CN108543116A - 海藻酸钠与明胶复合水凝胶3d胰岛支架及其制备方法 - Google Patents

海藻酸钠与明胶复合水凝胶3d胰岛支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，包括通过3D打印制备的支架本体，所述支架本体的材料为海藻酸钠与明胶复合水凝胶，所述支架本体包括直径为10‑15mm，高为2.5‑5mm，壁厚为2.5‑5mm，容量为150‑300ul的圆柱体和直径为5‑8um，壁厚为2.5‑5mm的管道，所述圆柱支架为中空结构，所述圆柱支架设置有多个，多个所述圆柱支架通过所述管道连接，且具体公开了一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架的制备方法。本发明通过将海藻酸钠与明胶结合制成海藻酸钠与明胶复合水凝胶，结合3D打印技术，实现打印一种骨架更细、更薄、体积更小且为圆孔的3D胰岛支架，为胰岛细胞的营养物质、氧气和生物活性物质的输送提供合理的微环境。

Description

海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织支架的制备领域，尤其涉及一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架及其方法。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。
糖尿病又可以分为I型糖尿病和II型糖尿病。I型糖尿病是由于缺乏胰岛素导致的，可通过胰岛移植的治疗缓解症状，该过程需要从健康供体的胰腺上移植大量的细胞。这个方法会带来需要不断注射免疫抑制剂药物去避免受到外来细胞的排斥的问题，且免疫抑制类药物副作用较大。后来，人们提出了人工胰腺，人工胰腺的优点是可改善患者的血糖控制，减少低血糖的发生，缺点是不能很好地控制餐后血糖，有时需要辅以手动调节胰岛素输注。其原因在完全闭环的胰岛素泵中，系统并不能提前预知何时进餐，皮下胰岛素吸收延迟，使进餐早期的血糖高峰得不到有效控制，同时，餐后血糖的迅速升高有可能导致胰岛素输注过量，进而引发餐后晚期出现低血糖。类似的问题在运动引起的显著血糖变化时同样也存在。
通过结合3D技术，创建一种植入支架，该植入支架可以嵌入或者封装健康的胰岛细胞，而且这种植入物的结构和材料能够保证非常有效的氧气和营养的供给，以及胰岛素和葡萄唐的快速交换，同时将宿主细胞挡在外面，目前打印的这个植入支架，这种微小腺体是由一个细胞储存器容量为250ml，呈盘状直径为13mm，厚度为4.5mm，细胞储存容器里由200un*200un的微小方格构成，可以容纳一个胰岛。各个小方格之间由长50um，150*150um大小的管道相互连接。由于其骨架之间的结构太厚，会导致体积过大，且方形的孔与胰岛圆形或椭圆形的吻合不佳。此外胰岛的直径大小不一，尽管胰岛直径的主要是200μm，但仍然有大量的胰岛直径在100μm-150un和200-300um之间。孔径过大会导致大量胰岛无法放置于支架上的缺点。
发明内容
针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供一种优化的三维海藻酸钠-明胶水凝胶胰岛支架，能够通过3D打印技术，使用海藻酸钠-明胶复合水凝胶作为打印墨水，打印一种圆孔、骨架更细、更薄、体积更小的微小胰岛支架。
为实现上述目的，本发明提供一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，包括通过3D打印制备的支架本体，所述支架本体的材料为海藻酸钠与明胶复合水凝胶，所述支架本体包括圆柱支架和管道，所述圆柱支架为中空结构，所述圆柱支架设置有多个，多个所述圆柱支架通过所述管道连接，不同所述圆柱支架通过所述管道相互导通。
其中，所述海藻酸钠与明胶复合水凝胶包括海藻酸钠和明胶，所述海藻酸钠与所述明胶的质量比为2：10至2：15。
其中，所述海藻酸钠与明胶复合水凝胶包括海藻酸钠和明胶，所述海藻酸钠与所述明胶的质量比为2：15。
其中，所述圆柱支架的直径为10-15mm，高为2.5-5mm，壁厚为2.5-5mm，容量为150-300ul；所述管道的直径为5-8um，壁厚为2.5-5mm。
其中，所述圆柱支架的直径为10mm，高为2.5mm，壁厚为2.5mm，容量为200ul；所述管道的直径为5um，壁厚为2.5mm。
本发明还提供一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架的制备方法，用于制备上述中任一项所述的一种海藻酸纳与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，包括以下步骤：
打印材料的配置：海藻酸钠和明胶按质量比为2：10或1：10的比例配置，溶于0.9%的生理盐水中形成初步水凝胶，所述初步水凝胶与CaCI2溶液交联，静置24小时后配置成海藻酸钠与明胶复合水凝胶；
3D打印：利用Magics XR软件设计拟建圆孔柱体支架模型，在计算机上建立圆孔柱体支架的三维模型；将配置好的海藻酸钠与明胶复合水凝胶放置于三维生物打印机的喷头中，根据三维模型打印3D胰岛支架。
其中，所述初步水凝胶的配置方法为：在80℃恒温加热下，使用盐水搅拌溶解，获得海藻酸钠与明胶的复合溶液，复合溶液配制完成后，将其注入24 孔板，每孔各取1 mL，室温冷却30 min，形成初步水凝胶。
其中，所述海藻酸钠与明胶复合水凝胶的打印材料的浓度为1.5wt%、2.0wt%或2.5wt%。
其中，所述初步水凝胶与CaCI2溶液交联的具体方法为：用去离子水配置10%CaCI2溶液，加入24孔板，使钙离子与海藻酸钠中的羧基螯合成复合凝胶，每孔各取1ml，持续10min。
其中，所述3D打印过程中使用的打印针头直径为200-410μm，打印压力为0.9-1.5bar，打印速度为40~55mm/s，打印高度为10mm~55mm。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明提供的通过将海藻酸钠与明胶结合制成海藻酸钠与明胶复合水凝胶，极大地改善了凝胶的机械性能，且控制其比例，为得到孔径更小、骨架更薄的3D胰岛支架提供基础；通过结合3D打印技术，精确控制海藻酸钠与明胶复合水凝胶的流量、打印高度和打印的速度等实现打印一种实现了骨架骨架更细、更薄、体积更小，细胞的空间合理分布，且将3D胰岛支架孔径设计为圆孔，使得其与胰岛细胞更吻合，为细胞的营养物质、氧气和生物活性物质的输送提供合理的微环境，具有良好可重复性。
附图说明
图1为3D胰岛支架的圆柱支架结构示意图；
图2为海藻酸钠与明胶复合水凝胶对3D胰岛支架尺寸的影响图；
图3为打印高度对对3D胰岛支架尺寸的影响图；
图4为打印速度对3D胰岛支架尺寸的影响；
图5为胰岛细胞的染色活性检测结果;
图6为胰岛细胞的活性检测曲线。
主要元件符号说明如下：
1、圆柱支架 11、圆孔。
具体实施方式
为了更清楚地表述本发明，下面结合附图对本发明作进一步地描述。
海藻酸盐是一种从海带、巨藻等褐藻中提取的天然多糖。其微溶于水，安全，无毒，有良好的生物相容性和免疫原性，来源广泛，价格便宜的优势，但其存在着细胞附着位点少；
明胶是从胶原中提取的多肽物质，属于天然高分子生物材料，其主要成分为各种氨基酸，明胶基水凝胶因其优异的生物相容性、细胞黏附性、生物可降解性和生物活性因子负载能力等特点，但明胶基水凝胶热稳定性差，且降解速率过快无法与组织生长速率匹配。
本发明将海藻酸钠与明胶结合构成的复合水凝胶，其与细胞外基质具有化学相似性，且二者的结合也有效解决了传统水凝胶支架材料机械强度较弱的问题，明胶与海藻酸钠通过化学交联结合将有效二者的生物学稳定性与物理机械性能。
基于上述原理，本发明将经CaCI2交联后的海藻酸钠与明胶复合水凝胶作为浆料，打印3D胰岛支架，且由于胰岛直径主要在150-300 um之间，设计一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，该3D胰岛支架包括圆柱支架和管道，圆柱支架之间通过管道连接，圆柱支架的直径为10-15mm，高为2.5-5mm，壁厚为2.5-5mm，容量为150-300ul；管道的直径为5-8um，壁厚为2.5-5mm,一个圆孔柱体支架负载一个胰岛颗粒,如图1。
通过以下实施例实现以上目的：
实施例1
在80℃恒温加热下，使用盐水搅拌溶解，获得质量分数为2%海藻酸钠与10%明胶的复合溶液，复合溶液配制完成后，将其注入24 孔板，每孔各取1 mL，室温冷却30 min，形成初步水凝胶。之后，再用去离子水配制10%CaCI2溶液，加入24 孔板，使钙离子与海藻酸中的羧基螯合成复合凝胶，每孔同样各取1 mL，此过程持续10 min，静置24小时，由此获得海藻酸纳与明胶质量比为2:10的复合水凝胶，该复合水凝胶的溶胀率为660%～740%。
实施例2
在80℃恒温加热下，使用盐水搅拌溶解，获得质量分数为2%海藻酸钠与15%明胶的复合溶液。复合溶液配制完成后，将其注入24 孔板，每孔各取1 mL，室温冷却30 min，形成初步水凝胶。之后，再用去离子水配制10% CaCI2溶液，加入24 孔板，使钙离子与海藻酸中的羧基螯合成复合凝胶，每孔同样各取1 mL，此过程持续10 min，静置24小时，由此获得明胶与海藻酸纳质量比为15：2的复合水凝胶，该复合水凝胶的溶胀率为740%～820%。
由于不同质量比的海藻酸钠与明胶复合水凝胶对孔径及孔隙率的影响，其中，明胶与海藻酸钠质量比为15∶2 时，复合水凝胶展现出良好的微观形貌，孔径大小适宜且均一，溶胀率保持在660%～740%，有利于组织和细胞的生长、增殖及分化。
实施例3
（1）将海藻酸钠与明胶的质量比为15：2的复合溶液溶于浓度为0.9%的生理盐水溶液中，搅拌均匀，形成浓度为1.5wt%的初步水凝胶，之后，使浓度为10.0% CaCI2溶液与该初步复合水凝胶交联，静置24后得到海藻酸钠与明胶复合水凝胶；
将打印浆料放入三维打印机中打印含海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，其中三维打印机为德国的3D-bioplotter，针头使用410μm，打印压力1.5bar， 打印速度为50mm/s，打印高度25mm，打印料筒温度为30℃，打印平台温度为10℃。
实施例4
将海藻酸钠与明胶的质量比为15：2的复合溶液溶于溶度为0.9%的生理盐水溶液中，搅拌均匀，形成浓度为2.0wt%的初步水凝胶，之后，使浓度为10.0% CaCI2溶液与该初步复合水凝胶交联，静置24后得到海藻酸钠与明胶复合水凝胶。
将打印浆料放入三维打印机中打印海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，其中三维打印机为德国的3D-bioplotter，针头使用410μm，打印压力1.5bar， 打印速度为50mm/s，打印高度25mm，打印料筒温度为30℃，打印平台温度为10℃。
实施例5
将海藻酸钠与明胶的质量比为15：2的复合溶液溶于溶度为0.9%的生理盐水溶液中，搅拌均匀，形成浓度为2.5wt%的初步水凝胶，之后，使浓度为10.0wt% CaCI2溶液与该初步水凝胶交联，静置24后得到海藻酸钠与明胶复合水凝胶。
将打印浆料放入三维打印机中打印海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，其中三维打印机为德国的3D-bioplotter，针头使用410μm，打印压力1.5bar， 打印速度为50mm/s，打印高度25mm，打印料筒温度为30℃，打印平台温度为10℃。
结果如图2所述，随着海藻酸钠与明胶浓度的增加，海藻酸钠与明胶复合水凝胶的壁厚随之降低。
实施例6
将实施例5得到的海藻酸钠与明胶复合水凝胶浆料放置在打印机中，其中，针头使用410μm，打印压力1.5bar， 打印速度为45mm/s，打印高度25mm，打印料筒温度为30℃，打印平台温度为10℃。
实施例7
将实施例5得到的海藻酸钠与明胶复合水凝胶浆料放置在打印机中，其中，针头使用410μm，打印压力1.5bar， 打印速度为40mm/s，打印高度25mm，打印料筒温度为30℃，打印平台温度为10℃。
结果如图3，实施例5-7中得出打印速度越快，打印的海藻酸钠与明胶复合水凝胶的壁厚随之降低。
实施例8
将实施例5得到的海藻酸钠与明胶复合水凝胶浆料放置在打印机中，其中，针头使用410μm，打印压力1.5bar， 打印速度为50mm/s，打印高度55mm，打印料筒温度为30℃，打印平台温度为10℃。
实施例9
将实施例5得到的海藻酸钠与明胶复合水凝胶浆料放置在打印机中，其中，针头使用410μm，打印压力1.5bar， 打印速度为50mm/s，打印高度10mm，打印料筒温度为30℃，打印平台温度为10℃。
结果如图4，实施例5、实施8和9看出，随着打印高度的增大，海藻酸钠与明胶复合水凝胶的壁厚随之降低。
且从实施例3-9可看出，在针头使用410μm，打印压力1.5bar， 打印速度为55mm/s，打印高度55mm，打印料筒温度为30℃，打印平台温度为10℃时，正好打印出直径为10mm、厚度为2.5mm的胰岛支架。
实施例10
检测胰岛细胞的活性
配制质量比为15:2的海藻酸钠明胶溶液： 称取明胶5 g， 70℃溶解在无菌PBS 溶液中，0.22 μm 过滤除菌后，保存在37℃细胞培养箱中待用。吸取10 mL 上述无菌10%海藻酸钠与明胶溶液， 将高温高压灭菌的35g 海藻酸钠倒入明胶溶液中，磁力搅拌2 h，使海藻酸钠均匀溶解于明胶溶液中，2∶15 的海藻酸钠与明胶复合溶液配置完成。吸取上述海藻酸钠与明胶复合溶液4.5 mL 于无菌样品瓶中，加入细胞总量为2.3×106，体积为0.5 mL 的细胞悬浮液，磁力搅拌2 min 至均匀。用1 mL 针筒吸取300 μL，分别滴加到12 孔板中。孔板分3 组，每组3 孔， 分别为A （第1 天）、B （第3 天）、C （第7天）。将过滤除菌的2% CaCI2溶液缓慢滴加到上述4 种海藻酸钠与明胶溶液中，凝胶15 min，以负压吸引器吸出多余的CaCI2溶液，并用无菌PBS 溶液清洗。滴加2 mL 含10%胰岛细胞 的DMEM F12 培养基，37℃下于细胞培养箱中放置30 min，分别培养1、3、7 d，检测细胞成活率。
图5分别为3D 培养胰岛细胞第1 天、第3 天、第7 天的活、死细胞染色分析结果，结合image-proplus 6.0 分别计数活、死细胞个数，并计算细胞成活率（图6），发现细胞在此种复合水凝胶中生长状态良好，并保持着较高的成活率。
本发明的优势在于：
（1）通过将海藻酸钠与明胶结合制成海藻酸钠与明胶复合水凝胶，极大地改善了凝胶的机械性能，且控制其比例，为得到孔径更小、骨架更薄的胰岛支架提供基础；
（2）通过结合3D打印技术，精确控制海藻酸钠与明胶复合水凝胶的流量、打印高度和打印的速度等实现打印一种骨架更细、更薄、体积更小，细胞的空间合理分布，且将胰岛支架孔径设计为圆孔，使得其与胰岛细胞更吻合，为细胞的营养物质、氧气和生物活性物质的输送提供合理的微环境，具有良好可重复性。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，其特征在于，包括通过3D打印制备的支架本体，所述支架本体的材料为海藻酸钠与明胶复合水凝胶，所述支架本体包括圆柱支架和管道，所述圆柱支架为中空结构，所述圆柱支架设置有多个，多个所述圆柱支架通过所述管道连接，不同所述圆柱支架通过所述管道相互导通。
2.根据权利要求1所述的一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，其特征在于，所述海藻酸钠与明胶复合水凝胶包括海藻酸钠和明胶，所述海藻酸钠与所述明胶的质量比为2：10至2：15。
3.根据权利要求2所述一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，其特征在于，所述海藻酸钠与明胶复合水凝胶包括海藻酸钠和明胶，所述海藻酸钠与所述明胶的质量比为2：15。
4.根据权利要求1所述的一种海藻酸纳与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，其特征在于，所述圆柱支架的直径为10-15mm，高为2.5-5mm，壁厚为2.5-5mm，容量为150-300ul；所述管道的直径为5-8um，壁厚为2.5-5mm。
5.根据权利要求4所述的一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，其特征在于，所述圆柱支架的直径为10mm，高为2.5mm，壁厚为2.5mm，容量为200ul；所述管道的直径为5um，壁厚为2.5mm。
6.一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架的制备方法，用于制备上述权利要求1-5中任一项所述的一种海藻酸纳与明胶复合水凝胶3D胰岛支架，其特征在于，包括一下步骤：
打印材料的配置：海藻酸钠和明胶按质量比为2：10或1：10的比例配置，溶于0.9%的生理盐水中形成初步水凝胶，所述初步水凝胶与CaCI2溶液交联，静置24小时后配置成海藻酸钠与明胶复合水凝胶；
3D打印：利用Magics XR软件设计拟建圆孔柱体支架模型，在计算机上建立圆孔柱体支架的三维模型；将配置好的海藻酸钠与明胶复合水凝胶放置于三维生物打印机的喷头中，根据三维模型打印3D胰岛支架。
7.根据权利要求5所述的一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架的制备方法，其特征在于，所述初步水凝胶的配置方法为：在80℃恒温加热下，使用盐水搅拌溶解，获得海藻酸钠与明胶的复合溶液，复合溶液配制完成后，将其注入24 孔板，每孔各取1 mL，室温冷却30 min，形成初步水凝胶。
8.根据权利要求6所述的一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠与明胶复合水凝胶的打印材料的浓度为1.5wt%、2.0wt%或2.5wt%。
9.根据权利要求6所述的一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架的制备方法，其特征在于，所述初步水凝胶与CaCI2溶液交联的具体方法为：用去离子水配置10%CaCI2溶液，加入24孔板，使钙离子与海藻酸钠中的羧基螯合成复合凝胶，每孔各取1ml，持续10min。
10.根据权利要求6所述的一种海藻酸钠与明胶复合水凝胶3D胰岛支架的制备方法，其特征在于，所述3D打印过程中使用的打印针头直径为200-410μm，打印压力为0.9-1.5bar，打印速度为40~50mm/s，打印高度为10mm~55mm。
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