CN108743514A - 一种延长皮肤衰老功能改善的组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种延长皮肤衰老功能改善的组合物及其制备方法，它涉及一种组合物及其制备方法，本发明要解决已有技术对皮肤的紫外色斑、棕色斑去除效果不佳、对胶原蛋白分泌持续的效果差以及局部单纯因子注射液粘度差、对基底组织支撑作用弱、对细胞组织平衡能力差等造成的短期效果不明显，长期效果不持久等多种问题。本发明的组合物有效成分包括血小板因子，成纤维细胞，低分子量透明质酸，层粘连蛋白,超氧化歧化酶,葡萄糖酸钠，醋酸钠，氯化钠、氯化钾和氯化镁。本发明可以延长皮肤衰老功能改善的作用。经过本组合应用，可以延长单纯血小板因子、单纯成纤维细胞对皮肤衰老功能改善的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗衰老组合物及其制备方法。
背景技术
皮肤衰老是由自身原因及外界环境共同导致的。人出生后皮肤组织日渐完善，功能日渐强化，但当达到某一时期就会开始退化，这种退化往往没有突出的外在体现而是无察觉中慢慢进行。一般人类年龄达到25岁时，皮肤的生长将伴随着老化同时进行，随着时间推移30岁开始皮肤老化越来越明显。皮肤衰老主要表现在皮肤干燥、粗糙、色素沉积、松弛至渐渐产生色斑及皱纹。衰老后的皮肤角质层保护屏障能力下降，成纤维细胞逐渐减少，皮肤中胶原含量降低，皮脂腺分泌量降低，皮肤血液循环减少，营养供给不足。加之不良生活习惯及外界糟糕的环境影响，皮肤衰老的进程难以暂停甚至倒转。
目前美容业界延缓皮肤衰老的手段繁多，例如单纯填充胶原蛋白、线雕、拉皮等方法，虽然能够短期改善皮肤衰老症状，但是由于这些外来填充物在体内代谢快，需要经常、反复填充，同时因为这些物理填充造成短时视觉上的皮肤充盈和弹性实质上长期造成的皮肤真皮组织与皮下组织的分离、缺乏弹性、僵硬等众多不良反应，反而会加速皮肤老化，久而久之患者进入对这些美容方法的恶性依赖性循环。良好的皮肤改善，一定是在细胞层面的活化和再生修复，同时也是更安全、可靠的方法。间充质干细胞，包括脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞胎盘间充质干细胞，均来源于中胚层，是具有多向分化能力的干细胞，在组织再生方面具有重要作用。但是由于干细胞命运控制的复杂性、体内定植、体内分化或不定向分化等安全性问题，目前将体外扩增的间充质干细胞用于临床医学美容还属于尝试阶段。成纤维细胞是组成皮肤真皮的主要细胞，由于其可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及其他有机基质(主要成分为蛋白多糖)，对于保持皮肤弹性、强度具有十分重要的作用。但是成纤维细胞旁分泌的能力弱，单纯采用自身的成纤维细胞移植对局部皮肤文理、皱纹、分泌胶原按摩等有改善作用且安全，但是对皮肤的紫外色斑、棕色斑效果不佳；另外单纯的成纤维细胞移植后会因为机体环境的改变善，而逐渐降低胶原蛋白的分泌，因此持续的效果差，需要反复注射，方可维持良好的抗衰老的效果；若单独进行细胞因子注射，或者血小板血浆注射，由于其粘度差，对基底组织起不到支撑作用，因此会产生短期效果不明显，长期效果不持久等问题。
发明内容
本发明为了解决上述的问题，发明一种可以延长抗衰老效果的组合及其制备方法。
本发明的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物，它的有效成分包括质量百分含量为40～50％的血小板因子、浓度为2～10×107个/mL的成纤维细胞、质量百分含量为20～30％的低分子量透明质酸、浓度为1～10μg/mL层粘连蛋白、浓度为20～50ng/mL的超氧化歧化酶、浓度为5～5.5mg/mL的葡萄糖酸钠、浓度为2～2.5mg/mL的醋酸钠、5～5.5mg/mL的氯化钠、浓度为0.3～0.5mg/mL的氯化钾和浓度为0.1～0.2mg/mL的氯化镁。
本发明的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物的制备方法，它是按照以下步骤进行的：
一、血小板因子制备：
1)采用含有柠檬酸钠抗凝剂的采血袋采全血，在室温下，按照与全血体积比为5～7:1的比例向装有全血的采血袋中加入分子量为400000～700000D的质量百分含量为5.5％～6.5％的羟乙基淀粉溶液，充分混匀后自然沉降1h，将沉降的红细胞弃除，袋中液体混匀后，在800～1100x g的条件下室温离心20min，将袋中上清液上层的2/3排出并收集作为A液；向剩在袋中的液体中加入与剩余液体等体积的含有2μM前列腺素E1、0.4U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，混匀，作为B液；
2)在安全柜中，将体积百分含量为30％Percoll生理盐水溶液置于离心管内，按体积比为2:1的比例加入B液，在室温、300～500x g的条件下离心15～25min；离心后将下层白细胞层去掉，剩余液体在室温、800～1600x g的条件下离心15～25min；离心后将上清液弃掉，沉淀用生理盐水洗涤后，加入体积为采集全血体积1/10的A液，混匀，作为C液；
3)向C液中加入浓度为0.05～5mg/mL的无菌葡萄糖酸钙溶液，混匀后放置于30℃恒温孵育1～4h，取出后在4℃、1500～3000x g的条件下离心15～45min，去除析出的纤维蛋白，作为D液；
4)将盛装D液的离心管置于超声波冰水浴中，先在超声波强度为150～250W/cm2的条件下，处理15～60s，间歇15～60s后，再以300～400W/cm2超声波强度处理15～60s；再经0.22μm针头滤器过滤后，即为不含白细胞、不含纤维蛋白原、无血小板碎片的血小板因子溶液；
二、成纤维细胞制备：
5)将眼皮组织的真皮层切割成0.5～1.5mm2的块，在37℃无菌条件下，用混合胶原酶对皮肤组织进行消化30min后，停止消化；其中，混合胶原酶是由质量百分含量为0.5％的胶原酶I和质量百分含量为0.5％的胶原酶IV混合而成；
6)将消化完成的组织块漂洗3次，接种于培养板底部，且组织块的表皮面朝上，置于培养箱中干涸稳固1-2h后，向瓶内加入含体积百分含量为1～3％的由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液，使之刚好浸润组织块，然后将培养瓶置于温度为37℃、体积百分含量为5％的CO2细胞培养箱中培养，培养5～7天后更换新鲜含1～3％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液；待细胞爬出后，每3～5天换一次新鲜含1～3％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液；
7)通过细胞刮刀切割传代法，将组织块连带周围内圈角朊细胞切割、去除，将剩余的成纤维细胞刮散并置于培养板中，加入2mL含体积百分含量为4～5％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液，使细胞浓度在4～5×104/mL；待细胞密度达70％，进行传代、扩增，直至培养至P4-P5代，收获细胞；
三、组合物制备：
8)向步骤一制备的血小板因子中，加入透明质酸、层粘连蛋白、超氧化歧化酶、葡萄糖酸钠、氯化钾、氯化钠、三水合醋酸钠和六水合氯化镁，混匀后，得E液；
其中，E液中血小板因子溶液的质量百分含量为40～50％，低分子量透明质酸的质量百分含量为20～30％，层粘连蛋白的浓度为1～10μg/mL，超氧化歧化酶的浓度为20～50ng/mL，葡萄糖酸钠的浓度为5～5.5mg/mL的，醋酸钠的浓度为2～2.5mg/mL，氯化钠的浓度为5～5.5mg/mL，氯化钾的浓度为0.3～0.5mg/mL和氯化镁的浓度为0.1～0.2mg/mL；
9)将步骤二培养的P4-P5代成纤维细胞用质量百分含量为0.25％的胰酶替代物TrypLE Express在37℃条件下消化2min后，收集细胞，用生理盐水洗涤两次，在180x g的条件下离心5min，弃上清，沉淀即为成纤维细胞；
10)向步骤9)成纤维细胞中加入8)的E液，使得成纤维细胞浓度为2～10×107/mL，即得延长皮肤衰老功能改善的组合物。
本发明包含以下有益效果：
1.本发明血小板因子的制备方法区别于普通的PRP和血小板裂解液，既包含了血小板中释放的大量因子、包含了血浆中的营养成分，但是又去除了血浆中的纤维蛋白和血液中的白细胞，因此防止液体的可能出现的析出对应用造成的影响，也防止了白细胞对应用过程中的促炎反应(见图1)。
2.本发明对血小板处理过程中既防止了血小板的凝聚，又在促进血小板因子释放过程中。采用了0.05～5mg/mL的无菌葡萄糖酸钙溶液并将样本置于30℃的恒温孵育1-4小时，组合物中EGF(血小板因子)为3000-5000pg/mL，实现了最佳的EGF因子释放(见表1)。
3.本发明采用的眼皮成纤维细胞扩增办法，可以实现极少量皮肤就获得数量多的成纤维细胞，在培养传代过程中，添加的同一供者的血小板因子，因此细胞适应培养环境快，获得倍增时间短。通过不同的血小板因子浓度，本发明首先在低浓度下促进了成纤维细胞的爬出(见图2)，再用较高浓度的血小板因子，增加了扩增效率(见图4)，获得的成纤维细胞在P4-P5代有最佳的胶原蛋白I的分泌(见图6)。
4.本发明的成纤维细胞原代到P1代过程中采用了机械分离传代方式，减少了成纤维细胞中存在的角朊细胞(见图1、2)，通过流式细胞鉴定，成纤维细胞纯度>98％。(见图5、7)
5.本发明组合物中血小板因子可以促进真皮细胞中的间充质干细胞的激活、扩增、迁移，因此对局部皮肤炎性损伤(斑点、暗沉等)起到修复作用。另外本组合物中的成纤维细胞可以分泌胶原蛋白再加上组合物中的层黏连蛋白的影响，对细小皱纹起到良好的抚平作用。本组合物中的超氧化歧化酶、葡萄糖酸钠、氯化钾、醋酸钠既可以抗氧化作用，同时又可以起到酸碱平衡作用，使得机体保持在一个良好的平衡态。组分中的低分子透明质酸可以起到保湿、增加皮肤的丰满度、增加组合物的粘稠度等。本发明组合物以及制备方法突出的特点就是同一来源血小板因子、成纤维细胞、低分子透明质酸、超氧化歧化酶、层粘连蛋白等最佳配比和协同作用，应用后可淡化色斑、减缓皱纹、提升皮肤光泽度收缩毛孔等改善衰老皮肤状态，呈现不同程度年轻化(见图9、10)。
6.本发明可以延长皮肤衰老功能的改善。经过本组合应用，可以延长单纯血小板因子、单纯成纤维细胞对皮肤衰老功能改善的作用(见表2)。
7.本发明采用了葡萄糖酸钠5.00mg/mL，醋酸钠2.22mg/mL，氯化钾0.4mg/mL，氯化钠5.25mg/mL、氯化钾0.38mg/mL和氯化镁0.14mg/mL多种电解质与组合物中，使得最终的组合物中电解质接近于生理血浆中的电解质成分，因此可以在衰老性皮肤应用后，起到维持体液平衡、纠正组织缺水、纠正电解质紊乱、维持酸碱平衡的辅助作用(见表3)。
附图说明
图1：组合物最终示意图；其中，A为全血图，B为加入羟乙基淀粉沉淀后图，C为血小板因子溶液，D为最终本发明组合物；
图2：组织块细胞爬出图；其中，A为组织块，B为角朊细胞层，C为成纤维细胞层；
图3：组织块剥离图；其中，A为原组织块和角朊细胞层位置，B为成纤维细胞；
图4：P5代成纤维细胞图；
图5：成纤维细胞鉴定结果(波形蛋白表达)图；其中，A为无一抗对照图，B为波形蛋白表达图；
图6：成纤维细胞鉴定结果(胶原分泌)图；其中，A为标准曲线图；B为胶原蛋白I表达情况图；
图7：成纤维细胞鉴定(表面标记物)图；
图8：组合物促进间充质干细胞迁移图；
图9：组合物应用效果图；其中，A为治疗前效果，B为治疗后效果；
图10：患者经本发明治疗前和治疗后皮肤状态的VISIA度数对比图。
具体实施方式
具体实施方式一：一种延长皮肤衰老功能改善的组合物，它的有效成分包括质量百分含量为40～50％的血小板因子、浓度为2～10×107个/mL的成纤维细胞、质量百分含量为20～30％的低分子量透明质酸、浓度为1～10μg/mL层粘连蛋白、浓度为20～50ng/mL的超氧化歧化酶、浓度为5～5.5mg/mL的葡萄糖酸钠、浓度为2～2.5mg/mL的醋酸钠、5～5.5mg/mL的氯化钠、浓度为0.3～0.5mg/mL的氯化钾和浓度为0.1～0.2mg/mL的氯化镁。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是:该组合的pH为6.7～7.4。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是:它的有效成分包括质量百分含量为40～50％的血小板因子、浓度为2～10×107个/mL的成纤维细胞、质量百分含量为20～30％的低分子量透明质酸、浓度为1～10μg/mL层粘连蛋白、浓度为20～50ng/mL的超氧化歧化酶、浓度为5.02mg/mL的葡萄糖酸钠、浓度为2.22mg/mL的醋酸钠、5.25mg/mL的氯化钠、浓度为0.38mg/mL的氯化钾和浓度为0.14mg/mL的氯化镁。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物的制备方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、血小板因子制备：
1)采用含有柠檬酸钠抗凝剂的采血袋采全血，在室温下，按照与全血体积比为5～7:1的比例向装有全血的采血袋中加入分子量为400000～700000D的质量百分含量为5.5％～6.5％的羟乙基淀粉溶液，充分混匀后自然沉降1h，将沉降的红细胞弃除，袋中液体混匀后，在800～1100x g的条件下室温离心20min，将袋中上清液上层的2/3排出并收集作为A液；向剩在袋中的液体中加入与剩余液体等体积的含有2μM前列腺素E1、0.4U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，混匀，作为B液；
2)在安全柜中，将体积百分含量为30％Percoll生理盐水溶液置于离心管内，按体积比为2:1的比例加入B液，在室温、300～500x g的条件下离心15～25min；离心后将下层白细胞层去掉，剩余液体在室温、800～1600x g的条件下离心15～25min；离心后将上清液弃掉，沉淀用生理盐水洗涤后，加入体积为采集全血体积1/10的A液，混匀，作为C液；
3)向C液中加入浓度为0.05～5mg/mL的无菌葡萄糖酸钙溶液，混匀后放置于30℃恒温孵育1～4h，取出后在4℃、1500～3000x g的条件下离心15～45min，去除析出的纤维蛋白，作为D液；
4)将盛装D液的离心管置于超声波冰水浴中，先在超声波强度为150～250W/cm2的条件下，处理15～60s，间歇15～60s后，再以300～400W/cm2超声波强度处理15～60s；再经0.22μm针头滤器过滤后，即为不含白细胞、不含纤维蛋白原、无血小板碎片的血小板因子溶液；
二、成纤维细胞制备：
5)将眼皮组织的真皮层切割成0.5～1.5mm2的块，在37℃无菌条件下，用混合胶原酶对皮肤组织进行消化30min后，停止消化；其中，混合胶原酶是由质量百分含量为0.5％的胶原酶I和质量百分含量为0.5％的胶原酶IV混合而成；
6)将消化完成的组织块漂洗3次，接种于培养板底部，且组织块的表皮面朝上，置于培养箱中干涸稳固1-2h后，向瓶内加入含体积百分含量为1～3％的由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液，使之刚好浸润组织块，然后将培养瓶置于温度为37℃、体积百分含量为5％的CO2细胞培养箱中培养，培养5～7天后更换新鲜含1～3％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液；待细胞爬出后，每3～5天换一次新鲜含1～3％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液；
7)通过细胞刮刀切割传代法，将组织块连带周围内圈角朊细胞切割、去除，将剩余的成纤维细胞刮散并置于培养板中，加入2mL含体积百分含量为4～5％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液，使细胞浓度在4～5×104/mL；待细胞密度达70％，进行传代、扩增，直至培养至P4-P5代，收获细胞；
三、组合物制备：
8)向步骤一制备的血小板因子中，加入透明质酸、层粘连蛋白、超氧化歧化酶、葡萄糖酸钠、氯化钾、氯化钠、三水合醋酸钠和六水合氯化镁，混匀后，得E液；
其中，E液中血小板因子溶液的质量百分含量为40～50％，低分子量透明质酸的质量百分含量为20～30％，层粘连蛋白的浓度为1～10μg/mL，超氧化歧化酶的浓度为20～50ng/mL，葡萄糖酸钠的浓度为5～5.5mg/mL的，醋酸钠的浓度为2～2.5mg/mL，氯化钠的浓度为5～5.5mg/mL，氯化钾的浓度为0.3～0.5mg/mL和氯化镁的浓度为0.1～0.2mg/mL；
9)将步骤二培养的P4-P5代成纤维细胞用质量百分含量为0.25％的胰酶替代物TrypLE Express在37℃条件下消化2min后，收集细胞，用生理盐水洗涤两次，在180x g的条件下离心5min，弃上清，沉淀即为成纤维细胞；
10)向步骤9)成纤维细胞中加入8)的E液，使得成纤维细胞浓度为2～10×107/mL，即得延长皮肤衰老功能改善的组合物。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是:步骤一中血小板因子制备采用分子量为400000～700000D的质量百分含量为5.5％～6.5％的羟乙基淀粉溶液。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四不同的是:步骤一中向C液中加入浓度为1～5mg/mL的无菌葡萄糖酸钙溶液，混匀后放置于30℃恒温孵育1～4h。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式四不同的是:血小板因子中不含白细胞裂解成分和纤维蛋白原。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式四不同的是:步骤二中成纤维细胞培养采用两种浓度梯度的步骤一制作的血小板因子溶液。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式四不同的是:步骤二中成纤维细胞原代培养采用混合胶原酶消化结合干涸方法；传代培养采用细胞刮刀切割传代法。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式四不同的是:透明质酸分子量为400K～1000K。其它与具体实施方式四相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1
本实施例的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物，它的有效成分包括质量百分含量为50％的血小板因子液、浓度为10×107个/mL的成纤维细胞、质量百分含量为30％的低分子量透明质酸、浓度为10μg/mL层粘连蛋白、浓度为50ng/mL的超氧化歧化酶、浓度为5.02mg/mL的葡萄糖酸钠、浓度为2.22mg/mL的醋酸钠、5.25mg/mL的氯化钠、浓度为0.38mg/mL的氯化钾和浓度为0.14mg/mL的氯化镁。
一种延长皮肤衰老功能改善的组合物的制备方法，是按照以下步骤进行的：
一、血小板因子制备：
1)采用柠檬酸钠抗凝剂的采血袋采全血140mL，在室温下，按照与全血6:1体积在采血袋中加入高分子量(400，000D)的质量百分含量为5.5％的羟乙基淀粉溶液，充分混匀后自然沉降1小时，将沉降的红细胞从采血袋底部的管道弃除。袋中液体混匀后，在1100x g室温离心20min，将袋中上清液上层的2/3排出并收集成为A液。向剩在袋中液体中前列腺素E1、0.4U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，混匀，作为B液。
2)在安全柜中，将体积百分含量30％Percoll生理盐水溶液(比重1.043g/mL)15mL将装在50mL离心管中，安装体积比2:1比例，小心再离心管中加入30mLB液，室温下500x g离心15min。小心用加长针头将下层白细胞层去掉，剩余液体在室温下离心1600x g条件下离心15min。离心后将上清液弃掉，沉淀用生理盐水洗涤后，加入全血体积1/10体积的A液，混匀，成为C液。
3)向C液中加入浓度为5mg/mL的无菌葡萄糖酸钙溶液，混匀后放置于30℃恒温孵育4h，取出后在4℃，3000x g条件下离心15～45min，去除析出的纤维蛋白，成为D液。
4)将盛装D液的离心管置于超声波冰水浴中，先在超声波强度为250W/cm2的条件下，处理60s，间歇60s后，再以400W/cm2超声波强度处理60s；再经0.22μm针头滤器过滤后，即为不含白细胞、不含纤维蛋白原、无血小板碎片的血小板因子溶液；
该血小板因子中活性因子浓度较传统冻融方法获得富血小板血浆的浓度更高，EGF为5000pg/mL；
上述过程中采用羟乙基淀粉自然沉降法去除红细胞。
上述过程中血小板浓缩后为3000×109/mL。
上述过程中采用葡萄糖酸钙方法去除血浆中的纤维蛋白原。
上述过程中采用30度恒温孵育4小时方法，激发血小板内的EGF形成和释放，获得EGF 5000pg/mL。
上述过程特征为采用分二步超声方式裂解血小板。
二、成纤维细胞制备：
1)从双眼皮手术中获得的眼皮组织，在体式镜下，用组织剪，刮掉样品中皮肤的皮下组织及血管和上层角质层，保留真皮层，再将皮肤移入新的灭菌表面皿内,用手术刀片将皮片切割成大小约1mm2的小块,注意尽可能使切缘锐利,便于细胞爬出，在37度无菌条件下，用胶原酶I、IV对皮肤组织进行轻微消化30分钟后，停止消化。
2)将消化完成的组织块漂洗3次，用灭菌的眼科弯镊夹取组织块接种于6孔板底部，约3-5块，均勻摆放，注意将表皮面朝上，便于贴壁。将未加培养液的细胞6孔板置于培养箱中,待组织块稍干涸贴壁较稳固后(1-2小时后)，向瓶内加入1mL含体积百分含量为3％由步骤一制备的血小板因子的a-MEM培养液，使之刚浸润组织块，注意动作轻柔，避免组织块受冲击脱落瓶底。将培养瓶置于37℃、体积百分含量为5％CO2的细胞培养箱中培养，5-7天后更换新鲜培养液。待细胞爬出后(约1周左右)，每3-5天换液一次。首先可见爬出的是鹅卵石状的角朊细胞，后续可见爬出的是梭型的成纤维细胞且爬行速度快，很快可见组织块周围形成两圈细胞，内圈为角朊细胞，外圈为成纤维细胞。
3)通过细胞刮刀切割传代法，将组织块连带周围内圈角朊细胞切割、去除，后将剩余的成纤维细胞刮散并传入新的培养板中，进一步利用2mL含体积百分含量为5％由步骤一制备的血小板因子的a-MEM培养液，使细胞浓度在4～5×104/mL。待细胞密度达70％，进行传代、扩增，直至培养至P4-P5代，收获细胞1～3×107。
上述过程中采用步骤一血小板因子为培养液。
上述过程中眼皮成纤维细胞分离方法为干涸培养法。
上述过程中眼皮成纤维细胞第一步传代采用细胞刮刀机械切割法。
三、组合物制备：
1)将步骤一制备的血小板因子中，加入透明质酸、层粘连蛋白、超氧化歧化酶、葡萄糖酸钠、氯化钾、醋酸钠等溶液，使得终浓度为血小板因子50％，低分子量透明质酸质量百分含量为30％，层粘连蛋白浓度为10μg/mL,超氧化歧化酶浓度为50ng/mL,葡萄糖酸钠浓度为5mg/mL，醋酸钠浓度为3.7mg/mL，氯化钾浓度为0.4mg/mL，成为E液。
2)将步骤二培养的P4-P5代成纤维细胞用0.25％胰酶替代物TrypLE Express 37度消化2min后，收集细胞，用生理盐水洗涤两次，最后一次在180x g条件下离心5min，弃上清，沉淀即为成纤维细胞。
3)向2)离心获得的沉淀中加入1)获得的E液中进行混合，使得成纤维细胞浓度为2-10×107/mL，得到最终组合物。
上述组合物的pH＝6.7～7.4。
上述血小板因子：透明质酸体积比为8:2。
上述血小板因子中没不含白细胞裂解成分。
上述血小板因子中不含纤维蛋白原。
上述成纤维细胞浓度为2-10×107/mL。
上述成纤维细胞纯度>98％，活率>99％。
上述组合物4C-15C放置8小时，在动物体内其中成纤维细胞活率仍可达到90％。
上述成纤维细胞为P4-P5代，有最佳的胶原分泌能力。
上述超氧化歧化酶最终含量为20-50ng/mL。
上述透明质酸为低分子量透明质酸，分子量为400K-1000K。
对实施例1制得的组合物进行验证：
1、成纤维细胞鉴定
本实施例首先用波形蛋白表达情况分析获得的成纤维细胞纯度。取P4-P5代细胞以3.5×104个/mL接种入预先放有无菌盖玻片的6孔板内制作细胞爬片,4d后取出爬片,PBS洗3次。40g/L多聚甲醛(pH 7.12)固定细胞30min,PBS洗3次。1抗人波形蛋白抗体(Vimentin)浓度为1：100,二抗山羊抗人IgG-FITC浓度为1：200,荧光显微镜观察。不加1抗细胞作为对照,余步骤相同。图5结果表明，99％细胞呈现出Vimentin阳性，对照组细胞则没有荧光。说明分离获得的成纤维细胞纯度高，杂细胞少。
本实施例同时采用流式细胞仪分析表面标记物表达情况，鉴定成纤维细胞纯度。从图7试验结果可见，成纤维细胞纯度高，P5代细胞表达CD105、CD73、CD90分别为99.13±1.51％、98.30±0.70％、99.41±1.89％。
2、成纤维细胞胶原I分泌情况
通过本实施例方法培养对P2-P5代成纤维细胞在6孔板中进行培养，待细胞密度达70％，用PBS洗涤两次后，加入a-MEM基础培养液继续培养16hr，收集培养基进行离心，上清通过ELISA试剂盒分析其中胶原I分泌量。同时将贴壁的成纤维细胞用TrypLE Express消化后计数，算出相应的6孔板内成纤维细胞总数。按照下面的公式进行不同代次胶原蛋白I分泌情况对比：
胶原蛋白分泌(ng/万个细胞)＝每毫升培养基中胶原蛋白I浓度(ng/mL)*收获的培养基体积(mL)/细胞总数*10000
如图6所示，P2、P3代次的成纤维细胞表达胶原蛋白I较低，到P4-P5胶原蛋白I分泌量高且稳定，在此阶段的细胞进行应用有利于其发挥胶原蛋白分泌作用。
3、促进间充质干细胞迁移作用研究
真皮层的间充质干细胞其活跃程度、迁移到皮肤损伤部位和炎症部位进行修复的能力，是皮肤光泽度和年轻化的关键，为了研究本发明组合物对真皮层间充质干细胞的影响，本实验使用12孔板，在接种前预先用marker笔在板背面画出将要制造“划痕”的位置，方便后期实验中镜下观察是在同一个视野。调整细胞浓度为5×104个/孔的浓度接种于12孔板上。对照组采用细胞培养液成份为MSCBM间充质干细胞无血清培养基+10％血清替代物；本发明组采用细胞培养液成份为MSCBM间充质干细胞无血清培养基+10％本发明制备的富含EGF(E液)。接种后观察，当细胞长满板底后，用1mL枪头垂直于板划出细胞划痕，尽量保证划痕宽度一直。PBS清洗孔板，去除划痕产生的细胞碎片。加入培养液，镜下拍照后孔板放于二氧化碳培养箱中培养48小时，每间隔24小时拿出孔板，确定视野后拍照记录。(图8)。图8中的白线为划痕的界限，两条划痕距离越近，表明细胞迁移速度越快).通过照片显示，经24小时培养，两组细胞均出现了向划痕区域迁移生长的现象，本发明组在24小时、48小时迁移程度均优于对照组，在48小时时本发明组划痕已经合拢。因此利用本发明的方法获得的组合物可以显著促进真皮间充质干细胞迁移。
4、EGF因子释放
本实施例采用了0.05～5mg/mL的无菌葡萄糖酸钙溶液并将样本置于30℃的恒温孵育1-4小时，实现了最佳的EGF因子释放(表1)。
表1
由表1可以看出，在不加葡萄糖酸钙和不进行30度孵育的情况下，组合物中的总蛋白含量最高，而其中的细胞因子含量最低。如果加入葡萄糖酸钙后的各种情况，由于纤维蛋白的析出，组合物中总蛋白明显下降，但是细胞因子例如EGF、PDGF-AB等反而呈现增加的趋势，可见孵育时间对于血小板a-颗粒中的细胞因子的释放，尤其是EGF的释放有明显的作用。本发明对血小板处理过程中既防止了血小板的凝聚，又在活化过程中采用了葡萄糖酸钙和30度最优化孵育过程对细胞因子的大量释放起到了决定性的作用。
5、皮肤改善效果
为了确定本发明的组合物的有效性，进行如下实验：
选取试验者10人，女性，年龄45-50周岁，平素健康无重大疾病。利用美国VISIA皮肤检测仪对试验者面部皮肤斑点、皱纹、纹理、毛孔、紫外线色斑、棕色斑、红区、紫质状态进行拍照记录及数据分析，以便试验前后皮肤状态数据对比(VISIA评分值越低代表测试者皮肤在该项目下状态越优)。应用本发明组合物3个月后，对试验者面部进行VISIA检测分析。10名试验者的8项指标均有不同程度的改善(图10)通过外观观察发现本发明组合物可显著提亮肤色、淡斑，对于红血丝者可有效改善红血丝颜色及大小，淡化浅表皱纹甚至使皱纹消失(图9)。
对于皮肤改善效果持续时间，本实施例对比了单独参与富血小板血浆、单独成纤维细胞对皮肤衰老年龄改善持续的时间。通过使用先后VISIA仪器对面部年龄判断的结果见表2.可见，采用本组合物在治疗3、6月达到综合年龄比治疗前分别年轻7、10岁，治疗后12、18月仍然比治疗前年轻8、5岁。而单独PRP组和单独成纤维细胞组虽然年龄均有所降低，但6个月后效果逐渐不明显。考虑到使用者在随访过程中年龄还在增长，因此可以看出本发明组合物可以获得更持久、显著的皮肤年轻化效果。
表2
本发明对比了人体血浆、本组合物、用生理盐水(0.9％NaCl)替代本组合物中葡萄糖酸钠，醋酸钠，氯化钾，氯化钠、氯化钾和氯化镁后的组合物的酸碱度和渗透压。另外，本发明将上述三组试验组分25mL分别浸泡干面膜后，在20±2度、40-60％湿度的环境中敷于测试支架上，经过15分钟后，称取重量，采用下列公式计算保水率：
保水率％＝(15分钟测试后的面膜总重-干面膜重量)*100％/(浸泡测试品后的面膜总重-干面膜重量)。
研究发现，采用本组合物中的多种电解质成分其酸碱度、渗透压比生理盐水组更接近于人体血浆，其保水效果也明显优于其他两组。
表3
Claims (10)
1.一种延长皮肤衰老功能改善的组合物，其特征在于它的有效成分包括质量百分含量为40～50％的血小板因子、浓度为2～10×107个/mL的成纤维细胞、质量百分含量为20～30％的低分子量透明质酸、浓度为1～10μg/mL层粘连蛋白、浓度为20～50ng/mL的超氧化歧化酶、浓度为5～5.5mg/mL的葡萄糖酸钠、浓度为2～2.5mg/mL的醋酸钠、5～5.5mg/mL的氯化钠、浓度为0.3～0.5mg/mL的氯化钾和浓度为0.1～0.2mg/mL的氯化镁。
2.根据权利要求1所述的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物，其特征在于该组合的pH为6.7～7.4。
3.根据权利要求1所述的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物，其特征在于它的有效成分包括质量百分含量为40～50％的血小板因子、浓度为2～10×107个/mL的成纤维细胞、质量百分含量为20～30％的低分子量透明质酸、浓度为1～10μg/mL层粘连蛋白、浓度为20～50ng/mL的超氧化歧化酶、浓度为5.02mg/mL的葡萄糖酸钠、浓度为2.22mg/mL的醋酸钠、5.25mg/mL的氯化钠、浓度为0.38mg/mL的氯化钾和浓度为0.14mg/mL的氯化镁。
4.一种延长皮肤衰老功能改善的组合物的制备方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、血小板因子制备：
1)采用含有柠檬酸钠抗凝剂的采血袋采全血，在室温下，按照与全血体积比为5～7:1的比例向装有全血的采血袋中加入分子量为400000～700000D的质量百分含量为5.5％～6.5％的羟乙基淀粉溶液，充分混匀后自然沉降1h，将沉降的红细胞弃除，袋中液体混匀后，在800～1100x g的条件下室温离心20min，将袋中上清液上层的2/3排出并收集作为A液；向剩在袋中的液体中加入与剩余液体等体积的含有2μM前列腺素E1、0.4U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，混匀，作为B液；
2)在安全柜中，将体积百分含量为30％Percoll生理盐水溶液置于离心管内，按体积比为2:1的比例加入B液，在室温、300～500x g的条件下离心15～25min；离心后将下层白细胞层去掉，剩余液体在室温、800～1600x g的条件下离心15～25min；离心后将上清液弃掉，沉淀用生理盐水洗涤后，加入体积为采集全血体积1/10的A液，混匀，作为C液；
3)向C液中加入浓度为0.05～5mg/mL的无菌葡萄糖酸钙溶液，混匀后放置于30℃恒温孵育1～4h，取出后在4℃、1500～3000x g的条件下离心15～45min，去除析出的纤维蛋白，作为D液；
4)将盛装D液的离心管置于超声波冰水浴中，先在超声波强度为150～250W/cm2的条件下，处理15～60s，间歇15～60s后，再以300～400W/cm2超声波强度处理15～60s；再经0.22μm针头滤器过滤后，即为不含白细胞、不含纤维蛋白原、无血小板碎片的血小板因子溶液；
二、成纤维细胞制备：
5)将眼皮组织的真皮层切割成0.5～1.5mm2的块，在37℃无菌条件下，用混合胶原酶对皮肤组织进行消化30min后，停止消化；其中，混合胶原酶是由质量百分含量为0.5％的胶原酶I和质量百分含量为0.5％的胶原酶IV混合而成；
6)将消化完成的组织块漂洗3次，接种于培养板底部，且组织块的表皮面朝上，置于培养箱中干涸稳固1-2h后，向瓶内加入含体积百分含量为1～3％的由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液，使之刚好浸润组织块，然后将培养瓶置于温度为37℃、体积百分含量为5％的CO2细胞培养箱中培养，培养5～7天后更换新鲜含1～3％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液；待细胞爬出后，每3～5天换一次新鲜含1～3％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液；
7)通过细胞刮刀切割传代法，将组织块连带周围内圈角朊细胞切割、去除，将剩余的成纤维细胞刮散并置于培养板中，加入2mL含体积百分含量为4～5％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液，使细胞浓度在4～5×104/mL；待细胞密度达70％，进行传代、扩增，直至培养至P4-P5代，收获细胞；
三、组合物制备：
8)向步骤一制备的血小板因子中，加入透明质酸、层粘连蛋白、超氧化歧化酶、葡萄糖酸钠、氯化钾、氯化钠、三水合醋酸钠和六水合氯化镁，混匀后，得E液；
其中，E液中血小板因子溶液的质量百分含量为40～50％，低分子量透明质酸的质量百分含量为20～30％，层粘连蛋白的浓度为1～10μg/mL，超氧化歧化酶的浓度为20～50ng/mL，葡萄糖酸钠的浓度为5～5.5mg/mL的，醋酸钠的浓度为2～2.5mg/mL，氯化钠的浓度为5～5.5mg/mL，氯化钾的浓度为0.3～0.5mg/mL和氯化镁的浓度为0.1～0.2mg/mL；
9)将步骤二培养的P4-P5代成纤维细胞用质量百分含量为0.25％的胰酶替代物TrypLEExpress在37℃条件下消化2min后，收集细胞，用生理盐水洗涤两次，在180x g的条件下离心5min，弃上清，沉淀即为成纤维细胞；
10)向步骤9)成纤维细胞中加入8)的E液，使得成纤维细胞浓度为2～10×107/mL，即得延长皮肤衰老功能改善的组合物。
5.根据权利要求3所述的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物的制备方法，其特征在于步骤一中血小板因子制备采用分子量为400000～700000D的质量百分含量为5.5％～6.5％的羟乙基淀粉溶液。
6.根据权利要求3所述的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物的制备方法，其特征在于步骤一中向C液中加入浓度为1～5mg/mL的无菌葡萄糖酸钙溶液，混匀后放置于30℃恒温孵育1～4h。
7.根据权利要求3所述的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物的制备方法，其特征在于血小板因子中不含白细胞裂解成分和纤维蛋白原。
8.根据权利要求3所述的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物的制备方法，其特征在于步骤二中成纤维细胞培养采用两种浓度梯度的步骤一制作的血小板因子溶液。
9.根据权利要求3所述的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物的制备方法，其特征在于步骤二中成纤维细胞原代培养采用混合胶原酶消化结合干涸方法；传代培养采用细胞刮刀切割传代法。
10.根据权利要求3所述的一种延长皮肤衰老功能改善的组合物的制备方法，其特征在于透明质酸分子量为400K～1000K。
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