CN111686301B - 一种高度透明的脱细胞角膜基质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，包括：一、对摘取的动物眼球进行清洗和病毒灭活处理；二、剪取角膜，然后将剪取的角膜清洗干净；三、将角膜置于低渗溶液中，超声处理后转入摇床中震荡处理；四、对角膜重复处理3～4次；五、高低渗溶液处理，每1～2次高低渗溶液处理后，将角膜置于透明溶液中处理0.5h～3h，最后一次高低渗溶液处理后对角膜进行脱水处理；六、对脱水处理后的角膜进行削切；七、灭菌后保存。本发明的方法能有效的防止角膜基质吸水发胀，避免破坏胶原束及天然三维微观结构，从而保证了前弹力层及基质层胶原结构排列整齐，进而使制备的脱细胞角膜基质具有与新鲜角膜相似的光学性能和强度。

Description

一种高度透明的脱细胞角膜基质及其制备方法
技术领域
本发明属于医疗器械技术领域，具体涉及一种高度透明的脱细胞角膜基质及其制备方法。
背景技术
角膜病是除白内障引起致盲的第二大致盲疾病，由于角膜长期直接与外界环境接触，极容易受外界机械损伤、微生物感染、烧伤等，致使角膜或部分发生病变，轻者引起角膜透明度下降影响患者正常生活，严重者将引起角膜混浊或者溃烂，使患者致盲或摘除眼球。据WTO统计，目前全世界角膜病盲患者约6000万人，中国有400万人，并且每年以10万例持续增加，绝大多数的患者可以通过角膜移植来重新获得视力，但是可接受角膜移植的患者每年仅4000-5000例。制约角膜移植的根本原因就是同种异体供体角膜来源资源极度匮乏，再加上移植后免疫排斥反应较为严重，甚至出现脱落，严重的影响角膜病的治疗和效果。因此，为给角膜病患者带来新希望和良好的治愈效果，研究和开发出能替代人角膜的角膜替代物最有效的途径。
近年来国内外对于人源角膜替代物研究很多，也使得角膜产品产业化得到实现，比如2015年深圳艾尼尔角膜工程有限公司的脱细胞角膜基质“艾欣瞳”和2016年广州优得清生物科技有限公司生产的脱细胞角膜植片，但是角膜基质材料来源和脱细胞处理方有多种方式，但是也存在不少问题。目前脱细胞技术主要集中在物理法、化学法和酶法脱细胞，冻融会使胶原纤维发生聚集断裂，且脱细胞不彻底，高静压会导致水的溶点升高，加压过程形成的冰晶破坏胶原的三维结构。采用酶法容易脱细胞，但是胶原会发生降解，且酶不容易灭活，导致纤维结果紊乱或者三维微结构破坏，透明度降低；采用去污剂脱细胞，不易清除，试剂残留高，材料细胞毒性高，不符合材料相容性要求，植入体内，自身细胞迁移改建效果不佳或者受到抑制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法。该方法能有效的防止角膜基质吸水发胀，避免破坏胶原束及天然三维微观结构，从而保证了前弹力层及基质层胶原结构排列整齐，进而使制备的脱细胞角膜基质具有与新鲜角膜相似的光学性能、曲率和强度，移植后角膜依然保持高度的透明，直至自身细胞迁移，完全融合。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、对摘取的动物眼球进行清洗和病毒灭活处理；
步骤二、从步骤一中经清洗和病毒灭活处理后的动物眼球上剪取角膜，然后将剪取的角膜清洗干净；
步骤三、将步骤二中清洗干净的角膜置于低渗溶液中，超声处理30s～300s后转入摇床中震荡处理0.5h～2h；
步骤四、按照步骤三的方法对角膜重复处理3～4次；
步骤五、对步骤四中重复处理后的角膜进行5～6次高低渗溶液处理，每1～2次高低渗溶液处理后，将角膜置于透明溶液中处理0.5h～3h，最后一次高低渗溶液处理后对角膜进行脱水处理；高低渗溶液处理一次的具体过程为：将角膜置于高渗溶液中，于摇床中震荡处理2h～8h，震荡处理过程中每1h～2h超声1min～5min，然后将角膜置于低渗溶液中，于摇床中震荡处理2h～8h，震荡处理过程中每1h～2h超声1min～5min；所述高渗溶液为含添加剂的氯化钠溶液，高渗溶液中氯化钠的浓度为1.0mol/L～5.0mol/L，添加剂的质量浓度为0.01mg/mL～5mg/mL，所述添加剂为EDTA二钠和/或透明质酸钠，所述低渗溶液为注射用水、pH值为5.5～7.4的磷酸盐缓冲溶液或质量浓度为0.9%～3%的氯化钠溶液，所述透明溶液为甘油、乙醇、丙酮、丁二醇、叔丁醇、甘露醇溶液和蔗糖溶液中的一种或几种；
步骤六、对步骤五中脱水处理后的角膜进行削切；
步骤七、将步骤六中削切后的角膜灭菌后保存。
上述的一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，步骤一中所述清洗和消毒处理的具体过程为：将摘取的动物眼球用生理盐水或pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，然后置于次氯酸钠溶液中进行病毒灭活处理，最后用生理盐水或pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液清洗去除次氯酸钠。
上述的一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，所述次氯酸钠溶液的质量浓度为0.02%～2%，次氯酸钠溶液的溶剂为生理盐水或低渗盐缓冲液，所述低渗盐缓冲液为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液，病毒灭活处理的时间为20min～60min。
上述的一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，步骤二中剪取的角膜带有3mm～4mm宽的巩膜。
上述的一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，步骤三中所述低渗溶液为生理盐水或低渗盐缓冲液，所述低渗盐缓冲液为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液，所述超声处理的频率为30Hz～150Hz，震荡处理的摇床转速为60rpm～180rpm，震荡处理过程中每隔0.5h～1h换液一次，低渗溶液的温度为4℃～37℃。
上述的一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，步骤五中所述透明溶液中溶质的质量浓度为20%～90%，透明溶液的溶剂为生理盐水或低渗盐缓冲液，所述低渗盐缓冲液为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液。
上述的一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，步骤五中所述脱水处理的方法为：配置浓度梯度的液态脱水剂，然后将角膜按照从低浓度到高浓度的顺序依次放入液态脱水剂中脱水，每个浓度梯度脱水3min～30min，所述液态脱水剂为甘油、乙醇和丁二醇中的一种或几种，液态脱水剂的溶剂为生理盐水或低渗盐缓冲液，所述低渗盐缓冲液为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；脱水总时间为20min～240min。
上述的一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，步骤五中所述脱水处理的方法为：将角膜用干燥的固态脱水剂脱水2h～18h。
上述的一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，脱水过程中每1h～4h更换一次脱水剂。
上述的一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，步骤六中削切后的角膜厚度为0.15mm～0.55mm。
上述的一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，步骤七中所述灭菌采用钴-60γ射线辐照灭菌、环氧乙烷灭菌、化学试剂灭菌或电子束灭菌。
上述的一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，步骤七中所述保存采用无菌条件下灌入无菌保存液保存，无菌保存液为甘油、丁二醇、丙二醇和甘露醇中的一种或几种，无菌保存液中溶质的质量浓度为70%～100%。
另外，本发明还提供了一种利用上述方法制备得到的脱细胞角膜基质。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用全眼球病毒灭活，最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，同时保持了角膜的生理形态，使角膜胶原纤维束的排列与新鲜角膜最为接近，最大程度的保证了角膜植入后的透明度；病毒灭活溶液采用生理盐水或低渗盐缓冲液作为溶剂配置，使角膜内外渗透压一致，避免了灭活过程角膜发胀，拉伸胶原纤维，破坏三维结构；病毒灭活采用次氯酸钠溶液，可破坏和溶解部分角膜上皮层，而对前弹力层以内结构不影响。
2、本发明首先对动物眼球进行清洗和病毒灭活处理，最大程度的降低了病毒风险，保证了生产加工人员的安全。
3、本发明采用高低渗溶液联合超声进行脱细胞，采用的高渗溶液和低渗溶液能够避免使用去垢剂或者酶进行脱细胞所造成的试剂残留或酶灭活不彻底所导致的潜在风险，同时能彻底脱细胞，去除抗原，减小免疫反应。
4、本发明的方法能有效的防止角膜基质吸水发胀，避免破坏胶原束及天然三维微观结构，从而保证了前弹力层及基质层胶原结构排列整齐，使制备的脱细胞角膜基质具有与新鲜角膜相似的光学性能和强度。
5、本发明高低渗溶液处理过程中采用透明溶液处理，不破坏角膜胶原三维结构，能使角膜的透明度与新鲜角膜透明度相当，移植后角膜依然保持高度的透明，直至自身细胞迁移，完全融合。
6、本发明的方法简单可靠，原料来源广泛，成本低，使用方便，易于工业化推广应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的脱细胞角膜基质的外观图。
图2为本发明实施例7制备的脱细胞角膜基质的外观图。
图3为本发明实施例9制备的脱细胞角膜基质的外观图。
图4为发明专利CN 104001217A和本发明实施例1制备的脱细胞角膜基质的外观对比图，其中图左为发明专利CN 104001217A制备的角膜，图右为本发明实施例1制备的角膜。
具体实施方式
实施例1
本实施例的脱细胞角膜基质的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将摘取的动物眼球用生理盐水冲洗干净，然后置于次氯酸钠溶液中进行病毒灭活处理，最后用生理盐水清洗去除次氯酸钠；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为0.1%，次氯酸钠溶液的溶剂为生理盐水，病毒灭活处理的时间为30min；
步骤二、从步骤一中经清洗和病毒灭活处理后的动物眼球上剪取角膜，剪取的角膜带有3mm宽的巩膜，然后将剪取的角膜用生理盐水清洗干净；
步骤三、将步骤二中清洗干净的角膜置于低渗溶液中，超声处理60s后转入摇床中震荡处理0.5h；所述低渗溶液为生理盐水，超声处理的频率为50Hz，震荡处理的摇床转速为100rpm，震荡处理过程中每隔0.5h换液一次，低渗溶液的温度为10℃；
步骤四、按照步骤三的方法对角膜重复处理4次；
步骤五、对步骤四中重复处理后的角膜进行5次高低渗溶液处理，每1次高低渗溶液处理后，将角膜置于透明溶液中处理1h，最后一次高低渗溶液处理后对角膜进行脱水处理；高低渗溶液处理一次的具体过程为：将角膜置于高渗溶液中，于摇床中震荡处理6h，震荡处理过程中每2h超声1min，然后将角膜置于低渗溶液中，于摇床中震荡处理6h，震荡处理过程中每2h超声1min；所述高渗溶液为含EDTA二钠和透明质酸钠的氯化钠溶液，高渗溶液中氯化钠的浓度为2.0mol/L，EDTA二钠的浓度为2mg/mL，透明质酸钠的浓度为0.003mg/mL，所述低渗溶液为质量浓度为1.5%的氯化钠溶液，所述透明溶液为以生理盐水为溶剂配置的质量浓度为70%的甘油溶液；所述脱水处理的方法为：以生理盐水为溶剂配置质量浓度依次为30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%的甘油溶液，然后将角膜按照从低浓度到高浓度的顺序依次放入甘油溶液中脱水，每个浓度梯度脱水3min，脱水总时间为21min；
步骤六、对步骤五中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜只包含前弹力层和部分基质层，厚度为0.4mm；
步骤七、将步骤六中削切后的角膜灭菌平铺到西林瓶中，基质层贴壁，采用钴-60γ射线进行辐照灭菌，辐照剂量为7kGy，然后将灭菌后的装有角膜的西林瓶在无菌条件下开盖灌装纯甘油，封盖保存。
从图1和图4可以看出，本实施例制备的角膜高度透明，透明度明显优于发明专利CN 104001217A制备的角膜。
实施例2
本实施例与实施例1相同，其中不同之处在于：步骤一中所述次氯酸钠溶液的溶剂为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤三中所述低渗溶液为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤五中所述透明溶液的溶剂为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液，所述液态脱水剂为乙醇或丁二醇，或者为甘油、乙醇和丁二醇中的两种或三种，液态脱水剂的溶剂为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤七中所述无菌保存液为丁二醇、丙二醇或甘露醇，或者为甘油、丁二醇、丙二醇和甘露醇中的至少两种。
实施例3
本实施例的脱细胞角膜基质的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将摘取的动物眼球用pH值为6的磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，然后置于次氯酸钠溶液中进行病毒灭活处理，最后用pH值为6的磷酸盐缓冲溶液清洗去除次氯酸钠；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为0.02%，次氯酸钠溶液的溶剂为pH值为6的磷酸盐缓冲溶液，病毒灭活处理的时间为60min；
步骤二、从步骤一中经清洗和病毒灭活处理后的动物眼球上剪取角膜，剪取的角膜带有4mm宽的巩膜，然后将剪取的角膜清洗干净；
步骤三、将步骤二中清洗干净的角膜置于低渗溶液中，超声处理30s后转入摇床中震荡处理2h；所述低渗溶液为pH值为6的磷酸盐缓冲溶液，超声处理的频率为150Hz，震荡处理的摇床转速为60rpm，震荡处理过程中每隔1h换液一次，低渗溶液的温度为4℃；
步骤四、按照步骤三的方法对角膜重复处理4次；
步骤五、对步骤四中重复处理后的角膜进行6次高低渗溶液处理，每2次高低渗溶液处理后，将角膜置于透明溶液中处理0.5h，最后一次高低渗溶液处理后对角膜进行脱水处理；高低渗溶液处理一次的具体过程为：将角膜置于高渗溶液中，于摇床中震荡处理2h，震荡处理过程中每2h超声5min，然后将角膜置于低渗溶液中，于摇床中震荡处理2h，震荡处理过程中每2h超声5min；所述高渗溶液为含EDTA二钠的氯化钠溶液，高渗溶液中氯化钠的浓度为5.0mol/L，EDTA二钠的浓度为0.01mg/mL，所述低渗溶液为注射用水，所述透明溶液为以pH值为6的磷酸盐缓冲溶液为溶剂配置的质量浓度为90%的丁二醇溶液；所述脱水处理的方法为：以pH值为6的磷酸盐缓冲溶液为溶剂配置溶质的质量浓度依次为60%、70%、80%、90%和100%的丁二醇和甘油等比例的混合溶液，然后将角膜按照从低浓度到高浓度的顺序依次放入混合溶液中脱水，每个浓度梯度脱水30min，脱水总时间为150min；
步骤六、对步骤五中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜只包含前弹力层和部分基质层，厚度为0.55mm；
步骤七、将步骤六中削切后的角膜平铺到西林瓶中，基质层贴壁，采用环氧乙烷灭菌2h，然后将灭菌后的装有角膜的西林瓶在无菌条件下开盖灌装纯丁二醇，封盖保存。
实施例4
本实施例与实施例3相同，其中不同之处在于：步骤一中所述次氯酸钠溶液的溶剂为生理盐水或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤三中所述低渗溶液为生理盐水或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤五中所述透明溶液的溶剂为生理盐水或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液，所述液态脱水剂为甘油、乙醇和丁二醇中的一种或三种，或者为甘油和乙醇，或者为乙醇和丁二醇，液态脱水剂的溶剂为生理盐水或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤七中所述无菌保存液为甘油、丙二醇或甘露醇，或者为甘油、丁二醇、丙二醇和甘露醇中的至少两种。
实施例5
本实施例的脱细胞角膜基质的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将摘取的动物眼球用pH值为8的磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，然后置于次氯酸钠溶液中进行病毒灭活处理，最后用pH值为8的磷酸盐缓冲溶液清洗去除次氯酸钠；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为2%，次氯酸钠溶液的溶剂为pH值为6的Tris缓冲盐溶液，病毒灭活处理的时间为20min；
步骤二、从步骤一中经清洗和病毒灭活处理后的动物眼球上剪取角膜，剪取的角膜带有3mm宽的巩膜，然后将剪取的角膜清洗干净；
步骤三、将步骤二中清洗干净的角膜置于低渗溶液中，超声处理200s后转入摇床中震荡处理1h；所述低渗溶液为pH值为6的Tris缓冲盐溶液，超声处理的频率为30Hz，震荡处理的摇床转速为180rpm，震荡处理过程中每隔0.5h换液一次，低渗溶液的温度为37℃；
步骤四、按照步骤三的方法对角膜重复处理3次；
步骤五、对步骤四中重复处理后的角膜进行5次高低渗溶液处理，每2次高低渗溶液处理后，将角膜置于透明溶液中处理3h，最后一次高低渗溶液处理后对角膜进行脱水处理；高低渗溶液处理一次的具体过程为：将角膜置于高渗溶液中，于摇床中震荡处理8h，震荡处理过程中每1h超声1min，然后将角膜置于低渗溶液中，于摇床中震荡处理5h，震荡处理过程中每1h超声1min；所述高渗溶液为含EDTA二钠和透明质酸钠的氯化钠溶液，高渗溶液中氯化钠的浓度为1.0mol/L，EDTA二钠的浓度为2mg/mL，透明质酸钠的浓度为1mg/mL，所述低渗溶液为pH值为5.5的磷酸盐缓冲溶液，所述透明溶液为以pH值为6的Tris缓冲盐溶液为溶剂配置的溶质质量浓度为80%的丁二醇和甘露醇的混合溶液，其中丁二醇和甘露醇的体积比为1：1；所述脱水处理的方法为：将角膜包埋于干燥的固态脱水剂（如氯化钠、氯化钙或蔗糖等）脱水6h，脱水过程中每2h更换一次脱水剂；
步骤六、对步骤五中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜只包含前弹力层和部分基质层，厚度为0.15mm；
步骤七、将步骤六中削切后的角膜平铺到西林瓶中，基质层贴壁，采用钴-60γ射线进行辐照灭菌，辐照剂量为5kGy，然后将灭菌后的装有角膜的西林瓶在无菌条件下开盖灌装质量浓度为70%的甘露醇，封盖保存。
实施例6
本实施例与实施例5相同，其中不同之处在于：步骤一中所述次氯酸钠溶液的溶剂为生理盐水或pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液；步骤三中所述低渗溶液为生理盐水或pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液；步骤五中所述透明溶液的溶剂为生理盐水或pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液；步骤七中所述无菌保存液为甘油、丁二醇或丙二醇，或者为甘油、丁二醇、丙二醇和甘露醇中的至少两种。
实施例7
本实施例的脱细胞角膜基质的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将摘取的动物眼球用pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，然后置于次氯酸钠溶液中进行病毒灭活处理，最后用pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液清洗去除次氯酸钠；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为0.1%，次氯酸钠溶液的溶剂为pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液，病毒灭活处理的时间为40min；
步骤二、从步骤一中经清洗和病毒灭活处理后的动物眼球上剪取角膜，剪取的角膜带有4mm宽的巩膜，然后将剪取的角膜清洗干净；
步骤三、将步骤二中清洗干净的角膜置于低渗溶液中，超声处理300s后转入摇床中震荡处理2h；所述低渗溶液为pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液，超声处理的频率为50Hz，震荡处理的摇床转速为120rpm，震荡处理过程中每隔0.8h换液一次，低渗溶液的温度为25℃；
步骤四、按照步骤三的方法对角膜重复处理3次；
步骤五、对步骤四中重复处理后的角膜进行5次高低渗溶液处理，每1次高低渗溶液处理后，将角膜置于透明溶液中处理0.5h，最后一次高低渗溶液处理后对角膜进行脱水处理；高低渗溶液处理一次的具体过程为：将角膜置于高渗溶液中，于摇床中震荡处理2h，震荡处理过程中每1h超声3min，然后将角膜置于低渗溶液中，于摇床中震荡处理8h，震荡处理过程中每2h超声2min；所述高渗溶液为含透明质酸钠的氯化钠溶液，高渗溶液中氯化钠的浓度为5.0mol/L，透明质酸钠的浓度为0.01mg/mL，所述低渗溶液为pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液，所述透明溶液为以pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液为溶剂配置的溶质质量浓度为20%的蔗糖溶液；所述脱水处理的方法为：将角膜包埋于干燥的固态脱水剂（如氯化钠、氯化钙或蔗糖等）脱水2h，脱水过程中每1h更换一次脱水剂；
步骤六、对步骤五中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜只包含前弹力层和部分基质层，厚度为0.55mm；
步骤七、将步骤六中削切后的角膜平铺到西林瓶中，基质层贴壁，采用钴-60γ射线进行辐照灭菌，辐照剂量为20kGy，然后将灭菌后的装有角膜的西林瓶在无菌条件下开盖灌装质量浓度为100%的丙二醇，封盖保存。
从图2可以看出，本实施例制备的角膜高度透明，透明度与新鲜角膜透明度相当。
实施例8
本实施例与实施例7相同，其中不同之处在于：步骤一中所述次氯酸钠溶液的溶剂为生理盐水或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤三中所述低渗溶液为生理盐水或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤五中所述透明溶液的溶剂为生理盐水或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤七中所述无菌保存液为甘油、丁二醇或甘露醇，或者为甘油、丁二醇、丙二醇和甘露醇中的至少两种。
实施例9
本实施例的脱细胞角膜基质的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将摘取的动物眼球用生理盐水冲洗干净，然后置于次氯酸钠溶液中进行病毒灭活处理，最后用生理盐水清洗去除次氯酸钠；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为0.15%，次氯酸钠溶液的溶剂为生理盐水或低渗盐缓冲液，所述低渗盐缓冲液为pH值为8的Tris缓冲盐溶液，病毒灭活处理的时间为30min；
步骤二、从步骤一中经清洗和病毒灭活处理后的动物眼球上剪取角膜，剪取的角膜带有3mm宽的巩膜，然后将剪取的角膜清洗干净；
步骤三、将步骤二中清洗干净的角膜置于低渗溶液中，超声处理100s后转入摇床中震荡处理1.5h；所述低渗溶液为pH值为8的Tris缓冲盐溶液，超声处理的频率为100Hz，震荡处理的摇床转速为150rpm，震荡处理过程中每隔0.5h换液一次，低渗溶液的温度为20℃；
步骤四、按照步骤三的方法对角膜重复处理4次；
步骤五、对步骤四中重复处理后的角膜进行5次高低渗溶液处理，每1次高低渗溶液处理后，将角膜置于透明溶液中处理2h，最后一次高低渗溶液处理后对角膜进行脱水处理；高低渗溶液处理一次的具体过程为：将角膜置于高渗溶液中，于摇床中震荡处理5h，震荡处理过程中每1.5h超声2min，然后将角膜置于低渗溶液中，于摇床中震荡处理5h，震荡处理过程中每1.5h超声3min；所述高渗溶液为含EDTA二钠的氯化钠溶液，高渗溶液中氯化钠的浓度为3.0mol/L，EDTA二钠的浓度为5mg/mL，所述低渗溶液为质量浓度为0.9%的氯化钠溶液，所述透明溶液为以pH值为8的Tris缓冲盐溶液为溶剂配置的溶质质量浓度为50%的甘油、丙酮、叔丁醇和甘露醇的混合溶液，其中甘油、丙酮、叔丁醇和甘露醇的体积比为3：1：1：1；所述脱水处理的方法为：以pH值为8的Tris缓冲盐溶液为溶剂配置质量浓度依次为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的甘油、乙醇和丁二醇的混合溶液，其中甘油、乙醇和丁二醇的体积比为3：1：1，然后将角膜按照从低浓度到高浓度的顺序依次放入混合溶液中脱水，每个浓度梯度脱水30min，脱水总时间为240min；
步骤六、对步骤五中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜厚度为0.3mm；
步骤七、将步骤六中削切后的角膜平铺到西林瓶中，基质层贴壁，采用环氧乙烷灭菌1h，然后将灭菌后的装有角膜的西林瓶在无菌条件下开盖灌装纯甘露醇，封盖保存。
从图3可以看出，本实施例制备的角膜高度透明，透明度与新鲜角膜透明度相当。
实施例10
本实施例与实施例9相同，其中不同之处在于：步骤一中所述次氯酸钠溶液的溶剂为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤三中所述低渗溶液为生理盐水或pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液；步骤五中所述透明溶液的溶剂为生理盐水或pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液；所述液态脱水剂为甘油、乙醇和丁二醇中的一种或两种，液态脱水剂的溶剂为生理盐水或pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液；步骤七中所述无菌保存液为甘油、丁二醇或丙二醇，或者为甘油、丁二醇、丙二醇和甘露醇中的至少两种。
实施例11
本实施例的脱细胞角膜基质的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将摘取的动物眼球用生理盐水冲洗干净，然后置于次氯酸钠溶液中进行病毒灭活处理，最后用生理盐水清洗去除次氯酸钠；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为1%，次氯酸钠溶液的溶剂为pH值为8的磷酸盐缓冲溶液，病毒灭活处理的时间为50min；
步骤二、从步骤一中经清洗和病毒灭活处理后的动物眼球上剪取角膜，剪取的角膜带有3mm宽的巩膜，然后将剪取的角膜清洗干净；
步骤三、将步骤二中清洗干净的角膜置于低渗溶液中，超声处理150s后转入摇床中震荡处理1h；所述低渗溶液为pH值为8的磷酸盐缓冲溶液，超声处理的频率为120Hz，震荡处理的摇床转速为100rpm，震荡处理过程中每隔0.5h换液一次，低渗溶液的温度为30℃；
步骤四、按照步骤三的方法对角膜重复处理4次；
步骤五、对步骤四中重复处理后的角膜进行6次高低渗溶液处理，每2次高低渗溶液处理后，将角膜置于透明溶液中处理2.5h，最后一次高低渗溶液处理后对角膜进行脱水处理；高低渗溶液处理一次的具体过程为：将角膜置于高渗溶液中，于摇床中震荡处理4h，震荡处理过程中每1h超声4min，然后将角膜置于低渗溶液中，于摇床中震荡处理3h，震荡处理过程中每1h超声2min；所述高渗溶液为含EDTA二钠和透明质酸钠的氯化钠溶液，高渗溶液中氯化钠的浓度为2.0mol/L，EDTA二钠的浓度为0.01mg/mL，透明质酸钠的浓度为0.01mg/mL，所述低渗溶液为pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液，所述透明溶液为以生理盐水为溶剂配置的溶质质量浓度为60%的乙醇、丙酮和叔丁醇的混合溶液，其中乙醇、丙酮和叔丁醇的体积比为2：1：1；所述脱水处理的方法为：以生理盐水为溶剂配置质量浓度依次为70%、80%、90%和100%的甘油和丁二醇的混合溶液，其中甘油和丁二醇的体积比为3：1，然后将角膜按照从低浓度到高浓度的顺序依次放入混合溶液中脱水，每个浓度梯度脱水5min，脱水总时间为20min；
步骤六、对步骤五中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜厚度为0.15mm～0.55mm；
步骤七、将步骤六中削切后的角膜平铺到西林瓶中，基质层贴壁，采用电子束灭菌，灭菌剂量为3kGy～15kGy，然后将灭菌后的装有角膜的西林瓶在无菌条件下开盖灌装溶质的质量浓度为70%的丁二醇、丙二醇和甘露醇的混合溶液封盖保存，其中丁二醇、丙二醇和甘露醇的体积比为1：2：2。
实施例12
本实施例与实施例11相同，其中不同之处在于：步骤一中所述次氯酸钠溶液的溶剂为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤三中所述低渗溶液为生理盐水或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤五中所述透明溶液的溶剂为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；所述液态脱水剂为甘油、乙醇和丁二醇中的一种或三种，或者为乙醇和丁二醇，或者为甘油和乙醇，液态脱水剂的溶剂为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤七中所述无菌保存液为甘油、丁二醇、丙二醇和甘露醇中的一种、两种或四种，或者为甘油、丁二醇和丙二醇，或者为甘油、丁二醇和甘露醇，或者为甘油、丙二醇和甘露醇。
实施例13
本实施例的脱细胞角膜基质的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将摘取的动物眼球用生理盐水冲洗干净，然后置于次氯酸钠溶液中进行病毒灭活处理，最后用生理盐水清洗去除次氯酸钠；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为1%，次氯酸钠溶液的溶剂为pH值为8的磷酸盐缓冲溶液，病毒灭活处理的时间为50min；
步骤二、从步骤一中经清洗和病毒灭活处理后的动物眼球上剪取角膜，剪取的角膜带有3mm宽的巩膜，然后将剪取的角膜清洗干净；
步骤三、将步骤二中清洗干净的角膜置于低渗溶液中，超声处理150s后转入摇床中震荡处理1h；所述低渗溶液为pH值为8的磷酸盐缓冲溶液，超声处理的频率为120Hz，震荡处理的摇床转速为100rpm，震荡处理过程中每隔0.5h换液一次，低渗溶液的温度为30℃；
步骤四、按照步骤三的方法对角膜重复处理4次；
步骤五、对步骤四中重复处理后的角膜进行6次高低渗溶液处理，每2次高低渗溶液处理后，将角膜置于透明溶液中处理2.5h，最后一次高低渗溶液处理后对角膜进行脱水处理；高低渗溶液处理一次的具体过程为：将角膜置于高渗溶液中，于摇床中震荡处理4h，震荡处理过程中每1h超声4min，然后将角膜置于低渗溶液中，于摇床中震荡处理3h，震荡处理过程中每1h超声2min；所述高渗溶液为含EDTA二钠和透明质酸钠的氯化钠溶液，高渗溶液中氯化钠的浓度为2.0mol/L，EDTA二钠的浓度为0.01mg/mL，透明质酸钠的浓度为0.01mg/mL，所述低渗溶液为质量浓度为3%的氯化钠溶液，所述透明溶液为以生理盐水为溶剂配置的溶质质量浓度为60%的乙醇、丙酮和叔丁醇的混合溶液，其中乙醇、丙酮和叔丁醇的体积比为2：1：1；所述脱水处理的方法为：将角膜包埋于干燥的固态脱水剂（如氯化钠、氯化钙或蔗糖等）脱水18h，脱水过程中每4h更换一次脱水剂；
步骤六、对步骤五中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜厚度为0.3mm；
步骤七、将步骤六中削切后的角膜平铺到西林瓶中，基质层贴壁，采用化学试剂灭菌，试剂可采用质量浓度为0.05%～0.5%的次氯酸钠溶液，然后将灭菌后的装有角膜的西林瓶在无菌条件下灌装溶质的质量浓度为90%的甘油和丁二醇的混合溶液封盖保存，其中甘油和丁二醇的体积比为1：2。
实施例14
本实施例与实施例13相同，其中不同之处在于：步骤一中所述次氯酸钠溶液的溶剂为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤三中所述低渗溶液为生理盐水或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤五中所述透明溶液的溶剂为pH值为6～8的磷酸盐缓冲溶液或pH值为6～8的Tris缓冲盐溶液；步骤七中所述无菌保存液为甘油、丁二醇、丙二醇和甘露醇中的一种、三种或四种，或者为丁二醇、丙二醇和甘露醇中的两种，或者为甘油和丙二醇，或者为甘油和甘露醇。
对新鲜角膜、本发明实施例1、实施例3、实施例5、实施例7、实施例9、实施例11和实施例13制备的脱细胞角膜基质的吸光度进行检测，并按照公开号为CN 104001217A的专利公开的方法制备脱细胞角膜基质，进行对比。吸光度检测实验方法具体为：将削切后的角膜黏贴至玻璃比色皿透光面，底部1/3～1/2处，放入紫外分光光度计分别测定400nm、500nm、600nm、700nm、800nm下吸光值，以洁净比色皿做对照。结果对比如下：
表1 吸光度测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
从上表中可以看出，采用本发明的方法制备的脱细胞角膜基质透明度高。
表2 本发明脱细胞前后的角膜缝线撕裂力对比
Figure 249829DEST_PATH_IMAGE002
从表2中可以看出，本发明脱细胞前后的角膜缝线撕裂力差别不大，说明本发明制备的脱细胞角膜基质具有与新鲜角膜相似的强度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (2)

1.一种高度透明的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将摘取的动物眼球用生理盐水冲洗干净，然后置于次氯酸钠溶液中进行病毒灭活处理，最后用生理盐水清洗去除次氯酸钠；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为0.1％，次氯酸钠溶液的溶剂为生理盐水，病毒灭活处理的时间为30min；
步骤二、从步骤一中经清洗和病毒灭活处理后的动物眼球上剪取角膜，剪取的角膜带有3mm宽的巩膜，然后将剪取的角膜用生理盐水清洗干净；
步骤三、将步骤二中清洗干净的角膜置于低渗溶液中，超声处理60s后转入摇床中震荡处理0.5h；所述低渗溶液为生理盐水，超声处理的频率为50Hz，震荡处理的摇床转速为100rpm，震荡处理过程中每隔0.5h换液一次，低渗溶液的温度为10℃；
步骤四、按照步骤三的方法对角膜重复处理4次；
步骤五、对步骤四中重复处理后的角膜进行5次高低渗溶液处理，每1次高低渗溶液处理后，将角膜置于透明溶液中处理1h，最后一次高低渗溶液处理后对角膜进行脱水处理；高低渗溶液处理一次的具体过程为：将角膜置于高渗溶液中，于摇床中震荡处理6h，震荡处理过程中每2h超声1min，然后将角膜置于低渗溶液中，于摇床中震荡处理6h，震荡处理过程中每2h超声1min；所述高渗溶液为含EDTA二钠和透明质酸钠的氯化钠溶液，高渗溶液中氯化钠的浓度为2.0mol/L，EDTA二钠的浓度为2mg/mL，透明质酸钠的浓度为0.003mg/mL，所述低渗溶液为质量浓度为1.5％的氯化钠溶液，所述透明溶液为以生理盐水为溶剂配置的质量浓度为70％的甘油溶液；所述脱水处理的方法为：以生理盐水为溶剂配置质量浓度依次为30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％的甘油溶液，然后将角膜按照从低浓度到高浓度的顺序依次放入甘油溶液中脱水，每个浓度梯度脱水3min，脱水总时间为21min；
步骤六、对步骤五中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜只包含前弹力层和部分基质层，厚度为0.4mm；
步骤七、将步骤六中削切后的角膜灭菌平铺到西林瓶中，基质层贴壁，采用钴-60γ射线进行辐照灭菌，辐照剂量为7kGy，然后将灭菌后的装有角膜的西林瓶在无菌条件下开盖灌装纯甘油，封盖保存。
2.一种利用如权利要求1所述方法制备得到的脱细胞角膜基质。
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