CN114870093A - 基于数字光处理的3d打印组织工程胰岛及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于3D生物打印技术领域，具体涉及一种基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛及其制备方法和用途。针对现有的3D打印制备胰岛存在着耗时长，打印得到的细胞活性低，胰岛细胞容易渗漏出封装装置等缺陷，本发明提供了一种基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法，采用中间部位是一个凹槽的圆形图案光，采用甲基丙烯酸化水凝胶溶液溶解于光引发剂为生物打印墨水，固化20秒，逐层打印，得到了直径为7‑12mm，高度为0.5‑2mm的迷你工程胰岛。本发明制备的工程胰岛具有防止胰岛细胞渗漏、胰岛细胞存活率高以及宿主免疫系统对植入材料的反应免疫原性低等特点，有重要科学意义和潜在的临床转化前景，也为未来能为I型糖尿病的临床治疗提供了新的思路。

Description

基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于3D生物打印技术领域，具体涉及一种基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛及其制备方法和用途。

背景技术

I型糖尿病(Type1diabetes，T1D)又被称为胰岛素依赖型糖尿病(Insulin-dependentdiabetesmellitus，IDDM)，I型糖尿病在糖尿病患者人群中大约占5％，它是一种慢性的多因素自身免疫疾病，其发病机制是免疫系统攻击自身胰岛，造成分泌胰岛素的胰岛β细胞损伤或死亡，最终导致高血糖症。目前，全球范围内I型糖尿病还缺乏有效的治疗方法，而临床上对于1型糖尿病的治疗主要集中在以下三个方面：(1)外源胰岛素注射：尽管该治疗方式能有效改善糖代谢，提高患者生存质量，但这种治疗不能模拟胰腺β细胞的实时胰岛素分泌模式，导致部分患者遭受眼部、肾脏、神经等终末端器官并发症的折磨，而必须接受其他临床治疗。(2)实体胰腺器官移植。(3)胰岛移植。胰腺器官移植和胰岛移植都存在供体来源缺乏，治疗费用昂贵，存在难以避免的移植后免疫排斥反应，而导致治疗失败等问题。胰岛移植为T1D患者提供了新的治疗方法，因为移植胰岛可以避免胰岛素注射引起的并发症，同时也能降低整个胰腺移植的风险。然而，受体对移植细胞的免疫排斥大大限制了胰岛移植的治疗应用。

因此，将胰岛细胞封装后进行体内移植是重要的发展方向。理想的包封装置需要满足以下四个条件：(1)有一定大小的孔径能够给细胞提供充足的血供和氧气，以维持细胞的存活和功能；(2)具有良好的生物相容性；(3)能够为细胞提供免疫保护的微环境，尽可能降低免疫排斥；(4)使分泌的胰岛素能排出装置，经体循环转运出去。

目前胰岛封装技术主要包括纳米粒、微胶囊、宏封装和3D生物打印。使用纳米粒和微胶囊化进行封装，由于所植入的胶囊不能准确定位在体内某一位置，如发生移植失败的情况，微胶囊和纳米粒不能完全从患者身上移除，存在一定的生物安全问题。相比之下，宏封装方式生物安全性更高，多个胰岛可以植入到同一设备中，移植后也容易回收。但宏封装方式的氧气和血流供应较差，不适宜所移植胰岛的长期生存，难以临床转化。因此，研发出既能保证细胞长期存活，并且能持续分泌胰岛素又能保护移植后的细胞免受受体免疫系统攻击的封装装置至关重要。

3D打印技术是一种增材制造技术，其能够借助CAD技术在制造过程中精确地沉积细胞、生物材料和生物活性因子，从而更好地模拟不同组织/器官的复杂结构和微环境。

目前大部分研究都是利用挤压式和喷墨式3D打印技术制备组织工程胰岛，但这些技术面临一些障碍。例如，挤压式和喷墨式3D打印喷嘴容易堵塞并发热，同时高剪切应力会影响细胞的活力。因此，要制造有生命和功能的生物器官，压力和喷嘴直径的选择必须与细胞类型保持一致。并且，现有的3D打印制备工程胰岛时，是将分离的胰岛再进一步消化成单细胞悬液之后将含胰岛细胞的混合培养液注入生物相容性支架上；或者将生物相容性支架材料与含胰岛细胞的混合培养液进行混合，通过3D生物打印制成人造胰腺组织。但这种方式构建的人造胰腺组织细胞的活性会大打折扣，众所周知，胰岛细胞的存活依赖于三维基质环境，当外部环境不能维持胰岛的立体结构时，胰岛细胞会逐渐凋亡，最后会造成胰岛细胞移植治疗的效果不佳。

综上可见，亟待开发一种新的适用于3D打印工程胰岛的方法，以便高效获取大量的活性好的工程胰岛，为后续的细胞治疗提供依据。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有的3D打印制备胰岛存在着打印喷嘴容易堵塞并发热，同时打印过程中的高剪切应力会影响细胞的活力，耗时长，打印完的细胞活性低，胰岛细胞容易渗漏出封装装置等缺陷。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种基于数字光处理的3D 打印组织工程胰岛的制备方法。该方法包括以下步骤：

a、在计算机上预先设计出能装载胰岛的图案形状，为中间部位是一个凹槽的圆形，凹槽深度为0.5-2mm；采用可见光固化生物打印墨水，固化时间为0-1 分钟，再按照图案光的设定进行逐层打印凹槽结构，每层曝光时间为5-40秒；

b、按照图案光的形状，在凹槽部位添加混合了胰岛细胞的生物打印墨水，再次进行15-25秒的光固化；通过DLP-3D逐层打印，得到了直径为7-12mm，高度为0.5-2mm的迷你胶囊，为DLP-3D得到的组织工程胰岛。

其中，上述基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法中，步骤a 所述的可见光波长为400-410nm。优选为405nm。

其中，上述基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法中，所述的生物打印墨水为甲基丙烯酸化水凝胶溶液溶解于光引发剂中制备而成。

进一步的，上述基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法中，所述的生物打印墨水中含有5-15％的甲基丙烯酸化水凝胶和0.025-0.075％的光引发剂。

其中，上述基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法中，所述的光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂或2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中的任意一种。

其中，上述基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法中，所述的光引发剂预热至温度为30-40℃。

其中，上述基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法中，步骤b 所述混合了胰岛细胞的生物打印墨水中胰岛细胞浓度为50-300个小胰岛。

其中，上述基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法中，步骤b 所述的光固化时间优选为20秒。

本发明还提供了一种由上述方法制备得到的组织工程胰岛。

本发明还提供了一种上述组织工程胰岛在制备治疗糖尿病的药物中的用途。

进一步的，上述组织工程胰岛在制备治疗糖尿病的药物中的用途中，所述的糖尿病为I型糖尿病。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法，采用特别筛选的生物打印墨水和DLP-3D打印技术制备了可回收的迷你胶囊装置，用于胰岛的递送并对糖尿病小鼠进行体内移植，本发明筛选得到GelMA20秒为DLP-3D打印最合适的光固化时间，能保证细胞具有高活率，且移植到免疫系统完整的小鼠皮下时引起的免疫原性低，同时，封装后的胰岛在不使用免疫抑制剂的条件下可长期(大于3个月)、有效改善STZ诱导的高血糖症状。本发明制备的工程胰岛具有防止胰岛细胞渗漏、胰岛细胞存活率高以及宿主免疫系统对植入材料的反应免疫原性低的特点，有重要科学意义和潜在的临床转化前景，也为未来能为I型糖尿病的临床治疗提供了新的思路。

附图说明

图1所示为计算机上预先设计的逐层固化凹槽装置的图案光形状，A图为凹槽装置的底，B图为凹槽装置四周的环。

图2所示为不同曝光时间下水凝胶的孔隙。

图3所示为CCK8测定不同曝光时间下3T3细胞增殖情况。

图4所示为不同曝光条件下的体内免疫反应测试，A图为不同曝光时间下α-SMA和CD45的免疫荧光图；B图为免疫细胞浸润深度统计；C图为胶原堆积荧光统计。

图5所示为3D打印凹槽装置的示意图。

图6所示为打印完成的迷你胶囊装置示意图。

图7所示为迷你胶囊装载胰岛植入糖尿病小鼠体内一个月血糖检测。

图8所示为迷你胶囊装载胰岛植入糖尿病小鼠体内长期血糖检测。

图9所示为体外测定胰岛的葡萄糖刺激胰岛素分泌实验。

图10所示为回收移植物进行体外的葡萄糖刺激胰岛素分泌实验。

图11所示为不同时间点的腹腔糖耐量实验及其统计。

图12所示为3D打印的胰岛封装装置图；A图为没有凹槽结构的封装系统； B图为凹槽结构装载胰岛的封装系统，左侧将装置倒置放置，右侧将装置正置放置，没有凹槽结构的封装装置中，胰岛细胞迅速沉降到底部，细胞逐渐渗漏出装置；而有凹槽结构的封装装置中胰岛细胞在始终位于装置的中间层，不容易渗漏。

图13所示为封装后胰岛的形态；A图为共聚焦显示胰岛在水凝胶中的状态； B图为扫描电镜显示胰岛形态结构的完整性。

图14所示为封装后胰岛体外相容性测试；A图为胰岛细胞死活染色，红色代表死细胞，绿色代表活细胞；B图为对细胞的活率进行统计。

图15所示为装载胰岛的迷你胶囊装置植入体内后的免疫反应，分别测定胶原相关指标α-SMA，免疫细胞指标CD45，巨噬细胞指标F4/80与iNOS。

图16所示为对免疫反应相关指标的荧光统计。

图17所示为回收不同时间点的移植物对切片中胰岛数目进行统计。

图18所示为移植完成15周后回收移植物进行胰岛标记物的免疫荧光染色。

具体实施方式

本发明提供了一种基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法，包括以下步骤：

a、在计算机上预先设计出能装载胰岛的图案形状，为中间部位是一个凹槽的圆形，凹槽深度为0.5-2mm；采用可见光固化生物打印墨水，固化时间为0-1 分钟，所述生物打印墨水为将甲基丙烯酸化水凝胶GelMA溶于30-40℃的光引发剂中制成，含有5-15％的甲基丙烯酸化水凝胶和0.025-0.075％的光引发剂；再按照图案光的设定进行逐层打印凹槽结构，每层曝光时间为5-40秒；

b、按照图案光的形状，在凹槽部位添加混合了胰岛细胞的生物打印墨水，再次进行15-25秒的光固化；通过DLP-3D逐层打印，得到了直径为7-12mm，高度为0.5-2mm的迷你胶囊，为DLP-3D得到的组织工程胰岛。

其中，上述基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法中，步骤b 所述混合了胰岛细胞的生物打印墨水中胰岛细胞浓度为50-300个小胰岛。

本发明还提供了一种由上述方法制备得到的组织工程胰岛。

本发明还提供了一种上述组织工程胰岛在制备治疗糖尿病的药物中的用途。

进一步的，上述组织工程胰岛在制备治疗糖尿病的药物中的用途中，所述的糖尿病为1型糖尿病。

数字光处理(DLP)3D打印技术是一种光学辅助打印技术，它利用计算机辅助设计来交叉连接光学聚合物来构建材料。该技术使用光投影以“一层一层”的固化方式创建3D对象，显示出高分辨率、快速打印速度和灵活性的卓越性能。相比于挤压和喷墨3D打印技术，DLP-3D打印不仅精度高、速度快，而且有利于结构的定制/个性化。然而，由于胰岛细胞的活性常常依赖于胰岛整体形态结构的完整性，即胰岛表面包膜的完整性对于完整结构的维持至关重要。如果直接封装胰岛细胞，胰岛又会因为自身重力而迅速沉降。之前的报道3D打印技术都是将分离的胰岛细胞再次进行消化成单细胞进行3D打印，分散的单细胞悬液活性低，难以达到细胞治疗的效果。因此，目前还未见有采用DLP-3D打印技术制备组织工程胰岛的报道。

本发明通过设计图案光，如图1所示，图案中的凹槽结构，能解决封装系统中面临的胰岛细胞因重力沉降而渗漏出封装装置的问题。此外，DLP-3D打印过程较为温和，可以一次性打印大量的胰岛细胞，且能高效维持细胞活力。

本发明在DLP-3D打印时，采用了甲基丙烯酸化水凝胶来制备生物打印墨水，GelMA是一种光敏生物水凝胶材料，来源于天然的胶原蛋白，由甲基丙烯酸酐和明胶制备而成。该材料具有良好的化学可调性和生物相容性。它可以通过紫外光或可见光固化反应激活，为多种细胞提供合适的生存环境。这种材料的这些特性非常适合用于组织工程支架。通过改变凝胶浓度或打印时间等一系列参数，可以有效地控制凝胶的孔隙和硬度。合适的GelMA水凝胶孔隙能使胰岛被包裹后能够进行物质交换，从而使细胞具有较高的活性。在合适的硬度下，GelMA水凝胶可以很容易地回收，安全性高。因此，GelMA水凝胶可以满足对胰岛细胞封装的要求。因此，本发明采用GelMA作为DLP-3D打印的生物打印墨水。

根据发明人的筛选实验发现，增加GelMA预聚物的浓度(>15w/v％)会导致 GelMA水凝胶中的细胞活力下降。相比之下，当GelMA浓度显著较低(<5w/v％) 时，会导致印刷过程中的光固化效果较差，得到的水凝胶更容易膨胀，没有足够的机械强度维持水凝胶支架在初始几何形状。与5％(w/v)GelMA水凝胶相比， 10％(w/v)GelMA水凝胶的水凝胶网络更紧凑，压缩模量更高，溶胀性能显著降低。因此，我们采用的生物打印墨水中，GelMA浓度优选为5-15％，更优选为 10％。

在制备生物打印墨水时，本发明将GelMA溶解于光引发剂中，本发明通过筛选，发现采用苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂(LAP)或2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)作为引发剂效果最好。LAP交联极其迅速，且可由405nm波段的蓝光激发，对细胞几乎没有损伤。I2959交联过程缓和，更利于需要精确控制固化过程的3D打印方向应用。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例1DLP-3D打印水凝胶在不同曝光时间下的表征

为了探索不同曝光时间下水凝胶的性质，将10％的GelMA溶液进行不同时间的聚合，得到GelMA5s、GelMA10s、GelMA20s和GelMA40s水凝胶。用于水凝胶定制的DLP-3D打印机的示意图如图1所示。利用扫描电镜(SEM)对 GelMA5s、GelMA10s、GelMA20s和GelMA40s水凝胶的微观结构进行了观察，结果如图2所示。

由图可见，所有水凝胶结构致密，孔隙大小不一，随着曝光时间的延长，水凝胶的孔隙逐渐变小。然而，维持细胞在水凝胶材料中的生物活性是有效治疗的关键。水凝胶孔隙的大小可能会对水凝胶材料中细胞的生物活性产生影响。

因此，我们采用CellCountingKit-8(CCK8)实验检测不同暴露时间获得的水凝胶对细胞活力的影响。结果如图3所示：GelMA5s水凝胶的OD值明显高于其他各组；第7天结束时，GelMA5s与GelMA20s差异无统计学意义；GelMA 10s和GelMA40s的OD值显著低于GelMA20s。同时，一种理想的植入材料还应当能够逃脱体内的免疫排斥，也就是异物反应(FBR)。考虑到FBR产生的纤维性沉积可能会阻碍物质运输并对被封装细胞的功能造成负面影响，我们接下来评估了不同暴露时间下获得的水凝胶的体内生物相容性。

将水凝胶皮下置入到免疫系统完整的C57BL/6小鼠体内2周后，通过平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CD45的免疫荧光显示，GelMA5s和GelMA10秒相比GelMA20秒和GelMA40秒形成更多的纤维化沉积和急性炎症反应(如图4A 所示)。GelMA20秒水凝胶与GelMA40s水凝胶的免疫细胞浸润深度没有显著差异；GelMA20秒胶原沉积比例高于GelMA40秒(如图4B、C所示)。在四组中，GelMA40秒引起的纤维沉积和免疫排斥最小，可能是由于其致密的结构和低孔隙率。由于GelMA水凝胶需要承载胰岛细胞进行物质交换，孔隙率低会面临氧气供应不足，导致细胞坏死，最后，胰岛素合成和分泌受阻，无法达到移植治疗的目的。因此综合考虑细胞存活和免疫排斥的影响，我们最终选择GelMA 20秒作为DLP-3D打印的最佳条件。

实施例2设计、制备DLP-3D打印组织工程胰岛

将GelMA溶于37℃的光引发剂(LAP)溶液中，形成含有10％GelMA(w/v) 和0.05％LAP的生物打印墨水。同时在计算机上预先设计出能装载胰岛的图案形状(如图5所示)，利用波长为405nm的可见光固化GelMA溶液。随后按照图案光的设定进行逐层打印凹槽结构，每层曝光时间为20秒。最后在凹槽结构的中间添加混合了胰岛细胞的GelMA生物墨水，再次进行20秒的光固化。通过 DLP-3D逐层打印，最终得到了直径为9mm，高度为1mm的迷你胶囊，即为3D 打印的组织工程胰岛(如图6所示)。

实施例3胰岛细胞的分离、培养及移植

胰岛从8-10周龄的雄性C57BL/6小鼠中分离，通过胆总管将胶原酶XI溶液注入到胰腺组织中，充分使胰腺组织膨胀，然后取出胰腺。将分离得到的胰腺置入含有胶原酶XI的缓冲液中，37℃水浴消化15分钟后加入预冷的含CaCl₂的 HBSS溶液终止消化。接着4℃，290g离心30秒后弃上清，将沉淀重悬后再次4℃， 290g离心30秒后弃上清，通过滤器倒置冲洗胰岛细胞至新的培养皿中，通过在显微镜下手动拣选胰岛并进行计数。收集到的胰岛细胞被重悬在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃培养。

分离得到的胰岛细胞经计数后进行3D打印得到组织工程胰岛，3D打印完成后的组织工程胰岛进行移植；体内治疗实验每只小鼠移植数量为250个胰岛 (约150个IEQ)。

利用链脲佐菌素(STZ)对C57BL/6小鼠进行多次(连续5天)低剂量(50mg/kg) 的建模。在进行移植时，只有连续两次非空腹血糖水平超过300mg/dl的小鼠被认为是糖尿病，因此被选择用于移植治疗。用异氟烷吸入法麻醉糖尿病小鼠，剃除移植部位的毛发，接着用碘伏擦拭小鼠背部皮肤表面，对其表面进行消毒。然后，将小鼠的背部皮肤切开。用手术镊子分离皮肤黏膜，将迷你胶囊植入皮下组织，用可吸收的手术线缝合伤口，作为实验组。移植未封装的胰岛细胞：用生理盐水重悬胰岛细胞后，在每只小鼠的背侧皮下注射250个胰岛，作为单独移植未封装的胰岛组。阳性对照组是未建模的正常小鼠，阴性对照组是建模后未进行处理的糖尿病小鼠。每组设置重复为5-15只小鼠。

(1)血糖监测及葡萄糖功能测定

经移植治疗的小鼠每周两次测量血液中的葡萄糖水平：使用1毫升注射器从的尾静脉取血，使用专业血糖仪(Accu-Chek)分析葡萄糖水平。结果如图7和图8 所示。由图可见，经过一个月以及长达15周的监测，接受3D打印胰岛移植的小鼠的高血糖症状得到了快速有效的缓解，血糖从600mg/dL下降到200-300mg/dL，而阴性对照组一直是持续高血糖的状态，移植未经封装的小鼠胰岛的血糖虽然在短时间内得到了减缓，但马上又恢复了高血糖状态，可能的原因是移植的胰岛在皮下存活率不高以及容易被体内免疫系统攻击从而导致移植失败。

因此，可见，本发明的组织工程胰岛移植后也具有很强的活性，并且活性持久，治疗效果好。

(2)静态葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)

所有样品用KRBH缓冲液冲洗三次，然后在KRBH缓冲液中37℃中平衡 30分钟。接下来，样品在含有2.8mM葡萄糖的KRBH缓冲液中，37℃孵育1 小时。收集上清液后，将样品转移到含有20mM葡萄糖的KRBH缓冲液中，继续收集上清液1小时。最后，将样品置于酸/乙醇溶液中-20℃，过夜放置来对样本中的胰岛素总量进行抽提，采用MercodiaUltrasensitiveMouseInsulin ELISA(10-1249-01)试剂盒测定所有样本的胰岛素浓度。结果如图9和10所示。

体外的葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)实验主要是为了验证胰岛经3D打印封装后是否仍然具有物质运输能力。实验组是经3D打印封装后的胰岛，对照组是直接培养在孔板中的胰岛细胞。体外的结果说明了，经封装后的胰岛仍然能对不同的葡萄糖浓度刺激做出反应，即低糖浓度分泌较少的胰岛素，高糖浓度分泌大量胰岛素。封装后的胰岛的功能与未封装的胰岛相似，说明本发明设计的封装系统能保证胰岛细胞的物质运输及功能。同时，本试验也证实了本发明的封装系统的长期有效性，能保证细胞的长期存活和功能完善。

(3)腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)

各组小鼠禁食8-12小时后，腹腔注射无菌葡萄糖溶液(Sigma-Aldrich)，剂量为每千克体重注射2克葡萄糖。分别在注射葡萄糖后0、15、30、60、90和120 分钟测定血糖水平，以便计算和分析各组的曲线下面积(AUC)。结果如图11所示。通过统计分析各组腹腔葡萄糖耐量试验曲线下面积，表现出接受封装后胰岛移植的小鼠能在2小时内清除外源注射的葡萄糖，表征其葡萄糖代谢能力得到了提高。而接受未封装胰岛移植的小鼠表现出和阴性对照组相似的葡萄糖代谢能力，即外源注射的葡萄糖不能在2小时内被清除。

实施例4封装胰岛的设计、制备和表征

由于胰岛移植后常发生免疫损伤，因此，本发明利用生物材料对胰岛进行封装能保护胰岛在移植后免受免疫损伤。基于实施例3所示的水凝胶在不同曝光时间下的生物相容性，我们首先将100个小岛(≈60IEQ)与GelMA溶液混合直接打印。然而，由于胰岛本身的重力作用，在3D打印过程中，胰岛会迅速沉降到水凝胶底部(如图12所示)，导致固化不完全，胰岛会慢慢从水凝胶底部渗漏，这个结果一方面会导致移植数量的显著减少，另一方面胰岛的持续渗漏将成为宿主免疫系统的目标。因此，我们设计并构建了一个凹槽结构的水凝胶来封装胰岛小岛(相关实验操作见实施例2)。共聚焦显微镜和扫描电镜结果显示，被封装的胰岛在体外培养7天后形态和球形结构保持完整(如图13所示)。培养7天后，活/死染色结果显示，GelMA20秒水凝胶封装的胰岛细胞与分散在组织培养板上的胰岛细胞相比，有较高的活力。说明本实验中封装的胰岛具有良好的生物相容性(如图14所示)。

同时，为了评价封装后胰岛的物质运输能力，我们将3D打印的胰岛在体外培养7天，然后进行葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)试验。结果显示，GelMA20 秒水凝胶封装的胰岛细胞能够在不同浓度的葡萄糖水平下分泌胰岛素(相关实验操作见实施例3中(2)。表明封装后的胰岛的物质运输不受影响。这些体外实验证明，迷你胶囊装置能够满足细胞封装的基本要求，能为胰岛细胞提供合适的生存环境，保证其高存活率和葡萄糖反应能力，表明该装置具有良好的生物相容性。

为了检测迷你胶囊装置引起的免疫反应，我们将250个胰岛(≈150IEQ) 均匀植入到迷你胶囊装置中，并将其移植到具有免疫系统完整的C57BL/6小鼠的背侧皮下间隙。4周后取出移植物进行免疫荧光染色和葡萄糖刺激胰岛素分泌 (GSIS)实验。结果显示，迷你胶囊装置胶原纤维沉积量较少(1.410±0.3078％α-SMA)，CD45阳性细胞比例仅为1.455±0.5438％。进一步分析在异物反应发生过程中发挥重要作用的巨噬细胞的分布，在取出的移植物中，每个视野的 F4/80(0.7620±0.3189％)和iNOS(0.6572±0.2994％)的表达极低(如图15、16所示)。

通过该部分的实验结果说明了我们制备的迷你胶囊装置在体内具有较低的免疫反应，能够保护移植的胰岛细胞免受宿主免疫系统的排斥。我们移植的未封装的胰岛是通过皮下注射移植的，胰岛注射后就游离分散到小鼠其他部位，之前我们也尝试过使用DIL或DIR染料来标记胰岛细胞，想观察未封装的胰岛最终定位到哪里，但遗憾的是这种通过染料标记的方式不能通过活体成像仪检测到，由此移植的未封装的胰岛一方面不能回收，另一方面不能准确的知道胰岛细胞最后去哪里了，这跟临床上通过肝门静脉移植胰岛面临着相同的缺陷，即胰岛不能准确地定位在某特定位置，安全性不高。而我们设计的迷你胶囊装置就植入在皮下，肉眼能监测移植物的情况，当发生副反应时，可以随时取出移植物，安全性高。

同时，我们监测了移植过程中小鼠的血糖水平。结果表明，接受迷你胶囊装置移植的小鼠与STZ诱导的糖尿病C57BL/6J小鼠相比，能明显缓解高血糖症状 (相关实验操作见实施例3中(1))。我们进行GSIS测试来分析回收的移植物是否仍然具有功能。结果显示，移植后4周，回收的移植物在不同的葡萄糖浓度下仍能分泌胰岛素，表明封装的胰岛确实对改善小鼠的高血糖有显著作用(相关实验操作见实施例3中(2))。因此，上述实验结果表明，迷你胶囊装置具有理想的传质能力和免疫保护功能。

实施例5本发明制备的封装胰岛的长期治疗效果

实验组有两部分，一组是移植了本发明凹槽封装的胰岛，另一组是移植未经封装的胰岛细胞。阴性对照组是未移植任何胰岛的糖尿病模型小鼠，阳性对照组是未建模的健康小鼠。

为了证明封装的胰岛在长期改善血糖方面的潜在治疗作用，我们将含有250 个胰岛(≈150IEQ)的装置皮下植入STZ诱导的糖尿病C57BL/6J小鼠进行长达15周的监测。前四周每周监测两次随机非空腹血糖水平，之后每周至少监测一次。值得注意的是，我们发现，与STZ诱导的糖尿病小鼠相比，所有接受迷你胶囊装置移植的小鼠的高血糖症状都获得了长期改善(相关实验操作见实施例 3中(1))。常规检测移植胰岛的葡萄糖代谢功能的方法是腹腔葡萄糖耐量试验 (IPGTT)，因此我们在移植完成后的第3周、第9周和第15周对小鼠进行了糖耐受试验。我们发现，与STZ诱导的糖尿病C57BL/6J小鼠相比，植入迷你胶囊装置的小鼠能够在2小时内消除外源注射的葡萄糖(相关实验操作见实施例3 中(3))，从而改善糖代谢。同时，在第3、9、15周时，通过免疫荧光染色，统计胰岛数量。我们发现第9周和第15周胰岛数量略低于第3周，但三组间的差异无统计学意义(P＝0.0924)(如图17所示)。在第15周对回收的装置进行染色 (INS标记β细胞；GCG标记α细胞)(如图18所示)和不同时间点切片胰岛数量统计显示，迷你胶囊装置能够维持移植胰岛细胞的长期存活，防止胰岛渗漏。值得注意的是，尽管不是所有接受迷你胶囊装置移植的小鼠都能长时间恢复正常血糖值(<200mg/dL)，但我们观察到非空腹血糖和葡萄糖代谢功能有显著改善。换言之，血糖水平的改善在临床上可以转换为外源性胰岛素需求的减少，增加葡萄糖的稳定性，从而减少高血糖引起的并发症，提高糖尿病患者生活质量。

由上述实施例可知，本发明设计了一种凹槽结构防止胰岛渗漏，通过逐层打印，DLP-3D打印迷你胶囊装置所具有的凹槽结构不但能装载大量的胰岛细胞，而且有效防止移植的胰岛渗漏，制备的迷你胶囊装置模拟胰岛的体内三维支撑环境。封装后的胰岛细胞形态结构完整，体外培养活性高，同时在体外培养过程中能对不同浓度的葡萄糖刺激做出响应，且具有良好的生物相容性。进行皮下移植迷你胶囊装置创面小、免疫原性低。迷你胶囊装置用于递送胰岛进行体内移植所引起的免疫反应低，在不使用任何免疫抑制治疗的前提下可以有效地保护胰岛免受宿主免疫系统的攻击，可有效改善STZ诱导的高血糖症状至少3个月。不同时间点的体内腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)显示了治疗相关的葡萄糖代谢功能的改善。移植完成15周后取出的移植体仍含有大量存活的胰岛细胞。作为临床前研究的概念性验证，我们评估了用于治疗1型糖尿病小鼠的迷你胶囊装置递送胰岛的可行性和安全性(易于移植、监测和移除)，因此，我们的结果表明，DLP-3D 打印的迷你胶囊装置具有临床转化应用的前瞻性价值。

Claims (10)

1.基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、在计算机上预先设计出能装载胰岛的图案形状，为中间部位是一个凹槽的圆形，凹槽深度为0.5-2mm；采用可见光固化生物打印墨水，固化时间为1分钟，再按照图案光的设定进行逐层打印凹槽结构，每层曝光时间为5-40秒；

b、按照图案光的形状，在凹槽部位添加混合了胰岛细胞的生物打印墨水，再次进行15-25秒的光固化；通过DLP-3D逐层打印，得到了直径为7-12mm，高度为0.5-2mm的迷你胶囊，为DLP-3D得到的组织工程胰岛。

2.根据权利要求1所述的基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法，其特征在于：步骤a所述的可见光波长为400-410nm。

3.根据权利要求1所述的基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法，其特征在于：所述的生物打印墨水为甲基丙烯酸化水凝胶溶液溶解于光引发剂中制备而成。

4.根据权利要求3所述的基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法，其特征在于：所述的生物打印墨水中含有5-15％的甲基丙烯酸化水凝胶和0.025-0.075％的光引发剂。

5.根据权利要求4所述的基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法，其特征在于：所述的光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂或2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法，其特征在于：步骤b所述混合了胰岛细胞的生物打印墨水中胰岛细胞浓度为50-300个小胰岛。

7.根据权利要求1所述的基于数字光处理的3D打印组织工程胰岛的制备方法，其特征在于：步骤b所述的光固化时间优选为20秒。

8.权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的组织工程胰岛。

9.权利要求1-7任一项方法制备得到的组织工程胰岛在制备治疗糖尿病的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的组织工程胰岛在制备治疗糖尿病的药物中的用途，其特征在于：所述的糖尿病为I型糖尿病。

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