06
Ph(×109/L) 417±113.63 251±41.62 305±117.87 336±96.97 342±109.06
注：5个时间点WBC检测值比较，F＝6.534，P<0.01；两两之间多重比较用LSD-t检验，*与d14，d21，d28比较，P<0.05.
表4 BC组新西兰白兔血常规主要指标的变化(n＝16，)
2.2.3FDP对新西兰白兔血主要生化指标的影响及其与对照组的比较见表5和6。
表5 FDP对新西兰白兔血液主要生化指标的影响(n＝16，)
d0 d7 d14 d21 d28
ALT(U/L) 84.75±31.46 59.25±29.53 59.85±14.83 73.5±43.29 29.5±23.64
TP(g/L) 58.53±2.41 57.23±3.31 53.13±13.24 63.35±8.47 58.3±4.52
ALB(g/L) 34.68±1.64 32.95±1.52 33.39±0.89 35.20±1.95 33.89±2.87
GLU(mmol/L) 7.26±0.50 6.78±0.82 7.43±0.40 7.723±0.45 6.23±1.51
Cr(μmol/L) 75.25±3.95*# 76.75±9.57*# 85.83±7.17*# 94.33±7.76*# 45.05±7.76*#
BUN(mmol/L) 8.65±0.96 6.95±1.24 8.77±0.25 6.72±1.60 4.67±3.33
注：5个时间点Cr和ALT检测值比较，F＝24.424，P<0.01；两两之间多重比较用LSD-t检验，*与d21比较，P<0.05，与d28比较，P<0.05
表6 BC组新西兰白兔血液主要生化指标的变化(n＝16，)
d0 d7 d14 d21 d28
ALT(U/L) 76.33±37.07 80.67±38.89 54.00±43.09 67.67±25.01 51.00±51.16
TP(g/L) 54.43±1.76 54.27±2.19 55.35±3.45 62.07±2.90 55.37±5.65
ALB(g/L) 33.17±1.00 31.77±0.70 32.70±1.20 35.73±1.10 33.73±1.92
GLU(mmol/L) 7.87±0.42 6.80±0.53 9.60±9.08 8.00±0.62 6.30±2.30
Cr(μmol/L) 80.00±14.53 79.67±14.84 75.00±11.00 85.33±8.96 46.00±6.0*
BUN(mmol/L) 7.43±1.19 8.17±2.17 8.13±0.55 5.23±1.25 6.5±4.50
注：5个时间点Cr检测值比较，F＝5.487，P<0.05；两两之间多重比较用LSD-t检验，*与d0，d21比较，P<0.05
在本组FDP安全性的动物实验中，单次皮肤刺激试验未见FDP引起SD大鼠皮肤出现红斑、水肿及渗出，说明FDP对完整皮肤无刺激作用。重复给药毒性试验，动物创伤模型新西兰白鼠创面涂敷FDP后未出现一般行为异常和死亡，涂敷区皮肤未见红斑、水肿，动物体重亦未减轻(参见图6和表2)，推测FDP长期涂敷对白兔皮肤无明显毒性反应。血液主要血常规及生化指标在一定程度上反映了动物代谢及生理机制状况，分别检测实验白兔的血常规和血生化指标。血常规中3项红细胞类指标(RBC、Hb、Hct)在FDP组和BC组动物均正常(P＞0.05)(参见表3和表4)，显示FDP不会造成创伤动物模型RBC的明显变化。FDP组动物d7时，WBC与试验前相近(P＞0.05)，而明显高于d14、d21、d28时的WBC(P＜0.05)(表3)。d7对动物采血时，动物创口尚未痊愈，受疼痛刺激而导致血液WBC暂时性升高，而到2周时，创口基本痊愈，状态恢复正常，WBC回到正常水平。实验过程中监测的6项生化指标中，FDP组与BC组动物的ALT、TP、ALB、GLU、Cr和BUN检测结果相近(P＞0.05)(参见表5和表6)，说明FDP没有引起实验动物这些生化指标的明显改变；组内出现了少数指标波动，但没有生物学意义。只有FDP组新西兰白兔在d21明显高于d7，可能是在此时间点实验时动物剧烈挣扎导致一过性增高；两组动物到了d28时，Cr值均降低，在正常值范围内，没有生物学意义(表5)。FDP组可见d28时ALT和BUN值较其他时间点均减低，数值水平上波动明显，但是统计分析显示5个时间点ALT和BUN值相互之间差异不明显(P＞0.05)，ALT和BUN值降低没有生物学意义。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种富含自体生长因子的凝胶修复面膜，其特征在于，所述凝胶修复面膜的主要成分为血小板生长因子溶液和激活剂；所述血小板生长因子溶液包括血小板源生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子中的至少一种生长因子；
所述激活剂包括葡萄糖酸钙和凝血酶。
2.根据权利要求1所述的富含自体生长因子的凝胶修复面膜，其特征在于，所述血小板生长因子溶液为用生理盐水将冻干血小板复水化后所得的溶液，所述冻干血小板由富血小板血浆冻干得到。
3.根据权利要求1所述的富含自体生长因子的凝胶修复面膜，其特征在于，所述血小板生长因子溶液与激活剂的体积比为10:1。
4.根据权利要求1所述的富含自体生长因子的凝胶修复面膜，其特征在于，所述血小板来源生长因子浓度为76.2991pg/ml；转化生长因子浓度为6.3651pg/ml；血管内皮生长因子浓度为1327.2148pg/ml；碱性成纤维细胞生长因子浓度为1091.2374pg/ml。
5.一种富含自体生长因子的凝胶修复面膜的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
A)激活剂的配制：将葡萄糖酸钙和凝血酶配制成激活剂后分装到无菌试管内，保存；
B)面膜制备：将分装好的生理盐水注入装有冻干血小板的冻干瓶内，轻微振荡至完全溶解后得血小板生长因子溶液，注入激活剂，轻微振荡后倒入面膜模具中静置，获得富含自体生长因子修复凝胶面膜；所述冻干血小板富含血小板生长因子。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述血小板生长因子溶液为用4ml生理盐水将冻干血小板复水化后所得的溶液，其中，冻干血小板由4ml富血小板血浆冻干得到。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述冻干血小板的制备过程如下：
1)采集面膜使用者全血，离心后取上层血清，继续离心取下层富血小板血浆汇集细胞，制备成富血小板血浆；
2)取富血小板血浆离心，弃上清，取与弃去上清同体积的预处理液，调pH，过滤后重悬血小板，振荡水浴后，将血小板悬液再次离心，弃上清留沉淀，用与弃去上清同体积的冻干液，调pH，过滤后，重悬血小板得血小板悬液；所述冻干液为冻干缓冲液与前列腺素混合制备而成；
3)将步骤2)所得血小板悬液转移到冻干瓶，置于超低温冰箱中预冻过夜，次日将冻干瓶移入冻干机进行真空干燥，制备成冻干血小板，密封保存。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述预处理液制备过程如下：将NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、NaHCO3、柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸钠、葡萄糖置于容器中，加超纯水溶解后并定容至1L，加入1ul/ml可逆性血小板激活抑制剂前列腺素E1，然后加入NaHCO3调节pH为6.6～6.8，然后用0.22um滤器过滤后备用。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述冻干缓冲液的制备过程如下：向预处理液中加入体积分数为30％的蛋白质保护剂后混匀制得冻干缓冲液。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白质保护剂与预处理液的体积比为3:10；
所述激活剂为用5ml葡萄糖酸钙溶解500U凝血酶所配制的溶液；
所述血小板生长因子溶液与激活剂的体积比为10:1；
所述激活剂保存于4℃的冰箱；
所述静置的时间为10～15分钟。
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