CN107847642A - 去细胞角膜及其制备方法和用途 - Google Patents

去细胞角膜及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备去细胞角膜的方法，其包含对动物角膜施以去细胞处理步骤，且所述方法的特征在于不使用蛋白酶、螯合剂、清洁剂、甘油或其组合处理角膜的步骤。通过该方法使免疫原减少至一定程度并保留该天然角膜的结构和构型，使制备而成的角膜能够作为三维支架，于移植后支撑宿主细胞于其上生长。

Description

去细胞角膜及其制备方法和用途
本申请主张2016年1月8日提申的美国临时案第62/276,238号的所有权利，其内容整体并入本申请案中。
技术领域
本发明内容属于制备去细胞角膜方法的领域，具体涉及所述去细胞角膜适合作为移植物使用，以及以所述去细胞角膜来治疗患有与角膜受损相关眼部疾病的个体的方法。
背景技术
有多种疾病或病症影响角膜的功能，情况严重时甚至需要通过手术和角膜组织移植来进行修复。因猪角膜折射率及尺寸与人类角膜相当，猪角膜已经被公认是最适合作为人类角膜的替代品。然而，异种移植猪角膜往往会引发宿主严重的免疫反应(或移植排斥)，这是由于猪角膜去细胞处理过程中去除细胞不完全或所用的制剂残留(例如，化学物质和酶)所造成。
因此，本领域需要一种经改良的角膜制备方法，其能保留天然角膜的结构和构型，并减少免疫原(即，任一种残留的细胞物质)，使制备而成的角膜能够作为三维支架，于移植后支撑宿主细胞于其上生长，且不会引起严重的免疫反应和诱发新生血管。
发明内容
发明内容旨在提供本发明内容的简化描述，以使公众对本发明内容具备基本的理解。此发明内容并非本发明内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。
本发明内容之一第一方面是有关于一种制备去细胞角膜的方法。所述方法包含对动物角膜施以超临界流体(SCF)处理；其中，该方法的特征在于不包括使用蛋白酶、螯合剂、清洁剂、甘油或其组合处理角膜的步骤。
依据某些实施方式，所述方法更包含在SCF处理前，以水或含0.5-4.0M NaCl溶液处理角膜至少24小时。
依据某些实施方式，在对角膜进行SCF处理时，更包含使用一辅溶剂并于压力73–500巴(Bar)以及温度30-50℃下，处理20-120分钟。
所述SCF是超临界二氧化碳(supercritical carbon dioxide,ScCO2)、超临界一氧化二氮(supercritical nitrous oxide,ScN2O)、超临界烷类(supercritical alkane)、超临界烯类(supercritical alkene)、超临界醇类(supercritical alcohol)、超临界丙酮(supercritical acetone)或其组合。在一实施例中，所述SCF是ScCO2。在另一实施例中，所述SCF是ScN2O。所述辅溶剂可以是C1-4醇，且选自于以下成员所组成的群组中：乙醇(ethanol)、丙醇(propanol)、异丙醇(isopropanol)、丁醇(butanol)、异丁醇(isobutanol)、仲丁醇(sec-butanol)、叔丁醇(t-butanol)和环丁醇(cyclobutanol)。在较佳的实施方式中，所述辅溶剂是30-100％(vol％)乙醇；在更佳的实施方式中，所述辅溶剂是50-98％乙醇；以及，在最佳的实施方式中，所述辅溶剂是60-75％(vol％)乙醇。
依据一较佳实施方式，所述SCF处理的执行条件为连同60％(vol％)乙醇于压力350巴和45℃下，处理80分钟。
在最佳实施方式中，本方法不含以蛋白酶、螯合剂、清洁剂、甘油或其组合处理角膜的步骤。
依据某些实施方式，所述角膜是取自于动物，其选自于以下成员所组成的群组中：猪、牛、绵羊、山羊、兔子、猴子或人类。在较佳的实施方式中，所述角膜是取自于猪。
因此，本发明内容第二方面是提供利用以所述方法制备而成的去细胞角膜。
依据较佳的实施方式，所述去细胞角膜是取自于猪角膜。
再者，本发明内容第三方面是关于以本发明内容所制备的去细胞角膜，来治疗患有与角膜受损相关眼部疾病的个体的方法。所述方法包含将本发明所述去细胞角膜植入个体眼中以修复所述与角膜损伤相关眼部疾病的步骤。
在可任选的实施方式中，所述方法包含在移植前，先在去细胞角膜上培养细胞。适合培养于本发明去细胞角膜上的细胞可选自于以下成员所组成的群组中：角膜内皮细胞、角膜基质细胞、角膜上皮细胞、胚胎干细胞和成体干细胞。
依据本发明内容某些实施方式，所述细胞是自体细胞。
依据本发明内容其他实施方式，所述细胞是同种异体细胞。
依据本发明内容某些实施方式，本方法所能治疗的眼部疾病是选自于以下成员所组成的群组中：角膜上皮营养不良(Fuchs'dystrophy)、圆锥角膜(keratoconus)、格状角膜营养不良(lattice cornea dystrophy)、地图-点-指纹状营养不良(map-dot-fingerprintdystrophy)、虹膜角膜内皮综合征(iridocorneal endothelial syndrome)、虹膜痣综合征(柯根-立斯)(iris nevus(Cogan-Reese)syndrome)、钱得勒综合征(Chandler'ssyndrome)和自发性虹膜萎缩(essential iris atrophy)。
依据本发明内容其他实施方式，所述眼部疾病是由单纯泡疹病毒感染所致。
依据本发明内容另一实施方式，所述眼部疾病是由沙眼披衣菌感染所致。
依据本发明内容又一实施方式，所述眼部疾病是由化学性灼伤所导致的。
在参阅下文实施方式后，本领域技术人员当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。
应当理解的是，前述一般性描述及以下详细描述是通过参考实施例来进行，并且旨在对如权利要求所保护的本发明做进一步解释。
附图说明
以下所附图式构成本说明书的一部分，其绘示出本发明多种实施方式的各种例示性系统、方法以及其他实施方式。本案详细说明的内容可依下列详细的描述结合图式说明，更清楚地理解其内容，其中，
图1是依据本发明内容一实施方式所示SDS PAGE分析从(A)正常角膜组织，和(B)经ScCO2处理的角膜组织萃取的可溶性角膜总蛋白的结果；
图2A是依据本发明内容一实施方式所示蛋白印迹分析正常角膜组织和经ScCO2处理的角膜组织中第一型胶原蛋白的结果；
图2B是依据本发明内容一实施方式所示蛋白印迹分析正常角膜组织和经ScCO2处理的角膜组织中第二型胶原蛋白的结果；
图3是实施例1.2去细胞角膜于放大倍率40X(A)和100X(B)下拍摄的组织染色的照片；以及
图4是依据本发明内容一实施方式所示实施例1.2去细胞角膜分别于接种hADCs前(A)和后(B)在放大倍率2,000X下所拍摄的SEM照片。
具体实施方式
在此所提供的详细叙述和所附的图式为本发明内容的说明性的描述，但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。
在此所示的单数名词“一(a,an)”包含复数型，除非另有定义。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考量而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
本发明内容是关于制备去细胞角膜的新颖方法、利用前述方法制备的去细胞角膜，以及利用所制成的去细胞角膜来治疗眼部疾病和/或病征并从中获益的用途。
本发明内容第一个方面涉及制备去细胞角膜的方法。其中，该方法能保留天然角膜的结构和构型，藉此提供一个光学微环境使宿主细胞移植后于其上生长。
再者，本方法至少包含对动物角膜施以超临界流体(SCF)处理的步骤，其中所述方法特征在于不包含以蛋白酶、螯合剂、清洁剂、甘油或其组合处理角膜的步骤。
在执行本发明步骤前，从动物眼球中移除角膜和部分巩膜组织。适用于本发明内容的动物包含，但不限于，猪、牛、乳牛、绵羊、山羊、兔子、猴子和人类。在一较佳的实施方式中，将猪的眼球以组织固定环托持，接着利用环锯将角膜和部分巩膜组织切除，并立即执行本发明的方法。
对上述取得的角膜施以去细胞步骤处理。所述去细胞步骤执行的目的在于移除角膜的细胞物质，且保留角膜组织的物理和生物化学特性，使其能够作为组织支架。再者，所述角膜以超临界流体(SCF)处理的同时，使用一辅溶剂并于压力73–500巴以及温度30-50℃下，处理20-120分钟。
所述SCF可以是临界二氧化碳、超临界一氧化二氮、超临界烷类、超临界烯类、超临界醇类或超临界丙酮。在一实施例中，所述SCF是ScCO2。在其他较佳的实施例中，所述SCF是ScN2O。所述辅溶剂可以是C1-4醇，其包含但不限于，乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇和环丁醇。在某些较佳的实施例中，所述辅溶剂是30-100％(vol％)乙醇，例如，30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％(vol％)乙醇。在较佳的实施例中，所述辅溶剂是40-98％乙醇，例如，40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97或98％(vol％)乙醇。在又一较佳的实施方式中，所述辅溶剂是60-75％(vol％)乙醇，例如，60、65、70或75％(vol％)乙醇。在最佳的实施方式中，所述辅溶剂是60％(vol％)乙醇。
所述去细胞步骤是于以下条件执行，其中压力约70-500巴，例如，70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500巴；较佳为约73-450巴，例如，73、74、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440或450巴；较佳为约250-400巴，例如，250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400巴；温度约30-50℃，例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃，较佳为约35-48℃，例如，35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48℃；以及处理时间为约20-120分钟，例如，20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120分钟；较佳为约30-90分钟，例如，30、40、50、60、70、80和90分钟。在较佳的实施方式，在60％(vol％)乙醇存在下对以步骤(1)溶液处理的角膜施以ScCO2处理，处理条件为压力约350巴，温度约45℃，处理时间为约80分钟。所述角膜于去细胞处理后，丧失其透明度或变混浊。
本方法特征在于：不包括以酶消化(即，蛋白酶或核酸酶)，和/或离子螯合作用处理(即，使用离子螯合剂)角膜的步骤，如现有技术所揭露的方法，例如，中国专利号104001215B和美国专利号8,313,893B2所揭露的方法。本发明的角膜也不使用清洁剂进行处理。在此所述的酶消化是指使用蛋白酶处理角膜，其包含，但不限于，胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜酶(papain)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、凤梨酶(bromelain)、奇异果酶(actinidain)、蛋白酶A(proteinase A)、蛋白酶K(proteinase K)、肽酶(peptidase)、无花果蛋白酶(ficin)、钙蛋白酶(calpain)、凋亡蛋白酶(caspase)及其组合；或一核酸酶，其可以是DNA核酸酶或RNA核酸酶。所述离子螯合作用处理是指以金属离子螯合剂处理角膜，其包含，但不限于，乙二胺四醋酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四醋酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid,DOTA)、1,4,7,NNN10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四三苯基膦(1,4,7,NNN10-tetraazacyclododecane-1,4,7,1-0-tetrakis)(亚甲基磷酸(methylene phosphonic acid))(DOTP)、反式-1,2环己二胺四醋酸(trans-1,2-diaminocyclohexan-tetra-acetic acid,CDTA)、4,5-二羟基苯-1,3-二磺酸(4,5-dihydroxybenzene-1,3-disulphonic acid)(Tiron)、硫脲(thiourea)、8-羟基喹啉-5-磺酸(8-hydroxyquinoline-5-sulphonic acid)、3,6-二磺基-1,8-二羟基-萘(3,6-disulpho-1,8-dihydroxy-naphthalene)、Eriochromeschwarz T(1-(1-羟基-2-萘基偶氮)-2-羟基-5-硝基-4-萘磺酸(1-(1-hydroxy-2-naphthylazo)-2-hydroxy-5-nitro-4-naphthalene sulphonic acid))以及紫尿酸铵(ammonium purpurate)。所述清洁剂处理步骤是指使用清洁剂处理所述角膜，特别是指由两性分子组成的液体清洁剂，例如，表面活性剂，其可以是阳离子(cationic)(即，四级铵化合物(quaternary ammonium compounds)、阴离子(anionic)(即，烷基苯磺酸盐(alkylbenzesulfonates)、胆汁酸(bile acids)及其类似物)或非离子(即，Tween、Triton和/或Brij系列)。再者，本发明的角膜不需要如常规方法所示将角膜浸入至甘油溶液中。
依据可任选的实施方式，在SCF处理前，将角膜浸入至水或盐溶液中，以从其上去除上皮层。依据本发明内容某些实施方式，所述溶液含一价盐(monovalent salts)，其包含，但不限于，氯化锂(lithium chloride)、氯化钠(sodium chloride)、氯化钾(potassiumchloride)、氯化铵(ammonium chloride)等。在较佳的实施方式中，所述盐溶液是浓度为约0.5-4M氯化钠溶液，例如、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0M；较佳为约1.0-3.5M，例如，1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4或3.5M；以及最佳为约1.5M。在较佳的实施方式中，所述角膜是浸泡于1.5M NaCl溶液(未额外添加金属螯合剂(即，EDTA))，于室温下轻微震荡约24小时。在其他实施方式中，于SCF处理前，所述角膜是浸泡于纯水中至少24小时。于盐溶液或纯水处理后，所述角膜将变得混浊或不透明状且膨胀。在此，本领域技术人员，可基于每一角膜处理过程的状况，在无须过度实验下，轻易地调整水或盐溶液的处理条件(即，处理时间和/或盐浓度)。在其他实施例中，所述角膜是以KCl溶液(0.5-4M)处理至少24小时。
因此，本发明内容另一方面是提供利用上述方法制备而成的去细胞角膜。以本发明方法制备而成的去细胞角膜，可保留天然角膜的胶原纤维完整性，且完全去除对于宿主而言具免疫原性的细胞物质，因此，对于宿主细胞(特别是取自于角膜的细胞)来说，是极佳的移植物，于移植后能够支持宿主细胞在去细胞角膜上生长，且不会诱导宿主体内产生不希望发生的移植排斥反应。
再者，本发明内容又一方面是一种治疗患有眼部疾病个体的方法，包括在需要治疗的个体眼部植入本发明的去细胞角膜移植物，其中，该去细胞角膜移植物可供细胞(即，源于角膜的细胞)在其上生长，且能够修复眼部疾病造成的角膜受损，眼部疾病例如，疾病、感染或意外(即，化学性灼伤所导致的)，使个体能够从去细胞角膜移植物中得到益处。
本方法包含将去细胞角膜移植至个体的眼睛上，以修复与眼部疾病相关的角膜缺损。
所述以本方法制备而成的去细胞角膜适合作为可供细胞生长的生物支架使用。再者，在可任选的实施方式中，本发明内容的去细胞角膜于移植前，能够在体外先进行细胞培养。可利用本领域任一种培养技术培养所述细胞。可以培养于去细胞角膜上的细胞，包含，但不限于，取自于角膜的细胞，例如，角膜内皮细胞、角膜基质细胞，以及角膜上皮细胞；胚胎干细胞，以及成体干细胞。再者，所述细胞可以是自体细胞(即，取自于接受去细胞角膜移植物的宿主)或同种异体细胞(即，取自于宿主以外的个体)。
本发明的去细胞角膜经培养合适的细胞后，可将其移植至患有角膜受损相关眼部疾病且需要角膜移植的宿主上。所述眼部疾病相关的角膜受损可以是疾病、感染或意外所导致的。
依据某些实施方式，所述眼部疾病是由疾病所导致的，其选自于以下成员所组成的群组中：角膜上皮营养不良、圆锥角膜、格状角膜营养不良、地图-点-指纹状营养不良、虹膜角膜内皮综合征、虹膜痣综合征(柯根-立斯)、钱得勒综合征和自发性虹膜萎缩。角膜上皮营养不良是由于于内皮细胞死亡，导致从基质移除的液体不足，进而造成角膜膨胀和视觉扭曲；最终上皮层膨胀导致眼球异常弯曲，进一步造成视觉扭曲。圆锥角膜是由渐进式角膜增厚所导致的疾病，其主因是角膜逐渐向外凸出造成异常弯曲。其他可以本方法治疗的疾病是格状角膜营养不良，其造成淀粉样沉积物或异常蛋白纤维堆积于基质内，导致混浊度上升进而降低视力。情况严重时，将导致外部上皮层侵蚀，在此状况下则需要进行角膜移植。地图-点-指纹状营养不良亦称为柯根氏营养不良(Cogan’s dystrophy)，此为影响角膜前部的退化性疾病，以裂隙灯观察时可以发现视力降低和/或角膜侵蚀的状况。虹膜角膜内皮综合征为妇女常见的疾病，其造成虹膜颜色改变、角膜肿胀以及青光眼的发生。所述综合征是具有相关症状的三种综合征群组所定义，即，虹膜痣综合征、钱得勒综合征或自发性虹膜萎缩。然而，此疾病群组的共通特征为内皮细胞从角膜迁移到虹膜上。角膜的内皮细胞死亡造成角膜肿胀和虹膜变形伴随视觉扭曲。
在其他实施方式中，所述与角膜受损相关的眼部疾病是由多种病原体所造成的，例如，单纯泡疹病毒所造成的病毒感染；或沙眼披衣菌所造成的细菌感染。
在又一实施方式，所述与角膜受损相关的眼部疾病是由意外所导致的，例如，酸性化学物质(如，电池中的盐酸(muriatic acid)或硫酸(sulphuric acid))和/或碱性化学物质(如，石灰(lime)、烤箱清洁剂(oven cleaners)、氨(ammonia))所导致的化学性灼伤。情况严重时，只能以角膜移植来改善角膜上的伤痕。
依据本发明内容一较佳实施方式，以本方法制备的去细胞角膜是直接施用至动物(即，兔子)受伤的眼睛，其中所述眼睛受损的程度是指到达需要角膜移植的程度。在此实施方式中，所述去细胞角膜在移植前，并未接种上皮细胞。于移植后，所述动物个体(即，兔子)受伤的眼睛能够完全恢复(即，恢复受伤角膜的完整性)。
下文提出多个实验例来说明本发明的某些实施方式，以利本领域技术人员实作本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。原则上本领域技术人员能够以本领域其他已知的步骤、方法或技术取代。
实施例
实施例1去细胞猪角膜的制备和特征分析
1.1制备去细胞猪角膜
将冷冻于-20℃的猪眼球，于室温下解冻(少于3分钟)，再以组织架夹持保持在适当位置。利用环锯(18公厘)切除角膜和部分巩膜。将切除的角膜浸泡在仅含1.5M NaCl或水(即，不添加任何盐类、螯合剂或蛋白酶)的容器(7公分x 5公分x 4公分)中。接着于室温下，以转速100rpm轻微震荡24小时，以移除上皮层(约50微米)。在此阶段，经NaCl或水处理的角膜肿胀且混浊(即，不透明)。
接着，将所述经NaCl或水处理的角膜置于组织架上，并将其置入ScCO2系统(HelixSFE Version R3U,Applied Separations Inc(Allentown,PA,USA))的容器中，且容器内含10毫升乙醇(75％)。所述ScCO2系统进行去细胞的操作条件为：压力120巴，38℃下，处理60分钟(即，静态和动态ScCO2处理)。
再将去细胞角膜存放于无菌环境中备用。
1.2制备去细胞猪角膜
在此实施例中，除了将ScCO2系统的操作条件改为压力350巴，45℃下处理80分钟(即，静态和动态ScCO2处理)外，是利用与实施例1.1所述步骤类似的方法来制备去细胞猪角膜。
接着，将制备而成的去细胞角膜存放于无菌环境中备用。
1.3实施例1.2的去细胞猪角膜的特征分析
以下列标准流程利用苏木精和曙红染色(hematoxylin and eosin staining,H&Estaining)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)染色和SDS-PAGE分析实施例1.2的去细胞角膜。
DAPI染色的定量结果显示，正常角膜具有相对高量的DNA计数量，其中所测得DNA量为37.29±5.3(纳克/毫克)，而实施例1.2的去细胞角膜的DNA量仅为11.51±0.74(纳克/毫克)，由此结果可以得知，本发明以ScCO2进行去细胞处理，能够有效移除角膜组织上的细胞物质。
SDS PAGE分析的结果确认实施例1.2经ScCO2处理的去细胞角膜上所保留的蛋白质是胶原蛋白(图1)，特别是第一型胶原蛋白，此一结果也经蛋白印迹确认(图2B)。
图3是实施例1.2的角膜经H&E染色，分别于放大倍率40X(图A)和100X(图B)下所拍摄的照片。由此可以证实，实施例1.2的角膜具有相对完整的纤维结构，因此于移植后可作为生物支架供细胞生长于上。
实施例2人类脂肪细胞(human adipose cells,hADCs)可生长于实施例1.2去细胞猪角膜上
2.1分离hADCs
从进行抽脂手术的病人身上所取得的脂肪组织中分离人类脂肪细胞(hADCs)。简言之，以大量的磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered slaine,PBS)冲洗脂肪组织(约50克)，以移除任一残留的红血球细胞。将彻底冲洗后的脂肪组织悬浮于PBS中，再进行离心，接着收集上层。再次离心，收集上层，接着将收集到的上层分成数个部分。将脂肪组织的每一部份移至另一干净试管，其中该试管含40毫升的杜氏改良培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium,DMEM))(含胶原蛋白酶(1毫克/毫升)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC)(2mM)和L-抗坏血酸2-磷酸(L-ascorbic acid 2-phosphate)(0.2mM))。将试管置于37℃，隔夜培养，接着进行离心，移除含有胶原蛋白酶的上层。收集每一试管中的沉淀物，再培养至DMEM(添加10％胎牛血清、NAC(2mM)和L-抗坏血酸2-磷酸(0.2mM))中，置于5％CO2的环境。隔天，以PBS将未贴附的细胞冲洗下来，再添加5毫升的K-NAC。每两天更换培养基直到细胞长满(confluence)为止，约为一周的期间。利用胰蛋白酶消化收集细胞，并将其储存于液态氮中备用。
2.2实施例1.2去细胞猪角膜可支持hADCS于其上生长
于接种前，将实施例1.2去细胞猪角膜浸入含抗生素混合物(盘林西林(penicillin)、链霉素(streptomycin)和双性霉素B(amphotericin B))的70％甘油溶液，浸泡3天，再以PBS(含抗生素混合物)充分清洗后，再将hADCs(1x104)接种在实施例2.1去细胞猪角膜上，接着培养14天。分别于第1、3、7和14天取下角膜小量样本，再以H&E染色和SEM分析。将一代表性结果示于图4。
图4的SEM照片为实施例1.2的去细胞角膜分别在hADCs接种前(图4A)和接种后7天(图4B)下所拍摄的。结果显示实施例1.2的去细胞猪角膜证实能作为支持hADCS生长的支架。
实施例3在异种移植模型中使用实施例1.2的去细胞猪角膜
于角膜异种移植模型中，评估实施例1.2去细胞猪角膜对于需移植的眼部疾病修复的影响。
为达到上述目的，本实验例采用纽西兰白兔(台湾地区行政部门农业委员会畜产试验所)，且严格遵守研究用动物使用规范进行试验。实验动物随机接受单眼角膜移植。肌肉内注射啮齿动物鸡尾酒药物(100毫克/毫升5的氯胺酮(ketamine)、20毫克/毫升的甲苯噻嗪(xylazine)和10毫克/毫升的乙酰丙嗪(acepromazine))(0.5-0.7毫升/公斤)以进行兔子(体重为2.0和3.0公斤)麻醉。将盐酸丙美卡因(proparacaine hydrochloride)局部麻醉滴剂(0.5％Ophthaine,Bristol-Myers Squibb)，连同盐酸环喷托酯(cyclopentolate)滴剂(1％,Alcon,Ft.Worth,Tex.)和苯肾上腺素(phenylephrine)滴剂(10.0％CibaVision,Duluth,Ga.)滴入至实验动物眼中，使瞳孔扩张最大化。所有操作步骤于显微镜下进行。利用深板层角膜移植术(DALK,deep anterior lamellar keratoplasty)于角膜上创造出5公厘的伤口。接着，将实施例1.2的去细胞角膜(直径约为6公厘)覆盖于伤口上，并以10-0号尼龙缝合线缝合至角膜上。施用局部眼药水(含1％)至眼睛上，每日三次，且持续施用7-10天。于手术三周后，眼睛以萤光素染色评估角膜的完整性。分别于第1、5、11、14和21天拍摄眼部影像。于实验结束时，牺牲动物以及染色，以观察经移植的实施例1.2角膜上新生的上皮细胞。
实验结果意外发现经DALK手术的兔子移植实施例1.2去细胞角膜，能够恢复角膜的完整性，且经移植的角膜移植物上发现从邻近区域(即，为受伤区域)新迁移至此的上皮细胞。
可以理解的是上述实施方式所揭露的具体实施例仅为例示，本领域技术人员能够对其进行各种修改。上述说明书、实施例和数据提供了本发明例示性实施方式整体完整的叙述和应用。虽然本发明于一定程度上具体揭示了多种实施方式，或是分别参照一或多个实施方式，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰。

Claims (21)

1.一种制备去细胞角膜的方法，包含以超临界流体处理动物的角膜，其特征在于，所述方法不包含以蛋白酶、螯合剂、清洁剂、甘油或其组合来处理所述角膜的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，还包含在施以所述超临界流体处理前，以水或含0.5-4.0MNaCl溶液处理所述角膜至少24小时。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述角膜施以所述超临界流体处理时，是在辅溶剂存在下，于压力73–500巴以及温度30-50℃下，处理20-120分钟。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述超临界流体是超临界二氧化碳、超临界一氧化二氮、超临界烷类、超临界烯类、超临界醇类、超临界丙酮任一种或其组合。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述超临界流体是超临界二氧化碳。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述超临界流体是超临界一氧化二氮。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述辅溶剂是体积百分比为30-100％的乙醇。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述角膜是以所述超临界流体连同体积百分比60％的乙醇，于压力350巴和45℃下处理80分钟。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物是选自于以下成员所组成的群组：猪、牛、绵羊、山羊、兔子、猴子和人类。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述动物为猪。
11.一种去细胞角膜，其是由权利要求1所述的方法制备而成。
12.如权利要求11所述的去细胞角膜，其特征在于，所述角膜是取自于猪角膜。
13.一种治疗患有与角膜损伤相关眼部疾病的个体的方法，其特征在于，包含将权利要求11所述的去细胞角膜植入所述个体眼中以修复所述与所述眼部疾病相关的角膜损伤。
14.如权利要求13所述的方法，还包含在进行移植前培养于其上的细胞。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞选自于以下成员所组成的群组：角膜内皮细胞、角膜基质细胞、角膜上皮细胞、胚胎干细胞和成体干细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞是自体细胞。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞是同种异体细胞。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述眼部疾病是选自于以下成员所组成的群组：角膜上皮营养不良、圆锥角膜、格状角膜营养不良、地图-点-指纹状营养不良、虹膜角膜内皮综合征、虹膜痣综合征(柯根-立斯)、钱得勒综合征和自发性虹膜萎缩。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述眼部疾病是由单纯泡疹病毒感染所致。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述眼部疾病是由沙眼披衣菌感染所致。
21.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述眼部疾病是由化学性灼伤所致。
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