KR102096724B1 - 무세포 각막, 무세포 각막의 제조 방법 및 그의 용도 - Google Patents

무세포 각막, 무세포 각막의 제조 방법 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

무세포 각막의 제조 방법은 동물의 각막에 탈-세포화(de-cellularization) 공정을 실시하는 단계를 포함하며, 각막을 프로테아제, 킬레이트제, 세정제, 글리세롤 또는 이들의 조합으로 처리하는 단계를 포함하지 않는다. 본래의 각막을 이 방법으로 가공하는 경우, 각막의 본래의 구조와 입체가 보존되며, 면역원성 물질은 생성된 각막이 이식 후 숙주 세포가 성장할 수 있는 3차원 스캐폴드로서 작용할 수 있는 수준으로 감소된다.

Description

무세포 각막, 무세포 각막의 제조 방법 및 그의 용도
본 출원은 2016년 1월 8일자로 출원된 미국 가출원 제62/276,238호의 우선권을 주장하며, 이는 본원에 참조로서 통합된다.
본 개시는 일반적으로 이식용 이식편(grafts for transplantation)으로서 적합한 무세포 각막을 제조하는 방법 및 각막 손상과 관련된 눈 상태를 앓고 있는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
각막의 기능에 영향을 미치는 많은 질병 및 상태가 있으며, 그 중 많은 것들은 수술 및 각막 조직의 이식을 포함하는 치료 작용을 필요로 하는 심각한 상태이다. 돼지의 각막은 인간의 각막에 맞먹는 굴절률과 크기를 지니고 있어 인간 각막의 가장 유망한 대체물로 여겨져 왔다. 그러나, 돼지 각막 이종 이식(xenograft)은 탈세포화 목적으로 사용되는 화학 물질 및 효소와 같은 잔류 시약뿐만 아니라, 고유 각막과 비교하여 구조 및/또는 형태의 불완전성으로 인해 수혜 숙주에서 심각한 면역 반응 (또는 이식 거부)이 유도되는 것으로 보고되고 있다.
따라서, 관련 분야에는 각막을 제조하기 위한 개선된 공정의 필요성이 존재하는데, 이는 면역원성 물질 (예를 들어, 임의의 잔류 세포 물질, 화학 물질 및/또는 효소)이 이와 같이 생성된 각막이 숙주 세포에 대한 3차원 스캐폴드로서 작용할 수 있는 수준으로 감소되는 동안, 천연 각막의 고유 구조 및 형태를 보존시켜 현저한 면역 반응 및 신생 혈관 형성을 유발하지 않으면서 이식 후 성장할 수 있도록 한다.
본원의 배경이 되는 기술은 일본공개특허공부 제1994－218036호 및 일본공개특허공보 제2007-105081호에 개시되어 있다.
본 개시는 무세포 각막의 제조 및 이들의 이용시 상기 언급한 문제점을 극복하기 위해 본 발명자들에 의해 창안되었다.
따라서, 본 개시의 제 1 양태는 무세포 각막을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 동물의 각막에 초임계 유체 (SCF)의 처리를 가하는 단계를 포함하고; 이 때, 상기 방법은 각막을 프로테아제, 킬레이트제, 세정제(detergent), 글리세롤 또는 이들의 조합으로 처리하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
일부 구체예에 따라, 상기 방법은 SCF의 처리에 앞서, 물에 또는 0.5-4.0 M NaCl을 함유하는 염 용액에 적어도 24시간 동안 상기 각막을 침지하는 단계를 추가로 더 포함한다.
일부 구체예에 따라, 상기 각막은 약 73 내지 500 bar의 압력하에 30 내지 50℃의 온도에서 약 20 내지 120분 동안 공-용매의 존재하에 초임계 유체 (SCF)로 처리된다 .
상기 SCF는 초임계 이산화탄소(ScCO2), 초임계 아산화질소(ScN2O), 초임계 알칸, 초임계 알켄, 초임계 알콜, 초임계 아세톤 또는 이들의 조합 중 어느 하나일 수 있다. 일 예시에서, SCF는 ScCO2이다. 또 다른 예에서, SCF는 ScN2O이다. 상기 공용매는 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올, sec-부탄올, t- 부탄올 및 시클로부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 C1-4 알코올 일 수있다. 바람직하게는, 공용매가 30-100% (v%)의 에탄올이고, 보다 바람직하게는 공용매가 50-98%의 에탄올이고, 가장 바람직하게는 60-75% (v%)의 에탄올이다.
바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 SCF 처리는 공용매가 60% (vol%)의 에탄올이고, 온도가 약 45℃이고, 압력이 약 350 Bar인 조건에서 수행되고, 상기 단계는 약 80분 동안 수행된다.
가장 바람직하게는 본 방법은 각막을 프로테아제, 킬레이트제, 세제, 글리세롤 용액 또는 이들의 조합으로 처리하는 단계를 포함하지 않는 것이다.
일부 구체예에 따라, 상기 각막은 돼지, 암소(cow), 양, 염소, 토끼, 원숭이 또는 인간으로 구성된 군으로부터 선택된 동물로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 상기 각막은 돼지로부터 얻어진다.
따라서, 본 개시의 제 2 양태는 전술한 방법에 의해 제조된 무세포 각막을 제공하는 것이다.
바람직한 실시예에 따르면, 무세포 각막은 돼지 각막으로부터 유래된다.
따라서, 본 개시의 제 3 양태는 본 발명에 의해 제조된 무세포 각막을 사용하여 눈 상태로 고생하는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 눈의 상태와 관련된 각막 손상을 회복하기 위해 본 발명의 무세포 각막을 대상의 눈에 이식하는 단계를 포함한다.
선택적 구체예에서, 상기 방법은 이식 전에 본 발명의 무세포 각막 상의 세포를 배양하는 단계를 추가로 더 포함한다. 본 발명의 무세포 각막 배양에 적합한 세포는 각막 내피 세포, 각막 간질(stromal) 세포, 각막 상피 세포, 배아 줄기세포 및 성체 줄기세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일부 실시예에 따르면, 세포는 자가 조직성(autologous)이다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 세포는 동종성(allogenic)이다.
본 발명의 일부 실시예에 따르면, 본 방법에 의해 치료할 수있는 눈 상태는 푸치 이영양증(Fuchs' dystrophy), 원추 각막(keratoconus), 격자 각막 이영양증(lattice cornea dystrophy), 맵-도트-지문 이영양증(map-dot-fingerprint dystrophy), 홍채 각막 내피 증후군(iridocorneal endothelial syndrome), 홍채 모반 증후군(iris nevus (Cogan-Reese) syndrome), 챈들러 증후군(Chandler's syndrome), 본 홍채 위축증(essential iris atrophy)으로 구성된 군에서 선택된다.
본 개시의 다른 구현예에 따르면, 상기 눈의 상태는 단순 헤르페스 바이러스에 의해 유발된 감염의 결과이다.
본 개시의 다른 구현예에 따르면, 상기 눈의 상태는 트라코마 클라미디아 (Chlamydia trachomatis)에 의해 유발된 감염의 결과이다.
본 개시의 또 다른 실시예에 따르면, 눈의 상태는 화학적 화상의 결과이다.
본 개시의 하나 이상의 실시예의 세부 사항은 이하의 첨부된 설명에서 설명된다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 모두 예시로서, 청구된 본 발명의 추가 설명을 제공하기 위한 것임을 이해해야 한다.
본 명세서에 통합되어 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 발명의 다양한 양태의 다양한 예시적인 시스템, 방법 및 다른 예시적인 실시예를 도시한다. 본 설명은 첨부도면을 고려하여 파악되는 상세한 설명으로부터 더 잘 이해 될 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 정상 각막 조직으로부터 추출된 가용성 각막 전체 단백질 및 (B) scCO2 처리된 각막 조직에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한다
도 2a는 본 발명의 일 구체예에 따른 정상 각막 조직 및 scCO2 처리된 각막 조직의 I 형 콜라겐에 대한 웨스턴 블랏 분석이다.
도 2b는 본 발명의 일 구체예에 따른 정상 각막 조직 및 scCO2 처리된 각막 조직의 II 형 콜라겐에 대한 웨스턴 블랏 분석이다.
도 3은 40 X (A) 및 100 X (B) 크기의 실시예 1.2의 각 무세포 각막의 조직 학적 염색 사진이다; 그리고
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 hADC를 씨딩하기 전 (a) 및 후(b)의 배율 2,000 X에서의 실시예 1.2의 무세포 각막의 SEM 사진이다.
첨부된 도면과 관련하여 이하에 제공되는 상세한 설명은 본 개시의 설명으로서 의도되며, 본 개시 내용이 구성되거나 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타 내기 위한 것이 아니다.
단수 형태는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하는 것으로 여기서 사용된다.
본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사값임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 임의의 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로 인해 필연적으로 발생하는 특정 오류를 포함한다. 또한, 여기에서 사용되는 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 상기 용어 "약"은 당업자가 고려할 때 평균의 허용 가능한 표준 오차 이내를 의미한다. 작동/작업 예 이외에, 또는 달리 명시하지 않는 한, 여기에 개시되는 재료의 양, 시간의 지속 시간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 등과 같은 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율은 모든 예에서 "약"이라는 용어로 변형된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시 및 첨부된 청구 범위에 기재된 수치 파라미터는 원하는 바에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 최소한 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수와 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본 개시는 무세포 각막을 제조하는 신규한 방법, 이에 의해 제조된 무세포 각막, 및 이로부터 제조된 무세포 각막을 사용하여 안질환 및/또는 이로부터 유익한 상태를 치료하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 제 1 양태는 각막의 고유 구조 및 형태가 보존되는 무세포 각막을 제조하는 방법을 포함하며, 따라서 이식 후에 숙주 조직 세포가 그 위에 성장할 수있는 최적의 미세 환경을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 적어도 동물의 각막에 초임계 유체 (SCF)의 처리를 실시하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 각막을 프로테아제, 킬레이트제, 세제, 글리세롤 용액 또는 이들의 조합물로 처리하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 방법을 시작하기 전에, 일부 공막(sclera) 조직과 함께 각막이 동물의 안구로부터 제거된다. 본 개시에서 사용하기에 적합한 동물은 돼지, 소(cattle), 암소(cows), 양, 염소, 토끼, 원숭이 및 인간을 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 일 실시예에서, 돼지의 안구가 조직 홀더 링(tissue holder ring)에 유지되고, 그 다음 일부 공막 조직과 함께 각막이 트레핀(trephine)의 도움으로 안구로부터 절단되어 본 방법에서 즉시 사용된다.
상기 수득된 각막은 이후 탈세포화(decellularization) 공정을 거친다. 탈 세포화 공정은 각막 조직의 물리적 및 생화학적 특성을 보존하면서 각막으로부터 세포성 물질을 제거하기 위한 목적으로 수행되므로, 조직 스캐폴드로 더 좋을 수 있다. 따라서, 상기 각막은 약 73-500 bar의 압력 하에서 30-50℃의 온도에서 약 20-120분 동안 공-용매의 존재하에 초임계유체 (supercritical fluid, SCF) 처리를 거친다.
상기 SCF는 초임계 이산화탄소(ScCO2), 초임계 아산화 질소(ScN2O), 초임계 알칸, 초임계 알켄, 초임계 알콜 또는 초임계 아세톤 중 어느 하나일 수 있다. 일 예시에서, SCF는 ScCO2이다. 또 다른 바람직한 예에서, SCF는 ScN2O이다. 상기 공용매는 비제한적으로, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올, sec-부탄올, t- 부탄올 및 시클로부탄올을 포함하는 C1-4 알코올 일 수 있다. 일부 바람직한 예에서, 공용매는 30-100% (v%) 에탄올, 예를 들어, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 및 100% (vol%) 에탄올이다. 더 바람직하게는, 상기 공용매는 40-98% 에탄올, 예를 들어, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 및 98% (vol%) 에탄올이다. 더더욱 바람직하게는, 상기 공용매는 60-75% (v%) 에탄올, 예를 들어 60, 65, 70, 및 75% (v%) 에탄올이다. 가장 바람직하게는, 상기 공용매는 60% (v%) 에탄올이다.
상기 탈세포화 공정은 압력이 약 70 - 500 bar, 예를 들어 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 및 500 bar; 바람직하게는 약 73 - 450 bar, 예를 들어 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 및 450 Bar; 더욱 바람직하게는 약 250-400 bar, 예를 들어 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 및 400 bar; 상기 온도는 30-50℃ 사이, 예를 들어 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50℃, 바람직하게는 약 35-48℃, 예를 들어 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 및 48℃; 그리고 약 20-120분 동안, 예를 들어 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 및 120분, 바람직하게는 약 30-90분, 예를 들어 30, 40, 50, 60, 70, 80, 및 90분의 조건에서 수행된다. 바람직한 구체예에서, 단계 (1)의 용액 처리된 각막을 약 350 bar, 45℃에서 약 80분 동안 60% (v%) 에탄올의 존재하에 ScCO2로 추가 처리한다. 상기 각막은 탈세포화 공정 후에 각막의 투명성을 잃거나 불투명해진다.
상기 본 방법은 선행 방법에서 기술하는 것처럼, 각막을 효소적 분해 (예를 들어, 프로테아제 또는 뉴클레아제 처리) 및/또는 이온 킬레이트 처리 (예를 들어, 이온 킬레이트제의 사용)하는 단계를 갖지 않는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 중국 특허 제104001215B호 및 미국특허 제8,313,893B2호를 참조하라. 또한, 본 발명의 각막은 세제(detergent)의 처리를 받지 않는다. 본 명세서에서 효소적 분해는 비제한적으로 펩신, 트립신, 키모트립신, 파파인, 키모파파인, 브로멜라인, 악티니다인(actinidain), 프로테이나아제A, 프로테이나아제K, 펩티다아제, 피신(ficin), 캘파인(calpain), 카스파제(caspase) 및 이들의 조합물을 포함하는 프로테아제; 또는 DNA 뉴클레아제 또는 RNA 뉴클레아제일 수 있는 뉴클레아제를 각막에 처리하는 것을 나타낸다. 본 명세서에서 이온 킬레이트 처리란, 비제한적으로 에틸렌디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라 아세트산 (DOTA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,1-0-테트라키스 (메틸렌포스폰산)(DOTP),트랜스-1,2-디아미노사이클로헥산트-에트라-아세트산(CDTA), 4,5-디히드록시벤젠-1,3-디설폰산(Tiron), 티오우레아, 8-히드록시퀴놀린-5-술폰산, 3,6-디술포-1,8-디히드록시-나프탈렌, Eriochromeschwarz T(1-(1-히드록시-2-나프틸아조)-2-히드록시-5-니트로-4-나프탈렌술폰산) 및 암모늄 퍼푸레이트를 포함하는 금속 이온 킬레이트제를 각막에 처리하는 것을 나타낸다. 본원에서 세제 처리란 각막을 세제로 처리하는 것을 말하며, 특히 양쪽친매성(amphiphilic) 분자, 예를 들어 양이온성(예: 4급 암모늄 화합물), 음이온성 (예: 알킬벤젠설포네이트, 담즙산 등) 또는 비-이온성 (예: Tween, Triton 및/또는 Brij 시리즈)인 계면활성제로 구성된 액체 세제로 처리하는 것을 말한다. 또한, 본 발명의 각막은 몇몇 종래의 공정에서 요구되는 바와 같이 글리세롤 용액에 침지될 필요가 없다.
선택적인 실시예에 따르면, SCF 처리 전에 각막을 물 또는 염 용액에 침지하고 이로부터 상피층을 제거한다. 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 용액은 염화리튬, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 1가 염(monovalent salts)을 함유한다. 바람직하게는, 상기 염 용액은 농도가 약 0.5 내지 4M인 염화나트륨 용액, 예를 들어, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 및 4.0 M; 더 바람직하게는 약 1.0 내지 3.5 M, 예를 들어 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 및 3.5 M; 그리고 가장 바람직하게는, 약 1.5 M이다. 바람직하게는, 상기 각막은 1.5 M NaCl 용액에 담그는데, 이 때 추가적인 금속 킬레이트제(예, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA))를 첨가하지 않고, 실온에서 부드럽게 24시간 동안 진탕한다. 다른 실시예에서, 상기 각막은 SCF 처리 전에 정제수(purified water)에 적어도 24시간 동안 담근다. 염 용액 또는 정제수로 처리한 후, 상기 각막은 불투명하거나 투명하지 않게 보이고 부풀었다. 이러한 선택적 물 또는 염 용액 처리의 조건은(예를 들어, 처리 시간 및/또는 염의 농도), 과도한 실험 없이 처리를 받은 각각의 각막의 상태에 기초하여 당 분야의 숙련자에 의해 용이하게 조정될 수 있다. 다른 예에서, 상기 각막을 적어도 24시간 동안 KCl 용액(0.5 내지 4M)으로 처리한다.
따라서, 본 개시의 추가의 양태는 전술한 방법에 의해 제조된 무세포 각막을 제공하는 것이다. 이와 같이 제조된 무세포 각막은 천연 각막의 콜라겐 섬유의 완전성(integrity)을 유지하며, 숙주에 면역원성을 가질 수 있는 세포 물질이 없으므로 숙주 세포, 특히 이식 후 숙주에 대한 바람직하지 않은 이식 후 반응 유도없이, 각막 유래 세포가 성장할 수 있는 우수한 그래프트로 작용할 수 있다.
따라서, 본원의 또 다른 양태는 안질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법에서 환자가 세포 (예를 들어, 각막 유래 세포)가 그 위에 성장하고 질병, 감염 또는 사고 (예를 들어, 화학적 화상)로 인한 임의의 각막 손상을 치료할 수 있는 무세포 각막의 그래프트로부터 이익을 얻을 수 있다.
이러한 점에서, 상기 방법은 눈 상태와 관련된 각막 손상을 치료하기 위해 무세포 각막을 대상의 눈에 이식하는 것을 포함한다.
전술한 방법에 의해 제조된 무세포 각막은 세포가 성장할 수 있는 생물학적 스캐폴드로서 사용하기에 적합하며, 따라서 임의의 실시 예에서, 본 개시의 상기 무세포 각막은 이식에 사용되기 전에 in vitro 에서 세포와 함께 예비-배양될 (pre-cultivated) 수 있다. 상기 세포는 당업계에 공지된 임의의 세포 배양 기술에 따라 배양될 수 있다. 배양될 수 있는 세포의 예로는 비제한적으로 각막 내피 세포, 각막 간질 세포 및 각막 상피 세포와 같은 각막 유래 세포; 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포를 포함한다. 또한, 상기 세포는 자가 조직(즉, 무세포 각막을 이식편으로 투여하는 숙주 유래) 또는 동종(즉, 숙주 이외의 대상체 유래)일 수 있다.
적절한 세포로 배양된 후, 본 무세포 각막은 각막 이식을 필요로하는 각막 손상과 관련된 눈 상태를 앓고 있는 숙주에 이식될 수 있다. 각막 손상과 관련된 상기 눈 상태는 질병, 감염 또는 사고로 인한 것일 수 있다.
일부 실시예에 따르면, 상기 눈 상태는 푸치 이영양증(Fuchs' dystrophy), 원추 각막(keratoconus), 격자 각막 이영양증(lattice cornea dystrophy), 맵-도트-지문 이영양증(map-dot-fingerprint dystrophy), 홍채 각막 내피 증후군(iridocorneal endothelial syndrome), 홍채 모반 증후군(iris nevus (Cogan-Reese) syndrome), 챈들러 증후군(Chandler's syndrome), 본 홍채 위축증(essential iris atrophy)으로 구성된 군에서 선택되는 질환으로부터 야기된다. 푸치 이영양증은 내피 세포를 상실하여 간질에서 액체가 비효율적으로 제거될 때 발생하고 각막이 부어 오르거나 시각을 왜곡시킨다; 궁극적으로 상피층이 팽창하기 시작하여 비정상적인 안구 굴곡이 발생하여 시력이 더욱 왜곡된다. 원추 각막(Keratoconus)은 각막이 점진적으로 얇아지는 장애로, 점차 바깥쪽으로 벌어져 비정상적인 만곡을 일으킨다. 본 방법으로 치료할 수 있는 또 다른 질환은, 아밀로이드 침착(deposite) 또는 비정상적인 단백질 섬유가 간질에 축적되어 불투명도 증가를 이끌어 결과적으로 시력 저하를 초래하는 격자 이영양증(lattice dystrophy)이다. 심한 경우에는 각막 이식이 필요한 상피 침식(epithelial erosion)으로 알려진 상태로 바깥쪽 상피층이 침식될 수 있다. 맵-도트-지문 이영양증(map-dot-fingerprint dystrophy)은 코간 이영양증(Cogan 's dystrophy)으로도 알려져 있으며, 이는 전방 각막(anterior cornea)에 영향을 주는 퇴행성 질환으로 감소된 시각 및/또는 재발성 각막 침식을 유발하는 특징적인 틈새등(slit lamp) 결과를 유발한다. 홍채 각막 내피 증후군(Iridocorneal endothelial syndrome)은 여성에서 흔히 발생하며 홍채색의 변화, 각막의 부종 및 녹내장의 발달을 초래한다. 이 증후군은 홍채 모반 증후군 (iris nevus syndrome); 챈들러 증후군 또는 본 홍채 위축증(essential iris atrophy)으로 지칭되는 세 가지 연결된 상태의 그룹으로 정의된다. 그러나 이 질병 그룹의 일반적인 특징은 내피 세포가 각막에서 홍채로 이동한다는 것이다. 상기 각막에서 내피 세포가 소실되면 각막이 부어 오르고 시력이 왜곡됨과 함께 홍채가 뒤틀리게 된다.
다른 실시예에서, 상기 각막 손상과 관련된 눈 상태는 단순 헤르페스 바이러스에 의해 야기된 바이러스 감염; 또는 트라코마 클라미디아(Chlamydia trachomatis)로 인한 세균 감염과 같은 여러 병원체에 의해 유발된다.
추가의 실시예에서, 각막 손상과 관련된 눈 상태는, 산성계 화학 물질(예 : 염화수소산(muriatic acid), 배터리에서 발견되는 황산) 및/또는 알칼리계 화학 물질 (예 : 석회(lime), 오븐 세척제, 암모니아)에 의해 일어나는 화학적 화상과 같은 사고로부터 유발된다. 심한 경우에는 상기 각막이 유일한 교정 수단이 각막 이식인 정도까지 손상된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시예에 따르면, 본 방법에 의해 제조된 무세포 각막은 동물 (즉, 토끼)의 상처입은 눈에 직접 적용되고, 이 때 상기 눈은 손상되어 각막 이식이 필요하다. 이 실시예에서, 무세포 각막은 상피 세포와 함께 씨딩되지 않았다. 이식 후에, 대상 동물 (즉, 토끼)은 상처 입은 눈에서 완전한 회복 (즉, 부상당한 각막의 완전성 회복)을 할 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 이는 한정보다는 예시를 목적으로 한다. 이들은 전형적으로 사용될 수 있는 것들이지만, 당업자에게 알려진 다른 절차, 방법론 또는 기술이 대안적으로 사용될 수 있다.
[ 실시예]
실시예 1 : 무세포 돼지 각막의 제조 및 특성 규명
1.1 무세포 돼지 각막의 제조
-20℃에서 저장한 동결핵화된(frozen nucleated) 돼지 눈을 실온에서 3분 이하 동안 해동시킨 후, 클램프하여 조직 홀더(tissue holder)에 의해 고정시켰다. 상기 각막 및 공막의 일부는 트라핀(trephine)(18mm)을 사용하여 눈에서 제거하였다. 상기 제거된 각막을 1.5M NaCl 또는 물만을 함유하는 용기(7 cm x 5 cm x 4 cm)에 침지하였다(즉, 어떠한 염, 킬레이트제 또는 프로테아제도 첨가하지 않음). 그 다음, 전체 용기를 실온에서 100 rpm의 속도로 24시간 동안 완만하게 진탕시켜 상피층 (약 50 μm)을 제거하였다. 이 단계에서, NaCl 또는 물로 처리된 각막은 팽창되고 불투명해졌다 (즉, non-transparent).
이어서, NaCl 또는 수(water) 처리된 각막을 조직 홀더 상에 놓은 다음 ScCO2 시스템 (Helix SFE Version R3U, Applied Separations Inc (Allentown, PA, USA))의 용기에 삽입하고, 이 용기에는 10mL 에탄올 (75%)이 존재하였다. 이어서, 상기 ScCO2 시스템을 120 bar의 압력, 38℃에서 60분 동안 작동시켜 (즉, 정적 및 동적 ScCO2 처리) 무세포 각막을 제조하였다.
그 다음 무세포 각막을 사용할 때까지 멸균 상태로 저장하였다.
1.2 무세포 돼지 각막의 제조
이 실시예에서, 무세포 돼지 각막은 ScCO2 시스템을 350 bar의 압력, 45℃의 온도에서 80분 동안 작동시킨 것을 제외하고는 실시예 1.1에 기재된 것과 유사한 과정에 따라(즉, 정적 및 동적 ScCO2 처리) 무세포 각막을 제조하였다.
이렇게 수득한 무세포 각막을 사용할 때까지 멸균 상태에서 보관하였다.
1.3 실시예 1.2의 무세포 돼지 각막의 특성 분석
실시예 1.2의 무세포 각막을 표준 프로토콜을 따르는 SDS-페이지 분석뿐만 아니라 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색 (H & E 염색), 4 ', 6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 염색에 의해 분석하였다.
DAPI 염색으로부터의 정량화된 결과는 정상 각막이 상대적으로 높은 수준의 DNA 카운트를 갖는 것으로 나타났으며, DNA의 양은 37.29 ± 5.3(ng/mg)인 것으로 결정된 반면, 실시예 1.2의 무세포 각막에서의 DNA 수준은 단지 11.51 + 0.74(ng/ mg)이었으며, 이는 현재 ScCO2 처리가 각막 조직으로부터 세포성 물질을 제거하는데 효과적임을 시사한다.
또한, SDS PAGE 분석은, ScCO2 처리 후 실시예 1.2의 각막에 잔류하는 단백질이 콜라겐이고 (도 1), 특히, 웨스턴 블랏에 의해 확인된 바와 같이 I 형 콜라겐임을 확인하였다 (도 2b).
도 3은 실시예 1.2의 각막의 배율 40 X (패널 A) 및 100 X (패널 B)에서의 각 H & E 염색 사진이다. 실시예 1.2의 각막은 비교적 손상되지 않은 피브릴 구조를 가졌으며, 따라서 이식 후 세포가 성장할 수 있는 생물학적 스캐폴드로서 제공될 수 있다.
실시예 2 : 실시예 1.2의 무세포 돼지 각막에서의 인간 지방 세포 ( hADCs ) 재성장(Re-growth)
2.1 hADC의 분리
인간 지방 세포 (hADCs)를 환자의 지방 흡입술에서 채취한 지방 조직으로부터 분리하였다. 간략히 말하면, 약 50g 지방 조직을 남은 적혈구를 제거하기 위해 과다 양의 PBS(phosphate-buffered slaine)로 헹구었다. 철저하게 헹구어 낸 지방 조직을 PBS에 현탁시키고 원심 분리하고 상층을 수집하였다. 한 번 원심 분리를 반복하고, 상층부를 수거 한 다음, 수집된 상층을 고르게 여러 부분으로 나누었다. 지방 조직의 각 부분을 콜라게나제(1mg/mL), N-아세틸-시스테인 (NAC) (2mM) 및 L- 아스코르빈산 2-인산염 (0.2 mM)를 함유하는 40㎖의 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)를 함유하는 다른 깨끗한 테스트 튜브에 옮겨 담았다. 상기 테스트 튜브를 밤새 37℃에서 배양한 다음, 원심 분리를 통해 콜라게나제 함유 상층을 제거하였다.
각 튜브의 펠렛을 수확하고 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청(FBS), NAC (2mM) 및 L- 아스코르빈산 2- 인산염 (0.2mM)이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 다음날, 부착되지 않은 세포를 PBS로 헹구어 내고 추가로 5mL의 K-NAC를 첨가하였다. 상기 배양 배지는 컨플루언스에 도달할 때까지 2일 간격으로 교체되었으며, 이는 약 1주일이 걸렸다. 상기 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고 이후의 사용시까지 액체 질소 중 저장 하였다.
2.2 실시예 1.2의 무세포 돼지 각막은 그 위에 hADCS의 성장을 지지함
씨딩하기 전에, 실시예 1.2의 무세포 돼지 각막을 항생제 (페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B)의 혼합물을 함유하는 70% 글리세롤 용액에 3일 동안 침지시키고, 항생제 혼합물을 역시 함유하고 있는 PBS로 완전히 세척하고, 그리고 나서 실시예 2.1의 hADC 약 1x104를 그 위에 씨딩하고, 이어서 상기 각막을 14일 동안 배양하였다. 상기 각막의 작은 샘플을 각각 1, 3, 7 및 14일에 채취하여 H & E 염색 및 SEM 분석을 수행하였다. 하나의 대표적인 결과를 도 4에 도시하였다.
도 4의 주사 전자 현미경(SEM) 사진은 각각 실시예 1.2의 무세포 각막으로부터 hADC를 씨딩하기 전(도 4a) 및 씨딩 7 일 후(도 4b)에 대한 사진이다. 실시예 1.2의 무세포 돼지 각막이 hADCS의 성장을 지지하기 위한 스캐폴드로서 작용할 수 있음을 분명히 확인하였다.
실시예 3 : 각막 이종 이식편 이식 모델( xenograft transplantation model)에서 실시예 1.2의 무세포 돼지 각막의 사용
각막 이종 이식편 이식 모델에서, 실시예 1.2의 무세포 돼지 각막의, 이식을 필요로하는 눈의 상태를 회복시키는 효과를 평가하였다.
이 목적을 위해, 사용된 동물은 뉴질랜드 백색 토끼 (가축 연구소, 농업 협의회, 행정원)이고, 연구에서 동물의 사용에 관한 관련 지침에 따라 엄격하게 유지된다. 한쪽 눈은 무작위로 각막 이식편을 받기 위해 배정된다. 체중이 2.0 ~ 3.0 kg인 토끼는 0.5 - 0.7 mL/kg 설치류 칵테일 (100 mg/mL 케타민, 20 mg/mL 크실라진 및 10 mg/mL 아세프로마진)의 근육 주사로 마취시킨다. 국소 마취약 프로파라카인(proparacaine) 하이드로클로라이드(0.5% Ophthaine, Bristol-Myers Squibb)를 동물의 눈에 사이클로펜톨레이트(cyclopentolate)(1%, Cyclogyl®, Alcon, Ft.Worth, Tex.) 및 페닐에프린(phenylephrine)(10.0% CibaVision, Duluth, Ga.)의 드랍과 함께 주입하여 동공의 최대 확장을 달성한다. 모든 조작은 조작 현미경으로 수행된다. DALK (deep anterior lamellar keratoplasty) 절차를 사용하여 상기 각막 상에 약 5mm의 상처가 생성시켰다. 그 다음, 상기 상처를 실시예 1.2의 무세포 각막 (직경 약 6mm)으로 덮고, 10-0 나일론 봉합사를 사용하여 각막에 봉합하였다.
1% 프리드니솔론(prednisolone)을 함유하는 국소 점안약을 하루 3번 눈에 적용하여 7-10일간 지속했다. 수술 3주 후, 상기 눈은 각막의 완전성을 평가하기 위해 플루오로세인(fluorescein)으로 염색되었다. 상기 눈의 이미지는 1, 5, 11, 14 및 21일에 각각 취해졌다. 실험의 끝에서, 동물을 희생시키고 실시예 1.2의 이식된 각막 상에 새로 성장한 상피 세포에 대해 염색하였다.
토끼가 DALK 수술을 받고, 이어서 실시예 1.2의 무세포 각막을 이식한 결과, 각막의 완전성을 회복할 수 있었고, 이웃 영역(즉, 상처입지 않은 영역)으로부터 새로이 이주한(migrated) 상피 세포가 관찰되었고, 그 위에 이식된 각막 이식편이 자라는 것은 놀랍고 예측하지 못한 발견이었다.
상기 실시예의 설명은 단지 예로서 주어지며 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 실시예의 구조 및 사용에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 실시예가 특정 정도로, 또는 하나 이상의 개별 실시 예를 참조하여 상술되었지만, 당업자는 본 개시 내용의 개념 또는 범위를 벗어나지 않고 개시된 실시예에 대한 많은 변형을 행할 수 있다.

Claims (21)

  1. 동물의 각막에 초임계 이산화탄소(scCO2)의 처리를 실시하는 것을 포함하는 무세포 각막의 제조방법으로,
    제조방법은 프로테아제, 킬레이트제, 세제(detergent), 글리세롤 또는 이들의 조합을 각막에 처리하는 단계를 포함하지 않으며,
    초임계 이산화탄소(scCO2)의 처리는 60% (vol %)의 에탄올의 존재하에 350 bar의 압력 및 45℃의 온도에서 80분 동안 수행되고,
    상기 초임계 이산화탄소(scCO2) 처리 전에, 적어도 24시간 동안 각막을 0.5-4.0M NaCl로 구성된 염 용액의 처리에 적용시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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  7. 제 1항에 있어서, 동물은 돼지, 소, 양, 염소, 토끼, 원숭이 또는 인간으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 동물은 돼지인 방법.
  9. 제 1항의 방법에 의해 제조된 무세포 각막.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 각막은 돼지 각막으로부터 유래된 무세포 각막.
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