CN108339156A - 去细胞甲床的制备方法以及组织工程化甲床的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种去细胞甲床的制备以及基于该去细胞甲床的组织工程化甲床的构建方法，其中采用脱细胞技术来制备去细胞甲床，该去细胞甲床无细胞及核酸成分，细胞外基质的结构及活性成分保存良好，生物相容性极佳；再基于该去细胞甲床来体外接种人源性的甲床干细胞，构建组织工程化甲床；构建的组织工程化甲床具备与正常甲床一致的组织结构和组成成分，并且接种的甲床干细胞具有特定的分化潜能，该组织工程化甲床具有一定程度的生长指甲的能力，可实现甲床缺损的修复，具有极佳的应用前景。

Description

去细胞甲床的制备方法以及组织工程化甲床的构建方法
技术领域
本发明涉及一种去细胞甲床的制备方法以及组织工程化甲床的构建方法，属于甲床治疗领域。
背景技术
指甲作为皮肤的附属结构，具有保护指端、辅助指端捏持、增强指腹感觉的作用，并可辅助手指完成一些日常生活中的特殊动作；同时指甲也是人体美容的重要修饰部分。
按照传统的手功能损害评定标准，指甲缺损并不造成手功能的丧失，但随着人们生活水平的日益提高及社交活动的增加，越来越多的患者要求修复指甲缺损，因此甲床缺损的修复显得尤为重要。
目前，临床上治疗甲床缺损，通常是施行植皮术、皮瓣修复术、甲床移植术及拇甲瓣移植术。这些手术的结果，多为新生的指甲不美观、不能生长指甲，或是以牺牲另外的指甲或趾甲为代价，例如，植皮术和皮瓣修复术是取甲床缺损患者自体的局部真皮或皮瓣进行移植，修复缺损甲床；虽然修复了缺损的甲床，但并不能替代甲床的功能，无指甲的新生；例如，甲床移植术，通过取较少暴露的足趾甲床移植到缺损区，然而该术式需要牺牲正常甲床，修复的甲床存活率较低，且长出的新指甲可能存在异常的外观，因此该术式在临床的使用率较低；例如，拇甲瓣移植术，主要适用于手拇指软组织缺损，常采用足趾的拇甲瓣修复手指软组织缺损；该术式修复的手指甲床保存良好，带指甲，然而常常会牺牲足趾的甲床。
因此，如何满意地修复甲床缺损以形成满意的指甲，是手外科临床上未能解决的难题之一。
2007年有国内学者尝试将甲床上皮细胞接种到脱细胞真皮基质上，然而构建的这种类甲床替代物并未进行动物模型体内移植，因此，其实际应用效果并未可知。
因此，发明人希望研究出一种新的组织工程化甲床的制备方法，获得的组织工程化甲床的组织结构与正常甲床一致，可实现甲床缺损的修复，而且无免疫排斥反应。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种去细胞甲床的制备方法，该制备方法至少包括以下依次进行的步骤：
步骤1)，取甲床组织：在无菌条件下获取患者的甲床组织，且保留甲床根部；
步骤2)，通过震荡处理去除细胞：将步骤1)获取的甲床组织放置于摇床振荡器上进行振荡，并且将甲床组织依次浸泡于肝素PBS溶液中振荡40分钟～1.5小时、1％的TritonX-100溶液中振荡3.5小时～4.5小时、PBS溶液中振荡40分钟～1.5小时、0.8％SDS溶液中振荡3.5小时～4.5小时、含有三种抗体的PBS溶液中振荡3.5小时～4.5小时获得去细胞甲床；其中，所述肝素PBS溶液是指肝素浓度为800～1200U/L的PBS溶液，所述含有三种抗体的PBS溶液是指含有80～120U/L青霉素、0.08～0.12mg/ml链霉素以及0.08～0.12mg/ml两性霉素B的PBS溶液；其中，振荡的速度为100～150转/分钟；
步骤3)干燥处理：将步骤2)获得的去细胞甲床真空干燥处理至少6小时，再通过60Co-γ射线灭菌处理至少2小时，其中60Co-γ射线的辐射强度为10～15Krad。
在本发明的一个优选实施方案中，在所述步骤3)中，将所述灭菌处理完成后得到的去细胞甲床密封保存于-80摄氏度环境中。
在本发明的另一个优选实施方案中，在所述步骤2)中，所述肝素PBS溶液是指肝素浓度为1000U/L的PBS溶液，所述含有三种抗体的PBS溶液是指含有100U/L青霉素、0.1mg/ml链霉素以及0.1mg/ml两性霉素B的PBS溶液。
在本发明的一个更优选实施方案中，在所述步骤2)中，将甲床组织依次浸泡于肝素PBS溶液中振荡1小时、1％的Triton X-100溶液中振荡4小时、PBS溶液中振荡1小时、0.8％SDS溶液中振荡4小时、含有三种抗体的PBS溶液中振荡4小时获得去细胞甲床；其中，振荡的速度为128转/分钟。
本发明另一方面提供了一种组织工程化甲床的构建方法，该构建方法至少包括以下依次进行的步骤：
步骤a)灭菌处理：将所述权利要求1或2得到的去细胞甲床浸泡于青链霉素双抗溶液中进行灭菌处理至少12小时，然后再用PBS溶液清洗所述青链霉素双抗溶液；其中，所述青链霉素双抗溶液中含有80-120U/L青霉素和0.08-0.12mg/ml链霉素；
步骤b)去细胞甲床的孵育：将步骤a)处理后获得的去细胞甲床置于含有10％(体积比)胎牛血清的DMEM低糖培养基中孵育至少2小时，所述10％胎牛血清的DMEM低糖培养基是指胎牛血清的体积比为10％，含糖量少于或等于1000mg/L；
步骤c)接种：将甲床干细胞按1.5×106～2.5×106个/平方厘米的密度接种到步骤b)获得的去细胞甲床上；
步骤d)甲床干细胞的培养：在37℃、5％CO2的环境下，在所述含有10％胎牛血清的DMEM低糖培养基的存在下培养至少7天，隔天换液，获得所述组织工程化甲床。
在本发明的一个优选实施方案中，在所述的步骤c)中，将甲床干细胞按照2×106个/平方厘米的密度接种到步骤b)获得的去细胞甲床上。
在本发明的另一个优选实施方案中，在所述去细胞甲床的制备方法的步骤2)中，所述肝素PBS溶液是指肝素浓度为1000U/L的PBS溶液，所述含有三种抗体的PBS溶液是指含有100U/L青霉素、0.1mg/ml链霉素以及0.1mg/ml两性霉素B的PBS溶液。
在本发明的一个更优选实施方案中，在所述去细胞甲床的制备方法的步骤2)中，将甲床组织依次浸泡于肝素PBS溶液中振荡1小时、1％的TritonX-100溶液中振荡4小时、PBS溶液中振荡1小时、0.8％SDS溶液中振荡4小时、含有三种抗体的PBS溶液中振荡4小时获得去细胞甲床；其中，振荡的速度为128转/分钟。
本发明提供了一种去细胞甲床的制备以及基于该去细胞甲床的组织工程化甲床的构建方法，采用脱细胞技术来制备去细胞甲床，该去细胞甲床无细胞及核酸成分，细胞外基质的结构及活性成分保存良好，生物相容性极佳；再基于该去细胞甲床来体外接种人源性的甲床干细胞，构建组织工程化甲床；构建的组织工程化甲床具备与正常甲床一致的组织结构和组成成分，并且接种的甲床干细胞具有特定的分化潜能，该组织工程化甲床具有一定程度的生长指甲的能力，可实现甲床缺损的修复，具有极佳的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的去细胞甲床的外观照片；
图2为实施例1制备的去细胞甲床的石蜡切片经苏木精-伊红(H&E)染色的结果；
图3为实施例1制备的去细胞甲床的石蜡切片Masson染色的结果；
图4为实施例1制备的去细胞甲床的石蜡切片PAS染色的结果；
图5为实施例1制备的去细胞甲床的石蜡切片经免疫荧光染色标记IV型胶原蛋白(Col IV)的结果；
图6为实施例1制备的去细胞甲床的石蜡切片免疫荧光染色标记主要组织相容性复合体(MHC-I)的结果；
图7为实施例2制备的组织工程化甲床在光学显微镜下的照片；
图8为实施例2制备的组织工程化甲床的石蜡切片经免疫荧光染色同时标记IV型胶原蛋白(Col IV)和角蛋白14(CK14)的结果；
图9为实施例2制备的组织工程化甲床的石蜡切片经免疫荧光染色同时标记波形蛋白(Vimentin)和角蛋白(Pan keratin)的结果；
图10为实施例2制备的组织工程化甲床体内移植2个月的石蜡切片H&E染色的结果；
图11为实施例2制备的组织工程化甲床体内移植2个月的石蜡切片经免疫荧光染色标记角蛋白(Pan keratin)的结果；
图12为实施例2制备的组织工程化甲床体内移植2个月的石蜡切片经免疫荧光染色标记IV型胶原蛋白(Col IV)的结果。
具体实施方式
以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。
定义
本文所称的术语“甲床”是位于指端指(趾)甲所覆盖区域。
本文所称的术语“甲床组织”是位于指端指(趾)甲所覆盖区域的上皮组织，其中甲根部是指(趾)甲的生发区，位于甲床的近端。
本文所称的术语“甲床干细胞”是位于甲根部皱襞内的干细胞，具有向甲床定向分化的潜能。
本文所称的术语“去细胞甲床”是指经脱细胞方法处理后的甲床，其内无细胞成分。
本文所称的术语“DMEM低糖培养基”是指低糖型的DMEM培养基(糖含量少于或等于1000mg/L)。
实施例1
实施例1提供了一种去细胞甲床的制备方法，该制备方法至少包括以下依次进行的步骤：
步骤1)，取甲床组织：在无菌条件下获取患者的甲床组织，且保留甲根部；
在本实施例中，选取截指患者(性别不限，患者年龄最好不要超过55岁)；在无菌条件下，止血钳拔出指(趾)甲，将甲床与周边表皮分隔开，仔细剥离甲床与末节指(趾)骨之间的连接，取下患者的甲床组织，且保留甲根部。
步骤2)，通过震荡处理去除细胞：将步骤1)获取的甲床组织放置于100ml容器内，再加入振荡液体，使甲床组织浸泡于振荡液体中，再放到摇床振荡器上进行振荡，振荡的速度为128转/分钟；在振荡的过程中，振荡液体有进行换液，具体来说，将甲床组织依次浸泡于肝素PBS溶液中振荡1小时、1％的Triton X-100溶液中振荡4小时、PBS溶液中振荡1小时、0.8％SDS溶液中振荡4小时、含有三种抗体的PBS溶液中振荡4小时；
其中，所述肝素PBS溶液是指肝素浓度为1000U/L的PBS溶液，所述含有三种抗体的PBS溶液是指含有100U/L青霉素、0.1mg/ml链霉素以及0.1mg/ml两性霉素B的PBS溶液；
步骤3)干燥处理：将步骤2)获得的去细胞甲床置于真空冷冻干燥机内进行真空干燥处理至少6小时，再通过60Co-γ射线灭菌处理(采用的是上海市第六人民医院放射科的γ射线辐照装置)至少2小时，其中60Co-γ射线的辐射强度为12Krad。
实施例1制备获得的去细胞甲床的肉眼观照片参见图1，从图1中可以看出实施例1制备获得的去细胞甲床外观呈瓷白色。
将实施例1制备获得的去细胞甲床制作石蜡切片，将去细胞甲床依次进行福尔马林溶液固定-梯度酒精脱水硬化-二甲苯透明-石蜡浸透等过程，制成石蜡切片，使用切片机制成5微米厚的组织切片。
然后将石蜡切片进行进行苏木精-伊红(H&E)染色。染色过程大致如下：取干燥的切片，置于二甲苯缸内脱蜡10分钟，梯度酒精复水，蒸馏水洗去酒精，苏木素染液15分钟，盐酸分色30秒，伊红溶液染色3分钟，二甲苯透明，最后用中性树脂进行封片，并在光学显微镜下观察该封片结构，参见图2，可以看出封片中红色部分为细胞外基质部分，并未见蓝色的细胞核结构。
然后将石蜡切片进行Masson三色染色。染色过程大致如下：将石蜡切片常规脱蜡至水，天青石蓝染色10分钟，蒸馏水洗去，Masson甲染液染色10分钟，蒸馏水洗去，Masson乙染液染色1分钟，蒸馏水洗去，Masson丙染液染色2分钟，蒸馏水洗去，常规脱水封片，并在光学显微镜下观察封片结构，参见图3，可以看出组织内胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。
然后将石蜡切片进行PAS染色。染色过程大致如下：将石蜡切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗，过碘酸酒精液染色10分钟，自来水冲洗10分钟，Schiff氏液染色10分钟，流水冲洗5分钟，苏木精染核3分钟，流水冲洗5分钟，常规脱水、透明、封片，并在光学显微镜下观察封片结构，参见图4，其中粉红色的部分为多糖成分。
然后将石蜡切片进行免疫荧光染色。染色过程大致如下：将石蜡切片进行二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，PBS洗两次，枸橼酸钠缓冲液抗原修复，PBS洗5分钟，5％胎牛血清室温封闭30分钟，一抗(采用collagen IV或者MHC-I)4℃孵育过夜，次日37℃复温45分钟，PBS洗3次，荧光二抗室温避光孵育2小时，PBS洗3次，Hoechst染核，PBS洗3次，封片，并在光学显微镜下观察封片结构。参见图5，为采用collagen IV作为一抗的荧光染色结果，绿色为阳性结构；参见图6，为采用MHC-I作为一抗的荧光染色结果，未见阳性结果。
综合以上图1至图6的结果，图1观察到的实施例1制备的去细胞甲床外观呈瓷白色；图2中观察到去细胞甲床内细胞已被去除，结构蛋白未断裂；图3中观察到去细胞甲床内胶原蛋白保留完好，且未见明显断裂；图4中观察到去细胞甲床内多糖成分保留；图5中观察到去细胞甲床内IV型胶原蛋白保留完好，未见明显断裂；图6中观察到去细胞甲床内MHC-I被去除，这说明去细胞甲床已无免疫原性。
实施例2
组织工程化甲床的构建方法，该构建方法至少包括以下依次进行的步骤：
步骤a)灭菌处理：将上述实施例1得到的去细胞甲床浸泡于青链霉素双抗溶液中进行灭菌处理至少12小时，然后再用PBS溶液清洗所述青链霉素双抗溶液；其中，所述青链霉素双抗溶液中含有100U/L青霉素和0.1mg/ml链霉素；
步骤b)去细胞甲床的孵育：将步骤a)处理后获得的去细胞甲床置于含有10％胎牛血清的DMEM低糖培养基中孵育至少2小时；
关于含有10％胎牛血清的DMEM低糖培养基的配制，其中DMEM低糖培养基是购自Gibco公司，21885-108产品型号；将胎牛血清以1：10的体积比加入DMEM低糖培养基中，配制完全培养基。
步骤c)接种：将甲床干细胞按2×106个/平方厘米的密度接种到步骤b)获得的去细胞甲床上；
步骤d)甲床干细胞的培养：在37℃、5％CO2的环境下，在所述含有10％胎牛血清的DMEM低糖培养基的存在下培养至少7天，隔天换液，获得组织工程化甲床。
实施例2的组织工程化甲床体外构建成功后，对其进行免疫荧光染色。染色过程如下：吸去培养皿中的培养基，PBS洗3次，多聚甲醛固定10分钟，PBS洗3次，5％胎牛血清室温封闭30分钟，“一抗”采用IV型胶原蛋白(Col IV)与角蛋白14(CK14)的组合，或者角蛋白(Pan Keratin)与波形蛋白(vimentin的组合)，4℃过夜孵育，次日37℃复温45分钟，PBS洗3次，荧光二抗室温避光孵育2小时，PBS洗3次，Hoechst染核，PBS洗3次，吸去溶液，荧光显微镜下观察。图8为采用Col IV与CK14为一抗的染色结果，其中绿色部分是Col IV，红色部分是CK14；图9为采用Pan Keratin与vimentin为一抗的染色结果，其中绿色部分是vimentin，红色部分是Pankeratin。
将实施例2获得的组织工程化甲床移植到1月龄裸鼠背部，加压固定1周，移植后2月再取材制作石蜡切片(依次进行福尔马林溶液固定-梯度酒精脱水硬化-二甲苯透明-石蜡浸透等过程，制成石蜡切片，使用切片机制成5微米厚的组织切片。)。
再将石蜡切片进行H&E染色，染色过程如下：取干燥的切片，置于二甲苯缸内脱蜡10分钟，梯度酒精复水，蒸馏水洗去酒精，苏木素染液15分钟，盐酸分色30秒，伊红溶液染色3分钟，二甲苯透明，最后用中性树脂进行封片，并在光学显微镜下观察该封片结构，参见图10，切片中红色部分为细胞外基质部分，蓝色颗粒为细胞核结构。
再将石蜡切片进行免疫荧光染色，染色过程如下：将石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，PBS洗两次，枸橼酸钠缓冲液抗原修复，PBS洗5分钟，5％胎牛血清室温封闭30分钟，一抗(Col IV或者Pan Keratin)4℃孵育过夜，次日37℃复温45分钟，PBS洗3次，荧光二抗室温避光孵育2小时，PBS洗3次，Hoechst染核，PBS洗3次，封片，参见图11为以Pan keratin为一抗的染色结果，其中红色部分为Pan keratin，图12为以Col IV为一抗的染色结果，其中红色部分为Col IV。
综合以上图7至图11的结果，其中，体外构建组织工程化甲床中观察到接种的甲床细胞能够以去细胞甲床为基质，在其上增殖、粘附，并且表达Pan keratin(参见图8中红色部分)和CK14(参见图7中红色)。将该组织工程化甲床移植入裸鼠背部修复皮肤缺损(参见图9)，2月后观察到组织工程化甲床移植区Pan keratin蛋白持续表达(参见图10)，IV型胶原蛋白结构仍有保留，降解较慢(参见图11)。以上说明该组织工程化甲床具有良好的组织相容性，且具有较强的成指甲特性，能够作为甲床修复的替代物。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种去细胞甲床的制备方法，其特征在于，该制备方法至少包括以下依次进行的步骤：
步骤1)，取甲床组织：在无菌条件下获取患者的甲床组织，且保留甲床根部；
步骤2)，通过震荡处理去除细胞：将步骤1)获取的甲床组织放置于摇床振荡器上进行振荡，并且将甲床组织依次浸泡于肝素PBS溶液中振荡40分钟～1.5小时、1％的Triton X-100溶液中振荡3.5小时～4.5小时、PBS溶液中振荡40分钟～1.5小时、0.8％SDS溶液中振荡3.5小时～4.5小时、含有三种抗体的PBS溶液中振荡3.5小时～4.5小时获得去细胞甲床；其中，所述肝素PBS溶液是指肝素浓度为800～1200U/L的PBS溶液，所述含有三种抗体的PBS溶液是指含有80～120U/L青霉素、0.08～0.12mg/ml链霉素以及0.08～0.12mg/ml两性霉素B的PBS溶液；其中，振荡的速度为100～150转/分钟；
步骤3)干燥处理：将步骤2)获得的去细胞甲床真空干燥处理至少6小时，再通过60Co-γ射线灭菌处理至少2小时，其中60Co-γ射线的辐射强度为10～15Krad。
2.如权利要求1所述的去细胞甲床的制备方法，其特征在于：
在所述步骤3)中，将所述灭菌处理完成后得到的去细胞甲床密封保存于-80摄氏度环境中。
3.如权利要求1或2所述的去细胞甲床的制备方法，其特征在于：
在所述步骤2)中，所述肝素PBS溶液是指肝素浓度为1000U/L的PBS溶液，所述含有三种抗体的PBS溶液是指含有100U/L青霉素、0.1mg/ml链霉素以及0.1mg/ml两性霉素B的PBS溶液。
4.如权利要求3所述的去细胞甲床的制备方法，其特征在于：
在所述步骤2)中，将甲床组织依次浸泡于肝素PBS溶液中振荡1小时、1％的Triton X-100溶液中振荡4小时、PBS溶液中振荡1小时、0.8％SDS溶液中振荡4小时、含有三种抗体的PBS溶液中振荡4小时获得去细胞甲床；其中，振荡的速度为128转/分钟。
5.一种组织工程化甲床的构建方法，其特征在于：该构建方法至少包括以下依次进行的步骤：
步骤a)灭菌处理：将所述权利要求1或2得到的去细胞甲床浸泡于青链霉素双抗溶液中进行灭菌处理至少12小时，然后再用PBS溶液清洗所述青链霉素双抗溶液；其中，所述青链霉素双抗溶液中含有80-120U/L青霉素和0.08-0.12mg/ml链霉素；
步骤b)去细胞甲床的孵育：将步骤a)处理后获得的去细胞甲床置于含有10％(体积比)胎牛血清的DMEM低糖培养基中孵育至少2小时；
步骤c)接种：将甲床干细胞按1.5×106～2.5×106个/平方厘米的密度接种到步骤b)获得的去细胞甲床上；
步骤d)甲床干细胞的培养：在37℃、5％CO2的环境下，在所述含有10％胎牛血清的DMEM低糖培养基的存在下培养至少7天，隔天换液，获得所述组织工程化甲床。
6.如权利要求5所述的组织工程化甲床的构建方法，其特征在于：
在所述的步骤c)中，将甲床干细胞按照2×106个/平方厘米的密度接种到步骤b)获得的去细胞甲床上。
7.如权利要求5所述的组织工程化甲床的构建方法，其特征在于：
在所述去细胞甲床的制备方法的步骤2)中，所述肝素PBS溶液是指肝素浓度为1000U/L的PBS溶液，所述含有三种抗体的PBS溶液是指含有100U/L青霉素、0.1mg/ml链霉素以及0.1mg/ml两性霉素B的PBS溶液。
8.如权利要求7所述的组织工程化甲床的构建方法，其特征在于：
在所述去细胞甲床的制备方法的步骤2)中，将甲床组织依次浸泡于肝素PBS溶液中振荡1小时、1％的Triton X-100溶液中振荡4小时、PBS溶液中振荡1小时、0.8％SDS溶液中振荡4小时、含有三种抗体的PBS溶液中振荡4小时获得去细胞甲床；其中，振荡的速度为128转/分钟。
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