CN104769101A - 组织产生方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了体外或离体产生组织和器官的方法，包括将细胞和胞外基质沉积到表面上，以及使用这些组织和器官的方法。在一个实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法使用的细胞和ECM作为相同组合物的一部分进行沉积。在另一实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法使用的细胞和ECM作为不同组合物的一部分进行沉积。

Description

组织产生方法
本申请要求2012年9月4日提交的美国临时专利申请No.61/696,479的优先权，其在此全文引入作为参考。
1.介绍
本文提供了在体外或离体产生组织和器官的方法，包括将细胞和/或胞外基质沉积至一个表面，以及使用该组织和器官的方法。
2.背景
生物打印(例如，器官打印)是一种涉及沉积生物材料的打印设备(例如改造的喷墨打印机)的研究和工程领域。该技术涉及快速产生和释放包含细胞的液滴并随后将其准确地沉积至一个表面。通过生物打印的方式使用基础细胞材料工程化的组织和器官代表了对目前在标准移植手段中使用的捐献者来源的组织和器官的一种有前景的替代。
3.概述
在一个方面，本文提供了一种用于产生组织(例如，三维组织)或器官的方法，包括在体外或离体将细胞和/或胞外基质(ECM)沉积至表面，从而形成所述组织。按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法可使用的细胞描述于下文第4.1.1节。按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法可工程化的组织和器官描述于下文第4.1.2节。按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法可使用的ECM描述于下文第4.1.3节。按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面描述于下文第4.1.4节。
在一个实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法使用的细胞和ECM作为相同组合物的一部分进行沉积。在另一实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法使用的细胞和ECM作为不同组合物的一部分进行沉积。在一个具体实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法使用的ECM包括可流动的ECM。在另一个具体实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法使用的细胞和ECM作为不同组合物的部分进行沉积，例如，其中ECM的沉积与细胞的沉积分开，例如，在细胞沉积前沉积，和/或其中ECM在细胞沉积前脱水。在其中ECM脱水的实施方式中，其可以随后在希望的时间再水化，例如，在细胞被沉积到已经沉积了ECM和细胞的表面上的时候。
在某些实施方式中，用于在体内形成本文描述的三维组织的细胞和ECM与沉积一种或多种额外的组分(例如，生长因子、交联剂、可聚合单体、聚合物、水凝胶，等等)同时、在其之前或之后沉积至表面。在某些实施方式中，所述细胞和ECM所沉积于其上的表面是已经被按照本文描述的方法生物打印了的表面。
在某些实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法使用的细胞和可流动的ECM(以及额外的组分)被打印至所述表面，例如，细胞和ECM被生物打印。在某些实施方式中，所述细胞和ECM被生物打印于其上的表面是已经被按照本文描述的方法生物打印了的表面。
在某些实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法使用的细胞和/或可流动的ECM(以及额外的组分)不被打印至所述表面，例如，细胞和ECM不被生物打印，而是通过一种不包括生物打印的方法被应用至所述表面。在某些实施方式中，不被生物打印至表面的细胞和/或可流动的ECM(以及额外的组分)被应用于已经被生物打印了的表面，例如，细胞和/或可流动的ECM(以及额外的组分)被应用于支架，例如，合成支架，例如合成基质。在一个具体实施方式中，细胞和/或可流动的ECM(以及额外的组分)被应用于支架(例如，表面)的仅仅一部分，例如，一个面。在另一个具体实施方式中，细胞和/或可流动的ECM(以及额外的组分)被应用于支架的所有面，即，整个支架都有应用的细胞和/或可流动的ECM。在另一个具体实施方式中，支架为聚已酸内酯(PCL)。
在某些实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面包含人工表面，即，人工制备的表面。在另一个具体实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面包含从受试者(例如，人类受试者)中去除的组织或器官(或其部分)。在某些实施方式中，所述从受试者中去除的组织或器官的表面可被去细胞化，例如，经处理以从该组织或器官表面的全部或部分去除细胞。在某些实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面是二维的。在某些实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面是三维的。在一个具体实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面是已被生物打印的表面，例如，被按照本文描述的方法生物打印的。在一个具体实施方式中，所述表面是聚已酸内酯(PCL)。
在另一方面，本文提供了使用本文描述的方法产生的组织和器官，以及使用该组织和器官的方法。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法工程化的组织(例如，三维组织)和器官被用于移植过程，包括皮肤移植和手术移植过程。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法工程化的组织(例如，三维组织)和器官被用于实验过程，例如，以评价药物或化合物对所述组织或器官的效果。
在另一方面，本文提供了包含细胞和ECM(例如，可流动的ECM)的组合物，其中所述组合物适合用于本文描述的方法中。本文还提供了试剂盒，其在一个或多个容器中包含所述组合物，以及按照本文描述的一种或多种方法使用所述组合物的说明书。
3.1附图简述
图1描述了包含聚已酸内酯(PCL)的支架，其以不同角度并以产生多种孔径的支架的方式进行生物打印。
图2描述了多视图的生物打印支架，胞外基质(ECM)在其上被应用至支架两面并随后脱水。
图3描述了细胞增殖分析的结果。在包含生物打印的PCL和脱水的ECM的杂合支架上培养的胎盘干细胞在8天的培养周期内增殖。
图4描述了细胞活力分析的结果。在包含生物打印的PCL和脱水的ECM的杂合支架上培养的胎盘干细胞在8天的培养周期内增殖并保持存活。
图5描述了完整的包含PCL、ECM和胎盘干细胞的三维杂合支架，其各自生物打印为各层(PCL的层和ECM/细胞的层)。
图6显示了胎盘干细胞在经过7天的培养周期后贯穿三维的生物打印支架分布。
图7描述了细胞活力分析的结果。用ECM和PCL生物打印形成三维杂合支架的胎盘干细胞在7天的培养周期内增殖并保持存活。
图8显示了用ECM和PCL生物打印形成三维杂合支架的干细胞在7天的培养周期内贯穿杂合支架中的ECM分布。
图9描述了细胞增殖分析的结果。在通过生物打印PCL、ECM和胎盘干细胞产生的三维杂合支架中培养的胎盘干细胞在7天的培养周期内增殖。
图10描述了一种包含PCL、胎盘ECM和产胰岛素细胞(β-TC-6细胞)的生物打印的支架。
图11描述了细胞增殖分析的结果。在包含PCL、胎盘ECM和产胰岛素细胞(β-TC-6细胞)的生物打印的支架中产胰岛素细胞的数量在14天的培养周期内保持稳定。
图12描述了包含PCL、胎盘ECM和产胰岛素细胞(β-TC-6细胞)的生物打印的支架的胰岛素产生水平。
图13描述了在暴露于葡萄糖挑战(glucose challenge)(A)或对照条件(B、C)下后，包含PCL、胎盘ECM和产胰岛素细胞(β-TC-6细胞)的生物打印的支架的胰岛素产生水平。
4.详述
在一个方面，本文提供了一种用于产生组织(例如，三维组织)或器官的方法，包括在体外或离体将细胞和胞外基质(ECM)沉积至表面从而形成所述组织。按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法可使用的细胞描述于下文第4.1.1节。按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法可工程化的组织和器官描述于下文第4.1.2节。按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法可使用的ECM描述于下文第4.1.3节。按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面描述于下文第4.1.4节。
在一个具体实施方式中，本文提供了一种用于产生组织(例如，三维组织)或器官的方法，包括在体外或离体将细胞和ECM沉积至表面从而形成所述组织或器官。
在另一个具体实施方式中，本文提供了一种用于产生组织(例如，三维组织)或器官的方法，包括在体外或离体将细胞和ECM沉积至表面从而形成所述组织或器官，其中所述ECM包括可流动的ECM，且其中所述细胞和所述可流动的ECM被配制为相同组合物的一部分。在一个具体实施方式中，所述细胞和所述ECM使用生物打印机进行沉积。在另一个具体实施方式中，所述细胞包含单一细胞类型。在另一个具体实施方式中，所述细胞包含多于一种细胞类型。
在另一个具体实施方式中，本文提供了一种用于产生组织(例如，三维组织)或器官的方法，包括在体外或离体将细胞和ECM沉积至表面从而形成所述组织或器官，其中所述ECM包括可流动的ECM，和其中所述细胞和所述可流动的ECM被配制为部分分离的组分。在一个具体实施方式中，所述细胞和所述ECM使用生物打印机进行沉积。在另一个具体实施方式中，所述细胞包含单一细胞类型。在另一个具体实施方式中，所述细胞包含多于一种细胞类型。
在另一个具体实施方式中，本文提供了一种用于产生组织(例如，三维组织)或器官的方法，包括在体外或离体将细胞和ECM沉积至表面从而形成所述组织或器官，其中所述ECM包括可流动的ECM，和其中所述细胞和所述可流动的ECM被配制为部分分离的组分。在一个具体实施方式中，所述细胞和所述ECM使用生物打印机进行沉积。在另一个具体实施方式中，所述细胞包含单一细胞类型。在另一个具体实施方式中，所述细胞包含多于一种细胞类型。
在另一个具体实施方式中，本文提供了一种用于产生组织(例如，三维组织)或器官的方法，包括在体外或离体将细胞、ECM和一种或多种额外的组分沉积至表面从而形成所述组织或器官。
在另一个具体实施方式中，本文提供了一种用于产生组织(例如，三维组织)或器官的方法，包括在体外或离体将细胞、ECM和一种或多种额外的组分沉积至表面从而形成所述组织或器官。在一个具体实施方式中，所述细胞、所述ECM、和所述一种或多种额外的组分使用生物打印机进行沉积。在另一个具体实施方式中，所述细胞包含单一细胞类型。在另一个具体实施方式中，所述细胞包含多于一种细胞类型。在另一个具体实施方式中，所述细胞、所述ECM和所述一种或多种额外的组分被配制为相同组合物的一部分。在另一个具体实施方式中，所述细胞、所述ECM和所述一种或多种额外的组分被配制为部分分离的组分。在另一个具体实施方式中，所述一种或多种额外的组分是生长因子、可聚合的单体、交联剂、聚合物或水凝胶。
在某些实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面包含人工表面，即，人造的表面。在另一个具体实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面包含从受试者(例如，人类受试者)中移除的组织或器官(或其部分)。在某些实施方式中，所述从受试者中移除的组织或器官的表面可被脱细胞化，例如，进行处理以从组织或器官的全部或部分表面去除细胞。在某些实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面是二维的。在某些实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面是三维的。在一个具体实施方式中，按照用于产生本文描述的组织(例如，三维组织)和器官的方法的细胞、ECM和/或额外的组分所可沉积的表面是被生物打印的表面，例如，按照本文描述的方法生物打印的。在一个具体实施方式中，该表面包含合成材料，例如，合成聚合物。在另一个具体实施方式中，该合成聚合物是PCL。
在某些实施方式中，细胞和ECM(例如，可流动的ECM)不同时打印，而是按层打印。在一个具体实施方式中，将细胞层打印到表面，然后打印ECM层。在另一个具体实施方式中，将ECM层打印到表面，然后打印细胞层。在某些实施方式中，可将多个ECM层打印到表面，然后打印多个细胞层，反之亦然。类似的，与细胞和/或ECM的打印同时、在其之前或之后打印的额外的组分可以按照本文描述的方法在细胞和ECM之间成层。
在某些实施方式中，打印细胞和ECM(例如，可流动的ECM)，从而被打印在其上的表面被细胞和ECM二者完全覆盖。在其它实施方式中，打印细胞和ECM(例如，可流动的ECM)，从而被打印在其上的表面被细胞和ECM二者部分覆盖。
在某些实施方式中，打印细胞和ECM(例如，可流动的ECM)，从而被打印在其上的表面在特定的、期望的区域被细胞覆盖；和在特定的、期望的区域被ECM覆盖，其中这些特定区域可重叠或不重叠。
在某些实施方式中，细胞和ECM(例如，可流动的ECM)可三维打印至表面。如本文使用的“三维打印”指生物打印机的打印头在三维表面下方、上方和周围移动的打印过程，例如，打印头被机械控制从而沿着特定轨迹转动。如本文使用的三维打印不同于本领域已知的标准生物打印方法，后者中通过开始在一个平的/平面的/二维的表面上建立组织来进行打印。
在一个实施方式中，ECM在体外或离体被打印至表面(例如，假体或骨)，随后使用标准细胞培养方法将细胞接种到所述包含ECM的表面上。然后该表面可被移植入受试者。在另一实施方式中，ECM在体外或离体被打印至表面(例如，假体或骨)，随后将所述包含ECM的表面移植入受试者，其中受试者的细胞附着和/或生长在所述表面上。
在一个具体实施方式中，本文提供了一种用于产生组织的方法，包括在体外或离体将细胞和ECM沉积至表面从而形成所述组织，其中所述表面包含具有内表面和外表面的骨，且其中包含第一细胞类型的第一细胞组分被打印至所述内表面上，包含第二细胞类型的第二细胞组分被打印至所述外表面上。如本文使用的，骨的“内表面”表示骨的要置于基质和肌肉组织对面的一面，骨的“外表面”表示骨的要被暴露在受试者身体外部的一面。按照该实施方式，内表面可被例如基质细胞、脂肪组织、间质干细胞、肌细胞或类似组合部分或全部覆盖，外表面可被例如真皮细胞部分或全部覆盖。在一个具体实施方式中，所述方法另外包括另一种额外的组分(例如，交联剂)的沉积。在另一个具体实施方式中，所述打印以三维方式进行。
在一个具体实施方式中，本文提供了一种用于产生肝脏的方法，包括在体外或离体将细胞和ECM沉积至表面从而形成所述肝脏，其中所述表面包含肝脏组织。在一个具体实施方式中，肝脏组织从将要移植所产生的肝脏的受试者获得。在另一个具体实施方式中，肝脏组织不从将要移植所产生的肝脏的受试者获得(例如，肝脏组织从活体或遗体供者获得)。在另一个具体实施方式中，所述沉积的细胞是肝脏细胞(例如，肝细胞)。在一个具体实施方式中，所述另外包括另一种额外的组分(例如，交联剂)的沉积。在另一个具体实施方式中，所述打印以三维方式进行。
在一个具体实施方式中，本文提供了一种用于产生皮肤的方法，包括在体外或离体将细胞和ECM沉积至表面从而形成所述皮肤，其中所述表面包含皮肤组织。在一个具体实施方式中，皮肤组织从将要移植所产生的皮肤的受试者获得。在另一个具体实施方式中，皮肤组织不从将要移植所产生的皮肤的受试者获得(例如，皮肤组织从活体或遗体供者获得)。在另一个具体实施方式中，所述沉积的细胞是皮肤细胞(例如，表皮细胞)。在一个具体实施方式中，所述另外包括另一种额外的组分(例如，交联剂)的沉积。在另一个具体实施方式中，所述打印以三维方式进行。
4.1生物打印
如本文使用的“生物打印”一般指使用标准或改进的打印技术，例如喷墨打印技术的活细胞以及其它成分(例如，可流动的ECM；合成基质)在表面上的沉积。将细胞沉积至表面和生物打印细胞(包括细胞与水凝胶的组合)的基本方法描述于Warren等人US 6,986,739，Boland等人US 7,051,654，Yoo等人US 2009/0208466和Xu等人US 2009/0208577，其各自公开内容在此全文引入作为参考。此外，适用于产生本文提供的组织和器官的生物打印机是商业可获得的，例如，Envisiontec GmbH(Gladbeck，Germany)的3D-BioplotterTM；和Organovo(San Diego，CA)的NovoGen MMX Bio打印机TM。
本文描述的方法中所用的生物打印机可包括通过对例如打印机驱动软件和/或打印机物理结构的改进使得能够控制温度、湿度、剪切力、打印速度和/或发射频率的原理和/或软件。在某些实施方式中，生物打印机软件和/或硬件优选的可被构建和/或设定为在打印过程中维持细胞温度约37℃。
在某些实施方式中，喷墨打印设备可包括二维或三维打印机。在某些实施方式中，生物打印机包含DC螺线管喷墨阀、用于容纳一种或多种细胞类型(例如，在可流动的组合物中的细胞)的一个或多个容器和/或在打印前例如连接至喷墨阀的ECM(例如，可流动的ECM)。生物打印机可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多容器，例如，每个容器针对每种细胞类型或每种用于构建本文描述的组织和器官的ECM。细胞可以通过气压、机械压或通过其他方式从容器运送至喷墨阀。通常，所述生物打印机，例如，生物打印机中的打印头，是计算机控制的，从而一种或多种细胞类型和所述ECM以一种预设的模式沉积。所述预设模式可以是在所述细胞来源或从中获得的器官或组织中再创造(recreate)或重构(recapitulate)所述一种或多种细胞类型的天然排列的模式，或不同于所述一种或多种细胞类型的天然排列的模式。
在某些实施方式中，本文提供的方法中所用的生物打印机可以是热气泡喷墨打印机，参见，例如，Niklasen等人US 6,537,567，或压电晶体振动打印头，例如，使用频率高达30kHz和电源范围12-100瓦特。在一些实施方式中，生物打印机打印头喷嘴每个独立的为直径0.05-200微米，或直径0.5-100微米，或直径10-70微米，或直径20-60微米。在进一步的实施方式中，喷嘴各自独立的为直径约40或50微米。可以使用具有相同或不同直径的多个喷嘴。在一些实施方式中，喷嘴具有圆形开口；在其它实施方式中，可使用其它合适的形状，例如，椭圆形、方形、长方形，等等，而不会偏离本发明的精神。
在某些实施方式中，可使用软件(例如，计算机辅助设计(CAD)软件程序)构建要生物打印的组织或器官的解剖学图像。按照这些实施方式，可以产生允许在三维表面上进行三维打印的程序，所述三维表面代表待打印的组织或器官的结构。例如，如果希望打印骨，可构建骨的解剖学图像并产生程序，其引导生物打印机的打印机头在打印过程中绕着三维的骨表面旋转。
在某些实施方式中，本文提供的生物打印方法包括将个体细胞液滴(例如，包含单一细胞的组合物或包含多个细胞的组合物)和可流动的胞外基质(ECM)输送/沉积至表面。
在某些实施方式中，本文提供的生物打印方法包括单一细胞类型和可流动的ECM在表面的沉积。根据该方法可使用的示例性细胞类型在下文4.1.1节提供。ECM，包括可流动的ECM，在下文4.1.3节提供。
在其它实施方式中，本文提供的生物打印方法包括多种(例如，2、3、4、5或更多)细胞类型和可流动的ECM在表面的沉积。在一个具体实施方式中，多种细胞类型作为相同组合物的一部分进行沉积，即，细胞的来源是包含多种细胞类型的单一组合物。在另一个具体实施方式中，多种细胞类型作为不同组合物的一部分进行沉积，即，细胞的来源是包含多种细胞类型的不同组合物。在另一个具体实施方式中，一部分多种细胞类型作为一种组合物的一部分沉积(例如，两种或多种细胞类型在在单一组合物中)，另一部分细胞多种类型作为不同组合物沉积(例如，一种或多种细胞类型在单一组合物中)。根据该方法可使用的示例性细胞类型在下文4.1.2节提供。
在一个具体实施方式中，待沉积的细胞和可流动的ECM作为相同组合物的部分一起在表面沉积(例如，同时)。在另一个具体实施方式中，待沉积的细胞和可流动的ECM作为不同组合物的部分一起在表面沉积。在另一个具体实施方式中，待沉积的细胞和可流动的ECM分别沉积在表面(例如，在不同时间)。
在某些实施方式中，细胞和可流动的ECM与一种或多种额外的组分一起沉积。在一个实施方式中，一种或多种额外的组分配制在相同组合物中作为细胞。在另一实施方式中，一种或多种额外的组分配制在相同组合物中作为ECM。在另一实施方式中，一种或多种额外的组分配制在相同组合物中作为细胞和ECM(即，单一组合物包含细胞、可流动的ECM和一种或多种额外的组分)。在另一实施方式中，一种或多种额外的组分配制在与包含细胞和/或ECM的组合物分离的组合物中，并与细胞和/或ECM在表面的沉积同时、在其之前或之后沉积。在一个具体实施方式中，一种或多种额外的组分促进细胞的存活、分化、增殖等。在另一个具体实施方式中，一种或多种额外的组分包含交联剂(参见4.1.3.2节)。在另一个具体实施方式中，一种或多种额外的组分包含水凝胶。在另一个具体实施方式中，一种或多种额外的组分包含合成聚合物。
本领域技术人员将认可，细胞和可流动的ECM、以及按照本文描述的方法所用的任意额外的组分，可以从分开的打印机喷嘴打印，或在共同组合物中通过同一打印机喷嘴打印，这取决于所形成的具体组织或器官。本领域技术人员还将认可，打印可以是同时的或顺序的，或其任意组合，且一些组分(例如，细胞、可流动的ECM或交联剂)可以以第一模式的形式打印，一些组分可以以第二模式的形式打印，等等。打印的具体组合和模式将取决于被打印的具体组织或器官。
在某些实施方式中，细胞、ECM和/或任何其它材料(例如，合成基质，例如，PCL)可以以一种特定模式被生物打印，以产生期望的效果。例如，生物打印的材料(例如，细胞、ECM、基质和本文描述的其它组分)可被生物打印或否则以不同角度按层沉积，从而产生具体的期望模式，例如具有具体孔径的三维结构。在一个具体实施方式中，生物打印的材料(例如，细胞、ECM、基质和本文描述的其它组分)被打印或否则以十字交叉方式沉积，以产生呈现为盒状的具有期望尺寸的孔的生物打印结构。在另一个具体实施方式中，生物打印的材料(例如，细胞、ECM、基质和本文描述的其它组分)被打印或否则按角度沉积，以产生呈现三角形或钻石形的期望尺寸的孔。例如，生物打印的材料(例如，细胞、ECM、基质和本文描述的其它组分)被打印或否则按特定角度沉积，例如，30度角、45度角、60度角，以产生期望的模式。根据这些方法，可以产生具有理想品质的结构，例如，培养细胞生长和增殖的能力。参见下述实施例1。在一个具体实施方式中，基质，例如，合成基质，被以有利于支撑细胞在所述生物打印的基质上生长和增殖的特定模式生物打印。在具体实施方式中，合成基质为PCL。
4.1.1细胞
按照本文描述的方法可以使用任何本领域已知的细胞类型，包括真核细胞。
按照本文描述的方法使用的细胞可以是同基因的(即，与接受者对象的细胞在基因上相同或紧密相关，从而使得组织移植排斥最小化)、同种异体的(即，来自与接受者对象同一物种的非基因相同成员)或异种的(即，来自与接受者对象不同物种的成员)。同基因的细胞包括那些自体的(即，来自接受者对象)和同系的(即，来自基因相同但不同的对象，例如，来自相同的双胞胎)。细胞可获得自，例如，捐献者(活体或遗体)或来自建立的细胞株或细胞系。例如，可以使用本领域已知的标准活体组织切片技术从捐献者(例如，潜在的接受者)收集细胞。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞包含于可流动的生理可接受的组合物中，例如，水、缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，等等)、液体培养基(例如，0.9N盐溶液、Kreb溶液、改进的Kreb溶液、Eagle培养基、改进的Eagle培养基(MEM)、Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)、Hank平衡盐，等等)，等等。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞可包含使用本领域已知的蛋白酶(例如，胶原酶、分散酶、胰蛋白酶、释放酶等等)从组织或器官中分离的初级细胞。器官组织可以在用蛋白酶进行组织处理之前、期间或之后进行物理分散，例如，通过切碎、浸渍、过滤，等等。在本文描述的方法中使用细胞前，所述细胞可以使用标准的、本领域已知的细胞培养技术进行培养，例如，以产生均质或基本上均质的细胞群，以选择特定细胞类型，等等。
在一个实施方式中，本文描述的方法中使用的细胞类型包括干细胞。按照本文描述的方法可使用的干细胞的非限制性列表包括：胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多功能干细胞、间充质干细胞、骨髓间充质干细胞(BM-MSC)、组织塑料吸附胎盘干细胞(PDAC)、脐带干细胞、羊水干细胞、羊膜来源的贴壁细胞(AMDAC)、成骨胎盘附着细胞(OPAC)、脂肪干细胞、缘干细胞、牙髓干细胞、成肌细胞、内皮祖细胞、神经干细胞、脱落的牙齿来源的干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、孤雌生殖来源的干细胞、重编程干细胞、羊膜来源的贴壁细胞或侧群干细胞。
在一个具体实施方式中，本文描述的方法包括使用胎盘干细胞(例如，US 7,468,276和US 8,057,788中描述的胎盘干细胞)。在另一个具体实施方式中，所述胎盘干细胞是在一个实施方式中，所述PDAC是CD34–、CD10+、CD105+和CD200+。在另一实施方式中，所述PDAC是CD34–、CD10+、CD105+和CD200+以及另外是CD45–、CD80–、CD86–和/或CD90+。
在另一个具体实施方式中，本文描述的方法包括使用AMDAC(例如，国际申请公开号WO10/059828中描述的AMDAC)。在一个实施方式中，所述AMDAC是Oct4-。在另一实施方式中，所述AMDAC是CD49f+。在另一实施方式中，所述AMDAC是Oct4-和CD49f+。
在另一个具体实施方式中，本文描述的方法包括使用PDAC和AMDAC。
在另一个具体实施方式中，本文描述的方法包括使用BM-MSC。
在另一实施方式中，本文描述的方法中所用的细胞类型包括分化的细胞。在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法的分化细胞包括内皮细胞、上皮细胞、真皮细胞、内胚层细胞、中胚层细胞、成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、肝细胞、胰腺细胞和/或基质细胞。在另一个具体实施方式中，细胞是产胰岛素细胞，例如，胰腺细胞(例如，胰岛细胞)或产胰岛素细胞系，例如，β-TC-6细胞。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法使用的分化细胞包括唾液粘液腺细胞、唾液浆液腺细胞、von Ebner腺细胞、乳腺细胞、泪腺细胞、聍腺细胞、外分泌汗腺暗细胞、外分泌汗腺清除细胞、顶泌汗腺细胞、Moll腺细胞、皮脂腺细胞、bowman腺细胞、Brunner腺细胞、精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细胞、Bartholin腺细胞、Littre腺细胞、子宫内膜细胞、分离的杯状细胞、胃粘膜粘液细胞、胃腺体酵母质细胞、腺胃泌酸细胞、胰腺腺泡细胞、潘氏细胞、II型肺泡细胞和/或克拉拉细胞。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法使用的分化细胞包括生长激素细胞、乳促素细胞、促甲状腺细胞、促性腺细胞、促皮质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠细胞、呼吸道细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、副甲状腺细胞、副甲状腺主细胞、嗜酸细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸间质细胞、鞘内细胞、黄体细胞、颗粒黄体细胞、鞘黄体细胞、近血管球细胞、致密斑细胞、极周细胞和/或系膜细胞。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法使用的分化细胞包括血管和淋巴管内皮窗状细胞、血管和淋巴管内皮连续细胞、血管和淋巴管内皮脾细胞、滑膜细胞、浆膜细胞(衬腹膜、胸膜和心包腔)、鳞状细胞、柱状细胞、暗细胞、前庭膜细胞(耳朵的衬内淋巴空间)、血管纹基底细胞，血管纹边缘细胞(耳朵的衬内淋巴空间)、Claudius细胞、Boettcher细胞、脉络丛细胞、软膜蛛网膜鳞片状细胞、色素睫状上皮细胞、非色素睫状上皮细胞、角膜内皮细胞、栓细胞、呼吸道纤毛细胞、输卵管纤毛细胞、子宫内膜纤毛细胞、睾丸网纤毛细胞、输出精小管纤毛细胞和/或纤毛室管膜细胞。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法使用的分化细胞包括表皮角质细胞，表皮基底细胞、手指甲和脚趾甲角质细胞、甲床基底细胞、脊髓毛干细胞、外皮毛干细胞、表皮毛干细胞、表皮毛根鞘细胞、Huxley层毛根鞘细胞、Henle层毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞、复层扁平上皮的表面上皮细胞、上皮基底细胞和/或泌尿上皮细胞。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法使用的分化细胞包括柯蒂氏器官听觉内毛细胞、柯蒂氏器官听觉外毛细胞、柯蒂氏器官内部支柱细胞、柯蒂氏器官外部支柱细胞、柯蒂氏器官内指骨细胞、柯蒂氏器官外指骨细胞、柯蒂氏器官边界细胞、柯蒂氏器官Hensen细胞、前庭器官支持细胞、味蕾支持细胞、嗅上皮支持细胞、Schwann细胞、卫星细胞、肠胶质细胞、嗅上皮基底细胞、冷敏感的初级感觉神经元、热敏初级感觉神经元、Merkel表皮细胞、嗅觉受体神经元、痛觉初级感觉神经元、光受体视杆细胞、光受体蓝色敏感圆锥细胞、光受体绿色敏感圆锥细胞、光受体红色敏感圆锥细胞、本体感受初级感觉神经元、触摸感应初级感觉神经元、I型颈动脉体细胞、II型颈动脉体细胞(血液pH传感器)、耳前庭器官I型毛细胞(加速度和重力)、耳前庭器官II型毛细胞、I型味蕾细胞、胆碱能神经细胞、肾上腺素能神经细胞和/或肽能神经细胞。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法使用的分化细胞包括星形细胞、神经原、寡树突细胞、纺锤体神经元、前晶状体上皮细胞、含晶体蛋白的晶状体纤维细胞、肝细胞、脂肪细胞、白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞、肝脂肪细胞、肾肾小球壁细胞、肾肾小球足细胞、肾近端小管刷状缘细胞、亨利氏套薄段细胞、肾远端小管细胞、肾集合管细胞、I型肺泡壁细胞、胰管细胞、无横纹管细胞、管细胞、肠刷状缘细胞、外分泌腺纹状管细胞、胆囊上皮细胞、输出精小管非纤毛细胞、附睾主细胞和/或附睾基底细胞。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法使用的分化细胞包括造釉上皮细胞、半月面上皮细胞、柯蒂氏器官牙齿之间上皮细胞、疏松结缔组织成纤维细胞、角膜基质细胞、肌腱成纤维细胞、骨髓网状组织成纤维细胞、非上皮成纤维细胞、周细胞、髓核细胞、成牙骨质细胞/牙骨质细胞、成牙质细胞、牙质细胞、透明软骨软骨细胞、纤维软骨软骨细胞、弹性软骨软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、骨先质细胞、玻璃体细胞、星状细胞(耳)、肝星状细胞(Ito细胞)、胰星状细胞、红色骨骼肌细胞、白色骨骼肌细胞、中间骨骼肌细胞、肌梭核袋细胞、肌梭核链细胞、卫星细胞、普通心肌细胞、节点心肌细胞、浦肯野纤维细胞、平滑肌细胞、虹膜肌上皮细胞和/或外分泌腺肌上皮细胞。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法使用的分化细胞包括网织红细胞、巨核细胞、单核细胞、结缔组织巨噬细胞、表皮Langerhans细胞、树突状细胞、小胶质细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、卵原细胞/卵母细胞、精子细胞、精母细胞、精原细胞、精细胞、卵巢卵泡细胞、Sertoli细胞、胸腺上皮细胞和/或间质肾细胞。
按照本文描述的方法使用的细胞可被配制在组合物中。在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞组合物被配制在仅包含单一细胞类型的组合物中，即，组合物中的细胞群是均匀的。在其它实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在包含多于一种细胞类型的组合物中，即，组合物中的细胞群是不均匀的。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在额外包含可流动的ECM(参见4.1.3节)的组合物中。可选的，所述可流动的ECM可作为按照本文描述的方法的分开的组合物的一部分与所述细胞的沉积同时、在其之前或之后进行沉积。在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在额外包含一种或多种合成单体或聚合物的组合物中。可选的，所述合成单体或聚合物可作为按照本文描述的方法的分开的组合物的一部分与所述细胞的沉积同时、在其之前或之后进行沉积。在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在额外包含可流动的ECM和一种或多种合成单体或聚合物的组合物中。在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在额外包含交联剂的组合物中。可选的，所述交联剂可作为按照本文描述的方法的分开的组合物的一部分与所述细胞的沉积同时、在其之前或之后进行沉积。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在额外包含一种或多种额外的组分(例如，促进细胞存活、分化、增殖等的组分)的组合物中。这些组分可包括但不限于，营养物、盐、糖、存活因子和生长因子。按照本文描述的方法可使用的示例性生长因子包括但不限于，胰岛素样生长因子(例如，IGF-1)、转化生长因子-β(TGF-β)、骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF)(1、2和3号)、骨桥蛋白、骨形成蛋白-2、生长激素如生长素、细胞引诱剂和附着剂等，及其混合物。可选的，所述促进细胞存活、分化、增殖等的一种或多种额外的组分可作为按照本文描述的方法的分开的组合物的一部分与所述细胞的沉积同时、在其之前或之后进行沉积。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在额外包含可聚合的单体的组合物中。按照本文描述的方法使用的细胞被配制在额外包含可聚合的单体的组合物中。可选的，所述可聚合的单体可作为按照本文描述的方法的分开的组合物的一部分与所述细胞的沉积同时、在其之前或之后进行沉积。在这些实施方式中，例如，可在生物打印前立即添加聚合催化剂，从而一旦细胞被打印，单体即聚合，形成包埋和/或物理支撑细胞的凝胶。例如，包含细胞的组合物可包含丙烯酰胺单体，其中在生物打印前立即加入TEMED和过硫酸铵或核黄素。在组合物中的细胞沉积至表面时，丙烯酰胺聚合，隔离和支撑细胞。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在额外包含粘合剂的组合物中。在一个具体实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在额外包含软组织粘合剂的组合物中，其包括但不限于氰基丙烯酸酯、血纤蛋白粘合剂和/或明胶-间苯二酚-甲醛胶。在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在额外包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)配体、胞外蛋白和/或胞外蛋白类似物的组合物中。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在组合物中，从而细胞可作为单一细胞被沉积至表面(即，每次一个细胞进行细胞沉积)。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在组合物中，从而细胞可作为包含多种细胞的聚集体被沉积至表面。这种聚集体可包含单一类型的细胞，或可包含多种细胞类型，例如，2、3、4、5或更多种细胞类型。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞被配制在组合物中，从而细胞作为组合物的一部分形成组织，其中所述组织可使用本文描述的方法被沉积到表面。这种组织可包含包含单一类型的细胞，或可包含多种细胞类型，例如，2、3、4、5或更多种细胞类型。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法使用的细胞作为具有小体积(例如，0.5至500皮升每滴)的细胞和/或组合物的个体液滴被沉积至表面。在各实施方式中，细胞或包含细胞的组合物的体积是约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、20、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100皮升，或约1至90皮升、约5至85皮升、约10至75皮升、约15至70皮升、约20至65皮升、或约25至约60皮升。
4.1.2组织和器官
本文提供了使用本文提供的一种或多种方法工程化/产生的组织和器官。
本领域已知的任何组织类型都可以使用本文描述的方法产生。在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织包含单一细胞类型。在其它实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织包含多种细胞类型。在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织包含多于一种组织类型。
在某些实施方式中，本文描述的方法包括细胞在表面沉积，其中所述表面包括来自受试者的组织，例如，来自捐献者、来自受体对象、来自尸体或来自其它来源的组织。在某些实施方式中，本文描述的方法包括细胞在表面沉积，其中所述表面包括并非来自受试者的组织，例如，合成的组织。
在一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织是结缔组织。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织是肌肉组织。按照本文描述的方法产生的肌肉组织可包含内脏(平滑)肌肉组织、骨骼肌组织或心肌组织。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织是神经组织。按照本文描述的方法产生的神经组织可包含中枢神经系统组织(例如，脑组织或脊髓组织)或周围神经系统组织(例如，脑神经和脊神经)。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织是上皮组织，包括内皮。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织可被用于工程化器官。在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织可被用于工程化一部分器官。
按照本文描述的方法工程化的组织和器官可以与任何已知的哺乳类器官系统相关，即，消化系统、循环系统、内分泌系统、排泄系统、免疫系统、皮肤系统、肌肉系统、神经系统、生殖系统、呼吸系统和/或骨骼系统。可按照本文描述的方法产生或形成的示例性器官包括但不限于肺、肝、心、脑、肾、皮肤、骨骼、胃、胰腺、膀胱、胆囊、小肠、大肠、前列腺、睾丸、卵巢、脊髓、咽、喉、气管、支气管、隔膜、输尿管、尿道、食道癌、结肠癌、胸腺和脾脏。在一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生或形成了胰脏。
在一个具体实施方式中，本文描述的方法被用于工程化骨。在另一个具体实施方式中，本文描述的方法被用于工程化皮肤。在另一个具体实施方式中，本文描述的方法被用于工程化肺组织、或肺或其部分。在另一个具体实施方式中，本文描述的方法被用于工程化肝脏组织、或肝脏或其部分。在另一个具体实施方式中，本文描述的方法被用于工程化神经组织、或神经或其部分。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织或器官可以额外包含有益于所述组织或器官的功能的组分。在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织或器官可以额外包含神经导管，即人工方式的引导轴突再生长。在一个具体实施方式中，神经导管由聚酐制成，例如，聚(邻羧基苯氧基)-对二甲苯)或聚(交酯-酸酐)。在某些实施方式中，神经导管可以在打印组织或器官同时沉积，即，神经导管随着组织或器官一起打印。在其它实施方式中，神经导管可以在打印所述组织或器官之前制备并在组织或器官被打印时置于(例如，手工放置)其内。在其它实施方式中，神经导管在打印所述组织或器官之前制备并在组织或器官被打印后置于(例如，手工放置)其内。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织或器官可以额外包含血管，例如，从受试者(例如，捐献者、受体对象或尸体)获得的血管或用本文描述的方法工程化的血管。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和器官的形状为组织或器官在其天然状态下所呈现的形状，例如，在人体内。例如，按照本文描述的方法产生的肺可类似于如在人体中呈现的人的肺。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和器官的形状并非组织或器官在其天然状态下所呈现的形状，但是以与该器官相同方式或相似方式发挥功能。例如，按照本文描述的方法产生的肺可以不像如在人体中呈现的人的肺，但是可以保留人肺的一些或全部功能。在这些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和器官可以为各种形状，包括但不限于球形、圆柱形、棒状或立方形(即，立方体)。
4.1.3胞外基质(ECM)
本文描述的方法包括细胞(例如，包含单一细胞的组合物和/或包含多种细胞的组合物)和胞外基质(ECM)，包括可流动的ECM，在表面的沉积。ECM可源自任何已知的ECM来源，并可使用任何本领域已知的方法被制成可流动的。在具体实施方式中，ECM包括可流动的ECM。ECM可使用例如下文4.1.3.1节描述的方法被制成可流动的。在某些实施方式中，ECM可使用例如下文4.1.3.2节描述的方法被交联。
按照本文描述的方法使用的ECM(例如，可流动的ECM)可被配制为组合物的一部分用于按照本文提供的方法使用。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法所用的ECM包括哺乳动物ECM、植物ECM、软体动物ECM和/或鱼类ECM。
在一个具体实施方式中，按照本文描述的方法所用的ECM包括哺乳动物ECM。在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法所用的ECM包括哺乳动物ECM，其中所述哺乳动物ECM源自胎盘(例如，人胎盘)。在另一个具体实施方式中，所述胎盘来源的ECM包含端肽胶原。
在另一个具体实施方式中，所述胎盘来源的ECM包括碱处理的和/或去垢剂处理的I型端肽胎盘胶原，其未被化学修饰或与蛋白酶接触，其中所述ECM包含按重量计少于5％的纤维连接蛋白或少于5％的层粘连蛋白；按重量计25％至92％的I型胶原；和按重量计2％至50％的III型胶原或2％至50％的IV型胶原。
在另一个具体实施方式中，所述胎盘来源的ECM包括碱处理的、去垢剂处理的I型端肽胎盘胶原，其未被化学修饰或与蛋白酶接触，其中所述ECM包含按重量计少于1％的纤维连接蛋白或少于1％的层粘连蛋白；按重量计74％至92％的I型胶原；和按重量计4％至6％的III型胶原或2％至15％的IV型胶原。
按照本文描述的方法使用的胎盘ECM，例如，包含胎盘端肽胶原的ECM，可使用本领域已知的方法制备，或可如下制备。首先，胎盘组织(整胎盘或其部分)通过标准方法获得，例如，剖腹产手术或正常生产后尽快收集，例如，无菌收集。胎盘组织可以来自胎盘的任何部分，包括羊膜(无论其可溶或不可溶或两者)、绒毛膜、脐带或来自完整胎盘。在某些实施方式中，胶原组合物从不含脐带的完整人胎盘制得。胎盘可储存于室温，或约2℃至8℃的温度，直至进一步处理。优选将胎盘抽血，即，完全排出生产后残余的胎盘和脐带血。在某些实施方式中，在生产之前对待产妇女筛查例如HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV和已知会污染胎盘组织的其它病原体。
可以在ECM生产之前对胎盘组织进行脱细胞化。胎盘组织可以根据本领域技术人员已知的任何技术进行脱细胞化，例如详细描述于美国专利申请号20040048796和20030187515中的那些，其内容在此全文引入作为参考。
可对胎盘组织进行渗透压休克。根据本领域技术人员的判断，渗透压休克可配合任何清洁(clarification)步骤，或者其可以作为惟一的清洁步骤。渗透压休克可以在任何本领域技术人员已知的渗透压休克条件下进行。这些条件包括将组织孵育在高渗透势或低渗透势或改变的高和低渗透势的溶液中。高渗透势溶液可以是本领域技术人员已知的任何一种高渗透势溶液，例如，包含一种或多种NaCl(例如，0.2-1.0M或0.2-2.0M)、KCl(例如，0.2-1.0或0.2to2.0M)、硫酸铵、单糖、二糖(例如，20％蔗糖)、亲水聚合物(例如，聚乙二醇)、甘油等的溶液。在某些实施方式中，高渗透势溶液是氯化钠溶液，例如，至少0.25M、0.5M、0.75M、11.0M、1.25M、1.5M、1.75M、2M、或2.5M NaCl。在一些实施方式中，氯化钠溶液为约0.25-5M、约0.5-4M、约0.75-3M或约1.0-2.0M NaCl。低渗透势溶液可以是本领域技术人员已知的任何一种低渗透势溶液，例如水，例如按照本领域技术人员已知的任何方法进行去离子的水。在一些实施方式中，渗透压休克溶液包括具有渗透压休克势能低于50mM NaCl的渗透压休克势能的水。在某些实施方式中，渗透压休克在氯化钠溶液中，然后在水溶液中进行。在某些实施方式中，进行一种或两种NaCl溶液处理，然后进行水洗。
在某些实施方式中，渗透压休克得到的组合物可随后与去垢剂一起孵育。去垢剂可以是本领域技术人员已知的任何能够破碎细胞或亚细胞膜的去垢剂，例如，阳离子去垢剂、阴离子去垢剂、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸钠、Triton X100、TWEEN，等等。去垢剂处理可在约0℃至约30℃、约5℃至约25℃、约5℃至约20℃、约5℃至约15℃、约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、或约30℃下进行。去垢剂处理可进行例如约1-24小时、约2-20小时、约5-15小时、约8-12小时或约2-5小时。
在某些实施方式中，去垢剂处理得到的组合物可随后在碱性条件下孵育。用于碱处理的具体的碱包括浓度为例如0.2-1.0M的生物相容性碱、挥发性碱或任何有机或无机碱。在某些实施方式中，所述碱选自NH4OH、KOH和NaOH，例如，0.1M NaOH、0.25M NaOH、0.5M NaOH或1M NaOH。碱处理可以在例如0℃至30℃、5℃至25℃、5℃至20℃、5℃至15℃、约0℃.、约5℃.、约10℃.、约15℃.、约20℃.、约25℃、或约30℃下进行例如约1-24小时、约2-20小时、约5-15小时、约8-12小时或约2-5小时。
ECM的产生可不用碱处理；省略碱处理步骤通常导致比包括碱处理所产生的ECM组合物包含相对较高数量的弹性蛋白、纤维连接蛋白和/或层粘连蛋白的ECM组合物。
通常，上述用于人胎盘组织的过程导致胎盘ECM的产生，后者包含碱处理的和/或去垢剂处理的I型端肽胎盘胶原，其未被化学修饰或与蛋白酶接触，其中所述ECM包含少于按重量计5％的纤维连接蛋白或少于5％的层粘连蛋白；按重量计25％至92％的I型胶原；2％至50％的III型胶原；按重量计2％至50％的IV型胶原；和/或按重量计少于40％的弹性蛋白。在一个更具体的实施方式中，该过程导致产生碱处理的、去垢剂处理的I型端肽胎盘胶原，其中所述胶原未被化学修饰或与蛋白酶接触，且其中所述组合物包含少于按重量计1％的纤维连接蛋白；按重量计少于1％的层粘连蛋白；按重量计74％至92％的I型胶原；按重量计4％至6％的III型胶原；按重量计2％至15％的IV型胶原；和/或按重量计少于12％的弹性蛋白。
在某些实施方式中，本文提供的包含可流动的ECM的组合物可以额外包含其它组分。在某些实施方式中，本文提供的包含可流动的ECM的组合物额外包含一种或多种细胞类型，例如，一种或多种上文4.1.1节中描述的的细胞类型。可选的，所述细胞可以与所述ECM的沉积同时、在其之前或之后作为按照本文描述的方法的分开的组合物的一部分进行沉积。
在某些实施方式中，本文提供的包含可流动的ECM的组合物额外包含水凝胶(例如，热敏性水凝胶和/或光敏性水凝胶)。可选的，水凝胶可与所述ECM的沉积同时、在其之前或之后作为按照本文描述的方法的分开的组合物的一部分进行沉积。
在某些实施方式中，本文提供的包含可流动的ECM的组合物额外包含一种或多种细胞类型，例如，一种或多种上文4.1.1节中描述的的细胞类型，和水凝胶。在一个具体实施方式中，本文提供的包含可流动的ECM和水凝胶(例如，热敏性水凝胶和/或光敏性水凝胶)的组合物被配制从而ECM:水凝胶的比例范围为按重量计约10:1至约1:10。
示例性水凝胶可包括可通过共价、离子或氢键交联以产生包埋水分子形成凝胶的三维开放晶格结构的有机聚合物(天然或合成的)。用于该聚合物的合适的水凝胶包括自组装肽，例如RAD16。形成水凝胶的材料包括多糖，例如海藻糖及其盐；肽；聚膦嗪和聚丙烯酸酯，其通过离子键交联；或嵌段共聚物，例如聚氧乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物，其分别通过温度或pH交联。在一些实施方式中，水凝胶或基质可以是生物可降解的。
在某些实施方式中，本文提供的包含可流动的ECM的组合物额外包含合成聚合物。在一个具体实施方式中，合成聚合物包括聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚(邻羧基苯氧基)-对二甲苯)(聚(o-CPX))、聚(交酯-酸酐)(PLAA)、n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺、戊赤藓糖醇二丙烯酸酯、聚丙烯酸甲酯、羧甲基纤维素和/或聚(乳酸盐乙醇酸共聚物)(PLGA)。在另一个具体实施方式中，合成聚合物包括热塑性塑料，例如，聚已酸内酯(PCL)、聚乳酸盐、聚对苯二甲酸丁二酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚酯、聚醋酸乙烯酯和/或聚氯乙烯。可选的，一种或多种合成聚合物可与所述ECM的沉积同时、在其之前或之后作为按照本文描述的方法的分开的组合物的一部分进行沉积。在一个具体实施方式中，该合成聚合物是PCL。
在某些实施方式中，本文提供的包含可流动的ECM的组合物额外包含腱生蛋白C，一种已知与纤维连接蛋白或其片段作用的人蛋白。可选的，腱生蛋白C可与所述ECM的沉积同时、在其之前或之后作为按照本文描述的方法的分开的组合物的一部分进行沉积。
在某些实施方式中，本文提供的包含可流动的ECM的组合物额外包含钛-铝-钒(Ti6Al4V)。可选的，Ti6Al4V可与所述ECM的沉积同时、在其之前或之后作为按照本文描述的方法的分开的组合物的一部分进行沉积。
在某些实施方式中，本文提供的组合物中的ECM和/或组合物的额外组分，例如合成聚合物，可被衍生化。衍生化ECM和合成聚合物的方法是本领域已知的，包括但不限于，使用细胞吸附肽(例如，包含的一种或多种RGD基序的肽)的衍生化、使用细胞吸附蛋白的衍生化、使用细胞因子(例如，例如，血管内皮生长因子(VEGF)或骨形成蛋白(BMP))的衍生化和使用粘多糖的衍生化。
4.1.3.1可流动的ECM的产生方法
按照本文描述的方法所用的ECM可使用本领域已知的和本文描述的方法制备成可流动的。
在一个实施方式中，按照本文描述的方法所用的ECM通过将ECM与酸或碱接触制备成可流动的，例如，包含足以使所述ECM可溶的数量的所述酸或碱的酸或碱溶液。一旦ECM已被制成可流动的，如果需要，则可使用本领域已知的方法将含ECM的组合物制备成中性的，或者变为期望的pH。
在另一实施方式中，按照本文描述的方法所用的ECM通过将ECM与酶或酶的组合接触制备成可流动的，例如，蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和/或弹性蛋白酶。一旦ECM已被制成可流动的，如果需要，则可使用本领域已知的方法使酶失活。
在另一实施方式中，按照本文描述的方法所用的ECM使用物理方法被制备成可流动的。在一个具体实施方式中，按照本文描述的方法所用的ECM通过研磨ECM制成可流动的，即，研磨ECM以克服内部键合力。在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法所用的ECM通过例如用搅拌器或其它来源剪切ECM制成可流动的。在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法所用的ECM通过切碎ECM制成可流动的。在某些实施方式中，当通过物理方法将ECM变得更加可流动时，可以在冷冻状态下操作ECM(例如，ECM被冻干或在液氮中冷冻)。
4.1.3.2交联ECM的方法
按照本文描述的方法所用的ECM可使用本领域已知的和本文描述的方法进行交联。
在某些实施方式中，ECM在其应用至表面之前交联，即，ECM可在打印前交联。按照这些实施方式，交联剂可以被包含在含有ECM的组合物中，且如果需要的话，可在ECM打印前在引起ECM交联的条件下处理含有ECM的组合物和交联剂。
在其它实施方式中，ECM在其应用至表面之后交联，即，ECM可在打印后交联。在一个实施方式中，通过首先将ECM打印至表面，然后将交联剂打印至表面，使得ECM在其应用至表面之后交联(即，ECM和交联剂作为分开的组合物打印)。按照该实施方式，如果需要的话，可通过在引起ECM交联的条件下处理ECM和交联剂使得ECM随后交联。
在另一实施方式中，通过将同时包含ECM和交联剂的组合物打印至表面，且打印后在引起ECM交联的条件下处理ECM和交联剂，使得ECM在其应用至表面之后交联。
在一个具体实施方式中，通过透明质酸(一种ECM组分)的化学交联使ECM交联。化学交联透明质酸的示例性方式包括但不限于，二乙烯砜交联、双环氧化物交联、苄基酯交联、丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)交联、通过硫醇修饰的二硫化物交联、HA的卤乙酸盐修饰、HA的二酰肼修饰、HA的酪胺修饰和使用偶极环加成反应(即，“点击化学”)。这些方法是本领域已知的并进一步描述于例如Burdick和Prestwich，2011，Adv.Mater.23:H41-H56。
在另一个具体实施方式中，ECM通过ECM蛋白的化学交联进行交联。能够交联ECM蛋白的示例性化学物质包括但不限于，戊二醛、己二异氰酸酯(HDMI)、京尼平、碳化二亚胺、聚乙二醇、过氧化苯甲酰、BioGlue(一种基于戊二醛的交联剂，Cryolife Inc.)、聚磷酸酯和可水解的聚轮烷。
在另一个具体实施方式中，ECM通过使用例如甲基丙烯酸酐和/或甲基丙烯酸缩水甘油酯的透明质酸光聚合进行交联(参见，例如，Burdick和Prestwich，2011，Adv.Mater.23:H41-H56)。
在另一个具体实施方式中，ECM通过使用酶进行交联。适于交联ECM的酶包括但不限于，赖氨酰氧化酶(参见，例如，Levental等人，2009，Cell 139:891-906)和组织型转谷氨酰胺酶(参见，例如，Griffin等人，2002，J.Biochem.368:377-96)。
本领域技术人员将认可，交联剂应当基于生物打印产品所期望的用途进行选择。例如，当本文描述的方法被用于产生待施用给受试者的组织或器官时，应当注意选择和使用生物可相容的交联剂，即，对受试者无害。可选的，当本文描述的方法被用于产生不对受试者施用的组织或器官时，例如，用于诊断分析中的组织或器官，那么本方法的实践者可不必注意选择交联剂。
4.1.4表面
可使用任何可沉积(例如，打印)细胞、可流动的ECM和/或任何额外的组分的合适的表面，以产生按照本文描述的方法产生的组织和器官。这些表面可以是二维的(例如，平的、二维的表面)或可以是三维的。
在一个实施方式中，沉积(例如，打印)细胞、可流动的ECM和/或任何额外的组分的表面包括人工表面，即，人造的表面。在一个具体实施方式中，所述人工表面是假体。在某些实施方式中，基于其用于给药和/或移植至受试者，例如，人类受试者的适合程度选择人工表面。例如，当待沉积至人工表面的组织或器官被制备的目的是将其移植至受试者中时，可以选择使用已知非免疫原性的人工表面(即，不会激发宿主免疫应答的表面)。在某些实施方式中，人工表面可进行处理以使得其适于给药和/或移植至受试者，例如，人类受试者。
在一个实施方式中，沉积细胞、可流动的ECM和/或任何额外的组分的表面包括塑料表面。沉积所述细胞、ECM和/或额外组分的示例性的塑料表面种类包括但不限于，聚酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯和聚氨酯。
在一个实施方式中，沉积细胞、可流动的ECM和/或任何额外的组分的表面包括金属表面。沉积所述细胞、ECM和/或额外组分的示例性的金属表面种类包括但不限于，铝、铬、钴、铜、金、铁、铅、镁、锰、汞、镍、铂、银、锡、钛、钨和锌。
在某些实施方式中，沉积细胞、可流动的ECM和/或任何额外的组分的人工表面被工程化从而形成特定形状。例如，人工表面可被工程化从而其为骨(例如，耳骨)的形状，在所述表面上或表面内即可沉积合适的细胞(例如，骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和其它骨相关细胞)、可流动的ECM和/或任何额外的组分，从而产生适于在受试者中移植的骨。
在另一实施方式中，所述表面包括来自受试者(例如，人类受试者)的组织或器官或由受试者细胞得到的组织或器官。在某些实施方式中，所述来自受试者的组织或器官的表面可被脱细胞化，例如进行处理以从该组织或器官表面的全部或部分去除细胞。在一个具体实施方式中，表面组织或表面器官所来源的受试者是按照本文描述的方法产生的组织或器官的目标接受者。在另一个具体实施方式中，表面组织或表面器官所来源的受试者不是按照本文描述的方法产生的组织或器官的目标接受者(例如，提供待打印在其上的表面组织或表面器官的受试者是捐献者或尸体受试者)。
按照本文描述的方法的细胞、可流动的ECM和/或任何额外的组分可被沉积至(例如，打印至)来自受试者的任何合适的组织或器官。在一个具体实施方式中，提供打印表面的组织是结缔组织(包括骨)、肌肉组织(包括内脏(平滑)肌组织、骨骼肌组织、和心肌组织)、神经组织(包括中枢神经系统组织(如脑组织或脊髓组织)或周围神经系统组织(如脑神经和脊神经))或上皮组织(包括内皮)。在另一个具体实施方式中，提供打印表面的器官是来自任何已知的哺乳动物器官系统，包括消化系统、循环系统、内分泌系统、排泄系统、免疫系统、皮肤系统、肌肉系统、神经系统、生殖系统、呼吸系统和/或骨骼系统。在另一个具体实施方式中，提供打印表面的器官是全部或部分的肺、肝、心、脑、肾、皮肤、骨骼、胃、胰腺、膀胱、胆囊、小肠、大肠、前列腺、睾丸、卵巢、脊髓、咽、喉、气管、支气管、隔膜、输尿管、尿道、食道、结肠、胸腺和脾。在另一个具体实施方式中，提供打印表面的器官是胰腺或其部分。
在一个具体实施方式中，细胞、可流动的ECM和/或任何额外的组分被沉积至(例如，打印至)包括骨或由骨组成的表面。可被打印的示例性的骨包括长骨、短骨、平骨、不规则骨和seismoid骨。可被打印的具体的骨包括但不限于，颅骨、面骨、耳骨、趾骨的骨、手臂骨、腿骨、肋骨、手和手指的骨、脚和脚趾的骨骼、脚踝骨、腕骨、胸部的骨(如胸骨)等等。
在某些实施方式中，本文描述的作为支架用于沉积(例如，通过生物打印或其它方式沉积)细胞、可流动的ECM和/或任何额外的组分的表面是未被生物打印的表面。在某些实施方式中，本文描述的作为支架用于沉积(例如，通过生物打印或其它方式沉积)细胞、可流动的ECM和/或任何额外的组分的表面是已被生物打印的表面，例如，按照本文描述的方法生物打印的。在一个具体实施方式中，生物打印的表面包括合成材料。在一个具体实施方式中，合成材料是PCL。
4.2组合物
本文提供了按照本文描述的方法可以使用的组合物。在一个实施方式中，本文提供了包含按照本文描述的方法适用的细胞(例如，上述4.1.1节描述的细胞)的组合物。在另一实施方式中，本文提供了包含按照本文描述的方法适用的可流动的ECM(例如，上述4.1.3节描述的可流动的ECM)的组合物。在另一实施方式中，提供了包含按照本文描述的方法适用的一种或多种交联剂(例如，上述4.1.1节描述的交联剂)的组合物。
在一个实施方式中，本文提供了一种包含细胞(例如，上述4.1.1节描述的细胞)和可流动的ECM(例如，上述4.1.3节描述的可流动的ECM)的组合物。在一个具体实施方式中，细胞包含干细胞，例如，骨髓来源的间质干细胞(BM-MSC)、组织塑料吸附胎盘干细胞(PDAC)和/或羊膜来源的贴壁细胞(AMDAC)。在另一个具体实施方式中，可流动的ECM源自胎盘(例如，人胎盘)。
在另一实施方式中，本文提供了一种包含可流动的ECM(例如，上述4.1.3节描述的可流动的ECM)和一种或多种交联剂(例如，上述4.1.1节描述的交联剂)的组合物。
在另一实施方式中，本文提供了一种包含细胞(例如，上述4.1.1节描述的细胞)和一种或多种交联剂(例如，上述4.1.1节描述的交联剂)的组合物。
在另一实施方式中，本文提供了一种包含细胞(例如，上述4.1.1节描述的细胞)、可流动的ECM(例如，上述4.1.3节描述的可流动的ECM)和一种或多种交联剂(例如，上述4.1.1节描述的交联剂)的组合物。
在一个具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和可流动的ECM，其中所述干细胞是PDAC且其中所述可流动的ECM源自胎盘。在另一个具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和交联剂，其中所述干细胞是PDAC。在另一个具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞、可流动的ECM和交联剂，其中所述干细胞是PDAC且其中所述可流动的ECM源自胎盘。
在另一个具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和可流动的ECM，其中所述干细胞是AMDAC且其中所述可流动的ECM源自胎盘。在另一个具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和交联剂，其中所述干细胞是AMDAC。在另一个具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞、可流动的ECM和交联剂，其中所述干细胞是AMDAC且其中所述可流动的ECM源自胎盘。
在另一个具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和可流动的ECM，其中所述干细胞是BM-MSC且其中所述可流动的ECM源自胎盘。在另一个具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞和交联剂，其中所述干细胞是BM-MSC。在另一个具体实施方式中，本文提供的组合物包含干细胞、可流动的ECM和交联剂，其中所述干细胞是BM-MSC且其中所述可流动的ECM源自胎盘。
本文提供的组合物除包含的细胞(例如，上述4.1.1节描述的细胞)和/或可流动的ECM(例如，上述4.1.3节描述的可流动的ECM)和/或一种或多种交联剂(例如，上述4.1.1节描述的交联剂)之外，还可以额外包含其它组分。在某些实施方式中，本文提供的组合物额外包含水凝胶(例如，热敏性水凝胶和/或光敏性水凝胶)。可选的，水凝胶可被配制在与本文提供的包含细胞和ECM的组合物分开的组合物中。在某些实施方式中，本文提供的组合物额外包含合成聚合物，例如聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚(邻羧基苯氧基)-对二甲苯)(聚(o-CPX))、聚(交酯-酸酐)(PLAA)、n-异丙基丙烯酰胺、戊赤藓糖醇二丙烯酸酯、聚丙烯酸甲酯、羧甲基纤维素聚(乳酸盐乙醇酸共聚物)(PLGA)和/或热塑料(例如，聚已酸内酯、聚乳酸盐、聚对苯二甲酸丁二酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚酯、聚醋酸乙烯酯和/或聚氯乙烯)。可选的，合成聚合物可被配制在与本文提供的包含细胞和ECM的组合物分开的组合物中。在某些实施方式中，本文提供的组合物额外包含腱生蛋白C或其片段。可选的，腱生蛋白C或其片段可被配制在与本文提供的包含细胞和ECM的组合物分开的组合物中。在某些实施方式中，本文提供的组合物额外包含钛-铝-钒(Ti6Al4V)。可选的，Ti6Al4V可被配制在与本文提供的包含细胞和ECM的组合物分开的组合物中。在某些实施方式中，本文提供的组合物额外包含药物(例如，小分子药物)。可选的，药物可被配制在与本文提供的包含细胞和ECM的组合物分开的组合物中。在某些实施方式中，本文提供组合物的额外包含抗体(例如，治疗性抗体)。可选的，抗体可被配制在与本文提供的包含细胞和ECM的组合物分开的组合物中。
在某些实施方式中，本文提供的组合物额外包含促进组合物中使用的细胞存活、分化、增殖等的一种或多种额外的组分。这些组分可包括但不限于，营养物、盐、糖、存活因子和生长因子。按照本文描述的方法可使用的示例性生长因子包括但不限于，胰岛素样生长因子(例如，IGF-1)、转化生长因子-β(TGF-β)、骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF)(1、2和3号)、骨桥蛋白、骨形成蛋白-2、生长激素如生长素、细胞引诱剂和附着剂等，及其混合物。可选的，所述促进细胞存活、分化、增殖等的一种或多种额外的组分可被配制在与本文提供的包含细胞和ECM的组合物分开的组合物中。
4.3用途
按照本文描述的方法产生的组织和器官可被用于任何合适的目的。在一个具体实施方式中，按照本文描述的方法的组织和器官被用于治疗目的，例如，该组织和/或器官被用于移植。在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的器官被用于实验目的，例如，以评价一种或多种化合物和/或手术治疗对所述组织或器官的影响。
4.3.1治疗用途
在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和/或器官被移植入需要该移植的受试者。可被移植入个体的示例性组织和器官描述于4.1.2节。移植方法，包括种植(grafting，例如，植皮)和手术移植过程对本领域技术人员而言是熟知的。
在某些实施方式中，移植的组织和/或器官所来源的细胞和/或ECM来自移植受体。在其它实施方式中，移植的组织和/或器官所来源的细胞和/或ECM不来自移植受体，而是来自另一对象，例如，捐献者、尸体等等。
在某些实施方式中，移植的组织和/或器官所来源的细胞来自移植受体，且移植的组织和/或器官所来源的ECM不来自移植受体，而是来自另一来源。在一个具体实施方式中，移植的组织和/或器官所来源的ECM胎盘(例如，人胎盘)。
在某些实施方式中，移植的组织和/或器官所来源的ECM来自移植受体，且移植的组织和/或器官所来源的细胞不来自移植受体，而是来自另一来源。
在一个具体实施方式中，本文描述的方法被用于产生适于移植的皮肤，且所述皮肤被移植(即，种植)至需要该移植的受试者(例如，烧伤受害者)。在一个具体实施方式中，所述受试者是人。
在另一个具体实施方式中，本文描述的方法被用于产生适于移植的骨，且所述骨被移植(例如，手术移植)至需要该移植的受试者(例如，罹患骨质疏松或骨癌的患者)。在一个具体实施方式中，所述受试者是人。
在另一个具体实施方式中，本文描述的方法被用于产生适于移植的肝脏或其部分，且所述肝脏或其部分被移植(例如，手术移植)至需要该移植的受试者(例如，罹患肝硬化、肝炎或肝癌的患者)。在一个具体实施方式中，所述受试者是人。
在另一个具体实施方式中，本文描述的方法被用于产生适于移植的肺或其部分，且所述肺或其部分被移植(例如，手术移植)至需要该移植的受试者(例如，罹患肺癌的患者)。在一个具体实施方式中，所述受试者是人。
在另一个具体实施方式中，本文描述的方法被用于产生适于移植的神经组织(例如，脑组织或脊髓组织)，且所述神经组织被移植(例如，手术移植)至需要该移植的受试者。在一个具体实施方式中，所述受试者被诊断患有神经疾病(即，中枢或周围神经系统的疾病)。在另一个具体实施方式中，所述受试者患有损伤该受试者中枢或周围神经系统的外伤，例如，受试者患有外伤性脑损伤(TBI)或脊髓损伤(SCI)。在另一个具体实施方式中，所述受试者是人。
在另一个具体实施方式中，本文描述的方法用于产生适于移植的循环系统组织(例如，心脏组织、动脉或静脉)，且所述循环组织被移植(例如，手术移植)至需要该移植的受试者。在一个具体实施方式中，所述受试者是人。
4.3.1.1患者群体
按照本文描述的方法产生的组织和/或器官可被用于使得各种患者群体受益。在一个实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和/或器官被用于需要移植组织和/或器官的受试者。
在一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和/或器官被移植到经诊断患有癌症的受试者，即，以替换所述受试者受到癌症影响的一种或多种器官/组织的全部或部分。在一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和/或器官被移植到经诊断患有骨或结缔组织肉瘤、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌(如，小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、咽喉癌和间皮瘤)和/或前列腺癌的受试者。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的肺组织和/或器官被移植到经诊断患有呼吸疾病的受试者，例如，该受试者经诊断患有哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、肺炎、肺结核、肺癌和/或囊性纤维化。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的肝脏组织和/或器官被移植到经诊断患有肝病的受试者，例如，该受试者经诊断患有肝炎(例如，甲型、乙型或丙型肝炎)、肝癌、血色病或肝硬化。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的骨组织和/或器官被移植到经诊断患有骨病的受试者，例如，该受试者经诊断患有骨癌(如骨肉瘤)、骨坏死、代谢性骨病、进行性骨化性纤维发育不良或骨质疏松症。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的神经组织和/或器官被移植到经诊断患有神经疾病的受试者(即，中枢或周围神经疾病)，例如，该受试者经诊断患有脑癌、脑炎、脑膜炎、Alzheimer病、Parkinson病、中风或多种硬化。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的表皮(例如，皮肤)组织被移植到经诊断患有皮肤疾病的受试者(即，感染皮肤的疾病)，例如，该受试者经诊断患有皮肤癌、湿疹、痤疮、牛皮癣、带状疱疹、角化病；或该受试者有疤。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的神经组织和/或器官被移植到遭受损伤受试者中枢或周围神经系统的外伤的受试者，例如，受试者患有外伤性脑损伤(TBI)或脊髓损伤(SCI)。
在另一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的循环系统组织和/或器官被移植到经诊断患有循环系统疾病的受试者，例如，该受试者经诊断患有冠心病、心肌病(如，内在或外在心肌病)、心脏病、中风、炎症性心脏病、高血压性心脏病或瓣膜心脏病。
在一些实施方式中，被移植按照本文描述的方法产生的组织或器官的受试者是动物。在某些实施方式中，所述动物是鸟。在某些实施方式中，所述动物是犬。在某些实施方式中，所述动物是猫。在某些实施方式中，所述动物是马。在某些实施方式中，所述动物是牛。在某些实施方式中，所述动物是哺乳动物，例如，马、猪、鼠或灵长类，特别是人。在一个具体实施方式中，被移植按照本文描述的方法产生的组织或器官的受试者是人。
在某些实施方式中，被移植按照本文描述的方法产生的组织或器官的受试者是成人。在某些实施方式中，被移植按照本文描述的方法产生的组织或器官的受试者是人婴儿。在某些实施方式中，被移植按照本文描述的方法产生的组织或器官的受试者是人儿童。
4.3.2实验用途
在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和/或器官被用于实验目的。
在一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和/或器官被用于筛选药物对所述组织和/或器官的影响。根据这些方法，按照本文描述的方法产生的组织或器官可被暴露于给定药物(例如，待评价的药物)和对照(例如，不含该药物的组合物)，该药物对所述组织或器官的影响可使用本领域技术人员已知的方法进行评价(例如，通过评价药物相对于对照的毒性；药物相对于对照引发某种结果的效力，等等)。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和/或器官可被移植入非人动物，即可通过对经受该移植的第一非人动物给予该药物并对经受该移植的第二非人动物给予对照(例如，不含该药物的组合物)并比较结果，来评价药物在该非人动物中对所述组织或器官的影响。
在某些实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和/或器官可被移植入非人动物，即可通过对对经受该移植的第一非人动物所移植的组织/器官进行手术过程并对经受该移植的第二非人动物不进行该手术过程并比较结果，来评价手术过程在该非人动物中对所述组织或器官的影响。
在一个具体实施方式中，按照本文描述的方法产生的组织和/或器官被用于体外目的。例如，按照本文描述的方法产生的组织或器官被置于受试者体外但执行功能，其使得受试者受益，例如，该组织或器官执行通常由位于受试者体内的组织或器官所执行的功能。
4.4试剂盒
本文提供了一种包含一种或多种容器的药包或试剂盒，所述容器填充一种或多种本文描述的组合物组分。可选的与这些容器相关的可以是一份通知，其形式由监管药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机关规定，所述通知反映了生产、使用或销售的机关批准用于人类给药。
在一个具体实施方式中，本文提供的试剂盒包括含有本文描述的细胞和本文描述的可流动的ECM的组合物。这一试剂盒可选的可以包括含有一种或多种额外的组分(例如，交联剂)的组合物。在另一个具体实施方式中，本文提供的试剂盒包括含有本文描述的细胞、本文描述的可流动的ECM和本文描述的一种或多种交联剂的组合物。本文所涵盖的试剂盒可按照本文描述的方法进行使用。
5.实施例
5.1实施例1：生物打印的支架支撑胎盘干细胞的附着和生长
本实施例显示合成材料可被生物打印以产生控制纤维直径和孔径的支架，且这种支架提供了应用胞外基质(ECM)的合适基质。本实施例进一步显示包含生物打印的合成材料和ECM的支架(杂合支架)代表了一种细胞附着和生长的合适基质，包括胎盘细胞，例如胎盘干细胞。
5.1.1方法
为了制作包含合成材料和ECM的杂合支架，首先使用生物打印机(EnvisionTEC，Gladbeck，Germany)将聚已酸内酯(PCL)(Mn 45,000，Sigma)打印入支架(54x54x0.64mm)。打印条件如下：温度90℃，打印压力3～5.5bar，打印速度2～6mm/s，用合适大小的针。如前所述从人胎盘分离ECM(参见，例如，Bhatia MB，Wounds 20，29，2008)。分离的ECM被用于生物打印的PCL支架的两面并进行干燥(脱水)，从而产生包含PCL和ECM的杂合支架。得到的杂合PCL-ECM支架被戳进10mm直径的盘，用培养基预湿过夜，并以12,500细胞/cm2接种按照本文描述的方法制备的胎盘干细胞(参见，例如，4.1.1节)。细胞培养8天的时间周期。按照标准步骤在不同时间点(n＝3)进行钙黄绿素染色和MTS增殖分析，以测定细胞活力和增殖。
5.1.2结果
通过优化打印条件，产生了不同纤维大小、孔径和孔结构的PCL支架(图1)。打印的纤维形成了稳定的网络用于产生包含PCL和ECM的杂合支架。进一步，不同纤维大小和孔结构的打印使得制备包含多种性质的杂合支架成为可能。
在生物打印的PCL支架两面的ECM的脱水导致产生杂合支架。观察到PCL和ECM之间的良好整合；当通过处理或培养支架对杂合支架进行操作(包括再水化)时，没有发现PCL和ECM之间存在分离(图2)。
随着时间过去，胎盘干细胞在杂合支架的表面扩散，并在培养第6天覆盖了杂合支架的大部分表面。MTS细胞增殖分析显示细胞数随时间显著增加(图3)。此外，杂合支架上接种的胎盘干细胞显示在8天的培养周期中良好的活力，如钙黄绿素染色所示(图4)。这些数据共同表明PCL-ECM杂合支架支撑细胞的附着、存活和生长。
5.1.3结论
本实施例显示包含ECM和合成材料(PCL)的杂合支架可通过包括生物打印的方法产生，且细胞不仅附着到该支架上，当在该支架上培养时还存活并增殖。
5.2实施例2：生物打印的支架支撑胎盘干细胞的附着和生长
本实施例显示合成材料和包含细胞(例如胎盘细胞，例如，胎盘干细胞的ECM)可被同时生物打印以产生杂合支架。如本实施例所示，生物打印的细胞不仅在生物打印过程存活，而且在用杂合支架培养时随时间增殖。
5.2.1方法
按实施例1的描述制备ECM并混合含1百万/ml胎盘干细胞的0.5％藻酸盐水凝胶。接下来，按层生物打印PCL和含细胞ECM，以产生包含PCL和ECM的杂合支架。在支架的每一层，先打印PCL，然后打印ECM/细胞组分，以填充PCL线之间的缝隙。打印这样的2层或5层，并用CaCl2溶液交联以产生杂合支架。生物打印的、含细胞的支架(细胞/ECM/PCL)被培养7天，并在不同时间点通过钙黄绿素染色和MTS细胞增殖分析评价细胞的增殖和存活。
5.2.2结果
生物打印的支架在整个细胞培养过程中保持完整结构(图5)。PCL为ECM水凝胶提供了良好的结构支撑，其允许产生三维构建体。生物打印后和整个培养中，细胞贯穿三维构建体良好分布；在培养过程中在整个支架深度都发现细胞(图6)。
胎盘干细胞在生物打印过程中存活并贯穿培养过程在三维生物打印杂合支架中持续增殖，如钙黄绿素染色所示(图7)。如图8所示，发现大部分细胞在杂合支架中贯穿ECM分布，表明ECM增强了细胞附着和在ECM水凝胶中分布。这一点通过比较细胞在单独的藻酸盐中和细胞在支架中的位置得到了证实。此外，如图9所示，MTS细胞增殖分析显示了2层和5层支架均有细胞数量增长，表明这些杂合支架支撑细胞生长。
5.2.3结论
本实施例显示包含ECM和合成材料(PCL)的杂合支架可通过包括同时生物打印ECM和PCL的方法产生。本实施例还显示细胞可伴随着杂合支架(ECM和PCL)的组分一起被生物打印、且细胞在生物打印中存活这一事实。进一步，伴随着杂合支架的组分一起生物打印的细胞当在所述支架上培养时增殖，且比在单独的细胞基质(藻酸盐)中培养时更好地贯穿支架分布。
5.3实施例3：功能性生物打印的支架
本实施例显示合成材料和包含细胞的ECM可被生物打印以产生功能性支架。
β-TC-6细胞，一种产胰岛素细胞系，被与人胎盘来源的胞外基质(ECM)一起生物打印入一个生物打印的支架。支架的尺寸为15x15x2.5mm，包含5层。在每一层，先打印聚已酸内酯(PCL)，然后在PCL线之间打印β-TC-6细胞，后者以1千5百万细胞/ml在藻酸盐-ECM水凝胶(1％藻酸盐和12％ECM)中混合。将整个支架浸入1％氯化钙溶液交联20分钟。然后在细胞培养箱内在6孔板(3-5ml培养基每孔)中含15％胎牛血清的DMEM培养基中培养支架。在不同时间点，收获支架用于钙黄绿素染色和MTS增殖分析，以分别表征细胞活力和细胞增殖。图10显示了生物打印支架的结构。
钙黄绿素染色显示β-TC-6细胞在打印过程中存活并在培养中保持活力。支架的剖视图显示细胞贯穿支架均匀分布，并在每一层保持存活(见图10)。MTS分析确认了产胰岛素的β-TC-6细胞保持活力长达3周，且有活力细胞的整体数量保持恒定(见图11)。
为了测定β-TC-6细胞是否能在生物打印的支架中发挥作用，检测了细胞的胰岛素生产。为了检测胰岛素生产，生物打印的支架被暴露在新鲜生长培养基(在6孔板中，3ml/孔)中2小时，使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Millipore)对来自每个支架的上清液等份检测了胰岛素浓度。产生的最高胰岛素水平在第0天测得(见图12)。分泌的胰岛素水平随后(第3天和第6天)降低，但是从培养第3天到第6天保持稳定(见图12)。从而，β-TC-6细胞在被生物打印后保留了生产和分泌胰岛素的能力。
产胰岛素细胞在胰脏中的一个关键作用是响应血液中升高的葡萄糖水平产生胰岛素。因此通过将支架暴露于葡萄糖激增挑战(glucose surgechallenge)考察了包含PCL、ECM和β-TC-6细胞的生物打印支架是否保留了这一功能(见图13)。一个支架(图13的“A”)被暴露在葡萄糖饥饿条件下(无葡萄糖IMDM培养基，10％FCS)2天，然后用胰岛素产生条件(50mM葡萄糖/1mM IBMX)进行挑战。作为对照，生物打印的支架被保持在具有稳定葡萄糖水平的正常培养基中(图13的“B”和“C”)。在对照中，在与测试支架(即，图13的A)用胰岛素产生条件进行挑战的同时更换培养基。对来自每种培养物(A，B，和C)的上清液每半小时取样，通过ELISA检测来自每份上清液的胰岛素浓度。图13显示了不同时间点来自各培养物的胰岛素产生水平，表明暴露于葡萄糖饥饿条件然后用胰岛素产生条件进行挑战的生物打印的支架(即，图13的A)在挑战后3小时产生了比其在挑战后0.5小时的胰岛素产生水平超过80倍的胰岛素，而对照(即，图13的B和C)则产生了少得多的胰岛素(在更换培养基后3小时仅为比其在更换培养基后0.5小时的胰岛素产生水平约2倍的胰岛素)。
本实施例显示可以产生包含合成材料、细胞和ECM的生物打印支架，且该生物打印支架的细胞保持活力和功能性。
本文公开的组合物和方法不局限于本文描述的具体实施方式的范围内。事实上，对于本领域技术人员而言，在所描述的组合物和方法之外的各种改变根据之前的描述和附图都是显而易见的。这些改变也意为落入了附加的权利要求的范围内。
本文引用了很多出版物、专利和专利申请，其公开内容全文引入作为参考。

Claims (75)

1.一种形成三维组织或器官的方法，包括将至少一种包含细胞和胞外基质(ECM)的细胞组合物沉积至表面。
2.权利要求1的方法，其中所述ECM包括可流动的ECM。
3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞组合物和所述ECM被打印至所述表面。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述沉积通过喷墨打印实现。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述表面是人工表面。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述表面是脱细胞的组织或脱细胞的器官。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述ECM包括哺乳动物ECM、软体动物ECM、鱼类ECM和/或植物ECM。
8.权利要求7的方法，其中所述哺乳动物ECM是胎盘ECM。
9.权利要求8的方法，其中所述ECM包含端肽胎盘胶原。
10.权利要求9的方法，其中所述端肽胎盘胶原包含碱处理的、去垢剂处理的I型端肽胎盘胶原。
11.权利要求9或10的方法，其中所述胶原未被化学修饰或与蛋白酶接触。
12.权利要求8的方法，其中所述胎盘ECM包含碱处理的和/或去垢剂处理的I型端肽胎盘胶原，其未被化学修饰或与蛋白酶接触，其中所述ECM包含按重量计少于5％的纤维连接蛋白或少于5％的层粘连蛋白；按重量计25％至92％的I型胶原；和按重量计2％至50％的III型胶原或2％至50％的IV型胶原。
13.权利要求8的方法，其中所述胎盘ECM包含碱处理的、去垢剂处理的I型端肽胎盘胶原，其未被化学修饰或与蛋白酶接触，其中所述ECM包含按重量计少于1％的纤维连接蛋白或少于1％的层粘连蛋白；按重量计74％至92％的I型胶原；和按重量计4％至6％的III型胶原或2％至15％的IV型胶原。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述ECM在所述沉积之前衍生化。
15.权利要求14的方法，其中所述ECM用一种或多种的细胞附着肽、细胞附着蛋白、细胞因子或粘多糖进行衍生化。
16.权利要求1-15任一项的方法，进一步包括细胞附着肽、细胞附着蛋白、细胞因子或粘多糖的沉积。
17.权利要求16的方法，其中所述细胞因子是血管内皮细胞生长因子(VEGF)或骨形成蛋白(BMP)。
18.权利要求16的方法，其中所述细胞附着肽是包含一种或多种RGD基序的肽。
19.权利要求1-18任一项的方法，进一步包括合成聚合物的沉积。
20.权利要求19的方法，其中所述合成聚合物是热敏性的。
21.权利要求19的方法，其中所述合成聚合物是光敏性的。
22.权利要求19的方法，其中所述合成聚合物包含热塑性塑料。
23.权利要求22的方法，其中所述合成聚合物是聚(乳酸盐乙醇酸共聚物)(PLGA)。
24.权利要求22的方法，其中所述热塑性塑料是聚已酸内酯、聚乳酸盐、聚对苯二甲酸丁二酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚酯、聚醋酸乙烯酯或聚氯乙烯。
25.权利要求19的方法，其中所述合成聚合物是聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚(邻羧基苯氧基)-对二甲苯)(聚(o-CPX))、聚(交酯-酸酐)(PLAA)、n-异丙基丙烯酰胺、戊赤藓糖醇二丙烯酸酯、聚丙烯酸甲酯、羧甲基纤维素或聚(乳酸盐乙醇酸共聚物)(PLGA)。
26.权利要求1-25任一项的方法，进一步包含腱生蛋白C或其片段的沉积。
27.权利要求1-35任一项的方法，进一步包含钛-铝-钒(Ti6Al4V)组合物的沉积。
28.权利要求27的方法，其中所述钛-铝-钒组合物以相连通的纤维多孔网络的形式沉积。
29.权利要求1的方法，其中所述组织或器官包含至少一层的所述细胞组合物和至少一层的ECM。
30.权利要求1的方法，其中至少一部分所述组织或器官包含打印在交替层的至少一层所述细胞组合物和至少一层所述ECM。
31.权利要求19的方法，其中在产生所述组织或器官时，至少一部分所述合成聚合物以基本上彼此平行的多纤维的形式打印。
32.权利要求31的方法，其中所述多纤维基本上彼此平行地沉积打印，从而物理上不会彼此接触。
33.权利要求32的方法，其中所述合成聚合物多次沉积。
34.权利要求33的方法，其中当进行所述多次沉积时，所述纤维在至少两次的所述次数中以不同方向打印。
35.权利要求33的方法，其中所述当进行所述多次沉积时，所述纤维在所述次数中的每一次均以不同方向沉积。
36.权利要求1-35任一项的方法，其中所述组织包含至少两层所述ECM。
37.权利要求的方法36，其中至少一部分所述至少两层的所述基质被所述细胞组合物彼此分开。
38.权利要求3的方法，其中所述打印包括在所述两层基质之间打印粘合剂。
39.权利要求1-38任一项的方法，其中所述ECM和所述细胞组合物分开沉积到所述表面。
40.权利要求1-38任一项的方法，其中至少一部分所述ECM在打印所述细胞组合物前被沉积到所述表面。
41.权利要求1-38任一项的方法，其中所述细胞组合物和所述ECM在所述沉积前进行合并。
42.权利要求3的方法，其中所述细胞组合物在所述打印中被打印至所述ECM上。
43.权利要求3的方法，其中所述细胞组合物在完成所述ECM的所述打印之后被打印至所述ECM上。
44.权利要求1-43任一项的方法，其中所述ECM在所述沉积过程中形成三维结构。
45.权利要求1-44任一项的方法，进一步包括骨替代物的沉积。
46.权利要求1-45的方法，其中所述表面是骨或包含骨。
47.权利要求45的方法，其中所述骨替代物被打印以对应所述组织的接受者的骨。
48.权利要求47的方法，其中该方法进一步包括产生所述组织的接受者的骨的三维映射，其中所述骨替代物被打印以对应所述三维映射。
49.权利要求47或权利要求48的方法，其中所述骨是头盖骨或面骨。
50.权利要求47或权利要求48的方法，其中所述骨是耳骨或指骨的骨。
51.权利要求47-50任一项的方法，其中所述细胞组合物被打印至所述骨或骨替代物上，从而所述细胞组合物至少部分覆盖所述骨或骨替代物的表面。
52.权利要求1的方法，其中所述组织包含(a)由具有内表面和外表面的骨组成的表面，和(b)两种细胞组合物，其中所述第一细胞组合物包含打印在所述内表面的第一细胞类型和打印在所述外表面的第二细胞类型。
53.权利要求1-52任一项的方法，其中所述沉积以三维方式进行。
54.权利要求53的方法，其中所述组织被打印至三维表面。
55.权利要求4的方法，其中使用具有多个打印头或多个打印喷嘴的打印机进行所述喷墨打印。
56.权利要求55的方法，其中每个所述打印头或打印喷嘴是分别可控的。
57.权利要求56的方法，其中每个所述打印头或打印喷嘴独立于剩余的所述打印头或打印喷嘴进行操作。
58.权利要求55-57任一项的方法，其中至少一个所述多个打印头或打印喷嘴打印所述细胞组合物，且至少另一个所述多个打印头或打印喷嘴打印所述ECM。
59.权利要求1的方法，其中所述细胞组合物和所述ECM在所述打印之前进行合并。
60.权利要求1-59任一项的方法，其中所述细胞组合物包含骨髓来源的间质干细胞(BM-MSC)。
61.权利要求1-59任一项的方法，其中所述细胞组合物包含组织培养塑料附着CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盘干细胞。
62.权利要求61的方法，其中所述胎盘干细胞额外是CD45–、CD80–、CD86–或CD90+一种或多种。
63.权利要求61或62的方法，其中所述胎盘干细胞抑制所述接受者中的免疫应答。
64.权利要求63的方法，其中所述胎盘干细胞抑制所述接受者中的局部免疫应答。
65.权利要求1-59任一项的方法，其中所述细胞组合物包含胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多功能干细胞、间充质干细胞、骨髓间充质干细胞(BM-MSC)、组织塑料吸附胎盘干细胞(PDAC)、脐带干细胞、羊水干细胞、羊膜来源的贴壁细胞(AMDAC)、成骨胎盘附着细胞(OPAC)、脂肪干细胞、缘干细胞、牙髓干细胞、成肌细胞、内皮祖细胞、神经干细胞、脱落的牙齿来源的干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、孤雌生殖来源的干细胞、重编程干细胞、羊膜来源的贴壁细胞或侧群干细胞。
66.权利要求1-59任一项的方法，其中所述细胞组合物包含分化细胞。
67.权利要求66的方法，其中所述分化细胞包括内皮细胞、上皮细胞、真皮细胞、内胚层细胞、中胚层细胞、成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、肝细胞、胰腺细胞或基质细胞。
68.权利要求66的方法，其中所述分化的细胞包含唾液粘液腺细胞、唾液浆液腺细胞、von Ebner腺细胞、乳腺细胞、泪腺细胞、聍腺细胞、外分泌汗腺暗细胞、外分泌汗腺清除细胞、顶泌汗腺细胞、Moll腺细胞、皮脂腺细胞、bowman腺细胞、Brunner腺细胞、精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细胞、Bartholin腺细胞、Littre腺细胞、子宫内膜细胞、分离的杯状细胞、胃粘膜粘液细胞、胃腺体酵母质细胞、腺胃泌酸细胞、胰腺腺泡细胞、潘氏细胞、II型肺泡细胞、克拉拉细胞、生长激素细胞、乳促素细胞、促甲状腺细胞、促性腺细胞、促皮质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠细胞、呼吸道细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、副甲状腺细胞、副甲状腺主细胞、嗜酸细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸间质细胞、鞘内细胞、黄体细胞、颗粒黄体细胞、鞘黄体细胞、近血管球细胞、致密斑细胞、极周细胞、系膜细胞、血管和淋巴管内皮窗状细胞、血管和淋巴管内皮连续细胞、血管和淋巴管内皮脾细胞、滑膜细胞、浆膜细胞(衬腹膜、胸膜和心包腔)、鳞状细胞、柱状细胞、暗细胞、前庭膜细胞(耳朵的衬内淋巴空间)、血管纹基底细胞，血管纹边缘细胞(耳朵的衬内淋巴空间)、Claudius细胞、Boettcher细胞、脉络丛细胞、软膜蛛网膜鳞片状细胞、色素睫状上皮细胞、非色素睫状上皮细胞、角膜内皮细胞、栓细胞、呼吸道纤毛细胞、输卵管纤毛细胞、子宫内膜纤毛细胞、睾丸网纤毛细胞、输出精小管纤毛细胞、纤毛室管膜细胞、表皮角质细胞，表皮基底细胞、手指甲和脚趾甲角质细胞、甲床基底细胞、脊髓毛干细胞、外皮毛干细胞、表皮毛干细胞、表皮毛根鞘细胞、Huxley层毛根鞘细胞、Henle层毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞、复层扁平上皮的表面上皮细胞、上皮基底细胞、泌尿上皮细胞、柯蒂氏器官听觉内毛细胞、柯蒂氏器官听觉外毛细胞、嗅上皮基底细胞、冷敏感的初级感觉神经元、热敏初级感觉神经元、Merkel表皮细胞、嗅觉受体神经元、痛觉初级感觉神经元、光受体视杆细胞、光受体蓝色敏感圆锥细胞、光受体绿色敏感圆锥细胞、光受体红色敏感圆锥细胞、本体感受初级感觉神经元、触摸感应初级感觉神经元、I型颈动脉体细胞、II型颈动脉体细胞(血液pH传感器)、耳前庭器官I型毛细胞(加速度和重力)、耳前庭器官II型毛细胞、I型味蕾细胞、胆碱能神经细胞、肾上腺素能神经细胞、肽能神经细胞、柯蒂氏器官内部支柱细胞、柯蒂氏器官外部支柱细胞、柯蒂氏器官内指骨细胞、柯蒂氏器官外指骨细胞、柯蒂氏器官边界细胞、柯蒂氏器官Hensen细胞、前庭器官支持细胞、味蕾支持细胞、嗅上皮支持细胞、Schwann细胞、卫星细胞、肠胶质细胞、星形细胞、神经原、寡树突细胞、纺锤体神经元、前晶状体上皮细胞、含晶体蛋白的晶状体纤维细胞、肝细胞、脂肪细胞、白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞、肝脂肪细胞、肾肾小球壁细胞、肾肾小球足细胞、肾近端小管刷状缘细胞、亨利氏套薄段细胞、肾远端小管细胞、肾集合管细胞、I型肺泡壁细胞、胰管细胞、无横纹管细胞、管细胞、肠刷状缘细胞、外分泌腺纹状管细胞、胆囊上皮细胞、输出精小管非纤毛细胞、附睾主细胞、附睾基底细胞、造釉上皮细胞、半月面上皮细胞、柯蒂氏器官牙齿之间上皮细胞、疏松结缔组织成纤维细胞、角膜基质细胞、肌腱成纤维细胞、骨髓网状组织成纤维细胞、非上皮成纤维细胞、周细胞、髓核细胞、成牙骨质细胞/牙骨质细胞、成牙质细胞、牙质细胞、透明软骨软骨细胞、纤维软骨软骨细胞、弹性软骨软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、骨先质细胞、玻璃体细胞、星状细胞(耳)、肝星状细胞(Ito细胞)、胰星状细胞、红色骨骼肌细胞、白色骨骼肌细胞、中间骨骼肌细胞、肌梭核袋细胞、肌梭核链细胞、卫星细胞、普通心肌细胞、节点心肌细胞、浦肯野纤维细胞、平滑肌细胞、虹膜肌上皮细胞、外分泌腺肌上皮细胞、网织红细胞、巨核细胞、单核细胞、结缔组织巨噬细胞、表皮Langerhans细胞、树突状细胞、小胶质细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、卵原细胞/卵母细胞、精子细胞、精母细胞、精原细胞、精细胞、卵巢卵泡细胞、Sertoli细胞、胸腺上皮细胞和/或间质肾细胞。
69.权利要求1-68任一项的方法，其中所述组织包含神经导管。
70.权利要求69的方法，其中所述神经导管由聚酐制成。
71.权利要求70的方法，其中所述聚酐是聚(邻羧基苯氧基)-对二甲苯)或聚(交酯-酸酐)。
72.权利要求69-71任一项的方法，其中所述神经导管使用所述聚酐通过所述喷墨打印沉积入所述组织。
73.权利要求69-71任一项的方法，其中所述神经导管在所述打印之前制备，并在所述组织的打印过程中被置于所述组织内。
74.权利要求72或权利要求73的方法，其中所述组织包含的所述神经导管适于移植入中枢神经系统(CNS)的损伤区域。
75.权利要求74的方法，其中所述CNS的区域是脊髓。
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