CN114904055B - 一种生物型巩膜修复材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物型巩膜修复材料及其制备方法，包括如下步骤：(1)以动物结缔组织为原材料，切取所述动物结缔组织上的动物组织，获得厚度均一的片状组织；(2)将所述片状组织经过两性溶剂处理、表面活性剂处理、碱处理、酸处理、盐溶液处理、缓冲溶液处理中的任意一种或多种处理后，再依次经过两性溶剂处理以脱水、易挥发试剂处理以稳定组织微观结构，然后干燥获得中间品；(3)对中间品依次进行分切、包装、灭菌后获得生物型巩膜修复材料。本发明的生物型巩膜修复材料的来源广泛、制造成本相对较低，且生物相容性好、能够完全降解。

Description

一种生物型巩膜修复材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗生物材料技术领域，具体涉及一种生物型巩膜修复材料及其制备方法。
背景技术
巩膜是眼球壁的主要组成之一，是眼球纤维膜的后5/6部分。前方联接角膜，后方与视神经的鞘膜延续。巩膜在视神经穿出部附近最厚，愈前愈薄，在肌腱附着处又复增厚(巩膜厚度：后极部1mm，赤道部0.4～0.5mm，直肌附着处0.3mm)。其与角膜交界处外面有环形的角膜沟，深部有巩膜静脉窦。巩膜内附有脉络膜、视网膜，是为眼球提供强度的主要生理结构。
巩膜主要是由胶原纤维组成，与睑板结构近似。不仅可用于眼睑缺损的修复代替睑板作支架组织，而且也可用于巩膜缺损的修补，做成巩膜条后可用于视网膜脱离的环扎术及巩膜缩短术。眼部手术常常需要多种修复材料，保存同种异体巩膜是最常应用的材料之一，如巩膜缺损修补、视网膜复位术、高度近视眼后巩膜加固术及难治性青光眼的硅管植入术等。目前较多用于眼部整形手术。
保存同种异体巩膜作为眶内植入物的包裹材料得到广泛的应用，其作用机理是移植后能够引导自体组织修复。同种异体巩膜的来源与保存的过程如下，①巩膜的来源：一般医院主要是从角膜移植取下角膜后的巩膜，除去球内容物后，修建去结膜及巩膜上的组织和视神经；或者是从临床上摘除的眼球、无移植禁忌症者(如恶性肿瘤、传染性疾病、眼球的急慢性炎症等)，摘除眼球后，剪去角膜及巩膜上的组织和视神经，清除球内容物，切忌不可留任何色素膜组织。②巩膜的保存：将得到的巩膜组织首先放入95％酒精中脱水48h，然后取出再放入75％酒精中，长期保存即可；或者像干燥保存角膜那样，用污水氯化钙干燥，脱水48h后，置入含硅胶干燥剂的保存瓶内于4℃冰箱条件下长期保存备用。由此可见同种异体巩膜的供体来源有限，不能满足临床手术量的需求，且费用相对较高，还存在潜在的传染病风险且无法做到系统控制，也无法实现标准化生产，移植后可能存在一定程度的排异反应。另外，硅海绵类材料也常用于巩膜修复、眼球赤道部环扎、局部垫塞等，实现脉络膜、视网膜重新贴合附着。然而还存在生物相容性不够理想，有粘连、瘢痕、钙化的风险，且不可降解，长期留有异物感，并妨碍眼球的正常活动。
发明内容
为了解决同种异体巩膜供体来源有限、不能满足临床手术量的需求，且费用相对较高还存在风险的技术问题以及硅海绵类材料不可降解、生物相容性差的技术问题，而提供一种生物型巩膜修复材料及其制备方法。本发明方法的生物型巩膜修复材料的来源广泛、制造成本相对较低，且生物相容性好、能够完全降解。
为了达到以上目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种生物型巩膜修复材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)以动物结缔组织为原材料，切取所述动物结缔组织上的动物组织，获得厚度均一的片状组织；
(2)将所述片状组织经过两性溶剂处理、表面活性剂处理、碱处理、酸处理、盐溶液处理、缓冲溶液处理中的任意一种或多种处理后，再依次经过两性溶剂处理以脱水、易挥发试剂处理以稳定组织微观结构，然后干燥获得中间品；
(3)对中间品依次进行分切、包装、灭菌后获得生物型巩膜修复材料。
进一步地，步骤(2)中所述经过两性溶剂处理、表面活性剂处理、碱处理、酸处理、盐溶液处理、缓冲溶液处理中的任意多种处理的过程是：①先将所述片状组织可选择性进行两性溶剂处理，②然后进行表面活性剂处理，③再多次进行酸处理或碱处理，④然后可选择性再进行一次表面活性剂处理，⑤然后进行酸处理、碱处理、缓冲溶液处理中的一种或多种，⑥重复步骤③～⑤，⑦进行盐溶液处理，⑧进行缓冲溶液处理。根据实际情况可缺省步骤、调整步骤顺序或重复步骤穿插。
进一步地，所述两性溶剂处理的过程是：使用两性溶剂或混以0.05～1倍体积的水于0℃～40℃下进行多次两性溶剂的梯度处理，单次处理时间为1h～60h，用于梯度脱除片状组织中的水分；
所述易挥发试剂处理的过程是：在所述两性溶剂处理过后，混以相对于所述两性溶剂1～9倍体积的易挥发试剂用于梯度置换两性溶剂为易挥发试剂，于0℃～35℃下进行多次易挥发试剂的振荡处理，单次处理时间为1h～72h，起到脱水干燥后稳定片状组织微观结构的作用，通过易挥发试剂在快速挥发的这一过程中保持组织微观结构。
再进一步地，所述两性溶剂为甲醇、乙醇、乙二醇、甘油、异丙醇中的一种或多种；所述易挥发试剂为超临界二氧化碳、正己烷、乙醚、异戊烷、氯仿、丙酮中的一种。
进一步地，所述动物结缔组织包括皮肤、肌筋膜、骨膜、胸腔内膜、腹腔内膜中的任一种，但不限于此；所述动物包括猪、牛、羊、马、鹿、鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟中的任一种，需经检疫并符合人类食用要求，但不限于此。
进一步地，所述片状组织为所述动物组织的天然结构的不同层组或者全层动物组织。天然结构的不同层组的含义，例如，以皮肤为原料，可自表皮层切取0.2-25mm的厚度，取到的层次按厚度增加可依次包含表皮、基底层、真皮乳头层、真皮网状层、皮下脂肪、皮下筋膜等；也可自皮下筋膜层切取0.2-25mm的厚度，取到的层次按厚度增加可依次包含皮下筋膜、皮下脂肪、真皮网状层、真皮乳头层、基底层、表皮层等；也可以是自表皮层或皮下筋膜层去掉一定厚度后，另行切取的一定厚度和部位。又如，以肌筋膜为原料，可自肌筋膜切取0.2-25mm厚度，切取厚度超过1mm时，可包含肌肉的一部分；又如，以骨膜为原料，可自骨膜切取0.2-2mm厚度，切取厚度超过1mm时，可包含骨的一部分，等等。片状组织的厚度与层次的对应关系，与动物组织的天然结构有关，根据需要的层次和目标厚度选择适宜的动物和组织。
进一步地，所述表面活性剂处理的过程是使用质量浓度为0.1％～5％的表面活性剂水溶液于0℃～35℃下进行多次处理，单次处理时间为0.5h～72h，在处理时可进行调节pH＝7～12；所述表面活性剂为SDS、Triton、Tween中的一种或多种；表面活性剂处理发挥的作用为脱细胞、脱脂、病毒灭活；
所述碱处理的过程是使用当量浓度为0.02N～6N的碱性水溶液于0℃～20℃下进行多次处理，单次处理时间为10min～120min；所述碱性水溶液中的碱性化合物为NaOH、KOH、Ca(OH)2、NaCO3、K2HPO4中的一种或多种；碱处理发挥的作用可为脱细胞、脱脂、脱杂蛋白、去除无定型基质、病毒灭活、调节等电点；
所述酸处理的过程是使用0.005N～4N的酸性水溶液于0℃～20℃下进行多次处理，单次处理时间为10min～120min；所述酸性水溶液中的酸性化合物为HCl、H2SO4、HNO3中的一种或多种；酸处理发挥的作用为脱细胞(去除DNA)、脱杂蛋白、去除无定型基质、病毒灭活、调节等电点；
所述盐溶液处理的过程是使用质量浓度为2％～25％的盐水溶液于-2℃～40℃下进行多次处理，单次处理时间为0.5h～60h；所述盐水溶液中的盐为NaCl、KCl、CaCl2、NaHCO3、Na2CO3中的一种或多种；盐溶液处理发挥的作用为脱细胞(去除DNA)、稳定蛋白结构；
所述缓冲溶液处理的过程是使用pH＝4～9.5的缓冲溶液于4℃～35℃下进行多次处理，单次处理时间为0.5h～60h；所述缓冲溶液的体系为K2HPO4-KH2PO4体系、Na2CO3-NaHCO3体系、Tris-HCl体系中的一种；缓冲溶液处理发挥的作用是为了调节pH值。
进一步地，所述干燥为自然晾干、通风晾干、鼓风烘干、真空烘干中的一种。
进一步地，所述分切采用机械切割或激光切割；所述灭菌采用环氧乙烷熏蒸或辐照灭菌。
本发明最后一方面提供上述制备方法制得的生物型巩膜修复材料，所述生物型巩膜修复材料为膜片状并具有多孔微观结构，用于巩膜及附属器官的修复。本发明的生物型巩膜修复材料主要成分为胶原蛋白，并包含微量弹性蛋白；本发明方法能够完全脱除可能引起免疫排斥反应的细胞以及无定型机制等非目标成分。
有益技术效果：
本发明制备生物型巩膜修复材料的原材料取自动物的结缔组织，并且在加工早期即切取均匀厚度和层次，使加工过程和获得的材料具有更高的一致性；本发明采用两性溶剂处理、表面活性剂处理、碱处理、酸处理、盐溶液处理、缓冲溶液处理中的任意一种或多种处理(可根据实际情况缺省步骤、调整步骤顺序或重复步骤穿插)来对动物组织进行有序可控的脱细胞、脱脂、脱杂蛋白、去除无定型基质、病毒灭活、调节等电点、稳定、调节pH值等的操作，然后采用两性溶剂处理对动物组织进行脱水，再添加易挥发试剂梯度洗脱置换来稳定动物组织的微观结构，然后采用常规干燥后并严格控制试剂残留，保证产品无毒性的基础上，获得微观结构稳定的脱细胞基质的多孔结构，其实质为非冻干的脱水干燥技术，与现有技术中冻干脱水干燥技术相比，本发明在保证蓬松多孔结构的基础上，避免了冻干过程因产生冰晶而造成纤维断裂的问题，以及引起纤维力学强度下降的问题。
本发明的生物型巩膜修复材料主要成分为胶原，胶原具有较好的生物相容性好，能够被人体内的胶原酶完全降解为人体可吸收的小分子氨基酸，用于修复巩膜后不影响眼球活动，无异物感；通过取材和加工过程控制修复材料的力学性能，能满足不同垫塞厚度、绑扎力度的需求；原材料来源丰富，可实现标准化批量加工，有利于术式推广，使更多患者受益。
本发明的生物型巩膜修复材料用于病理性、机械性、医源性等原因造成的巩膜及附属器官形态异常、器质性损伤的修复、再生和功能恢复。本发明的生物型巩膜修复材料用于修补和强化因病变或机械损伤、手术误伤等原因造成的巩膜变薄、破裂，以恢复巩膜的连续结构以及必要的生物强度；阻止因病理性原因引起的眼球轴向过度伸长，并在此基础上缩短眼轴长度，以恢复脉络膜密度；通过眼球外紧扎、垫塞等方式给眼球加压，促使脱落的视网膜、脉络膜重新附着于巩膜内表面，恢复视觉功能和视觉质量。本发明生物型巩膜修复材料的作用原理是通过自体巩膜有序修复，改善巩膜强度和血供，使受损组织恢复正常，并在发挥功能后完全降解。
附图说明
图1为实施例1中生物型巩膜修复材料的HE染色图。
图2为实施例1中生物型巩膜修复材料的SEM形貌图。
图3为实施例2中生物型巩膜修复材料的HE染色图。
图4为实施例2中生物型巩膜修复材料的SEM形貌图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值不限制本发明的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法应当被视为说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
实施例1
一种生物型巩膜修复材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)以猪皮(自表皮至皮下筋膜厚度共计30mm)为原料，洗净后，自皮下筋膜层切取厚度均一的片状组织，片状组织厚度为5mm，包含皮下筋膜全层和皮下脂肪层的一部分；
(2)①使用无水乙醇于10℃～25℃下浸泡步骤(1)中的片状组织，搅拌处理2h；
②使用pH＝8.5、1wt％SDS水溶液于20℃～30℃浸泡处理①处理后获得的材料，搅拌处理16h，并重复一次；
③使用1N NaOH水溶液于0℃冰水浴浸泡②处理后获得的材料，间歇搅拌，处理0.5h；
④使用pH＝5～5.5、总溶质浓度5wt％的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液体系于10℃～15℃下浸泡③处理后获得的材料，搅拌处理0.5h；
⑤使用0.1N HCl水溶液于4℃～8℃下浸泡④处理后获得的材料，间歇搅拌处理1h，处理后冰水清洗三次；
⑥重复一遍③～⑤的过程；
⑦使用10wt％NaCl水溶液于10℃～30℃浸泡⑥处理后获得的材料，间歇搅拌处理2h，处理后室温下流动水清洗2h；
⑧使用pH＝7～8，总溶质浓度0.5wt％K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液体系于4℃～10℃浸泡⑦处理后获得的材料48h，刚开始浸泡的1h内间歇搅拌；
⑨依次使用50wt％乙醇水溶液、75wt％乙醇水溶液、无水乙醇对⑧处理后获得的材料进行脱水，室温下分别搅拌浸泡处理5h、8h、24h；
⑩使用正己烷室温下连续振摇⑨处理后获得的材料，处理两遍，第一遍4h，第二遍20h，起到脱水干燥后稳定片状组织微观结构的作用，通过易挥发试剂在快速挥发的这一过程中保持组织微观结构；
Figure BDA0002938860860000061
将经过⑩处理后获得的材料单层平铺，在通风橱中通风晾干，获得中间品；
(3)对中间品依次进行分切、包装，并使用γ射线辐照灭菌，辐照剂量25kGy，最后获得膜厚0.8mm的生物型巩膜修复材料。
对本实施例制备的生物型巩膜修复材料进行HE染色测试，HE染色如图1所示，由图1可知，本实施例制得的生物型巩膜修复材料中的细胞基质已经去除完全，较好的保存了猪皮中的胶原蛋白支架。然后对本实施例制备的生物型巩膜修复材料进行扫描电子显微镜的观察，其SEM形貌图如图2所示，由图2可知，猪皮经过正己烷振荡处理且风干后，得到了脱细胞基质完全的多孔结构，多孔结构有利于视网膜血管的生长。
实施例2
一种生物型巩膜修复材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)以牛骨膜(含骨)为原料，洗净后，自筋膜切取厚度2mm，包含骨膜全层及骨的一部分；
(2)①使用1wt％Triton水溶液于20℃～30℃浸泡、搅拌处理16h，并重复一次；
②使用1N HCl水溶液于4℃～8℃下浸泡①处理后获得的材料三次，分别搅拌处理4h、6h、18h；
③使用1wt％Triton水溶液于20℃～30℃浸泡②处理后获得的材料，搅拌处理16h；
④使用2N NaOH水溶液于0℃冰水浴浸泡③处理后获得的材料，间歇搅拌，处理0.5h；
⑤使用pH＝5～5.5、总溶质浓度5wt％的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液体系于10℃～15℃下浸泡④处理后获得的材料，搅拌处理0.5h；
⑥重复一遍③～⑤的过程；
⑦使用5wt％NaCl水溶液于10℃～30℃浸泡⑥处理后获得的材料，间歇搅拌处理2h，处理后室温下流动水清洗2h；
⑧使用pH＝7～8，总溶质浓度0.2wt％K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液体系于4℃～10℃浸泡⑦处理后获得的材料72h，刚开始浸泡的2h内间歇搅拌；
⑨依次使用50wt％乙醇水溶液、75wt％乙醇水溶液、无水乙醇对⑧处理后获得的材料进行脱水，室温下分别搅拌浸泡处理5h、8h、24h；
⑩使用乙醚室温下连续振摇⑨处理后获得的材料10h，起到脱水干燥后稳定片状组织微观结构的作用，通过易挥发试剂在快速挥发的这一过程中保持组织微观结构；
Figure BDA0002938860860000071
将经过⑩处理后获得的材料单层平铺，在通风橱中通风晾干，获得中间品；
(3)对中间品依次进行分切、包装，并使用环氧乙烷熏蒸灭菌，最后获得膜厚1.8mm的生物型巩膜修复材料。
对本实施例制备的生物型巩膜修复材料进行HE染色测试，HE染色如图3所示，由图3可知，本实施例制得的生物型巩膜修复材料中的细胞基质已经去除完全，较好的保存了牛骨膜中的胶原蛋白支架。然后对本实施例制备的生物型巩膜修复材料进行扫描电子显微镜的观察，其SEM形貌图如图2所示，由图2可知，牛骨膜经过乙醚浸泡且风干后，得到了脱细胞基质完全的多孔结构，多孔结构有利于视网膜血管的生长。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种生物型巩膜修复材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以动物结缔组织为原材料，切取所述动物结缔组织上的动物组织，获得厚度均一的片状组织；
(2) 将所述片状组织经过如下处理：
①先将所述片状组织进行或不进行两性溶剂处理，所述两性溶剂处理的过程是：使用两性溶剂或混以0.05～1倍体积的水于0℃～40℃下进行多次两性溶剂的梯度处理，单次处理时间为1h～60h，所述两性溶剂为甲醇、乙醇、乙二醇、甘油、异丙醇中的一种或多种；
②然后进行表面活性剂处理，
③再多次进行酸处理或碱处理，
④然后再进行或不进行一次表面活性剂处理，
⑤然后进行缓冲溶液处理，
⑥重复步骤③～⑤，
⑦进行盐溶液处理，
⑧进行缓冲溶液处理；
再依次经过两性溶剂处理以脱水、易挥发试剂处理以稳定组织微观结构，然后干燥获得中间品；
所述两性溶剂处理以脱水具体是：依次使用50wt％乙醇水溶液、75wt％乙醇水溶液、无水乙醇对⑧处理后获得的材料进行脱水，室温下分别搅拌浸泡处理5h、8h、24h；
所述易挥发试剂为超临界二氧化碳、正己烷、乙醚、异戊烷、氯仿、丙酮中的一种；
(3)对中间品依次进行分切、包装、灭菌后获得生物型巩膜修复材料，所述生物型巩膜修复材料为膜片状并具有多孔微观结构，用于巩膜及附属器官的修复。
2.根据权利要求1所述的一种生物型巩膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述动物结缔组织包括皮肤、肌筋膜、骨膜、胸腔内膜、腹腔内膜中的任一种；所述动物包括猪、牛、羊、马、鹿、鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟中的任一种。
3.根据权利要求1所述的一种生物型巩膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述片状组织为所述动物组织的天然结构的不同层组或者全层动物组织。
4.根据权利要求1所述的一种生物型巩膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂处理的过程是使用质量浓度为0.1％～5％的表面活性剂水溶液于0℃～35℃下进行多次处理，单次处理时间为0.5h～72h，在处理时可进行调节pH＝7～12；所述表面活性剂为SDS、Triton、Tween中的一种或多种；
所述碱处理的过程是使用当量浓度为0.02N～6N的碱性水溶液于0℃～20℃下进行多次处理，单次处理时间为10min～120min；所述碱性水溶液中的碱性化合物为NaOH、KOH、Ca(OH)2、NaCO3、K2HPO4中的一种或多种；
所述酸处理的过程是使用0.005N～4N的酸性水溶液于0℃～20℃下进行多次处理，单次处理时间为10min～120min；所述酸性水溶液中的酸性化合物为HCl、H2SO4、HNO3中的一种或多种；
所述盐溶液处理的过程是使用质量浓度为2％～25％的盐水溶液于-2℃～40℃下进行多次处理，单次处理时间为0.5h～60h；所述盐水溶液中的盐为NaCl、KCl中的一种或多种；
所述缓冲溶液处理的过程是使用pH＝4～9.5的缓冲溶液于4℃～35℃下进行多次处理，单次处理时间为0.5h～60h；所述缓冲溶液的体系为K2HPO4-KH2PO4体系、Na2CO3-NaHCO3体系、Tris-HCl体系中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种生物型巩膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述干燥为自然晾干、通风晾干、鼓风烘干、真空烘干中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种生物型巩膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述分切采用机械切割或激光切割；所述灭菌采用环氧乙烷熏蒸或辐照灭菌。
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