KR101293364B1

KR101293364B1 - 조직공학적 인간 각막 내피의 재건 방법

Info

Publication number: KR101293364B1
Application number: KR1020117024699A
Authority: KR
Inventors: 팅준 판; 홍셍 수이; 준 자오; 리샨 콩
Original assignee: 칭다오 올-브라이트 바이오텍 리미티드; 오션 유니벌시티 오브 차이나
Priority date: 2009-03-23
Filing date: 2010-02-08
Publication date: 2013-08-05
Also published as: CN101508971B; EP2412799A1; JP2012521200A; WO2010108400A1; CN101508971A; EP2412799A4; US8609408B2; KR20120007511A; JP5292507B2; EP2412799B1; US20120015439A1

Abstract

본 발명은 조직공학적 인간 각막 내피의 재건 방법에 관한 것이다. 조직공학적 인간 각막 내피는 20% 송아지 혈청-DMEM/F12 배양 용액을 통해 시험관내에서 각막 내피 세포를 대수 성장기까지 배양하는 단계, 트립시나제로 소화시킴으로써 상피층이 완전히 제거된 양막 틀 운반체를 제조한 후, 상기 양막 틀 운반체를 배양 플레이트의 웰의 바닥에 펼치고, 이것을 건조시켜 단단히 부착시키는 단계; 및 타입 Ⅳ 콜라겐과 20% 송아지 혈청을 함유하는 DMEM/F12 배양 용액 내에 있는 대수 성장기의 인간 각막 내피 세포를 상기 웰 내에 접종하여 시험관내 배양을 시작하는 단계에 의해 시험관내에서 재건된다. 상기 재건된 조직공학적 인간 각막 내피는 배치로 제조되어 각막 내피 시각장애인을 위한 임상적 각막 이식 치료에서의 조직공학적 인간 각막 내피에 대한 대량 수요를 충족시키고, 조직공학적 인간 각막 내피의 시험관내 재건 및 임상적 치료 비용을 절감할 수 있다.

Description

조직공학적 인간 각막 내피의 재건 방법{METHOD FOR RECONSTRUCTING TISSUE ENGINEERED HUMAN CORNEAL ENDOTHELIUM}

본 발명은 인간 각막 내피 세포 및 노출된(denuded) 인간 양막을 이용한 조직공학적 인간 각막 내피의 재건 방법에 관한 것이다.

고등동물의 각막 내피는 각막의 투명도 및 두께를 유지하고 각막에 영양물을 공급함에 있어서 대체할 수 없는 역할을 한다. 각막이 수술 등에 의해 감염되거나 외상을 받으면 각막 내피 세포의 수는 다양한 정도로 감소될 것이다. 일단 각막 내피 세포의 밀도가 각막 내피의 생리학적 기능을 유지하는데 필요한 임계 밀도보다 떨어지면 각막 내피에 비가역적인 변화가 일어나게 되고, 결국 원발성(primary) 각막 내피염을 형성하게 된다. 현재 중국에는 원발성 각막 내피염을 앓고 있는 환자가 적어도 80만명이 있다. 비록 이들은 각막 이식을 통해 치유할 수 있지만, 각막 기증자가 너무 적어 대부분의 환자들은 시력을 회복할 수 없다. 최근 각막 조직공학의 대두로 조직공학적 인간 각막 내피의 시험관내 재건과 원발성 각막 내피염 치료에 새로운 희망을 가져다 주었다. 인간 각막 내피 세포와 적절한 틀 운반체(scaffold carrier)를 이용하여 시험관내에서 조직공학적으로 인간 각막 내피를 재건하는 방법은 이미 학문적인 관심사가 되었다.

인간 각막 내피의 시험관내 재건에 대한 연구는 1992년부터 처음으로 시작되었다. 그 후, 1999년 메이 그리피스(May Griffith) 등은 암 유전자에 전달감염(transfection)된 불멸화 인간 각막 상피 세포, 인간 각막 기질 세포, 인간 각막 내피 세포 및 글루타르알데히드 교차결합된 콜라겐을 이용하여 정상 각막과 대체로 유사한 형태학적 특성, 투명도 및 조직 구조를 갖는 기능성 인간 각막 동등물(equivalent)을 성공적으로 재건함으로써, 인간 각막 상피의 시험관내 재건을 위한 길을 개척하였다. 그러나, 암 유전자에 전달감염되고 발암 가능성을 갖는 불멸화된 각질세포를 이용하는 것은 이들 세포를 치료 목적으로 인간 각막 상피의 재건에 사용하는 것을 매우 제한하고 있다. 2004년 일본 학자인 유타카 이시노(Yutaka Ishino) 및 다츠야 미무라(Tatsuya Mimura)는 각각 시험관내에서 4-5회 계대배양한 인간 각막 내피 세포 및 노출된 인간 양막 및 콜라겐 시트를 이용하여 정상 각막 내피와 유사한 기능을 수행하는 인간 각막 내피 세포 시트를 재건하였다. 2007년 쥬-양 라이(Jui-Yang Lai)는 안구 은행에 보존된 인간의 성인 각막으로부터 채취한 1차 배양된 인간 각막 내피 세포와 변형된 틀 운반체인 N-(1-메틸에틸)-2-프로펜아미드 호모폴리머를 이용함으로써 인간 각막 내피와 기능적으로 유사한 각막 내피 세포 시트를 제조하였다. 2008년 일본 도쿄대 의학대학의 코우이치로 히타니(Kouichiro Hitani)는 세포 배양 삽입체(insert) 상에서 인간 각막 내피 세포를 배양함으로써 정상 인간 각막 상피와 동등한 기능을 갖는 인간 각막 내피 세포 시트를 얻었다. 이러한 성취들은 비-전달감염된 HCE 세포를 이용한 조직공학적 인간 각막 내피의 재건에 새로운 길을 열었다. 그러나, 전술한 방법에서 도입된 종자 세포(seeder cell)는 안구 은행에 보존된 각막으로부터 1차 배양되거나 24-웰 배양 플레이트 내에서 4-5회 계대 배양된 인간 각막 내피 세포였다. 제한된 수의 종자 세포는 조직공학적 인간 각막 상피의 시험관내 재건을 제한하게 되고, 결과적으로 임상적인 각막 이식을 위한 재건된 각막 내피 동등물은 충분하지가 않다. 상기 방법은 단지 실험 연구에만 사용될 수 있다. 이들은 중국 내에 80만명 이상, 전세계적으로 1,000만명 이상인 원발성 각막 내피염을 앓고 있는 환자를 위한 임상적 치료 요구를 크게 만족시킬 수 없다.

2005년 팬(Fan) 등은 세계 최초로 어떠한 종양 유발 가능성도 없는 비-전달감염성 인간 각막 내피 세포주를 성공적으로 확립하였다. 이로부터, 조직공학적 인간 각막 내피의 대규모 재건에 필요한 종자 세포의 공급원(source) 문제는 해결되었다. 그러므로, 하루 빨리 이상적인 틀 운반체의 제조 기술을 확립하고, 그럼으로써 비감염전달성 인간 각막 내피 세포 및 이상적인 틀 운반체를 이용한 조직공학적 인간 각막 내피의 재건 방법을 발견하는 것은 이제 전세계 안과의사들의 주요 연구 과제가 되었다. 이것은 또한 조직공학적 각막 내피의 임상적 응용을 위한 열쇄이고, 전세계의 원발성 각막 내피염을 앓고 있는 환자에게 혜택을 주기 위한 열쇄이다.

본 발명의 목적은 인간 각막 내피 세포 및 노출된 인간 양막 틀 운반체를 이용하여 조직공학적 인간 각막 내피의 재건 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 방법: 바닥 면적이 25 ㎠인 배양 플라스크에서 인간 각막 내피 세포를 20%의 송아지 혈청을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 37℃ 온도에서 대수 성장기까지 배양 및 증식한다. 이후, 세포를 0.25% 트립신을 이용하여 소화하고, 이어서 격렬하게 피펫팅함으로써 재현탁한다. 이후, 현탁된 세포를 원심분리로 침강시킨 후 수확한다. 펠렛 내의 세포를 5 ㎖의 특정 배지로 재현탁하여 인간 각막 내피 세포 현탁액을 제조한다. 혈구계산기(hemocytometer)로 세포 밀도를 측정하고, 특정 배지를 이용하여 4.2×10⁶∼4.2×10⁷ 세포/㎖로 조정한다.

이어서, 페트리 디쉬 내에서 상피층이 그 하부에 있는 거꾸로된 동결건조된 인간 양막의 상피면을 0.25%의 트립신 용액을 이용해 소화시켜 노출된 인간 양막을 제조하였다. D-hanks 용액으로 2회 헹군 후, 상기 노출된 인간 양막을 천공기를 이용하여 48-웰 배양 플레이트의 웰과 동일한 직경의 디스크로 천공하였다. 상기 디스크는 그 상피층을 위로 향하게 하여 48-웰 배양 플레이트 내에서 웰의 바닥 위에 부착하였다. 이후, 상기 플레이트를 37℃로 세팅된 5% CO₂ 인큐베이터 내에 넣었다. 건조되어 웰의 바닥에 완전히 부착된 디스크를 양막 틀 운반체로서 사용한다.

마지막으로, 준비된 인간 각막 내피 세포 현탁액 0.1∼0.2 ㎖를 상기 노출된 인간 양막 틀 운반체가 부착된 배양 플레이트의 웰 내로 부드럽게 접종하여, 세포 현탁액이 웰 내에 균일하게 분포되도록 하였다. 이어서, 상기 플레이트를 37℃로 세팅된 5% CO₂ 인큐베이터에 놓고 20-24시간 동안 배양한다. 세포가 상기 노출된 양막 틀 운반체에 완전히 부착되면, 추가적인 특정 배지(아래에 개시됨)를 보충하여 배지의 액체 표면이 웰 높이의 3/4까지 되도록 한다. 인간 각막 내피 세포가 단일층을 형성하기 위해 확장될 때, 조직공학적 인간 각막 내피가 최종적으로 재건된다.

조직공학적 인간 각막 내피를 재건하기 위한 본 발명에서 사용되는 특정 배지의 제형은 20%의 송아지 혈청 및 0.05%∼0.1% 타입 Ⅳ 콜라겐이 보충된 DMEM/F12 배지이다.

인간 각막 내피 세포 및 노출된 양막 틀 운반체의 부착 친화도를 개선하기 위하여, 본 발명에서는 0.05%∼0.1%의 피브로넥틴을 상기 특정 배지 내에 동시에 보충한다.

본 발명에 개시된 방법을 이용하여 재건된 조직공학적 인간 각막 내피는 정상 인간 각막 내피와 매우 유사한 형태학적 특성, 조직 구조 및 투명도를 나타내며, 정상 인간 각막 내피와 유사한 기능을 한다. 이어서, 본 발명에서 재건된 조직공학적 인간 각막 내피는 각막 내피와 데스메막(Descemet's membrane)이 제거된 뉴질랜드 토끼의 눈에 이식하며, 이것은 토끼 각막을 39일까지 투명하게 유지하도록 할 수 있다. 본 발명은 주된 특징은 비-전달감염성이고 종양유발성이 없는 인간 각막 내피 세포주를 적용하는 것이다. 조직공학적 인간 각막 내피의 대규모 재건을 위한 대량의 종자 세포는 성공적인 계대배양에 의해 용이하게 얻을 수 있다. 각막 내피 재건을 위한 틀 운반체의 대량의 수요는 상업적으로 이용가능한 동결건조된 양막으로부터 제조된 상기 노출된 인간 양막을 이용하여 충족될 수 있다. 아울러, 상기 종자 세포 및 틀 운반체는 조직공학적 인간 각막 내피 및 그 임상적 치료 비용을 낮춘다.

본 발명의 구체적인 실시 방법

1. 조직공학적 인간 각막 내피를 재건하기 위한 특정 배지의 제조: 통상적으로 제조된 DMEM/F12 배지 70 ㎖을 타입 Ⅳ 콜라겐 40-80 ㎎과 혼합하고, 상기 용액을 0.22 ㎛ 미세구멍의 막을 통해 여과한다. 이어서 20 ㎖의 송아지 혈청을 첨가하고, 통상적으로 제조된 DMEM/F12 배지를 이용하여 배지의 최종 부피를 100 ㎖로 조정한다.

상기 노출된 인간 양막 틀 운반체에 대한 인간 각막 내피 세포의 부착 친화도를 개선하기 위하여, 본 발명에서는 또 0.05%∼0.1%의 피브로넥틴을 상기 배지에 보충한다.

2. 인간 각막 내피 세포주를 이용한 종자 세포의 제조: 바닥 면적이 25 ㎠인 배양 플라스크에서 인간 각막 내피 세포를 20%의 송아지 혈청을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 37℃ 온도에서 배양 및 증식한다. 인간 각막 내피 세포는 60-68시간의 증식 배양에서 대수 성장기에 도달한다. 상기 배지를 유리 드립 파이프(drip pipe)를 이용하여 제거한다. 세포를 적절한 부피의 0.25% 트립신 용액을 이용하여 1-2분 동안 소화시킨다. 상기 소화는 사용된 배지를 다시 피펫팅함으로써 중지시키는데, 이는 배지 내의 혈청이 트립신의 효소 활성을 억제하기 때문이다. 세포를 270-300 g에서 10-15분 동안 원심분리함으로써 세포를 수확하고, 세포 펠렛을 5 ㎖의 특정 배지 내에 균일하게 재현탁하여 인간 각막 내피 세포 현탁액을 제조한다. 이후, 혈구계산기로 세포 밀도를 분석하고, 4.2×10⁶∼4.2×10⁷ 세포/㎖로 조정한다.

3. 노출된 인간 양막 틀 운반체를 제조하기 위한 도치된 가수분해: 동결건조된 인간 양막을 페트리 디쉬 내에서 상피층이 그 하부에 있도록 거꾸로 위치시키고, 0.25%의 트립신 용액을 이용해 소화시켜 상피층을 제거한다. D-hanks 버퍼로 2회 헹군 후, 상기 노출된 인간 양막을 천공기를 이용하여 48-웰 배양 플레이트의 웰과 동일한 직경의 디스크로 천공한다.

4. 조직공학적 인간 각막 내피의 시험관내 재건: 노출된 인간 양막 디스크를 48-웰 배양 플레이트 내에서 웰의 바닥 위에 그 상피층을 위로 향하게 하여 각각 한 조각씩 부착시킨다. 이어서, 상기 디스크가 건조되고 상기 바닥에 완전히 부착할 때까지 상기 배양 플레이트를 37℃로 세팅된 인큐베이터 내에 넣는다. 전술한 바와 같이 준비된 인간 각막 내피 세포 현탁액을 그 바닥에 상기 노출된 양막 틀 운반체가 부착된 웰 내에 부드럽게 접종한다. 드립 파이프의 팁(tip)에 주의를 기울여서, 상기 팁을 상기 막에 가능한 가깝게 하지만 상기 막에 접촉하지는 않도록 하여 이들 사이의 임의의 가능한 접촉을 피하도록 한다. 세포 현탁액(0.1∼0.2 ㎖)을 상기 막의 중앙에 천천히 떨어뜨리고, 이를 반복적으로 부드럽게 피펫팅하여 세포가 균일하게 분포되도록 한다. 세포가 상기 노출된 양막 틀 운반체에 완전히 부착될 때까지 상기 배양 플레이트를 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에 20-24시간 동안 둔다. 전술한 추가적인 특정 배양 배지를 보충하여 배양 배지의 액체 표면이 웰 높이의 3/4까지 되도록 한다. 인간 각막 내피 세포가 확장하여 상기 노출된 인간 양막 틀 운반체 위에 단일층을 형성할 때, 조직공학적 인간 각막 내피가 최종적으로 재건된다.

실시예 1

바닥 면적이 25 ㎠인 배양 플라스크에서 인간 각막 내피 세포를 20%의 송아지 혈청을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 37℃ 온도에서 84시간 동안 배양 및 증식하였다. 통상적으로 제조된 DMEM/F12 배지 70 ㎖을 타입 Ⅳ 콜라겐 40-80 ㎎과 혼합함으로써, 조직공학적 인간 각막 내피를 재건하기 위하여 본 발명에서 사용된 특정 배지를 제조하였다. 상기 혼합물을 0.22 ㎛ 미세구멍의 막을 통해 여과하였다. 상기 여과물을 20 ㎖의 송아지 혈청과 혼합하고, 통상적으로 제조된 DMEM/F12 배지를 이용하여 최종 부피를 100 ㎖로 조정하였다. 증식 후 상기 배지를 유리 드립 파이프를 이용하여 플라스크로부터 제거하고, 사용된 채로 보관하였다. 상기 세포를 적절한 부피의 0.25% 트립신 용액을 이용하여 1.5분 동안 소화시켰다. 사용된 배지를 이용하여 상기 소화를 중지시켰다. 세포를 300 g에서 10분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛을 5 ㎖의 전술한 특정 배지 내에 균일하게 재현탁하여 인간 각막 내피 세포 현탁액을 제조하였다. 이후, 혈구계산기를 이용하여 세포 밀도를 분석하였고, 특정 배지로 4.7×10⁶ 세포/㎖로 조정하였다.

동결건조된 인간 양막의 상피층을 전술한 것과 같은 "도치 소화 방법"을 이용하여 0.25%의 트립신 용액으로 소화시켰다. 이어서, 생성된 노출된 양막을 D-hanks 버퍼를 이용하여 2회 헹구었고, 배양 플레이트의 웰과 동일한 직경의 디스크로 천공하였다. 양막 디스크를 48-웰 배양 플레이트 내에서 웰의 바닥 위에 그 상피층을 위로 향하게 하여 각각 한 조각씩 부착시켰다. 이어서, 상기 디스크가 건조되고 상기 바닥에 완전히 부착할 때까지 상기 플레이트를 37℃로 세팅된 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 유지하였고, 이를 양막 틀 운반체로 사용하였다. 상기 제조된 세포 현탁액을 상기 노출된 양막 틀 운반체가 부착된 배양 플레이트 웰 내에 첨가하였다. 특별한 주의를 기울여서, 드립 파이프의 팁이 상기 막에 접근하지만 상기 막에 접촉하지는 않도록 하여 이들 사이의 임의의 가능한 접촉을 피하도록 해야 한다. 세포 현탁액(0.2 ㎖)을 상기 막의 중앙에 천천히 떨어뜨리고, 드립 파이프를 이용해 반복적으로 부드럽게 피펫팅하여 세포가 웰 내에 균일하게 분포되도록 하였다. 세포가 양막 틀 운반체에 완전히 부착될 때까지 상기 플레이트를 37℃로 세팅된 5% CO₂ 인큐베이터에 24시간 동안 두었다. 전술한 추가적인 특정 배양 배지를 첨가하여 배지의 액체 표면이 웰 높이의 3/4까지 되도록 하였다. 인간 각막 내피 세포가 확장하여 단일층을 형성할 때, 조직공학적 인간 각막 내피가 재건되었다.

실시예 2

바닥 면적이 25 ㎠인 배양 플라스크에서 인간 각막 내피 세포를 20%의 송아지 혈청을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 37℃ 온도에서 72시간 동안 배양 및 증식하였다. 통상적으로 제조된 DMEM/F12 배지 70 ㎖을 타입 Ⅳ 콜라겐 40-80 ㎎과 혼합함으로써, 조직공학적 인간 각막 내피를 재건하기 위하여 본 발명에서 사용된 특정 배지를 제조하였다. 상기 혼합물을 0.22 ㎛ 미세구멍의 막을 통해 여과하였다. 상기 여과물을 20 ㎖의 송아지 혈청과 혼합하고, 통상적으로 제조된 DMEM/F12 배지를 이용하여 100 ㎖의 최종 부피로 조정하였다. 증식 후 상기 배지를 배양 플라스크로부터 유리 드립 파이프를 이용하여 제거하고, 사용된 채로 보관하였다. 상기 세포를 적절한 부피의 0.25% 트립신 용액을 이용하여 1분 동안 소화시켰다. 사용된 배지를 이용하여 상기 소화를 중지시켰다. 세포를 270 g에서 15분 동안 원심분리해 수확하고, 세포 펠렛을 5 ㎖의 특정 배지 내에 균일하게 재현탁하여 인간 각막 내피 세포 현탁액을 제조하였다. 이후, 혈구계산기를 이용하여 세포 밀도를 측정하였고, 특정 배지를 이용하여 4.2×10⁷ 세포/㎖로 조정하였다.

동결건조된 인간 양막의 상피층을 전술한 것과 같은 "도치 소화 방법"을 이용하여 0.25%의 트립신 용액으로 소화시켜 노출된 양막을 제조하였다. D-hanks 버퍼를 이용하여 2회 헹군 후, 상기 노출된 양막을 배양 플레이트의 웰과 동일한 직경의 디스크로 천공하였다. 양막 디스크를 48-웰 배양 플레이트 내에서 웰의 바닥 위에 그 상피층을 위로 향하게 하여 각각 한 조각씩 부착시켰다. 이어서, 상기 디스크가 건조되고 상기 바닥에 완전히 부착할 때까지 상기 플레이트를 37℃로 세팅된 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 유지하였다. 상기 디스크를 양막 틀 운반체로 사용하였다. 상기 제조된 세포 현탁액을 상기 노출된 양막 틀 운반체가 부착된 배양 플레이트 웰 내에 첨가하였다. 드립 파이프의 팁에 특별한 주의를 기울여야 한다; 팁은 상기 막에 접근하지만 상기 막에 접촉하지는 않도록 하여 이들 사이의 임의의 가능한 접촉을 피하도록 해야 한다. 세포 현탁액(0.1 ㎖)을 상기 막의 중앙에 천천히 떨어뜨리고, 드립 파이프를 이용해 반복적으로 피펫팅하여 세포가 배양 웰 내에 균일하게 분포되도록 하였다. 세포가 양막 틀 운반체에 완전히 부착될 때까지 상기 플레이트를 37℃로 세팅된 5% CO₂ 인큐베이터에 22시간 동안 두었다. 전술한 추가적인 특정 배양 배지를 보충하여 배지의 액체 표면이 웰 높이의 3/4까지 되도록 하였다. 인간 각막 내피 세포가 확장하여 단일층을 형성할 때, 조직공학적 인간 각막 내피가 재건되었다.

실시예 3

바닥 면적이 25 ㎠인 배양 플라스크에서 인간 각막 내피 세포를 20%의 송아지 혈청을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 37℃ 온도에서 60시간 동안 배양 및 증식하였다. 통상적으로 제조된 DMEM/F12 배지 70 ㎖을 타입 Ⅳ 콜라겐 40-80 ㎎과 혼합함으로써, 조직공학적 인간 각막 내피를 재건하기 위하여 본 발명에서 사용된 특정 배지를 제조하였다. 상기 혼합물을 0.22 ㎛ 미세구멍의 막을 통해 여과하였다. 상기 여과물을 20 ㎖의 송아지 혈청과 혼합하고, 통상적으로 제조된 DMEM/F12 배지를 이용하여 최종 부피를 100 ㎖로 조정하였다. 증식 후 상기 배지를 배양 플라스크로부터 유리 드립 파이프를 이용하여 제거하고, 사용된 채로 보관하였다. 상기 세포를 적절한 부피의 0.25% 트립신 용액을 이용하여 2분 동안 소화시켰다. 사용된 배지를 이용하여 상기 소화를 중지시켰다. 세포를 300 g에서 12분 동안 원심분리해 수확하고, 세포 펠렛을 5 ㎖의 특정 배지 내에 균일하게 재현탁하여 인간 각막 내피 세포 현탁액을 제조하였다. 혈구계산기를 이용하여 세포 밀도를 측정하였고, 특정 배지를 이용하여 4.4×10⁶ 세포/㎖로 조정하였다.

동결건조된 인간 양막의 상피층을 전술한 것과 같은 "도치 소화 방법"을 이용하여 0.25%의 트립신 용액으로 소화시켰다. 상기 노출된 양막을 D-hanks 버퍼를 이용하여 2회 헹군 후, 배양 플레이트의 웰과 동일한 직경의 디스크로 천공하였다. 양막 디스크를 48-웰 배양 플레이트 내에서 웰의 바닥 위에 그 상피층을 위로 향하게 하여 부착시켰다. 이어서, 상기 디스크가 건조되고 상기 바닥에 완전히 부착할 때까지 상기 플레이트를 37℃로 세팅된 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 유지하였다. 상기 디스크를 양막 틀 운반체로 사용하였다. 상기 제조된 세포 현탁액을 상기 노출된 양막 틀 운반체가 부착된 배양 플레이트 웰 내에 첨가하였다. 드립 파이프의 팁에 특별한 주의를 기울여야 한다; 팁은 상기 막에 접근하지만 상기 막에 접촉하지는 않도록 하여 이들 사이의 임의의 가능한 접촉을 피하도록 해야 한다. 세포 현탁액(0.21 ㎖)을 상기 막의 중앙에 천천히 떨어뜨리고, 드립 파이프를 이용해 반복적으로 피펫팅하여 세포가 웰 내에 균일하게 분포되도록 하였다. 세포가 양막 틀 운반체에 완전히 부착될 때까지 상기 플레이트를 37℃로 세팅된 5% CO₂ 인큐베이터에 20시간 동안 두었다. 전술한 특정 배양 배지를 보충하여 배양 배지의 액체 표면이 웰 높이의 3/4까지 되도록 하였다. 인간 각막 내피 세포가 확장하여 단일층을 형성할 때, 조직공학적 인간 각막 내피가 재건되었다.

Claims

인간 각막 내피 세포주를 20%의 송아지 혈청을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 배양 및 증식시키고, 0.25% 트립신으로 소화시킨 후, 270-300 g에서 10-15분 동안 원심분리하여 인간 각막 내피 세포를 수확하고, 상기 세포를 특정 배지(20% 송아지 혈청 및 0.05-0.1% 타입 Ⅳ 콜라겐으로 보충된 DMEM/F12 배지) 내에 재현탁시켜 인간 각막 내피 세포 현탁액을 제조하는 단계;
동결건조된 인간 양막을 페트리 디쉬 위에서 상피층을 아래로 하여 거꾸로 위치시키고, 상기 동결건조된 인간 양막의 상피층을 0.25%의 트립신 용액으로 소화시켜 노출된 인간 양막을 제조한 후, 천공기를 이용하여 배양 플레이트의 웰과 동일한 직경의 양막 디스크로 천공하는 단계;
상기 양막 디스크를 48-웰 세포 배양 플레이트의 웰의 바닥 위에 상기 소화된 상피층을 위로 향하게 하여 부착시키고, 상기 양막 디스크가 건조되고 상기 바닥에 완전히 부착될 때까지 상기 플레이트를 37℃ 인큐베이터 내에 유지시켜 양막 틀 운반체를 준비하는 단계; 및
상기 인간 각막 내피 세포 현탁액을 상기 양막 틀 운반체가 부착된 배양 플레이트 내에 접종하고, 상기 접종량은 0.1 ㎖ 및 0.2 ㎖ 사이에서 변화시키며, 상기 인간 각막 내피 세포가 상기 양막 틀 운반체에 완전히 부착될 때 상기 특정 배지를 첨가하여 배양 배지의 액체 표면이 웰 높이의 3/4까지 되도록 하고, 상기 인간 각막 내피 세포가 확장하여 단일층을 형성할 때 조직공학적 인간 각막 내피가 최종적으로 재건되는 단계를 포함하는 조직공학적 인간 각막 내피의 재건 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 특정 배지에 0.05%∼0.1%의 피브로넥틴을 첨가하는 조직공학적 인간 각막 내피의 재건 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 인간 각막 내피 세포주를 대수 성장기까지 증식시키는 조직공학적 인간 각막 내피의 재건 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 대수 성장기에서의 인간 각막 내피 세포주의 세포 밀도는 4.2×10⁶∼4.2×10⁷ 세포/㎖인 조직공학적 인간 각막 내피의 재건 방법.