CN1218755C

CN1218755C - 一种干细胞再生表层角膜及其作为角膜移植材料的用途

Info

Publication number: CN1218755C
Application number: CNB011237074A
Authority: CN
Inventors: 杜仪琴; 李凌松
Original assignee: KEYU UNION STEM CELL BIOTECHNOLOGY CO Ltd BEIJING
Current assignee: KEYU UNION STEM CELL BIOTECHNOLOGY CO Ltd BEIJING
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2001-07-27
Publication date: 2005-09-14
Anticipated expiration: 2021-07-27
Also published as: CN1398644A

Abstract

本发明公开了一种干细胞再生表层角膜的制备方法、一种干细胞再生表层角膜及其在角膜移植上的应用；取胚胎角膜上皮或成人角膜缘上皮，剪碎后用硝化液消化，终止消化后，离心制备单细胞悬液种植于培养皿或培养瓶中，加入适量培养基5%CO₂、37℃下培养；培养细胞每2-3天换液一次；当细胞汇聚达80-90%时传代，第2-6代细胞直接传代至羊膜上，同样培养条件再培养8-20天后即得到本发明的干细胞再生表层角膜，可以作为移植治疗角膜疾病的材料。本发明所述的方法及产品原料来源丰富，无鼠源性污染危险，免疫排斥轻或无免疫排斥，是一种可以用于多种角膜疾病治疗的新型材料。

Description

一种干细胞再生表层角膜及其作为角膜移植材料的用途

发明领域

本发明涉及一种干细胞再生表层角膜及其在角膜移植上的应用；特别是涉及以胚胎或异体角膜为原料，传代后在羊膜上非分化培养而制成的干细胞再生表层角膜及其在角膜移植上的应用。

背景技术

角膜是眼球最外层的部分，是无血管透明的结构，位于眼球最前端(所谓的黑眼珠)。它像照相机镜头一样是重要的屈光间质，外界光线必须首先通过角膜才能进入眼内。如果因化学性烧伤、热烫伤、感染或其它疾病使角膜变得混浊、角膜表面侵入血管，将严重影响视力，甚至失明。严重的角膜疾病需要通过手术的方法，去除病人混浊部分的角膜，用同样形状的健康透明的角膜来代替病变或损伤的角膜，以达到恢复视力或治疗角膜疾病的目的。

现有技术中角膜移植主要有三种方式，传统角膜移植、自体缘移植和异体缘移植，其主要特点如下：

1.传统角膜移植主要用于治疗各种原因引起的中央角膜混浊，其优点在于术后角膜光学区透明，缺点是仅为中央φ6-7mm光学区移植，对于干细胞缺失者无效，角膜很快再混浊，另外需要长期的免疫抑制治疗。

2.自体缘移植的优点是不需要免疫抑制治疗，但健眼有发生干细胞缺失危险，且不能360°环状移植，效果受到一定的限制。

3.异体缘移植是目前比较成熟的治疗干细胞缺失的手术方法，但供体材料极为有限，治疗机会非常少；有免疫排斥，术后用药至少一年，费用很高。

随着干细胞技术的发展，近年来，人们提出了采用培养干细胞角膜进行移植的方法，如CORNEA 2000；19(4)：421-42中公开了Schwab IR等的采用生物工程组织代替病变角膜的方法，其中角膜皮膜的细胞培养是采用自体或亲属的角膜皮膜，以保存人羊膜(HAM)为载体，传代后在HAM上分化培养细胞，滋养细胞为3T3，采用KGM培养基，无血清培养。这种方法的缺点是虽然在3T3滋养细胞上培养细胞可大量增殖，但因用鼠细胞作滋养细胞而有异源污染危险；另外在羊膜上分化培养使干细胞数量减少，无法保证长期有效性。

N ENGL J MED 2000；43：86-93中，Tsai RJF等人公开了通过移植自体的皮膜重建受损的角膜的方法，其中角膜皮膜的细胞培养是采用自体角膜细胞，以保存人羊膜(HAM)为载体，在HAM上组织块原代培养，培养基为DMEM∶F12＝1∶1，0.5％DMSO，鼠EGF，牛胰岛素，霍乱毒素，5％FBS。这种方法的优点在于自体细胞培养，无排斥反应，不采用滋养细胞3T3，但存在双眼患者不适用且原代培养的培养方法使干细胞与分化细胞混合存在，干细胞数量有限的缺点，可能也无法保证长期有效性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干细胞再生表层角膜，它几乎由纯的干细胞构成，移植后在体条件下分化，未分化细胞根据自体条件调节，干细胞保持其自我复制能力，可保证移植手术后细胞治疗的长期有效性；免疫排斥轻或无免疫排斥(自体细胞培养移植)，是一种可以用于多种角膜疾病治疗的新型材料。

本发明的再一目的在于上述一种干细胞再生表层角膜在治疗角膜疾病中的用途。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：取胚胎角膜上皮或成人角膜缘上皮，将其剪碎后用含酶的消化液消化。终止消化后，离心制备单细胞悬液用于培养；将单细胞悬液置于培养皿或培养瓶中，加入适量培养基培养，培养条件为5％CO₂、37℃。培养细胞每2-3天换液一次；当细胞汇聚达80-90％时传代，将第2-6代细胞直接传代至羊膜上非分化培养，以同样培养条件再培养8-20天后即得到本发明的干细胞再生表层角膜，可以作为移植治疗角膜疾病的材料。

所述的干细胞再生表层角膜植入人体后，于在体条件下分化，未分化细胞根据自体条件调节，干细胞保持其自我复制能力，达到治疗角膜疾病的目的。

其中，本发明所述的成人角膜缘上皮，是指区别于胚胎的成体，可以为几个月的幼儿或任何年龄的成人。

所述的消化液可以是胰蛋白酶+EDTA、胰蛋白酶、胶原酶、DispaseI或DispaseII，以及他们一种或一种以上的组合；优选胰蛋白酶或胰蛋白酶+EDTA；最优选胰蛋白酶+EDTA。

所述的中止消化可以采用胎牛血清、DMEM+胎牛血清或hanks液+FBS，以及他们一种或一种以上的组合来实现；优选采用胎牛血清或DMEM+胎牛血清；最优选采用DMEM+胎牛血清。

所述的培养液包括：DMEM(Dulbecco’s modified eagle’smedium)：Ham’s F12为1∶1---3∶1，10％胎牛血清，表皮生长因子EGF(10-20ng/ml)。

所述的培养液进一步包括：碱性成纤维细胞生长因子bFGF(10-30ng/ml)，胰岛素(5-40ug/ml)，转铁蛋白(1-10ug/ml)，三碘甲状腺原氨酸(1-3nM)，谷氨酰胺1-8mM，硒酸钠0-8ug/ml。

所述的羊膜采用如下方法处理：选择剖腹产产妇所产的、无HIV、乙肝、丙肝及梅毒感染的胎盘，在无菌条件下，用平衡盐液清洗血凝块，钝性分离羊膜，再用含庆大霉素4万U/200ML的平衡盐液清洗羊膜三遍，剪成2.5*2.5CM²大小，上皮基底膜向上贴附于高压灭菌的硝酸纤维素膜上，加入等量DMEM与甘油，于-80℃贮存。保存羊膜用于细胞培养时，先在PBS中水化30分钟，再用胰蛋白酶+EDTA(或单用EDTA)消化3小时，然后用细胞刮刀刮除其上皮，再用PBS洗3遍，上皮基底面向上平铺于培养皿中，即可将传代的细胞种植其上进行培养。

倒置显微镜下见羊膜上贴附的细胞均为圆形而不是分化角膜上皮的多角形；羊膜上细胞用BrdU标记24小时后进行细胞免疫组织化学鉴定，阳性细胞在15-40％，细胞的低标记率提示干细胞的慢循环特性，证明传代后得到的第2-6代细胞为干细胞，就是所需要的干细胞再生表层角膜。

本发明以胚胎角膜上皮或成人角膜缘上皮为原料，采用生物工程的方法制备了一种几乎为纯一色干细胞的干细胞再生表层角膜。移植后在体条件下分化，未分化细胞保持干细胞的自我复制能力，可根据自体条件调节其复制与分化，可保证移植手术后细胞治疗的长期有效性；本发明所述的方法及产品原料来源丰富，无鼠源性污染危险，免疫排斥轻或无免疫排斥，为角膜组织和器官缺损、功能障碍的治疗等开辟了新途径。

下面结合附图和实施例详细描述本发明，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。

附图说明

图1为BrdU标记细胞；

图2为干细胞缺失兔眼：角膜混浊、新生血管、上皮缺损；

图3为干细胞再生表层角膜移植治疗干细胞缺失兔眼。

具体实施方式

实施例1

于13周胚龄流产胎儿眼上，取全部角膜上皮，将其剪碎后用3ML0.1％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化15分钟，用等量DMEM+10％胎牛血清终止消化，1500RPM离心10分钟后，加入培养基制备单细胞悬液，将1.5ML单细胞悬液置于35MM塑料培养皿中，加入培养基在5％CO₂、37℃下培养。

培养基成分：DMEM∶F12＝1∶1，10％胎牛血清，表皮生长因子EGF(10ng/ml)，碱性成纤维细胞生长因子bFGF(20ng/ml)，胰岛素(5ug/ml)，转铁蛋白(5ug/ml)，三碘甲状腺原氨酸(2nM)，谷氨酰胺4mM，硒酸钠5ug/ml。

培养过程：培养细胞每2天换培养基一次，20天细胞汇聚达80-90％时传代，再10天传第2代，再8天传第3代，第三代细胞直接传代至已作处理的羊膜上，以同样培养条件再培养14天后，得到干细胞再生表层角膜用于移植治疗。其中羊膜的处理方法已经在发明内容中详细描述。

倒置显微镜下见羊膜上贴附细胞均为圆形而不是分化角膜上皮的多角形，细胞生长状态良好，细胞会聚，就是所需要的干细胞再生表层角膜。羊膜上细胞用BrdU标记24小时后行细胞免疫组织化学鉴定，如图1所示，BrdU阳性细胞占27.2％，而部分细胞阴性，细胞的低标记率符合干细胞的慢循环特性。细胞的低标记率提示干细胞的慢循环特性，证明传代后得到的第3代细胞为干细胞，就是所需要的干细胞再生表层角膜。

实施例2

在65岁男性患者因左眼绝对期青光眼进行左眼内容剜除术后立即取其角膜缘上皮，将上皮剪碎后用0.1％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化40分钟，用等量DMEM+10％胎牛血清终止消化，1200RPM离心10分钟，加入下述培养基制成单细胞悬液，将1.5ML单细胞悬液移入35MM塑料培养皿中加入培养基培养。培养条件为5％CO₂、37℃。

培养基成分：DMEM∶F12＝3∶1，10％胎牛血清，表皮生长因子EGF(20ng/ml)，碱性成纤维细胞生长因子bFGF(10ng/ml)，胰岛素(10ug/ml)，转铁蛋白(10ug/ml)，三碘甲状腺原氨酸(1nM)，谷氨酰胺8mM。

培养过程：培养细胞每3天换液一次，22天细胞汇聚达80-90％时传代，再9天传第2代，再8天传第3代，将第三代细胞直接传代至已作同实施例1中所述上处理的羊膜上，以同样培养条件再非分化培养14天后得到一种干细胞再生表层角膜，用于移植治疗。

倒置显微镜下见羊膜上贴附细胞均为圆形而不是分化角膜上皮的多角形，细胞生长状态良好，细胞会聚，就是所需要的干细胞再生表层角膜。羊膜上细胞用BrdU标记24小时后行细胞免疫组织化学鉴定，BrdU阳性细胞占20％，而部分细胞阴性，细胞的低标记率符合干细胞的慢循环特性。细胞的低标记率提示干细胞的慢循环特性，证明传代后得到的第3代细胞为干细胞。

将所得角膜移植到图2所示的角膜混浊、有新生血管，上皮缺损的干细胞缺损动物模型兔眼上。如图3所示，术后角膜新生血管消失，角膜透明。

实施例3

在10岁男性患者因外伤进行左眼内容剜除术后立即取其角膜缘上皮，将该上皮剪碎后用0.1％胰蛋白酶消化70分钟，等量10％胎牛血清终止消化，1200RPM离心10分钟，加入下述培养基制成单细胞悬液，将1.5ml单细胞悬液移入35MM塑料培养皿中培养。培养条件为5％CO₂、37℃。

培养基成分：所述的培养液包括：DMEM：Ham’s F12为2∶1，10％胎牛血清，表皮生长因子EGF15ng/ml。

培养过程：培养细胞每1天换液一次，25天细胞汇聚达80-90％时传代，再8天传第2代，再7天传第3代，第三代细胞直接传代至已作同实施例1中所述处理的羊膜上，同样培养条件再非分化培养15天后，得到一种干细胞再生表层角膜，用于移植治疗。

倒置显微镜下见羊膜上贴附细胞均为圆形而不是分化角膜上皮的多角形，细胞生长状态良好，细胞会聚，就是所需要的干细胞再生表层角膜。羊膜上细胞用BrdU标记24小时后行细胞免疫组织化学鉴定，BrdU阳性细胞占35％，而部分细胞阴性，细胞的低标记率符合干细胞的慢循环特性。细胞的低标记率提示干细胞的慢循环特性，证明传代后得到的第3代细胞为干细胞。

将所得角膜移植到角膜混浊、有新生血管，上皮缺损的干细胞缺损动物模型兔眼上。术后角膜新生血管消失，角膜透明。

实施例4

参见实施例3的试验条件制取单细胞悬液，其中消化液采用胶原酶和DispaseI，终止消化液采用胎牛血清和hanks液+FBS外；培养基采用DMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium)：Ham’s F12为2∶1，10％胎牛血清，表皮生长因子EGF 12ng/ml；碱性成纤维细胞生长因子bFGF 30ng/ml，胰岛素40ug/ml，转铁蛋白1ug/ml，三碘甲状腺原氨酸3nM，谷氨酰胺1mM，硒酸钠8ug/ml。

培养过程：培养细胞每5天换液一次，18天细胞汇聚达80-90％时传代，再7天传第2代，再6天传第3代，再5天传第4代等等，第六代细胞直接传代至已同上处理的羊膜上，同样培养条件再培养8天后，得到一种干细胞再生表层角膜，用于移植治疗。

倒置显微镜下见羊膜上贴附细胞均为圆形而不是分化角膜上皮的多角形，细胞生长状态良好，细胞会聚，就是所需要的干细胞再生表层角膜。羊膜上细胞用BrdU标记24小时后行细胞免疫组织化学鉴定，BrdU阳性细胞占15％，而部分细胞阴性，细胞的低标记率符合干细胞的慢循环特性。细胞的低标记率提示干细胞的慢循环特性，证明传代后得到的第3代细胞为干细胞。

实施例5

参见实施例3的方法，所不同之处在于传第二代后直接传代至已作同实施例1中所述处理的羊膜上，同样培养条件再非分化培养15天后，得到一种干细胞再生表层角膜。羊膜上细胞用BrdU标记24小时后行细胞免疫组织化学鉴定，BrdU阳性细胞占15％，而部分细胞阴性，细胞的低标记率符合干细胞的慢循环特性。细胞的低标记率提示干细胞的慢循环特性，证明传代后得到的第2代细胞为干细胞。

Claims

1.一种干细胞再生表层角膜，取胚胎角膜上皮或成人角膜缘上皮，剪碎后用含酶的消化液消化，终止消化后，离心制备单细胞悬液并用于培养；将单细胞悬液置于培养皿或培养瓶中，加入培养基在5％CO₂、37℃条件下培养；培养细胞每2-3天换液一次，当细胞汇聚达80-90％时传代，第2-6代细胞直接传代至经过处理的羊膜上，同样培养条件再非分化培养8-20天后即得到可以作为移植治疗角膜疾病的材料的干细胞再生表层角膜。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞再生表层角膜，的含酶的消化液为胰蛋白酶+EDTA，胰蛋白酶，胶原酶，DispaseI或DispaseII一种或一种以上的组合；胰蛋白酶或胰蛋白酶+EDTA。

3.根据权利要求1所述的一种干细胞再生表层角膜，所述中止消化液采用胎牛血清、DMEM+胎牛血清或hanks液+FBS一种或一种以上的组合；胎牛血清，或DMEM+胎牛血清。

4.根据权利要求1所述的一种干细胞再生表层角膜，其中所述的培养液包括1∶1-1∶3的DMEM∶F12、10％的FBS，10-20ng/ml的EGF。

5.根据权利要求4所述的一种干细胞再生表层角膜，其中所述的培养液进一步还包括：10-30ng/ml碱性成维细胞生长因子bFGF，5-40ug/ml胰岛素，1-10ug/ml转铁蛋白，1-3nM三碘甲状腺原氨酸，谷氨酰胺1-8Mm，硒酸钠0-8ug/ml。

6.根据权利要求1所述的一种干细胞再生表层角膜，其中所述的羊膜处理采用方法如下：选取择剖腹产产妇所产的、无HIV、乙肝、丙肝及梅毒感染的胎盘，在无菌条件下，用平衡盐液清洗血凝块，钝性分离羊膜，再用含庆大酶素4万U/20ML的平衡液清洗羊膜三遍，剪成2.5*2.5CM2大小，上皮基底膜向上贴附于高压灭菌的硝酸纤维膜素上，加入等量DMEM与甘油，-80℃贮存；保存羊膜用于细胞培养时，先在PBS中水化30分钟，在用胰蛋白酶+EDTA，消化3小时，然后用细胞刮刀刮出其上表皮，再用PBS洗3遍，上皮基底面向上平铺于培养皿中。

7.根据权利要求6所述的一种干细胞再生表层角膜，所述的制备过程为：取角膜缘上皮，剪碎后用0.1％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化40分钟，等量DMEM+10％胎牛血清中止消化，1200RPM离心10分钟，加入培养基制成单细胞悬液，取1.5ml单细胞悬液移入35MM塑料培养皿中加入培养基在5％CO₂、37℃下培养；

所述的培养基成分：DMEM∶F12-3∶1，10％胎牛血清，20ng/ml表皮生长因子EGF，10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子Bfgf，胰岛素10ug/ml，10ug/ml转铁蛋白，1Nm三点甲状腺原氨酸，8Mm谷氨酰胺；

培养过程：培养细胞每3天换液一次，22天细胞汇聚达80-90％时代，再9天传第2代，再8天传第3代，第三代细胞直接传代至已同上处理的羊膜上，同样培养条件再培养14天后，得到一种用于移植治疗的干细胞再生表层角膜。

8.根据权利要求1-7任一项所述的一种干细胞再生表层角膜，其特征在于羊膜上细胞用BrdU标记24小时后，阳性细胞在15-40％。

9.权利要求1所述的一种干细胞再生表层角膜，在眼角膜移植上的应用。