CN102807965B

CN102807965B - 一种组织工程角膜的制备方法及其装置

Info

Publication number: CN102807965B
Application number: CN201210310206.5A
Authority: CN
Inventors: 卢永波
Original assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-08-28
Filing date: 2012-08-28
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-08-28
Also published as: CN102807965A

Abstract

一种组织工程角膜的制备方法及其装置，本发明是在脱细胞角膜基质上接种羊膜上皮细胞，经培养得到复合羊膜上皮细胞的构建体；再以双面培养方式，采用气液交替光照培养与液下无光照培养进行交替培养完成。所制备的组织工程角膜是一种优良的角膜替代物，具有接近天然角膜的热稳定性和透明度，在680nm波长下，透光率为90％～95％；由于采用双面培养装置，能使构建体表面充分接触气体，增加上皮细胞膜片的复层层数，达到5～7层细胞堆积，并使存活率大于90％，维持着良好的干细胞性；可用于角膜溃疡、角膜白斑、角膜营养不良等各类型角膜板层移植，尤其在伴有持续性上皮缺损、角膜缘干细胞缺乏的高危移植中能显现出很好的临床疗效。

Description

一种组织工程角膜的制备方法及其装置

技术领域

本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种临床移植用组织工程角膜的制备方法及其装置。

背景技术

角膜为透明、无血管的组织结构，从外至内分为上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层。其中上皮细胞层由5～7层上皮细胞构成，由外至内为表层、基底上层和基底层；基底层与前弹力层之间存在着细胞外基质(ECM)沉积形成的基底膜结构，基底层由单层柱状基底层细胞组成，含有大量干细胞，向上分裂不断产生子代细胞；子代细胞分化为2～3层翼状细胞基底上层，对角膜上皮细胞层的营养与结构支持起到重要作用；表层细胞进一步分化形成未角化的扁平多边形细胞，具有良好的屏障功能；角膜缘位于角膜与巩膜之间为环状结构，纵贯上皮细胞层(角膜与巩膜之间无明显界限，呈过渡状，角膜缘为圆环状，一部分在角膜上，一部分在巩膜上)，是角膜的干细胞池，由角膜缘干细胞分裂产生的新细胞由边缘向中心移动和增殖，以及由基底层细胞产生的子代细胞向表层更新，共同维持角膜上皮细胞层的结构与功能。

外伤、感染、遗传因素均能导致角膜结构损伤，引起视力下降甚至失明，角膜盲是致盲的主要原因之一。目前角膜盲最好的治疗方式为角膜移植，我国约有500万患者，并以每年150～200万的速度递增。由于供体角膜来源的稀缺限制了角膜移植术的开展，每年接受异体移植的患者仅3000例左右。

为解决这一问题，近年来有大量的研究致力于角膜替代物的研发。由于人工合成材料所制备角膜替代物的成分单一，难以形成天然角膜的微观结构，且在透明度、机械强度、稳定性、生物相容性等方面存在着不足。因此，以动物源性的角膜经过脱细胞处理后形成的免疫原性较低的角膜基质，因具有接近天然角膜的胶原排列结构和良好的力学性能而获得广泛认可。但是角膜病损常伴有复杂的炎症反应、大量血管新生，尤其是热、化学性烧伤，史蒂文斯-约翰逊综合症，眼表瘢痕化天疱疮等引起的角膜缘干细胞缺乏可致角膜结膜化，形成炎性瘢痕组织，大量血管新生，是角膜盲的重要病因之一。在这类高危角膜移植中，普通的脱细胞角膜基质，甚至异体角膜移植也很难获得长期有效的结果。因此治疗这类高危适应症，必须同时重建角膜上皮功能并以透明基质替换原有不透明的瘢痕组织。基于这两点，具有自我更新的上皮细胞层结构的组织工程角膜是未来角膜替代物发展的方向。

传统的脱细胞角膜(如中国专利200410018107.5和200810026972.2)仅能提供角膜基质，缺乏具有活性功能的角膜上皮结构，不具有角膜上皮屏障功能以及角膜缘和角膜基底层细胞的更新能力，不适于高危角膜移植。

中国专利申请03140113.9公开了一种人工组织工程化的生物角膜，虽进行了上皮及内皮细胞的复合，但所用载体为含有基质细胞的新鲜角膜或经过保存处理的不含基质细胞的角膜，其保留了细胞或是细胞残留成分，会引起免疫排斥反应，尤其在免疫赦免丧失的高危移植中存在很大风险。

此外，也有文献及专利报道，利用自体细胞于体外扩增培养或是将干细胞种植于羊膜、纤维蛋白胶、胶原等支架材料上再移植，均存在有不足。

中国专利申请03150375.6中采用自体角膜缘细胞为种子细胞，仅适用于单侧角膜缘损伤的患者，当双眼病损时则无法取材，并且取材对健眼存在有损伤风险；重要的是无法实现产业化，不能满足患者的迫切需求。

中国专利申请201110039014.0公开了一种人角膜上皮细胞系的构建方法，其种子细胞来源存在免疫原性问题，在高危角膜移植中，免疫赦免地位被打破，增加了排斥风险；且培养体系中采用胎牛血清，引入了牛源性病毒的传播风险。

中国专利申请200410026031.0和200580021629.3是以干细胞与羊膜复合形成角膜上皮片。因羊膜基质较薄、机械强度及稳定性差，仅适用于眼表重建，需将替代损伤基质与眼表重建分步进行，使治疗周期长、痛苦程度高。

中国专利申请200580007682.8公开了一种将角膜上皮细胞与胶原凝胶复合形成角膜上皮片的方法。所形成的角膜上皮片机械强度及稳定性较差，应用于高危移植时，植床复杂的炎性环境及大量的基质金属蛋白酶均能导致植片降解，增加移植失败率；而且胶原凝胶不具备天然角膜的微观结构，与异体移植相比，移植后与植床的融合较为困难。

中国专利申请200710129136.2公开了一种组织工程化角膜上皮移植膜的制备方法，其存在有异体细胞免疫原性和胎牛血清使用风险的问题，而且仅考虑了干细胞性的维持，未考虑角膜上皮的天然组成结构及向心和向表层共同作用的细胞更新方式，移植后角膜上皮再次缺损的风险较大。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提出一种组织工程角膜的制备方法及其装置，所制备的组织工程角膜具有天然角膜上皮细胞层结构与功能，在移植后能实现细胞由边缘向中心更新及由基底层向表层更新。

本发明所提出的组织工程角膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、接种羊膜上皮细胞：将哺乳动物源性的脱细胞角膜基质(有前弹力层和基质层结构)置于细胞培养皿中，将羊膜上皮细胞按1×10⁵～1×10⁶个/cm²的密度接种于脱细胞角膜基质的前弹力层表面；加入培养液A，于37℃条件下，在体积浓度分别为85％～93％的N₂、5％的CO₂和2％～10％的O₂环境中培养5～7天；每两天换液，待羊膜上皮细胞于前弹力层表面生长汇合、并生长至1～2层时，得到复合羊膜上皮细胞的构建体；所述培养液A是以浓度为17.6g/L的MCDB153培养基水溶液为基液，内含有：表皮生长因子(EGF)2μg/L、人胰岛素10mg/L、L-谷氨酰胺2mM、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20ng/L、亚硒酸钠5mg/L和转铁蛋白100mg/L；培养液A与含血清的羊膜上皮细胞培养液相比，能促进羊膜上皮细胞中干细胞的克隆化生长，抑制分化细胞的生长，更好地维持羊膜上皮细胞的干细胞性。

本步骤在低氧条件下培养，是因为生理情况下人体组织平均氧含量为3％，富含干细胞的胚体氧浓度更低，低氧培养是维持干/祖细胞未分化状态的重要因子，可以促进自我更新及增殖。因此，采用培养液A低氧培养，能有效维持羊膜上皮细胞的干细胞性。经检测表达干细胞标记：阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤排斥抗原1-60(TRA 1-60)和肿瘤排斥抗原1-81(TRA 1-81)等具备多向分化能力。

步骤二、气液交替培养上皮细胞膜片：将步骤一所得构建体的基质面(脱细胞角膜基质层的一面)与培养液A接触培养；将羊膜上皮细胞面与培养液B间歇性接触培养，即用培养液B培养10s后再暴露于空气20s，如此反复循环12h；培养过程在光照条件下，37℃、体积浓度5％的CO₂环境中进行；

其中培养液B的组成是在纯水中含：2～10μg/L的EGF，100～300ng/L转化生长因子α(TGF-α)，2～13μg/L转化生长因子β₁(TGF-β₁)，10～30μg/L维生素A，100～300mg/L维生素C，45μM酪氨酸，100～200μM谷胱甘肽，20～100mg/L葡萄糖，1～2mM氯化钙，10～25g/L硫酸软骨素，1～10g/L透明质酸，pH 7.2～7.4，渗透压280～320mOsm/kg；培养液B模拟人泪液成分配制，能够诱导羊膜上皮细胞形成类似角膜上皮细胞层的结构。

本步骤模拟了人眼睑打开后外界对角膜生长的刺激因素。在眼睑打开后，外界环境的改变促使角膜上皮细胞迅速增殖及细胞层数增加，并进一步分化。引起角膜生长变化的主要外界刺激因素是光和氧，及泪液成分变化。有研究报道，多细胞动物发育和形态形成过程中，信号分子(成形素morphogen)能够通过快速的自由扩散以及细胞表面受体介导的内吞作用建立，并维持其浓度梯度分布，从而给予细胞位置信号，控制组织生长发育。在本步骤中，通过培养液B和羊膜上皮细胞面的间歇性接触培养，使得培养液B中信号分子(如EGF)、氧分子在羊膜上皮细胞面自由扩散为从上到下，从中心向边缘的浓度梯度，促进了上皮细胞的快速增殖，形成类似天然结构的上皮细胞膜片，细胞分化程度从上到下、从中心到边缘逐渐降低；通过气液交替培养使诱导液在构建体表面往复运动，从而给予上皮细胞膜片的表层细胞成熟信号；构建体表面处于气液交替的循环中，不同于传统静止培养方法，能够充分接触气体分子；培养液A、脱细胞角膜基底膜ECM成分共同维持着上皮细胞膜片基底层细胞及边缘细胞的干细胞性。

步骤三、角膜结构成熟培养：分别更换步骤二中的培养液A和培养液B，将步骤二所得构建体的基质面与培养液A接触，将羊膜上皮细胞面与培养液B接触，液下培养12h；培养过程在37℃、无光照条件下，体积浓度分别为85％～93％的N₂、5％的CO₂和2％～10％的O₂的混合气体环境中进行；

将步骤二与步骤三交替进行，每12小时交替一次，培养持续10～15天，最终得到结构进一步成熟的组织工程角膜。

步骤三模拟了睡眠状态下眼睑闭合时角膜所处的生理环境，与步骤二协同模拟日夜时段外界刺激因素的变化，促进了角膜结构的进一步成熟。

本发明所制备的组织工程角膜有接近天然角膜的热稳定性和透明度。经检测，在680nm波长下，离体15分钟的新鲜角膜的透光率为93％～96％；本发明制备的组织工程角膜透光率为90％～95％，透明度与新鲜角膜无显著差异。上皮细胞膜片中央区从下自上依次为具有自我更新能力的柱状基底层细胞、具有部分分裂增殖能力的翼细胞、及表层扁平的终末分裂细胞，细胞复层5～7层；边缘区细胞形态差异不显著，维持着良好的干细胞性。本发明制备的组织工程角膜是一种优良的角膜替代物，可以应用于角膜溃疡、角膜白斑、角膜营养不良等各类型角膜板层移植适应症，尤其在伴有持续性上皮缺损、角膜缘干细胞缺乏的高危移植中能够显现出很好的临床疗效。

本发明制备方法采用的角膜双面培养装置，由下至上依次为底盒、固定卡环、托盒、盒盖；底盒呈圆形盒状；托盒外底部有三个支腿，托盒高度小于底盒高度，能置于底盒内，托盒中心开有通孔，通孔直径与所培养角膜相适应；固定卡环内径与托盒通孔直径一致，固定卡环与托盒外底部能够通过旋卡方式固定；盒盖能与底盒匹配扣合，盒盖上设置有一进出液管直插底盒内底，再设置一进出液三通管，该三通管的一端在盒盖外，另两端通向托盒内底两侧。

本发明角膜双面培养装置的使用方法为，把所培养角膜(构建体)上皮细胞面朝上放在固定卡环中心，将固定卡环对应于托盒外底后旋卡密封固定，避免液体由二者之间渗漏，使角膜羊膜上皮细胞面朝上被夹在固定卡环与托盒外底之间，并且角膜的上下两面在固定卡环和托盒的通孔处裸露；再将托盒偏置在底盒内，扣上盒盖，盒盖上的进出液直管伸至底盒内底实现培养液(A)的交换(进出)，盒盖上的进出液三通管有两端伸至托盒内底两侧实现培养液(B)的交换(进出)，盒盖上的两个进出液管口可分别与蠕动泵连接，实现底盒和托盒中培养液进出的自动控制。

与现有技术及产品相比，本发明的角膜双面培养装置，1)改变了传统静止培养方式，使构建体表面能够充分接触气体，增加构建体上皮细胞膜片的复层层数；传统方法仅能形成1～3层细胞堆积，而本发明装置能实现5～7层细胞堆积，细胞状态显著改善，使存活率大于90％。2)能够模拟天然生长机制，用氧浓度、光刺激等因素的节律性变化诱导培养，具有更加接近天然角膜的成熟结构，上皮基底层细胞与脱细胞角膜基质间连接紧密，形成了大量半桥粒结构；且诱导因素均可量化，结果重现性好；3)通过培养液B的节律性流动，诱导形成的上皮细胞膜片表层更为光滑，且透明度及屏障功能显著提高；4)模拟天然泪液成分，通过培养液A与培养液B的浓度梯度，形成了由上向下、由中心向边缘干细胞性逐渐下降的区域变化，能够实现天然角膜上皮由基底层向表层、由边缘向中心同时更新。

附图说明

附图1为本发明设计的角膜双面培养装置一种实例的结构示意图；图中1为盒盖，2为托盒，3为固定卡环，4为底盒，5为进出液直管，6为进出液三通管，7为通孔；使用时，将构建体(角膜)置于2与3之间，固定卡环与托盒是通过卡槽旋紧密封固定。

附图2为本发明方法制备的组织工程角膜外观照片和组织学染色切片照片；A为角膜外观照片；B为HE染色切片结果照片，可见类似人天然角膜的复层上皮结构；

附图3为本发明方法制备的组织工程角膜透射电镜的结果照片，可见上皮基底层细胞与脱细胞角膜基质间连接紧密，形成了大量半桥粒结构；由于半桥粒是天然基底层上皮细胞的一种特殊结构，通过其与基底膜实现锚定连接；证明本发明制备的组织工程角膜形成了近似天然的上皮细胞与角膜前弹力膜间的连接结构；

附图4为兔角膜碱烧伤后未修复空白对照组照片。A为碱烧伤造模后，可见大面积白斑；B为碱烧伤后7天结果，仍可见大面积白斑；C为碱烧伤后30天结果，可见大量血管新生及烧伤区域基质溃疡；D为碱烧伤后30天荧光素钠染色结果，可见持续上皮缺损；

附图5为本发明制备的组织工程角膜修复兔角膜大面积碱烧伤实验组照片。A为1周照片，B为4周照片，C为6月照片；可以看出在移植1周、4周及6月过程中组织工程角膜始终稳定存在于植床并保持着良好的透明度，与植床逐渐整合，无不良反应。

具体实施方式

以下结合实例说明本发明技术方案的具体实施方式。其中，哺乳动物源性脱细胞角膜基质可以参考现有方法(如中国专利申请200410018107.5)。所使用的角膜双面培养装置采用医用高分子透明材料制备，例如：医用级聚苯乙烯(注塑成型)；实例1中的规格为：底盒直径3cm，深度2cm，托盒支腿0.5cm，托盒直径2cm，深度0.8cm，通孔直径1.1cm，盒盖直径3.5cm；实例2中的规格为：底盒直径3.5cm，深度2cm，托盒支腿0.5cm，托盒直径2.5cm，深度1cm，通孔直径1.8cm，盒盖直径4cm。

实施例1、

步骤一、羊膜上皮细胞接种：将脱细胞猪角膜基质置于12孔细胞培养板中，将经培养液A培养的2代羊膜上皮细胞，以1×10⁵/cm²密度接种于脱细胞角膜基质的前弹力层表面；加入2ml培养液A，液面下培养；所述的培养液A是以浓度为17.6g/L的MCDB153培养基水溶液为基液，内含有：EGF为2μg/L、人胰岛素10mg/L、L-谷氨酰胺2mM、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20ng/L、亚硒酸钠5mg/L、转铁蛋白100mg/L；细胞培养箱的条件为，在体积浓度分别为90％的N₂，5％的CO₂，5％的O₂的混合气体环境中，37℃培养7天；每两天更换培养液，待羊膜上皮细胞于脱细胞角膜基质前弹力面生长汇合时，细胞生长至1～2层。获得脱细胞角膜基质表面复合有羊膜上皮细胞的构建体。

步骤二、气液交替培养上皮细胞膜片：按前述使用方法将构建体采用角膜双面培养装置进行角膜双面培养；先用硅胶管连接盒盖上的进出液直管口，通过0.22μm过滤器，连接蠕动泵通至培养液A瓶；再用硅胶管连接盒盖上的进出液三通管口，通过0.22μm过滤器，连接蠕动泵通至培养液B瓶；配制培养液B：在纯水中添加10μg/L的EGF、100ng/L的TGF-α、2μg/L的TGF-β1、10μg/L维生素A、150mg/L维生素C、45μM酪氨酸、107μM谷胱甘肽、60mg/L葡萄糖、1.2mM氯化钙、10g/L硫酸软骨素和10g/L透明质酸，调pH至7.2，调渗透压至280mOsm/kg；将培养液A和B分别装瓶；

打开全光谱光源，将角膜双面培养装置放入37℃、体积浓度为5％的CO₂环境中；向底盒中通入6ml培养液A；向托盒中循环通入培养液B培养12h，每个循环过程为30秒，即加200μl培养液B培养10s(包括加液-培养-抽液的全过程)，(抽液后)暴露于空气20s。

步骤三、角膜结构成熟培养：分别更换步骤二中底盒的培养液A和托盒的培养液B(600μl)，进行液下培养12h；培养过程在细胞培养箱37℃、无光照条件下，体积浓度分别为90％的N₂、5％的CO₂和5％的O₂的混合气体环境中进行；

将步骤二与步骤三交替进行，每12小时交替一次，培养持续14天，得到结构进一步成熟的组织工程角膜。

本实例以脱细胞猪角膜基质为支架，采用培养液A培养的第2代羊膜上皮细胞。用HE染色验证所制备的组织工程角膜结构特点(附图2B)。采用透射电镜观察所制备的组织工程角膜上皮细胞膜片与脱细胞角膜基质前弹力膜间形成了大量半桥粒结构。半桥粒是基底层上皮细胞上的一种特殊结构，上皮细胞借助于半桥粒与基底膜实现锚定连接。因此所构建的组织工程角膜形成了近似天然的上皮细胞与角膜前弹力膜间的连接结构(附图3)。

实施例2、

步骤一、羊膜上皮细胞接种：将脱细胞牛角膜基质置于12孔细胞培养板中，按8×10⁵/cm²密度接种原代羊膜上皮细胞于脱细胞角膜基质的前弹力层表面；加入4ml培养液A，液面下培养；所述的培养液A与实施例1相同；细胞培养箱的条件为，在体积浓度分别为93％的N₂，5％的CO₂，2％的O₂的混合气体环境中，37℃培养5天；每两天换液一次，待羊膜上皮细胞于脱细胞角膜基质前弹力层表面生长汇合时，细胞生长至1～2层。获得脱细胞角膜基质表面复合有羊膜上皮细胞的构建体。

步骤二、气液交替培养上皮细胞膜片：与实例1相同，按前述使用方法将构建体采用角膜双面培养装置进行角膜双面培养；配制培养液B：在纯水中添加5μg/L的EGF、200ng/L的TGF-α、13μg/L的TGF-β₁、20μg/L维生素A、260mg/L维生素C、45μM酪氨酸、107μM谷胱甘肽、100mg/L葡萄糖、1.6mM氯化钙、15g/L硫酸软骨素和5g/L透明质酸，调pH至7.4，调渗透压至300mOsm/kg；将培养液A和B分别装瓶；

打开全光谱光源，将角膜双面培养装置放入37℃、体积浓度为5％的CO₂环境中(细胞培养箱)；向底盒中通入6ml培养液A；向托盒中循环通入培养液B培养12h，每个循环过程为30s，即加500μl培养液B培养10s(包括加液-培养-抽液的全过程)，(抽液后)暴露于空气20s。

步骤三、液下角膜结构成熟培养：分别更换步骤二中底盒的培养液A和托盒的培养液B(1ml)，进行液下培养12h；培养过程在细胞培养箱37℃、无光照条件下，体积浓度分别为93％的N₂、5％的CO₂和2％的O₂的混合气体环境(细胞培养箱)中进行；

将步骤二与步骤三交替进行，每12小时交替一次，培养持续10天；得到结构进一步成熟的组织工程角膜。

本实例以脱细胞牛角膜基质为支架，以原代羊膜上皮细胞接种制备大直径的组织工程角膜，适用于全角膜板层移植。采用所制备的组织工程角膜进行兔角膜大面积碱烧伤的修复实验，由附图5可以看出，在移植1周、4周及6月过程中组织工程角膜始终稳定存在于植床，并保持着良好的透明度，与植床逐渐整合，无不良反应。

Claims

1.一种组织工程角膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、接种羊膜上皮细胞：将哺乳动物源性的脱细胞角膜基质置于细胞培养皿中，将羊膜上皮细胞按1×10⁵～1×10⁶个/cm²的密度接种于脱细胞角膜基质的前弹力层表面；加入培养液A，于37℃条件下，在体积浓度分别为85％～93％的N₂、5％的CO₂和2％～10％的O₂环境中培养5～7天；每两天换液，待羊膜上皮细胞于前弹力层表面生长汇合，得到复合羊膜上皮细胞的构建体；所述培养液A是以浓度为17.6g/L的MCDB153培养基水溶液为基液，内含有：表皮生长因子2μg/L、人胰岛素10mg/L、L-谷氨酰胺2mM、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20ng/L、亚硒酸钠5mg/L和转铁蛋白100mg/L；

步骤二、气液交替培养上皮细胞膜片：将步骤一所得构建体的基质面与培养液A接触培养；将羊膜上皮细胞面与培养液B间歇性接触培养，即用培养液B培养10s后再暴露于空气20s，如此反复循环12h；培养过程在光照条件下，37℃、体积浓度5％的CO₂环境中进行；

其中培养液B的组成是在纯水中含：2～10μg/L的EGF，100～300ng/L转化生长因子α，2～13μg/L转化生长因子β₁，10～30μg/L维生素A，100～300mg/L维生素C，45μM酪氨酸，100～200μM谷胱甘肽，20～100mg/L葡萄糖，1～2mM氯化钙，10～25g/L硫酸软骨素，1～10g/L透明质酸，pH 7.2～7.4，渗透压280～320mOsm/kg；

步骤三、角膜结构成熟培养：分别更换步骤二中的培养液A和培养液B，将步骤二所得构建体的基质面与培养液A接触，将羊膜上皮细胞面与培养液B接触，液下培养12h；培养过程在37℃、无光照条件下，体积浓度分别为 85％～93％的N₂、5％的CO₂和2％～10％的O₂的混合气体环境中进行；

2.一种制备权利要求1所述组织工程角膜的培养装置，其特征在于，所述培养装置由下至上依次为底盒、固定卡环、托盒、盒盖；底盒呈圆形盒状；托盒外底部有三个支腿，托盒高度小于底盒高度，能置于底盒内，托盒中心开有通孔，通孔直径与所培养角膜相适应；固定卡环内径与托盒通孔直径一致，固定卡环与托盒外底部能够通过旋卡方式固定；盒盖能与底盒匹配扣合，盒盖上设置有一进出液管直插底盒内底，再设置一进出液三通管，该三通管的一端在盒盖外，另两端通向托盒内底两侧。