CN113825531A - 用于植入式诊断和治疗的血管化装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于植入式诊断和治疗的血管化装置及方法的新型装置和方法。本公开在某些实施例中提供包含可降解壳体和不可降解内核的装置。在某些实施例中，所述不可降解内核可包括经封装的治疗性细胞和/或生物传感器，其中可降解壳体作为用于血管生长的支架，进而增强流向细胞和/或生物传感器的血流。

Description

用于植入式诊断和治疗的血管化装置及方法

优先权声明

本申请要求2019年2月15日提交的美国临时专利申请序列号62/806,496的优先权权益，该美国临时专利申请全部内容据此以引用方式并入。

政府支持条款

该发明是在美国国立卫生研究院授予的第R01DK120459号政府拨款的支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。

技术领域

本公开涉及生物学、医学、医疗器械和免疫学领域。更具体地，本公开涉及用于植入诊断和治疗的血管化装置及方法。

背景技术

本组织工程领域旨在通过纳入细胞、生物材料及生化和物化因子的组合来满足对于促进人类疾病或损伤再生的治疗的技术和方法的巨大需求。诚然，在过去几十年里，人类在构建可植入的血管化构建体(诸如皮肤、角膜和膀胱)方面已经取得了巨大进展。然而，由于需要构建血管系统以供应营养及除去厚的构建体中的废物，如何获取功能性的生理相关组织依然是该领域面临的主要挑战。该挑战可归因于扩散输送限制，此类扩散输送限制使营养物质获取不足，进而导致细胞坏死。此外，由于缺乏能力，不能通过重建细胞和基质的异质形态以获取形状和结构可控的构建体，器官置换的发展也受到了阻碍。

目前已经研究出几种促进营养物质输送至工程化组织的方法。最常见的方法之一是使用各种材料处理步骤，诸如临界点干燥、气体发泡和洗盐或静电纺丝以构建可在体外灌注以用于组织培养的大孔结构。虽然此类过程已经产生了用于构建功能性组织的模板，且该功能性组织具有与天然组织相匹配的机械顺应性和用于输送营养物质和氧气的高比表面积，但由于这些构建体包含开放的多孔空隙容积而非血管网络，使用这些方法很难实现对于支架结构的精确空间控制。此外，构建此类工程化组织的过程中所涉及的大多数处理步骤都需要细胞毒素类试剂或条件，这进一步限制了其在活体细胞存在的条件下的使用。

此外，针系成型技术已用于获取具有天然及合成材料的可灌注直型通道。然而，由于使用的是直针，借助此类技术无法获得与组织的异质性和复杂性非常相似的高级构建体。

另一种方法是利用软光刻技术，这是一套改自微处理器行业的技术，通过光刻进行光图形化，进而实现对支架结构的空间控制，以获得微流体网络。然而，此类技术需要使用昂贵的专用设备才可达到微米级分辨率，且此类构建方式过慢，无法高效制作大型器官血管系统模型。此外，光刻通常在笛卡尔坐标中完成，以产生具有矩形截面的通道。然而，天然血管很少是沿着直型x、y或z向量，且血管的横截面为圆形。人们一直在探寻一种将光刻工艺和逐层叠合方法相结合的策略，以实现多层工程化组织。遗憾的是，制造工艺的严苛性、高精度对准连续层的难点以及边对边伪影的存在限制了人们通过使用此类方法获得复杂的三维(3D)互联微流体网络。

为避免人工逐层对准带来的相关挑战，已使用3D投影立体光刻技术或沉积技术手动或自动逐层制造多层3D结构，其中3D投影光刻技术可在单次曝光下制造整个层(Lin etal.，2013)，沉积技术可制造异质3D组织构建体(Kolesky et al.，2014)。虽然在这些努力之下，已经产生了具有空间图案化细胞的工程化组织(Gauvin et al.，2012)，但此类工程化组织与生理上相关的复杂血管系统并不相似。此外，到目前为止仅制造出了具有少数层的水凝胶。

尽管活体血管系统由从数厘米(诸如主动脉)到数微米(诸如毛细血管)的流体网络组成，但目前可用的技术尚不能完全捕获对多细胞生命至关重要的整个输送网络。此外，目前的大多数体外模型都包含3D构建体，其单个血管网络包含一个入口和一个出口。然而，复杂生物系统的一个关键特征，即相互穿插的血管网络的存在，现有的文献缺乏关于该特征的记载，但该特征对于哺乳动物的营养物质充分输送这一生理学而言却是至关重要的。例如，由于氧气的被动输送性质，肺泡必须处于靠近肺部毛细血管网络的位置，以确保红细胞的氧合作用。

因此，生物相容性移植装置的缺失是阻碍细胞治疗成功的一个根本障碍。植入生物材料会导致异物反应(FBR)，此类异物反应是炎症事件和伤口愈合过程的级联反应，最终导致纤维变性(壁脱落)和随后的植入失败(Harding and Reynolds，2014；Langer，2009；Williams，2008)。针对许多材料都描述过该反应，从天然聚合物到合成材料(Ratner，2002，Ward，2008，Zhang et al.，2013)。因此，医疗行业迫切需要开发生物材料来克服这一关键性挑战，即消除与生物材料移植相关的FBR。发明人通过组合化学和高通量筛选(Vegas etal.，2016b)鉴别免疫调节小分子进而解决了这一挑战，并验证了此类小分子在防止非人灵长类动物中纤维变性以及长期细胞存活方面的长期有效性。

胰岛封装疗法最常用的研究方法为将分离的胰岛制备成藻酸盐微球体(Lum etal.，1991；Scharp and Marchetti，2014；Schneider et al.，2005)。藻酸盐是一种多功能生物材料，可在双阳离子(Ca²⁺，Ba²⁺)水溶液中形成水凝胶，并已用于多种生物医学应用，诸如药物递送、组织再生、植入式传感器和封装(Keamey and Mooney，2013；Lee and Mooney，2012)。由于藻酸盐具有成本低、毒性低、凝胶温和且对细胞无害、可保持性好等优点，该材料在涂层和封装技术中广受欢迎。然而，遗憾的是，即使是空的藻酸盐微球体的免疫识别也会引起FBR，而经封装的同种异体或异种异体供体组织的存在会进一步加剧FBR(de Vos etal.，2006；Robitaille et al.，2005；King et al.，2001)。在对C57BL/6小鼠和非人灵长类动物(NHP)的实验研究(Jacobs-Tulleneers-Thevissen et al.，2013；Scharp andMarchetti，2014；King et al.，2001)及人类临床试验中，已经观察到对藻酸盐的该种纤维化反应。

此外，由于需要在血流附近放置同种异体胰岛细胞以快速响应于上述血糖水平，再加上胰岛细胞对氧气的要求较高，特别是在胰岛素分泌期间(Sato et al.，2011)，这给在整个器官范围内重现正常胰腺功能增加了额外的挑战。尽管此类血管化挑战已经清晰明了，但可用来开发血管化装置的生物材料技术仍然捉摸不定。

发明内容

简而言之，本发明提供了用于植入式诊断和治疗的血管化装置及方法。发明人使用最先进的3D生物打印技术来引导免疫分离治疗性细胞构建体的血管化，以获得长期活力和功能性，并使得较高密度的治疗性细胞能够移植。

根据对有效血管网络的要求，模拟血管几何形状的人造组织的设计标准包括但不限于多个分支血管，所述多个分支血管的尺寸范围为直径从数十微米到数百微米且具有基本上平滑的内壁，以最小化流体流动期间的摩擦阻力和湍流。

本公开在某些实施例中提供包含可降解壳体和不可降解内核的装置。在某些实施例中，所述不可降解内核可包括经封装的治疗性细胞和/或生物传感器，其中可降解壳体作为用于血管生长的支架，进而增强流向细胞和/或生物传感器的血流。

更具体地，提供了一种可植入装置，所述可植入装置包含：可降解外部壳体，所述可降解外部壳体包含可降解聚合物；以及内部不可降解部分，所述内部不可降解部分包含可降解聚合物。所述可降解外部壳体可包含图案化结构，所述图案化结构促进所述可植入装置，即，血管化床的血管化，和/或所述不可降解部分可包含天然或合成水凝胶。所述合成水凝胶可为聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEDGA)。所述装置还可包含甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)、天然和化学改性透明质酸，以及天然和化学改性藻酸盐。

所述水凝胶可包含80％以上的水。所述水凝胶可包含约10％的GelMA和约3％的PEDGA。所述水凝胶可包含丙烯酸酯-(PEG-蛋白质)n-PEG-丙烯酸酯的单体，任选地，其中PEG为2-35kDa，蛋白质大于100Da，且总分子量(MW)为至少500kDa或n＝2-500个重复单元。所述水凝胶可包含丙烯酰胺、乙烯基砜、降冰片烯取代丙烯酸酯基团、藻酸盐、蚕丝、葡聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、纤维素、肝素、聚己内酯或其多组分形式。

所述内部不可降解部分装载有：药物，即，小分子治疗剂或生物治疗剂(肽、抗体等)；晶体；细胞，诸如源自异种组织的细胞、源自尸体的细胞、干细胞、源自干细胞的细胞、源自细胞系的细胞、原代细胞、重编程细胞、重编程干细胞、源自重编程干细胞的细胞、基因工程改造细胞或它们的组合。所述细胞可为人类细胞和/或胰岛分泌细胞和/或胰岛细胞。所述内部不可降解部分可经图案化。所述装置可包含多层水凝胶。

所述可降解外部壳体或内部不可降解部分可装载有：药物，即，小分子治疗剂或生物治疗剂(肽、抗体等)；晶体；或释氧化合物，诸如CaO₂。所述可降解外部壳体或内部不可降解部分装载有非结晶、结晶和/或经封装的促血管生成因子，诸如血管内皮生长因子(VEGF)、或促血管生成细胞，诸如内皮细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞或促血管生成巨噬细胞。所述内部不可降解部分可装载有生物传感器，诸如，所述生物传感器可测量血氧、血糖、肿瘤抗原、胆固醇、肌酐、血红蛋白A1C、胰岛素、胰高血糖素、激素含量、小分子药物含量、DNA、RNA、细胞因子、循环肿瘤细胞以及其他可能的诊断指标。所述可降解外壳和/或内部不可降解部分可被图案化，诸如其中内部不可降解部分经图案化以在植入后允许血管化。其中所述图案化结构可包含血管几何形状，诸如多个分支血管，所述多个分支血管的尺寸范围为直径从数十微米到数百微米，且具有基本上平滑的内壁，以最小化流体流动期间的摩擦阻力和湍流。

本公开还提供：一种监测受试者的状况或状态的方法，所述方法包括将本文所述装置植入所述受试者体内，其中所述装置包含传感器或生物传感器；一种治疗受试者身体状况或疾病的方法，所述方法包括将本文所述装置植入所述受试者体内，其中所述装置包含治疗剂；一种在受试者体内形成血管化装置的方法，所述方法包括将本文所述装置植入所述受试者体内；一种在受试者体内的植入物或假体周围形成血管化组织的方法，所述方法包括将本文所述装置植入所述受试者体内，诸如其中所述植入物或假体为神经接口装置；以及一种在受试者体内的植入物或假体周围形成增容化组织的方法，所述方法包括将本文所述装置植入所述受试者体内，诸如其中所述植入物或假体为乳房植入物或组织填充物。

本发明的装置、方法、组合物、试剂盒和系统中的任一个的任何实施例可由所描述的步骤和/或特征组成或基本上由所描述的步骤和/或特征组成，而不是包括/包含(comprise/include)/含有/具有所描述的步骤和/或特征。因此，在任何权利要求中，术语“由......组成”或“基本上由......组成”可替换上述任何开放式连接动词，以将给定权利要求的范围从使用开放式连接动词的范围更改为其他范围。

除非明确指出仅指代替代方案或替代方案是互斥的，否则权利要求中的术语“或”的使用是指“和/或”，尽管本公开内容支持仅涉及替代方案及“和/或”的定义。贯穿本申请全文的术语“约”或“大约”用于表示一个值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。根据长期存在的专利法，“一个/一种(a/an)”在权利要求书或说明书中与“包括”结合使用时表示一个或多个，除非特别注明。

根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，虽然指示了本发明的优选实施例，但是详细描述和具体实施例仅以说明的方式给出，因为通过此详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

以下附图形成了本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图，结合在此呈现的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。专利或申请文件可含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有一幅或多幅彩图的本专利或专利申请公布的拷贝。

图1示出了实施例的示意图，所述实施例，所述实施例包含由可降解聚合物包裹的不可降解部分。

图2示出了实施例的示意图，所述实施例包含装载到装置的不可降解部分中的治疗性细胞、生物传感器或其他植入物。

图3示出了实施例的示意图，所述实施例包含控制氧气释放的方法和材料，所述方法和材料可将促血管生成物质或其他相关化合物装载到装置的可降解和/或不可降解部分。

图4示出了实施例的示意图，所述实施例包含可降解部分，可使用不同长度的聚合物链在浓度、硬度和抗纤维化特性方面，对该可降解部分进行改性。

图5示出了实施例的示意图，所述实施例包含具有许多可能的拓扑结构的血管系统。

图6示出了实施例的示意图，所述实施例包含将所述装置的不可降解部分和可降解部分结合在一起的锚。

图7示出了实施例的示意图，所述实施例包含或不包含内衬在血管支架的内皮细胞。

图8示出了用于治疗性细胞构建体速血管化的水凝胶。

图9示出了用于宏装置开发的优化壳体化学的开发。

图10示出了体内测试的装置的两个实施例：具有中空血管的装置(左)和具有内皮化血管的装置(右)。

图11示出了探讨可灌注水凝胶中血管效率的血管设计。

图12示出了具有用于内部壳体和外部壳体的各种几何形状的装置。

图13.用于移植免疫隔离胰岛的血管化装置。诸如内皮细胞和人骨髓间充质干细胞等促血管生成细胞封装在3D打印可降解壳体中，并且胰岛铸型到TMTD藻酸盐的不可降解内核中。经封装的促血管生成细胞促成血管侵犯，3D打印血管通道有助于引导血管侵犯。随着时间的推移，血管网络保留下来，并为免疫隔离胰岛提供营养物质。

图14A-B。凝胶的制备与设计。凝胶通过以下方式制备：将光敏水凝胶前体溶液与所需类型的细胞组合，以将细胞封装在以复杂结构和设计图案化的水凝胶中。内皮细胞可接种到生物打印凝胶的内腔内，并通过灌注培养来促进内皮细胞的血管生成表型。最后，治疗性细胞，也即此种情况下的胰岛，可铸型到3D打印装置的腔室中(图14A)。由此产生了一种核壳血管化装置，其中治疗性细胞位于一个腔室中并且促血管生成细胞位于块状凝胶中。在此实例中，胰岛包被在TMTD藻酸盐(不可降解)中，HUVEC和hMSC包被在块状PEG/GelMA凝胶中，血管内皮细胞内衬在内腔内(图14B)。

图15。血管化凝胶的生物材料组成。凝胶是通过将对与生物活性细胞混合在一起的单体进行立体光刻而制备的，以在复杂凝胶结构中形成生物活性细胞的批量封装。凝胶的内腔还可以接种内皮细胞，在灌注培养中可以供养内皮细胞，以增强此类细胞的血管生成潜力。在此实例中，PEG和GelMA用于形成凝胶结构，MSC和内皮细胞批量封装，以分泌血管化因子并促进凝胶降解。内皮细胞也接种到内腔中，以促进血管形成。通过调节生物材料特性和细胞组分，我们可以微调生物材料的特性，从而达到预期的体内响应。

图16A-D。针对光引发剂(LAP)、光反应性聚合物(PEGDA和GelMA)和小分子改性3D打印凝胶的合成的反应图解。(图16A)LAP及PEGDA的合成。(图16B)GelMA的合成。(图16C)免疫调节小分子Met-RZA15的合成。(图16D)PEGDA和GelMA与Met-RZA15光交联，形成带有悬浮Met-RZA15的水凝胶网络。

图17A-B。水凝胶结构的胶原酶降解率和剪切刚度之间呈负相关。(图17A)不同水凝胶制剂在0.2mg/mL胶原酶中的降解动力学。发明人观察到一种一般趋势，即降解率会随着聚合物浓度的增加而降低。此外，由于缺乏可酶切割的肽序列，PEGDA的加入似乎有极其强烈的衰减作用。(图17B)与纯GelMA凝胶相比，PEGDA的加入极大地提高了剪切刚度。

图18A-D。印制凝胶的TOF-SIMS表面分析证实与Met-RZA小分子缀合。(图18A)空白凝胶基质(顶部描记线)与Met-RZA缀合凝胶(底部描记线)的TOF-SIMS测量对比。(图18B)从RZA15质量范围内部分(a)开始的空白凝胶描记线和Met-RZA凝胶描记线的叠加图。(图18C)从Met-RZA质量范围内部分(a)开始的空白凝胶描记线和Met-RZA凝胶描记线的叠加图。(图18D)未改性凝胶和小分子改性凝胶的TOF-SIMS数据的量化。

图19A-D。中空血管通道可在生物相容性3D打印水凝胶中打印。(图19A)首先将3D模型分切成一系列2D图案。(图19A)将2D图案作为紫外光掩膜依次投射到光敏聚合物溶液上，从而产生具有图案化结构的固体水凝胶结构。(图19C)单通道凝胶的图式化几何结构，是所有血管网络中最小的单元。(图19D)通过降低打印层高度(bar＝1mm)可获得圆度不断增加的中空血管通道。凝胶包含20wt％的PEGDA(6kDa)和1mg/mL FITC-葡聚糖(150kDa)，以实现荧光可视化。在生物制造领域，单通道水凝胶的3D打印依然是不可小觑的挑战。由于圆形特征中的悬垂性质，在挤压式打印和基于光的打印方法中，材料都会不经意地堵塞中空通道。

图20A-B。完全可灌注结构模型可通过投影立体光刻完整制造而成。发明人使用开源3D计算机图形软件(Blender Foundation，Amsterdam，Netherlands)设计了(图20A)蛇形及(图20B)分支血管结构。发明人在具有完全可灌注中空内腔的PEGDA：GelMA(3.25wt％的3.4kDa PEGDA/10wt％的GelMA)水凝胶中形成此类经设计的血管结构。他们通过灌注(图20A)1微米红色荧光珠(PBS+10％甘油中占比1∶800)和(图20B)表达H2B-mVenus(未示出)和mCherry的人腺癌肺泡基底上皮细胞(A549)来验证内腔通畅性，此类肺泡基底上皮细胞流经发明人设计的整个血管结构。

图21A-F。打印水凝胶显示出理想的流动模式。(图21A)将直径为1微米的荧光珠以1∶800的荧光微珠与PBS+10％甘油的比率灌注通过蛇形结构的水凝胶。使用尼康EclipseTi落射荧光显微镜(帧率为24.6ms)捕捉视频数据。入口流速设置为2.0μL/min，白色箭头显示流动方向。使用MATLAB的开源应用程序PIVlab来分析荧光珠运动的粒子图像测速(PIV)数据(Theilicke and Stamhuis，2014)。(图21B)在PIVlab中完成分析后，生成速度矢量的热图。图21A和图21D中的较亮区域表示水凝胶中不含运动颗粒的区域，这些区域在图像处理之前被手动遮蔽，且箭头表示速度矢量。利用垂直于流动方向的直线(图21B和图21E中的箭头)检验速度矢量，以确定此结构中的流动特性。(图21C)线中各点的速度曲线图数据。为所有视频帧编译各个数据点(圆)，并将其绘制在同一图表上。对于沿母曲线的各个距离，在所有帧中取速度平均值。使用与各个距离相关联的平均速度来生成抛物线最佳拟合曲线，如橙色所示(r2＝0.855)。(图21D-F)对分支结构水凝胶反复进行试验。对于本设计，荧光珠浓度为1∶200(微珠∶PBS)，进口流速设置为5μL/min。对于此速度曲线图的最佳拟合曲线，r2＝0.966。

图22A-B。3D打印血管在心脏收缩压与心脏舒张压之间的动态流体循环下具备高度顺应性。(图22A)通过施加气动气压来测量血管扩张(水凝胶组分：20wt％的6kDa PEGDA；通道直径：1.5mm；通道长度：20mm)。白色虚线表示成像通道的壁面(条形＝1mm)。(图22B)发现顺应性在聚合物参数空间内是高度可调谐的，与分子量直接相关，但与聚合物浓度呈负相关(n≥4)。打印凝胶连接到开源气动泵(MillerLab Pneumatic System，2016)，以提供舒张压(80mmHg)和收缩压(120mmHg)之间的动态流体循环。在光学体视显微镜和sCMOS相机上捕捉直径变化。以每秒50帧以上的帧数捕捉图像，从而可通过高空间分辨率确定直径的最大变化值。组织工程血管的顺应性按照先前报道的方式进行测量(L’Heureux et al.，2006)。

图23A-D。完全内皮化的血管网络包覆在通道壁上，并保持内腔通畅。发明人优化的水凝胶配方(3.25wt％的3.4kDa PEGDA，10wt％的GelMA)支持人内皮细胞附着。发明人将10-30x10⁶细胞/mL的组成性表达GFP的人脐静脉内皮细胞(GFP-HUVECs，Angioproteomie，Boston，MA)注入血管入口，并让细胞粘附到内腔壁上。进行初始的细胞注射之后，发明人每隔15分钟将凝胶围绕血管轴旋转90度，总共旋转2个小时。之后用Vasculife培养基(Lifeline Technologies，LL-0003，Frederick，MD)培养凝胶，通过蠕动泵将管道流体联接至血管网络的入口，从而将流速精准控制为5μl/min。采用尼康Eclipse Ti落射荧光显微镜(图23A、23B和23D)或蔡司LSM 780共焦显微镜(图23C)采用图像。

图24。灌注7天后，超过85％的HUVEC仍能在血管网络中存活：内皮化的蛇形通道以5μl/min的速度灌注7天后，经染色以测定细胞活力。本发明人以1μM和1μl/mL PBS中的LIVE/DEAD成像试剂盒(Invitrogen，R37601)的DEAD(乙锭均二聚物-1)组分制备钙黄绿素紫AM溶液(ThermoFisher Scientific)。将染色液注入通道，在37℃培养30分钟后成像(尼康Eclipse Ti落射荧光显微镜)。随机选择四个兴趣区域，并手动计数活细胞和死细胞，以获得细胞活力输出。

图25A-C。TMTD藻酸盐决可铸型至3D打印凝胶中。(图25A)打印凝胶的透视照片。(图25B)放大以突出显示底层血管系统和3D打印锚，以固定藻酸盐块。(图25C)打印凝胶的横截面。

图26A-D。胰岛铸型到血管支架后活性＞90％，刺激指数＞2。(图26A)将TMTD藻酸盐中的胰岛注入3D打印的血管支架中。铸型后，凝胶用含有1∶200钙黄绿素AM和1∶200乙锭均二聚物-1的完全CMRL-1066培养30min，之后固定并成像。比例尺＝100μm。(图26B)测定5个封装后胰岛的胰岛细胞活性。(图26C)凝胶进行葡萄糖刺激下的胰岛素分泌(GSIS)测定，平均刺激指数为3.35，n＝5个独立样本。(图26D)GSIS测定的刺激指数＞2。所有绘图的平均值为+/-S.D。

图27A-E。体内性腺脂肪垫植入显示了3D打印通道中的血液和密切相关的宿主血管系统。(图27A)3D打印装置脂肪垫植入的手术方法(图27B)内皮化凝胶灌流培养6天后，显示内衬有粘附的GFP-HUVEC。比例尺＝1mm。(图27C)凝胶缝合至脂肪垫。(图27D-E)移植凝胶显示通道中的血液(白色箭头)和紧密相关的宿主血管系统(黑色箭头)。植入(左插图)前具有蛇形通道的内皮化凝胶4(图27D)和5(图27E)。左插图，比例尺＝1mm。

图28A-C。图案化的生物材料促使发生血管侵犯。免疫分离胰岛血管化装置的3D模型(图28A，左)。生物打印凝胶包含s形血管通道中待灌注的GFP内皮细胞和凝胶中大量的红内皮细胞(图28A，右)。发明人发现细胞在蛇形结构中呈现单层，这也是内皮细胞成熟的标志。将凝胶缝合至雄性SCID-米色小鼠(Charles River Labs)的附睾脂肪垫上(图28B，左)，并从同一位点取回(图28B，右)。静脉注射荧光右旋糖酐可以照亮所有侵入凝胶的血管系统，并可使用共聚焦显微镜进行观察(图28C)。

图29。用于识别关键血管参数的图像分析管道。发明人可以利用图像分析方法来识别水凝胶中的关键血管参数。静脉注射荧光右旋糖酐的共聚焦成像照亮水凝胶中的血管网络(共聚焦)。此类具有16位色深的图像首先使用ImageJ(二值化)进行二值化。二值图像表示血管系统(黑色像素)相对于背景(白色像素)的位置。将此类二值图像量化，以鉴定图像中血管(黑色像素)占总像素的比例。这导致了血液所占据的凝胶的部分面积的量化。然后，利用ImageJ对二值图像进行骨架化处理。通过使用ImageJ骨架化插件，可以量化接点的数量、分支的数量以及分支总长度(此处未示出)。样本ROI中的接点和分支如下所示。

图30A-F。用于实现体内血管化的生物材料设计。3D打印血管化装置可由各种水凝胶化学成分、块状凝胶中的细胞和通道中的细胞制成。选择三种此类制剂，并将该制剂移植及缝合至SCID-米色小鼠(图30A)的附睾脂肪垫上，以对其在体内进行评估。水凝胶在体外制备并通过落射荧光显微镜成像，显示在所有凝胶块中存在RFP-HUVEC，以及收缩的胶原索(条件1下的GFP HUVEC，植入物前体)和融合内皮单层(条件2和3下的GFP-HUVEC，植入物前体)(参见图30B)。取材前，经尾静脉注射CF633-缀合右旋糖酐(Biotium)，并循环15分钟。将小鼠无痛致死，并固定凝胶。将血管侵犯的关键参数进行量化(图30C-F；n＝每组4-6个重复数)。

图31A-B。血管发育的动力学研究。血管发育动力学是胰岛移植血管化的一个关键因素。发明人通过在不同时间点外植凝胶来探测动力学。在体外制备凝胶，并在植入前测定凝胶内皮细胞形态(图31A，植入物前体落射荧光)。在不同的时间点植入并收取凝胶。发明人指出，血管侵犯发生在4到8周之间(图31B)。图像代表n＝每组4-6个重复数。

图32A-G。图案化血管网络中流体流动的评估及体外单通道血管网络的初步测试可在体外制备具有不同血管结构的凝胶(图32A)。可通过荧光微珠追踪来量化速度大小值(尼康Ti落射荧光显微镜；参见图32B)。沿线各点的速度曲线图数据。为所有视频帧编译各个数据点(蓝圈)，并将其绘制在同一图表上。对于沿母曲线的各个距离，在所有帧中取速度平均值。使用与各距离相关的平均速度来生成抛物线最佳拟合曲线，如橙色所示(r2＝0.855；图32C)。为研究血管结构对于细胞功能及营养输送的影响，发明人通过使用包被荧光素酶表达细胞及在完全培养基中灌注D-荧光素，从而进行体外测定。在ATP、氧气及荧光素存在的情况下，荧光素酶会发光，从而量化复杂水凝胶中的营养输送及细胞功能。将不同血管结构的凝胶与表达荧光素酶的细胞浇入藻酸盐基质中，以研究营养物质的输送和细胞活性(图32D。在完全培养基中使用D-荧光素灌注此类凝胶(0.15mg/mL最终浓度；PerkinElmer)。通过活体成像(PerkinElmer IVIS Kinetic III)显示了代表性的凝胶在灌注0小时(图32E)和在灌注2小时(图32F)的数据。细胞发光动力学通过Living Image软件进行量化，并经Prism 8进行绘制(图32G；n＝4+/-s.d.)。

图33A-D。筛选用于营养输送的血管结构。打印具有不同血管结构的凝胶，并在血管网络周围的空间浇入含有表达荧光素酶的HEK293细胞(每mL藻酸盐具有2500万个细胞)(图33A)。将含有D-荧光素的介质通过水凝胶的血管内腔灌注至水凝胶，通过块状凝胶输送荧光素和氧气。通过活体成像(IVIS Kinetic III)，发明人可以量化发光，其中发光是因工程化水凝胶中的营养输送和细胞功能而产生的。制备三种不同的血管结构并分析其营养输送功能(图33B)。每5分钟量化一次发光，总共持续120分钟(图33C；六边形和蛇形结构，n＝1；单通道结构，n＝9；平均+/-S.E.M)。在目前的研究中，发明人指出，动力学分析(图33C)显示相比单通道或蛇形结构，六边形结构在研究终点(图33D)的营养输送效率更高。

图34A-D。高密度封装胰岛的评价及今后的糖尿病研究。糖尿病研究将比较TMTD-藻酸盐封装的胰岛与实验组；比较水凝胶及优化的生物材料制剂和优化的用于营养输送的血管结构(图34A)。发明人还计划进行细胞类型控制，以控制胰岛与促血管生成细胞共移植带来的影响(图34A)。将750IEQ(胰岛当量)的新鲜大鼠胰岛浇入藻酸盐块，并将藻酸盐块移植到5只经STZ诱导的C57B16小鼠中(Jackson Labs；图34B)。低于200mg/dL的小鼠则看作是已经治愈了。在为期7周的研究中，小鼠的治愈率在0％到60％之间，显示出血糖控制不稳定(图。34C)。将藻酸盐块在外植体上染色以鉴定胰岛活性(Live/Dead测定，Thermo Fisher)。经检查，胰岛已经死亡(图34D)。这表明如果没有血管系统，高密度包被的胰岛不能将血糖充分恢复至正常水平。本研究作为与血管化凝胶对比的基准。

图35。组织学研究显示血管在凝胶中的形成。为验证生物工程化凝胶中已经发生血管侵犯，将样本提交进行组织学研究。3D打印的PEG/GelMA凝胶植入免疫受损的小鼠体内，为期8周，其中凝胶的内腔中以胶原索进行图案化且凝胶块中以hMSC和HUVEC进行图案化。然后取回凝胶并将凝胶提交进行组织学分析。通过福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)进行组织学研究。将凝胶切片成6微米的厚度，并进行H&E染色。对整个凝胶进行成像(左：EVOSXL彩色CCD 2X放大倍率，比例尺＝2000μm)以及插图(右：Nikon A1 RSI 40X水浸式Di-F3彩色相机，比例尺＝10μm)。在插图的多个区域(右)可见红细胞和毛细血管样结构。

图36。打印具有不同生物材料特性的多层水凝胶构建体。在此实例中，立体光刻3D打印系统可按如下方式使用：可使用水凝胶前体溶液进行打印，该水凝胶前体溶液(此处表示为制剂1)由降冰片烯改性的透明质酸(NorHA)、硫醇封端的细胞粘附肽CGRGDS(SEQ IDNO：2)，以及二硫醇封端的可降解肽CGPQGIWGQGCR(SEQ ID NO：1)组成。这导致该装置的组件被打印为可降解的生物材料制剂。之后暂停打印，将打印溶液替换成具有不同性质的溶液，例如，不可降解的PEG-二丙烯酸酯。在LAP存在的条件下进行光聚合，以产生该装置的第二组件，表示为制剂2。最后，可将该打印溶液换成诸如可降解制剂1的另一种打印溶液，以打印该装置的最终组件。这最终导致产生的3D打印装备具有空间分离的各种生物材料属性。

具体实施方式

输送和扩散限制仍然是发展高度细胞化构建体面临的主要障碍。尽管这一挑战已经清晰明了，但用来开发血管化装置的技术仍然捉摸不定。医疗行业迫切需要开发生物材料来克服这一挑战，即消除与生物材料移植相关的FBR。发明人通过组合化学和高通量筛选鉴定免疫调节小分子，进而解决了这一挑战(Vegas et al2016b)，并验证了此类小分子在防止非人类灵长类动物中的纤维变性以及长期细胞存活方面的长期有效性。

一方面，发明人开发了生物材料化学和新型制造策略，如先进的三维打印技术，以明确解决工程化组织和可植入装置面临的血管化挑战(Miller，2014)。他们开发了一条高通量管道，用于合成及评估数百种材料和原型装置，并探索了细胞包被和装置制造的新方案。关于藻酸盐基材料，已鉴定出表现出低炎症水平的新型先导化合物，但需要进一步开发(见下文)。为提高安全性和有效性，发明人正在研究使用半渗透、低纤维化的血管化装置，结合藻酸盐薄片作为遏制单元，从而实现在畸胎瘤形成的情况下促进所有移植细胞的完全移除。这项工作为功能性和可拓展的同种异体替代组织奠定了重要的基础，此类组织可用于恢复大型糖尿病动物模型中的血糖控制，最终用于恢复人类的血糖控制。

下文详细阐述本公开的这些和其他方面。

I.3D打印装置

A.装置组件

发明人先前已经描述了一种3D打印方法，该方法可以利用生物启发的设计标准来制造3D工程化组织，包括但不限于符合默里定律、直径从几十微米到数百微米的多尺度分支血管、平滑的内壁、圆形横截面和多个入口/出口。事实上，随着打印参数的优化，制造能力取决于建模能力。此外，可以制造出单层或多层中包含异质属性的更复杂的设计。例如，可以结合具有预定义梯度的灰度掩模来获得具有不同硬度的层，或在仍然使用相同的罐和溶液的情况下控制生物分子和细胞的固定。此外，对于更复杂和生理相关的3D模型，可通过计算机生长模型来实现利用分形空间填充模型在预先存在的血管网络周围或通过预先存在的血管网络或基于天然组织的结构计算生长血管网络。此类数学分形、空间填充模型可以从，例如纽结理论、希尔伯特曲线和L系统中推导出来。用于预测理想化血管网络的数学分形空间填充模型包括但不限于纽结理论、Plumber′s Nightmare、Peano曲线、希尔伯特曲线、毕达哥拉斯树和布朗树模型。例如，Plumber′s Nightmare模型基本上由两个通过直立圆柱体相互连接的血管阶梯模型组成。多个Plumber′sNightmare模型可以相互内插，从而相互贯穿。血管阶梯模型由一个入口和一个出口组成，其中有两个水平圆柱体通过对角柱体连接在一起，从而形成通道间的连接。

光聚合性水凝胶材料，诸如聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)可以使用光引发剂体系，诸如酰基膦酸锂(LAP)进行交联(Fairbanks et al.2009)，该体系可在紫外光至可见光波长范围内吸收光。例如，发明人可通过添加低浓度的碳黑(碳黑可以在所有紫外-可见光光谱中吸收光)或低浓度的酒石黄(酒石黄的光吸收峰值在500nm附近)，以限制光的穿透深度。为量化这一方法，发明人开发了一种光流变学测定，以监测水凝胶的聚合和硬度随光剂量和样本厚度的变化。事实上，添加酒石黄等添加剂可以通过影响凝胶动力学和最终凝胶流变性能来控制预聚混合物的凝胶程度。其他材料包括烯改性的天然和合成可光聚合材料，诸如藻酸盐、蚕丝、葡聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、纤维素、肝素和聚(己内酯)，以及这些材料的多组分形式。

为实现数厘米量级的多层水凝胶的复杂图案化，并具有较高的图案保真度，控制打印过程中的光曝光，使得投射到构建平台上的光主要与该层相互作用，从而实现部分或全部凝胶化。自由基介导的水凝胶光聚合利用光引发剂，该光引发剂是一种对特定波长范围敏感的分子，光吸收后，分子会衰减并释放催化水凝胶聚合的自由基。为此，量化光引发剂的波长灵敏度是有必要的。高浓度的光引发剂将吸收更多的光，并通过限制入射光的穿透深度来提供更高的z向分辨率。然而，高浓度的光引发剂会破坏光聚合反应(自由基越多，相互湮灭的几率越高)，光引发剂在高浓度下具有细胞毒性。此外，在投影仪具有高x-y向分辨率的情况下，一个难题便是光线穿过先前打印层的z方向照射，这可能会限制形成复杂悬垂结构(诸如在血管系统中发现的结构)的能力，并且还可能对被包埋细胞造成光毒性。

因此，为实现高分辨率打印，本公开首次提供了一种光化学手段，以便在保持高细胞活力的同时在生物打印组织中提供高z向分辨率。为解决上述问题，发明人已经确定了一种通用策略，由此将生物相容性材料或化学品添加至预聚合溶液中，以提供更高的z向分辨率。添加材料的选择基于三个标准：1)能够吸收完全覆盖光引发剂的感光波长范围的光波长，2)有限参与或有限抑制光聚合反应，以及3)具备所需浓度下的生物相容性。本文所述添加剂材料系指生物相容的、适于控制光穿透的光吸收添加剂材料。筛选出多个吸收光的分子，用于限制了光对已形成层的穿透深度。合适的分子在预聚合溶液中使用的光引发剂的所在区域吸收。能够控制光穿透并因此适合用作生物相容性光吸收添加材料的分子的实例包括炭黑、黄色食用色素、酒石黄、纳米颗粒、微粒、金纳米颗粒、核黄素、酚红、β-胡萝卜素、姜黄素、藏红花和姜黄。蛋白质也可以作为合适的生物相容性光吸收添加材料，前提是它们的峰值吸收与光引发剂的峰值吸收重叠并与入射光源匹配。此外，发明人认识到，用于光引发剂的所在区域吸收的蛋白质，诸如青色荧光蛋白(CFP)或绿色荧光蛋白(GFP)，转染或转导的细胞可以在高浓度下使用，同时减少或不添加添加剂，以减少由于细胞内存在的光吸收分子而导致的侧向过固化。此外，由于发明人的方法严格控制投射光的穿透，我们得以打印出具有水平和垂直通道的水凝胶。

为解决用这种方法制造工程化组织所需的长时间打印而导致的潜在细胞活力问题，可以通过多种方式维持或提高细胞活力。一种方法是通过在低温条件下打印来降低细胞的新陈代谢活性。低温(通常在4℃下进行)保存实体器官以延长移植器官的保存时间，同样，降低打印细胞的温度将显著降低细胞代谢。例如，发明人已表明，可以利用冷藏室(4℃)实现低温生物打印。此外，在预聚合溶液中加入维生素、生长因子或血清，以便于获得营养物质，从而可以维持或提高细胞活力。重要的是，只需适度增加必要的曝光时间，光聚合便可对温度的降低有很高的耐受性。此外，降低整个3D打印装置和试剂的温度可能有助于熄灭由入射光或光聚合过程中产生的热。此外，PEG和甘油等分子在细胞培养中已被广泛用作低温保护剂。因此，在低温打印过程中使用诸如PEG之类的聚合物可以提高细胞存活率。

所有多细胞生物中都存在分支多尺度输送系统。与血管网所具有的高度复杂的分支结构类似，呼吸树也由复杂的分支结构组成，以保证肺远端区域空气的充分供应。已有研究表明，内皮细胞可能有助于肺上皮细胞的分支。然而，目前的制造技术都无法制造出模拟天然肺组织的解剖复杂性的结构。通过使用3D打印，应该可以制造出模拟天然肺组织和血管系统的解剖复杂性的结构。通过采用所提出的方法，可以打印此类结构，并将内皮细胞和上皮细胞类型嵌入通道内腔，从而模拟血管和呼吸网络。借助可获得的圆形横截面，可以顺着通道内嵌形成融合细胞层。由于所提出的方法具有更高的z向分辨率，因此通道可以更为接近血管和呼吸网络。所公开的方法和材料可以实现对多个网络的几何形状和体系结构的精细控制。通过使用类似生理血管网络的分形空间填充模型，该技术可实现设计和制造具有相互穿插通道的相关3D结构。

此外，所提出的方法可以与其他支架制造技术相结合，如粒子沥滤或表面涂层，以产生具有改良的内部微结构或表面特性的生理相关的复杂结构。此外，所提出的方法可用于制造应用于器官芯片或人体芯片的微流控器件。此外，打印机可以改造为包括特定的传感器，以确保打印出更精确的层厚度。

在某些实施例中，提供了预聚合溶液。该预聚合溶液包括分子量大于2000道尔顿的光敏聚合物、光引发剂和适于控制光穿透的生物相容性光吸收添加材料。在一些实施例中，该预聚合溶液还可以包括一个或多个活细胞(此处简称为细胞)。在某些方面，该预聚合溶液可包括低温保护剂，诸如低分子量PEG、甘油、乙二醇、蔗糖、丙二醇、海藻糖、棉子糖、瓜尔豆胶、黄原胶和D-甘露醇。低温保护剂可为渗透性的，或非渗透性的。本文将更详细地描述这些组分中的每一种。该预聚合溶液也可包含10wt％至99.5wt％的水。该预聚合溶液也可包含80wt％至90wt％的水。在某些方面，该预聚合溶液还可以包含DMEM介质、血清、蛋白质、生长因子、增稠剂和/或防凝结组分。此类组分可为该预聚合溶液中的细胞提供营养和/或中性浮力。

在某些实施例中，可以使用分子量大于2000道尔顿的光敏聚合物。光敏聚合物的每个聚合物分子中可包含至少两个乙烯基团。这种乙烯基团可以包括丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯。可使用的光敏聚合物实例包括但不限于：聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEDGA)、细胞粘附聚(乙二醇)、MMP敏感的聚(乙二醇)、聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、聚(乙二醇)二丙烯酰胺(PEGDAAm)、甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)、甲基丙烯酸酯化透明质酸(MeHA)和PEG化纤维蛋白原。光敏聚合物还可以通过诸如CGRGDS (SEQ ID NO：2)的细胞粘附肽的缀合改性。

在某些实施例中，可以使用光引发剂。光引发剂是一种对特定波长范围敏感的分子，光吸收后，分子会衰减并释放催化水凝胶聚合的自由基。举例来说，此类光引发剂可包括但不限于：酰基膦酸锂、Irgacure 2959、伊红Y体系(由伊红Y、l-乙烯-2-吡咯烷酮(NVP)和三乙醇胺(TEA)组成)、三(三苯基膦)钌(II)、以及通常与4-N，N-二甲氨基苯甲酸乙酯或TEA及光敏剂一起使用的樟脑醌。高浓度的光引发剂可以通过限制入射光的穿透深度来提高z向分辨率，然而，高浓度的光引发剂会破坏光聚合反应，并且具有细胞毒性。此外，由于光线可以穿过先前打印层照射，使用高浓度的光引发剂可能会限制打印复杂悬垂结构的能力，并且对被包埋细胞造成毒性。

在某些实施例中，可以使用生物相容性光吸收添加材料。生物相容性光吸收添加材料的选择基于三个标准：1)能够吸收完全覆盖光引发剂的感光波长范围的光波长，2)有限参与或有限抑制光聚合反应，以及3)具备所需浓度下的生物相容性。生物相容性光吸收添加材料可以是有机材料。举例来说，生物相容性光吸收添加材料可包括，但不限于碳黑、黄色食用色素、酒石黄、纳米颗粒、微粒、金纳米颗粒、核黄素、酚红、β-胡萝卜素、姜黄素、藏红花和姜黄。此外，用于光引发剂的所在区域吸收的蛋白质，诸如青色荧光蛋白(CFP)或绿色荧光蛋白(GFP)，转染或转导的细胞可以在高浓度下使用，同时减少或不添加添加剂，以减少由于细胞内存在的光吸收分子而导致的侧向过固化。由于严格控制投射光的穿透降低了光线对已打印层的穿透，进而实现高z向分辨率打印，可通过生物相容性光吸收添加材料打印出具有水平和垂直通道的水凝胶。

在某些实施例中，提供了水凝胶基质。所述水凝胶基质可以包括第一管状通道和第二管状通道。所述水凝胶基质可以是多孔的。所述水凝胶基质还可以包括嵌入其中的第一细胞类型和第二细胞类型。在某些方面，所述水凝胶基质可以包括嵌入其中的第一细胞类型。

水凝胶基质可以在一个或多个层中产生，并且在某些实施例中，将包括多于1000个层，约10个层到约2000个层，约10个层到约1000个层，约10个层到约500个层，约10个层到约100个层，约100个层到约2000个层，约100个层到约1000个层，约100个层到约500个层，约100个层到约300个层，约500个层到约1000个层，约500个层到约2000个层，约1000个层到约2000个层，以及上述层数之间的任何范围。在某些实施例中，每层可具有的厚度为大约25微米至大约100微米、大约50微米至大约100微米、大约25微米至大约50微米，以及上述厚度之间的任何范围。在某些其他方面，每层具有的厚度为50微米。甚至在其他方面，每层具有的厚度为小于50微米。还在其他实施例中，每层具有的厚度为25微米。在某些方面，每层具有的厚度为100微米。在某些方面，水凝胶基质的一层或多层可包含第一细胞类型，其中水凝胶基质的一层或其他多层可包含除第一细胞类型的第二细胞类型。

水凝胶基质的一层或多层可具有嵌入其中的细胞。与具有嵌入细胞的水凝胶基质的一层或多层相邻的水凝胶基质的一层或多层包括细胞外基质蛋白。

水凝胶基质的一层或多可由光敏聚合物形成。在某些方面，水凝胶基质的一层或多层可由第二光敏聚合物形成。水凝胶基质的一层或多层可各自包含第一部分和第二部分。在某些方面，第一部分由光敏聚合物形成，第二部分由分子量大于2000道尔顿的第二光敏聚合物形成。在某些方面，第一部分可以包括嵌入其中的第一细胞类型，并且第二部分可以包括嵌入其中的第二细胞类型，其中第一细胞类型不同于第二细胞类型。在某些方面，第一部分可以包括第一荧光团，并且第二部分可以包括第二荧光团，其中第一荧光团不同于第二荧光团。

在一些实施例中，水凝胶可以包括第一管状通道和第二管状通道。在某些方面，第一管状通道和第二管状通道可各包括与块状水凝胶基质的多个层相交的水平段。第二管状通道可以与第一通道相互穿插，其中相互穿插定义为在两个通道之间的空间关系中，一个通道与另一个通道的两个分离部分之间的平面至少相交一次。管状通道也可具有分支。例如，正如在环形结模型中所观察到的，管状通道可具有分支，其中管状通道在水凝胶内的另一点处重新汇集。然而，分支结构还可以包括从第一管状通道和/或第二管状通道延伸并终止于水凝胶内的通道。例如，可使用本文方法设计和制造树状结构。在某些实施例中，管状通道的直径为300至500微米、500微米或更小、400微米或更小、或300微米或更小。管状通道也可为可灌注通道。此外，管状通道还可随着其中压力的增加而膨胀。管状通道内可内衬有细胞，包括上皮细胞和内皮细胞。在某些方面，第一管状通道内衬有内皮细胞。在某些方面，第二管状通道内衬有上皮细胞。

第一管状通道还可以包括位于水凝胶基质表面上的第一管状入口和第一管状出口。第二管状通道还可以包括位于水凝胶基质表面上的第二管状入口和第二管状出口。第一管状通道可包括一个阀门或其他正面特征。管状通道还可包括从管状通道延伸到水凝胶基质中的尖刺。管状通道内可填充任何适当的流体或气体。举例来说，此类流体或气体可以包括体液和氧气。在某些方面，第一管状通道内可填充流体。

在某些其他方面，第一管状通道内可填充培养基、红细胞、血液、尿液、胆汁和/或诸如氮气和/或氧气等气体。在某些方面，第二管状通道内可填充培养基、红细胞、血液、尿液、胆汁和/或诸如氮气和/或氧气等气体。管状通道内也可填充一种或多种不同的流体和/或气体。

本公开的水凝胶可包括两个以上的管状通道。例如，水凝胶可以包括第三管状通道和第四管状通道。管状通道可与一个以上的其他管状通道相互穿插。例如，第三管状通道可与第四管状通道相互穿插。类似地，第二管状通道可与第一管状通道和第三管状通道相互穿插。包含多个管状通道的管状通道网络还可以与至少一个管状通道或至少一个其他管状通道网络相互穿插。例如，第三管状通道可与第一管状通道相互穿插，而第一管状通道可与第二管状通道相互穿插。作为另一个实例，第三管通道和第四管通道可以相互穿插并与第一管通道或包括第一管通道和第二管通道的互穿网络相互穿插。以此方式，可以构建复杂模型，该复杂模型允许实现管状通道和管状通道网络之间的复杂相互作用。前文多个管状通道的实例仅用于示例目的，并非旨在限制本发明。

应该注意的是，用于本装置的各种特征的聚合物列表可能重叠，因为对任何给定聚合物的潜在修改可以使其对可降解或不可降解部分有用。可降解部分具有多种用途，包括含有促血管生成化合物、释氧化合物、免疫调节化合物或其他生物活性化合物，以及包括内皮细胞在内的细胞。可降解物质可影响其植入的局部位点，包括但不限于血管化、免疫调节和控制释放其他化合物，和/或通过这些和其他相关手段对装置的不可降解部分发挥有益优势。

B.制造多层水凝胶基质构建体的方法

在某些实施例中，提供了制造多层水凝胶基质构建体的方法。首先，使用设计软件创建多层水凝胶基质构建体的3D模型，其中所述多层水凝胶基质构建体的3D模型包括在提供第一管状通道的多层水凝胶基质构建体中产生第一细长空隙的第一计算算法，以及在提供第二管状通道的多层水凝胶基质构建体中产生第二细长空隙的第二计算算法，其中第二计算算法导致第二管状通道和第一管状通道相互穿插。然后将3D模型转换成适合在3D打印软件中使用的格式，以产生格式化的3D模型。然后将格式化的3D模型导入3D打印软件，其中3D打印软件被编程为将3D模型分切成多个二维(2D)xy图像。将预聚合溶液供应给与3D打印机的构建平台相关联的罐中，其中所述罐是透明的，并且其中所述预聚合溶液包含：分子量大于2000道尔顿且每个聚合物分子至少含有两个乙烯基团的光敏聚合物；用于控制光穿透的吸光添加材料；以及光引发剂。所述罐还可包括水凝胶不会附着其上的涂层，例如疏水涂层。例如，该涂层可以是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。这使得水凝胶可以与该罐分离，而不产生粘连。3D打印机的可移动Z轴平台定位在与罐相距一定距离之处，其中Z轴平台包括足以使胶凝材料附着其上的表面，其中该表面与罐的内底表面之间的距离等于组织构建体的所需的层厚度。之后，将图案投射到罐的内底表面上。例如，光源可以被投射通过诸如DLP系统的光学构造，以便产生图案。然后，对多层水凝胶基质构建体的层进行聚合。供应预聚合溶液、定位可移动Z轴平台、投射光源以及对层进行聚合的步骤可以重复进行一次或多次，其中通过移动可移动Z轴平台，使得移动的距离等于每个随后的层的期望厚度，并且其中针对每个随后的层显示相同或不同的图案。在某些方面，至少以下步骤是在低温条件下进行的：向罐供应预聚合溶液；定位可移动Z轴平台；将光源投射通过光学构造；以及对多层组织构建体的层进行聚合。低温条件可以包括4℃的温度。光学构造可以包括准直器、聚光器、滤光器和DMD阵列。例如，光学构造可为数字光处理系统的一部分。

在某些方面，该距离为50微米至100微米。在某些其他方面，该距离为50微米。光学构造可包括反射镜，其中反射镜被定位成在罐的内底表面上提供图案。反射镜可以来回滑动以使投影居中，并为多层水凝胶基质构建体的各层的对齐做准备。

在一些实施例中，重复步骤至少进行一次以产生第二层，其中用于该第二层的预聚合溶液包含第二光敏聚合物，该第二光敏聚合物不同于用于制造第一层的光敏聚合物。在某些方面，第二光敏聚合物可以具有与该光敏聚合物不同的分子量。重复步骤可以进行多次，直至足以产生具有第一管状通道和第二管状通道的多层水凝胶基质构建体。

在某些实施例中，可以从纽结理论导出第一计算算法。在某些方面，第一计算算法和/或第二计算算法可为希尔伯特(Hilbert)曲线。第一计算算法和第二计算算法可符合默里定律(Murray′s Law)。在某些方面，第一计算算法可使第一管状通道分支化。第一计算算法和第二计算算法可包括数学空间填充模型。数学空间填充模型可以包括Plumber′sNightmare、Peano曲线、希尔伯特曲线、毕达哥拉斯树(Pythagoras tree)和布朗树(Brownian tree)模型。

组装的3D打印机是一种自动化的、计算机辅助的3D原型制作装置，利用增材制造技术选择性地对光敏生物材料一次一层进行图案化，从而产生3D组织工程化构建体。打印机含有降低至构建平台上的可移动Z轴平台，该构建平台含有载有预聚合溶液的罐，该预聚合溶液包含光敏聚合物和光引发剂。其上粘附有胶凝材料的表面附着到可移动Z轴平台。此外，打印机底座装有一面45°的反射镜，该反射镜将水平投影反射至透明罐的内底表面上。组装的打印机还装有实现打印过程自动化的微电子设备。

为了打印结构，在计算机辅助设计(CAD)软件中创建3D模型，然后将其导出为立体光刻(.stl)格式。将.stl文件导入到已输入打印参数的软件中。然后，该软件通过计算将3D模型分切成用作动态光掩膜的二维(2D)xy图像，并使用输入的打印参数来创建用于受控自动打印的命令。透明罐内装满预聚合混合物后，便将Z轴平台降低至罐上，使该Z轴平台的表面与桶的内底表面之间的距离达到所需的层厚度。然后，光源将光投射通过光学装置，该光学装置包含准直器、聚光器、滤光器(诸如用于选择感兴趣的特定波长的二向色或带通)和DMD阵列(例如市售的投影仪或微型投影仪)的组合，以便在罐的内底表面上产生图案(在3D模型的第一层)，从而产生特定的3D图案化的层。材料经凝胶化后，Z轴平台自动上移至下一层高度，该过程随着连续性自动投影/Z轴平台移动而自动化进行，直至得到最终的3D构建体。

此外，来自投影仪设备的功率输出可能不均匀。因此，发明人将使功率输出均匀化或者进行平场处理，从而投影图案不会具有无意的异质特性。为此，他们将空白曝光投射到荧光粉胶片上，然后获得发光图像。这幅图像包含一个强度值的2D矩阵，这些强度值在数值计算程序中(诸如MATLAB)中基本上经归一化和倒排处理。倒立的图像实质上起到了滤光器的作用，实现更均匀的功率输出，以确保材料的凝胶化在整个投影层中都是均匀的。

对该组件的修改可以包括增加注射器装置，以便根据需要在打印过程中自动分配更多的预聚合溶液。为了获得具有不同材料的更多异质构建体，对组件的修改涉及修改构建平台、罐和/或Z轴平台，以便可以使用该技术自动打印多种材料。例如，可将构建平台设计为容纳装有不同材料的多个罐，以便打印含有多种材料的3D水凝胶。

通过使用生物打印机的基本配置，可以构建具有相互穿插的气道网络的多尺度分支血管网络。在CAD软件中创建该模型，然后将其导出为“.stl”格式。将导出的文件上传到软件中，并输入打印参数。制备好预聚合溶液后，便将其转移至容纳在构建平台上的罐上。然后，降低Z轴平台以获得所需的层厚度。通过一系列的3D模型的自动投影和Z-轴平台平移，最后形成了最终的3D打印水凝胶。然后便可将3D生物打印的水凝胶从Z平台上移除。3D打印模型的血管通道可通过内皮细胞灌注内皮化，气道通道可通过上皮细胞灌注上皮化。血管网络作为血液供应源，用于将氧气和营养物质输送到水凝胶块中的细胞，而气道网络提供了向血管网络供应氧气的手段。

然而，一旦入口的压力低于出口的压力，阀门就会关闭，从而阻止流体通过小叶回流。负面特征，如尖端尖锐的尖刺，可以被用来控制接种内皮细胞进入块状水凝胶区产生空间芽生。

通过使用配置成允许多种材料打印生物打印机，可以制造由成纤维细胞的外层、平滑肌细胞的内层和内皮化的内腔组成的多层血管管。成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞在适当的培养条件下分别培养。将成纤维细胞和平滑肌细胞分别以所需的密度与含有光聚合物和光引发剂的预聚合溶液混合。然后，将含有细胞的预聚合溶液放置在构建平台上的一个或多个罐内。

此外，构建平台可包含一个装有非细胞预聚合混合物的罐，所述非细胞预聚合物将用于打印3D模型的基底。将Z轴平台降低至预期层厚的非细胞预聚合混合物中，并开启打印过程。一旦打印完足够的基层，Z轴平台从基罐退出，并下降到下一层高度的第二材料位置处，所述第二材料含有具有平滑肌细胞的预聚合混合物。该层凝胶化后，将Z轴平台从第二罐移出，并用非细胞预聚合物冲洗以降低污染，并降低至第三罐，所述第三罐含有具有成纤维细胞的预聚合混合物，且层高与前述投影相同。在该层凝胶化之后，产生的层由具有2种不同细胞类型的图案组成。将Z轴平台从第三罐移出，冲洗，然后移回第二罐，重复该过程，直至生物打印出最终的多层、多材料3D水凝胶。然后去除3D生物打印的水凝胶，并通过向通道内灌注内皮细胞使水凝胶内皮化。

II.生物材料

所公开的装置可以包括一种或多种生物材料。材料为可用于诊断或治疗疾病、紊乱、状况、症状等的任何化合物、组合物、缀合物或构建体。此类材料制剂的实例包括细胞、组织、细胞产品、组织产品、蛋白质、抗体、疫苗、疫苗组分、抗原、表位、药物、盐、营养素、缓冲剂、酸和碱。

用于加入所公开的装置中的生物材料可为任何生物物质。例如，生物材料可为组织、细胞、生物小分子或生物大分子。生物大分子的实例包括核苷酸、氨基酸、辅因子和激素。生物大分子的实例包括核酸、多肽、蛋白质和多糖。

蛋白质的实例包括酶、受体、分泌蛋白、结构蛋白、信号蛋白、激素和配体。任何类别、类型、形式或特定的生物材料都可以与任何其他类别、类型、形式或特定的生物材料一起使用。

A.细胞

在一些实施例中，该装置可以包括细胞或组织，例如，活细胞或组织，在一些实施例中，活细胞或组织封装在聚合物中或用聚合物包被。在此类实施例中，聚合物封装或涂层的表面用本文公开的部分或化合物改性。在一些实施例中，细胞可以包括编码治疗性或诊断性多肽的外源核酸。

所选择的用于加入所公开的装置中的细胞类型取决于期望的治疗效果。细胞可能来自患者(自体细胞)，来自同一物种的另一个供体(同种异体细胞)，或者来自另一个物种(异种异体细胞)。虽然很容易获得异种异体细胞，但该细胞潜在的排斥反应和可能向患者传播病毒的危险限制了它们的临床应用。任何一种此类细胞都可以来自自然来源、干细胞、衍生细胞或基因工程改造细胞。

在一些实施例中，该细胞为基因工程改造细胞，分泌治疗剂，诸如用于治疗疾病或其他状况的蛋白质或激素。在一些实施例中，该细胞为基因工程改造细胞，分泌诊断剂。在一些实施例中，细胞为干细胞，例如，胚胎干细胞、问充质干细胞、肝干细胞或骨髓干细胞。

用于加入所公开的装置中的细胞类型包括来自天然来源的细胞，诸如源自异种组织的细胞、源自尸体的细胞和原代细胞；干细胞，诸如胚胎干细胞、间充质干细胞和诱导多能干细胞；衍生细胞，诸如源自干细胞的细胞、源自细胞系的细胞、重编程细胞、重编程干细胞和源自重编程干细胞的细胞；以及基因工程改造细胞，诸如经基因工程改造以表达蛋白质或核酸的细胞、经基因工程改造以生产代谢产物的细胞及经基因工程改造以代谢毒性物质的细胞。

用于加入所公开的装置中内含物的细胞类型包括肝细胞(例如，肝母细胞、肝星状细胞、胆管细胞或肝细胞)、胰岛素分泌细胞(例如，胰岛细胞、分离的胰岛β细胞或胰岛素瘤细胞)、肾细胞、表皮细胞、上皮细胞、神经细胞，包括神经元和胶质细胞(例如，星形胶质细胞)、神经节细胞、视网膜上皮细胞、肾上腺髓质细胞、肺细胞、心肌细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨髓细胞、脾细胞、胸腺细胞、腺细胞、血细胞(例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞细胞、淋巴细胞或单核细胞)、内分泌激素分泌细胞(例如，甲状旁腺细胞、甲状腺细胞或肾上腺细胞)、肠源性细胞和其他主要合成和分泌物质或代谢物质的细胞、内皮细胞(例如，毛细血管内皮细胞)、成纤维细胞(例如，皮肤成纤维细胞)、肌源细胞、角质形成细胞、平滑肌细胞、祖细胞(例如，骨髓祖细胞、脂肪祖细胞、肝脏前体细胞、内皮祖细胞、外周血祖细胞或来自肌肉、皮肤的祖细胞)骨髓基质细胞细胞系(例如，CHO细胞、MDCK细胞和PC12细胞)。

特殊的细胞类型为胰岛细胞或其他胰岛素分泌细胞。激素分泌细胞可以产生一种或多种激素，如胰岛素、甲状旁腺激素、抗利尿激素、催产素、生长激素、催乳激素、促甲状腺激素、促肾上腺皮质激素、卵泡刺激素、促黄体激素、甲状腺素、降血钙素、醛固酮、皮质醇、肾上腺素、胰高血糖素、雌激素、孕激素和睾酮。基因工程改造细胞也适合加入所公开的装置中。在一些实施例中，细胞经工程化以产生一种或多种激素，如胰岛素、甲状旁腺激素、抗利尿激素、催产素、生长激素、催乳激素、促甲状腺激素、促肾上腺皮质激素、卵泡刺激素、促黄体激素、甲状腺素、降血钙素、醛固酮、皮质醇、肾上腺素、胰高血糖素、雌激素、孕激素和睾酮。在一些实施例中，细胞经工程化以分泌凝血因子(例如，用于血友病治疗)或分泌生长激素。在一些实施例中，细胞包含在天然或生物工程化组织中。例如，在一些实施例中，用于加入所公开的装置中的细胞为生物人工肾小球。在一些实施例中，细胞适于移植到中枢神经系统中以治疗神经退行性疾病。

在某些实施例中，细胞可包含在预聚合溶液和/或水凝胶中。此类细胞可包括内皮细胞和上皮细胞类型。此类细胞可为人骨髓间充质干细胞(hMSC)。作为示例而非限制，上皮细胞可以包括人支气管上皮细胞(HBEC)、柱状纤毛上皮细胞、粘液细胞、浆液细胞、基底细胞、克拉拉细胞、神经内分泌细胞、I型和II型肺泡细胞以及A549人腺癌肺泡基底上皮细胞。作为示例而非限制，可以通过对上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、表面活性蛋白A、C和D、基底标记角蛋白14和TTF-1的染色来表征上皮细胞。类似地，作为示例而非限制，内皮细胞可以包括人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人肺微血管内皮细胞和诱导的多能内皮细胞。作为示例而非限制，可以通过对血小板内皮细胞粘附分子(PECAM/CD31)和血管内皮细胞(VE)-钙粘蛋白的染色来表征内皮细胞。

细胞可以直接从供体、供体细胞的细胞培养中或已建立的细胞培养系中获得。在特定实施例中，细胞直接从供体获得，并直接与聚合物材料一同清洗和植入。使用组织培养领域的技术人员所熟知的技术培养细胞。

细胞活力可以使用标准技术来评估，如组织学和荧光显微镜。可结合使用此类技术和功能性试验来确定植入细胞的功能。例如，对于肝细胞，可以通过在接受者的胆总管中放置插管来进行体内肝功能研究。然后便可将胆汁逐渐收集起来。胆汁色素可通过高压液相色谱分析来寻找未衍生化的四吡咯，或在P-葡萄糖醛酸酶处理或无P-葡萄糖醛酸酶处理的情况下，与重氮化的偶氮二吡咯乙基邻氨基苯甲酸酯反应转化为偶氮二吡咯后，用薄层色谱法进行分析。缀合胆汁色素经碱甲醇分解后，可用薄层色谱法确定双缀合胆红素和单缀合胆红素。一般而言，随着功能性移植肝细胞数量的增加，缀合胆红素的含量也会相应增加。还可对血液样本进行简单的肝功能测试，诸如白蛋白生产。可以根据需要使用本领域技术人员已知的技术进行类似的器官功能研究，以确定植入后细胞功能的范围。例如，可以植入胰岛细胞和其他胰岛素分泌细胞，并通过适当分泌胰岛素来调节血糖。也可植入其他内分泌组织和细胞。

细胞植入的一个或多个位置是根据个人需求以及所需细胞的数量而定。对于替代或补充器官或腺体功能的细胞(例如肝细胞或胰岛细胞)，可将混合物注射至肠系膜、皮下组织、腹膜后腔、腹膜前间隙和肌肉内间隙。

所公开的装置中所包含的细胞的数量和密度将取决于所选择的细胞和植入位置。在一些实施例中，单细胞在水凝胶胶囊中的浓度为0.1x10⁶到4x10⁶个/毫升，更具体地是0.5x10⁶到2x10⁶个/毫升。在其他实施例中，细胞以细胞团的形式存在。例如，胰岛细胞团(或整个胰岛)的各个直径为150μm的细胞团优选地包含约1500-2000个细胞，这定义为一个胰岛当量(IEQ)。因此，在一些实施例中，胰岛细胞的浓度为100-10000IE/ml，特别是200-3000IE/ml，更具体地说是500-1500IEQ/ml。

1.胰岛细胞和其他胰岛素分泌细胞

在特定实施例中，所公开的化合物包含胰岛细胞或其他胰岛素分泌细胞。胰岛细胞的分离方法是本领域已知的。Field et al.，Transplantation 61：1554(1996)；Linetsky et al.，Diabetes 46∶1120，1997).新鲜的胰腺组织可以通过切碎、撕开、粉碎和/或胶原酶消化来分离。然后，可以通过洗涤、过滤、离心或挑选程序将胰岛从污染的细胞和材料中分离出来。在美国专利第5,447,863号、第5,322,790号、第5,273,904号以及第4,868,121号中描述了用于分离和纯化胰岛细胞的方法和装置。在将分离的胰腺细胞加入水凝胶胶囊之前，可以选择使用本领域中已知的任何合适的胰岛细胞培养方法对其进行培养。例如，参见美国专利第5,821，121号。分离的细胞可在促进消除抗原成分的条件下在培养基中培养。胰岛素分泌细胞也可源自干细胞和细胞系，也可为经基因工程改造而生产胰岛素的细胞。

2.基因工程改造细胞

在一些实施例中，所公开的化合物包含经基因工程改造而生产蛋白质或核酸(例如，治疗性蛋白或核酸)的细胞。在这些实施例中，细胞可以是，诸如干细胞(例如，多能干细胞)、祖细胞(例加，多能祖细胞或寡能祖细胞)或终末分化细胞(即，单能细胞)。任何所公开的细胞类型都可以进行基因工程改造。例如，细胞可经基因工程改造成含有编码例如miRNA或RNAi之类的多核苷酸或编码蛋白质的多核苷酸的核酸。核酸可以，例如，整合到细胞基因组DNA中以实现稳定表达，或者可以，例如，整合到表达载体(例如，质粒DNA)中。可以根据要治疗的疾病(或要达到的效果)和移植或植入的位点来选择多核苷酸或蛋白质。在一些实施例中，多核苷酸或蛋白质具有抗肿瘤性。在其他实施例中，多核苷酸或蛋白质是一种激素、生长因子或酶。

B.非细胞材料

在一些实施例中，细胞分泌治疗性有效的物质，例如蛋白质或核酸。在一些实施例中，细胞产生一种代谢产物。在一些实施例中，细胞代谢有毒物质。在一些实施例中，细胞形成结构组织，诸如皮肤、骨骼、软骨、血管或肌肉。在一些实施例中，细胞为天然细胞，诸如自然分泌胰岛素的胰岛细胞或自然解毒的肝细胞。在一些实施例中，细胞可经基因工程改造以表达异源蛋白质或核酸和/或过表达内源性蛋白质或核酸。在一些实施例中，细胞通过基因工程改造以产生新的或不同的产品，这些产品可以是工程基因的表达产品，也可以是由工程基因产生的其他产品，诸如代谢物。

可包括在该装置中或工程改造至该装置中包括的细胞中的治疗剂包括，例如促甲状腺激素；有益的脂蛋白，诸如Apol；前列环素和其他血管活性物质、抗氧化剂和自由基清除剂；可溶性细胞因子受体，例如可溶性转化生长因子(TGF)受体，或细胞因子受体拮抗剂，例如ILlra；可溶性粘附分子，例如ICAM-1；病毒的可溶性受体，例如，HIV的CD4、CXCR4和CCR5；细胞因子；弹性蛋白酶抑制剂；骨形态发生蛋白(BMP)和BMP受体1和2；内皮糖蛋白；5-羟色胺受体；组织抑制金属蛋白酶；钾通道或钾通道调制器；抗炎因子；抗血管生成因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、肝脏生长因子、缺氧诱导因子(HIF)；具有神经营养和/或抗血管生成活性的多肽，包括睫状神经营养因子(CNTF)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、滋养素、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮抑素、ATF、血小板反应蛋白片段，其变体等。更多特定的多肽为成纤维细胞生长因子，诸如酸性FGF(aFGF)、碱性FGF(bFGF)、FGF-1和FGF-2以及内皮抑素。

在一些实施例中，活性剂为蛋白质或肽。蛋白质活性剂的实例包括但不限于：细胞因子及其受体，以及包括细胞因子或它们的受体的嵌合蛋白，包括，例如肿瘤坏死因子α和β、它们的受体及其衍生物；肾素；脂蛋白；秋水仙素；催乳素；促肾上腺皮质激素；血管加压素；生长抑素；赖氨加压素；促胰酶素；亮丙瑞林；α-1-抗胰蛋白酶；凝血因子，诸如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管假性血友病因子；抗凝血因子，诸如但蛋白质C；心房利钠因子；肺表面活性物质；除组织型纤溶酶原激活物(t-PA)之外的纤溶酶原激活物，例如尿激酶；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-alpha)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；穆勒氏抑制物；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；小鼠促性腺激素关联肽；绒毛膜促性腺激素；微生物蛋白，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；抑制素；激活素；激素或生长因子的受体；整合素；蛋白质A或D；类风湿因子；血小板源生长因子(PDGF)；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-a和TGF-β，包括TGF-βI、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，诸如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；干扰素，诸如干扰素-alpha(例如，干扰素例如，干扰素α2A)、-β、-γ、-λ和复合干扰素；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；转运蛋白；归巢受体；地址素；生育抑制因子，诸如前列腺素；生育促进剂；调节蛋白；抗体(包括抗体的片段)以及嵌合蛋白，诸如免疫黏附素；此类化合物的前体、衍生物、前体药物和类似物，以及此类化合物的药学上可接受的盐，或它们的前体、衍生物、前体药物和类似物。合适的蛋白质或肽可以是天然的或重组的，并且包括，例如，融合蛋白。

蛋白质活化剂的实例还包括CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-Iα)、CCL4(MIP-Iβ)、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1(KC)、CXCL2(SDFla)、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8(IL8)、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CX3CL1、XCL1、XCL2、TNFA、TNFB(LTA)、TNFC(LTB)、TNFSF4、TNFSF5(CD40LG)、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF13B、EDA、IL2、IL15、IL4、IL13、IL7、IL9、IL21、IL3、IL5、IL6、IL11、IL27、IL30、IL31、OSM、LIF、CNTF、CTF1、IL12a、IL12b、IL23、IL27、IL35、IL14、IL16、IL32、IL34、IL10、IL22、IL19、IL20、IL24、IL26、IL29、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IL28、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21、IFNB1、IFNK、IFNW1、IFNG、ILIA(IL1F1)、IL1B(IL1F2)、ILIRa(IL1F3)、IL1F5(IL36RN)、IL1F6(IL36A)、IL1F7(IL37)、IL1F8(IL36B)、IL1F9(IL36G)、ILIFIO(IL38)、IL33(IL1F11)、IL18(IL1G)、IL17、KITLG、IL25(IL17E)、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、SPP1、TGFB1，TGFB2、TGFB3、CCL3L1、CCL3L2、CCL3L3、CCL4L1、CCL4L2、IL17B、IL17C、IL17D、IL17F、AIMP1(SCYE1)、MIF、Areg、BC096441、Bmp1、BmplO、Bmp15、Bmp2、Bmp3、Bmp4、Bmp5、Bmp6、Bmp7、Bmp8a、Bmp8b、Clqtnf4、Ccl21a、Ccl27a、Cd70、Cer1、Cklf、Clcfl、Cmtm2a、Cmtm2b、Cmtm3、Cmtm4、Cmtm5、Cmtm6、Cmtm7、Cmtm8、Crlf1、Ctf2、Ebi3、Edn1、Fam3b、Fas1、Fgf2、Flt31、GdnO、Gdn l、Gdn5、Gdf2、Gdf3、Gdf5、Gdf6、Gdf7、Gdf9、Gml2597、Gml3271、Gml3275、Gml3276、Gml3280、Gml3283、Gm2564、Gpi1、Grem1、Grem2、Grn、Hmgb1、Ifnal 1、Ifna12、Ima9、Ifnab、Ifne、1117a、1123a、1125、1131、Iltifb、Inhba、Lefty1、Lefty 2、Mstn、Nampt、Ndp、Nodal、Pf4、Pgly l、Prl7dl、Scg2、Scgb3a1、Slurp1、Spp1、Thpo、TnfsflO、Tnfsfl1、Tnfsfl2、Tnfsfl3、Tnfsfl3b、Tnfsfl4、Tnfsfl5、Tnfsfl8、Tnfsf4、Tnfsf8、Tnfsf9、Tslp、Vegfa、Wnt1、Wnt2、Wnt5a、Wnt7a、Xcl1、肾上腺素、褪黑素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、前列腺素、白三烯、前列环素、血栓素、胰岛淀粉样多肽、苗勒抑制因子或激素、脂联素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素、血管加压素、精氨酸血管加压素、心钠素、脑钠肽、降血钙素、胆囊收缩素、皮质抑素、脑啡肽酶、内皮素、红血球生成素、卵泡刺激素、甘丙肽、人抑胃肽、胃泌素、胃饥饿素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1，促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、铁调素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳激素、生长激素、抑制素、胰岛素、生长调节素、瘦素、促脂素、促黄体激素、促黑素细胞激素、胃动素、食欲素、催产素、胰多肽、甲状旁腺激素、垂体腺苷酸环化酶激活肽、催乳素、催乳素释放激素、松弛素、肾素、分泌素、生长抑素、促血小板生成素、促甲状腺素、促甲状腺素释放激素、血管活性肠肽、雄激素、酸性麦芽糖酶(α-葡糖苷酶)、磷酸化酶、糖原脱支酶、磷酸果糖激酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、乳酸脱氢酶、肉碱棕榈酰转移酶、肉碱和全组织肌腺苷酸脱氨酶。

包括在所公开的装置中或从包括在装置中的细胞产生的激素可以是任何感兴趣的激素。内分泌激素的实例包括抗利尿激素(ADH)，由垂体后叶产生，作用于肾脏，并影响水平衡和血压；催产素，由垂体后叶产生，作用于子宫和乳房，并刺激子宫收缩和乳汁分泌；生长激素(GH)，由垂体前叶产生，作用于身体细胞、骨骼、肌肉，并影响生长和发育；催乳素，由垂体前叶产生，作用于乳房，并影响乳汁分泌；生长激素释放激素(GHRH)，释放生长激素，由下丘脑的弓状核产生；促甲状腺激素(TSH)，由垂体前叶产生，作用于甲状腺，并调节甲状腺激素；促甲状腺素释放激素(TRH)，由下丘脑产生，刺激TSH和催乳素从垂体前叶释放；促肾上腺皮质激素(ACTH)，由垂体前叶产生，作用于肾上腺皮质，并调节肾上腺皮质激素；卵泡刺激素(FSH)，由垂体前叶产生，作用于卵巢/睾丸，并刺激卵子和精子的产生；促黄体生成素(LH)，由垂体前叶产生，作用于卵巢/睾丸，并刺激排卵和性激素释放；促黄体生成素释放激素(LHRH)，也称为促性腺激素释放激素(GnRH)，由下丘脑内的GnRH神经元合成和释放，是一种用于释放FSH和LH的营养肽激素；甲状腺素，由甲状腺产生，作用于体细胞，并调节新陈代谢；降血钙素，由甲状腺产生，作用于肾上腺皮质，并降低血钙；甲状旁腺激素，由甲状旁腺产生，作用于骨基质，并提升血钙；醛固酮，由肾上腺皮质产生，作用于肾脏，并调节水平衡；皮质醇，由肾上腺皮质产生，作用于体细胞，减弱免疫系统和应激反应；肾上腺素，由肾上腺髓质产生，作用于心、肺、肝和体细胞，影响主要的“战斗或逃跑”反应；胰高血糖素，由胰腺产生，作用于肝体，并提高血糖水平；胰岛素，由胰腺产生，作用于体细胞，并降低血糖水平；雌激素，由卵巢产生，作用于生殖系统，影响青春期、月经和性腺发育；孕酮由卵巢产生，作用于生殖系统，影响青春期、月经周期和性腺发育；以及睾酮，由肾上腺、睾丸产生，作用于生殖系统，影响青春期、性腺发育和精子。

在一些实施例中，蛋白质是生长激素，诸如人类生长激素(hGH)、重组人类生长激素(rhGH)、牛生长激素、甲硫酮-人类生长激素、去苯丙氨酸人类生长激素和猪生长激素；胰岛素、胰岛素A链、胰岛素B链和胰岛素原；或生长因子，诸如血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)。

III.免疫隔离化藻酸盐

生物相容性可植入装置的缺失，包括在可植入装置存在的情况下，是阻碍细胞治疗成功的一个根本障碍。植入生物材料会导致异物反应(FBR)，此类异物反应是炎症事件和伤口愈合过程的级联反应，最终导致纤维变性(壁脱落)和随后的植入失败(12-14)。针对许多材料都描述过该反应，从天然聚合物到合成材料(15-17)。因此，医疗行业迫切需要开发生物材料来克服这一关键性挑战，即消除FBR。

为解决这一问题，发明人考虑使用免疫隔离化藻酸盐形成用于包含在本申请的装置中的细胞的保护性涂层。发明人使用组合化学和高通量筛选(Vegas et al.，2016b)鉴别免疫调节小分子，并验证了此类小分子在防止非人灵长类动物中纤维变性以及长期细胞存活方面的长期有效性。

本公开在某些实施例中提供包含可降解壳体和不可降解内核的装置。在某些实施例中，所述不可降解内核可包括经封装的治疗性细胞和/或生物传感器，其中可降解外壳作为用于血管生长的支架，进而增强流向细胞和/或生物传感器的血流。发明人使用最先进的3D生物打印技术来引导免疫分离治疗性细胞构建体的血管化，以获得长期活力和功能性，并使得较高密度的治疗性细胞能够移植。

一个实施例提供了在构建包含电池的装置中使用改性的藻酸盐聚合物。改性的海酸盐聚合物可具有任何所需的分子量。经凝胶渗透色谱确定，藻酸盐的重均分子量优选地介于1000和1000000道尔顿之间，更优选地介于10000和500000道尔顿之间。

改性藻酸盐聚合物可以包含任意比例的甘露糖醛单体、古罗糖醛单体和共价改性单体。在一些实施例中，改性藻酸盐聚合物中大于2.5％、5％、7.5％、10％、12％、14％、15％、16％、18％、20％、22％、24％、25％、26％、28％、30％、32.5％、35％、37.5％、40％、45％、50％、55％或60％的单体为共价改性单体。改性藻酸盐聚合物中大于10％、大于20％或大于30％的单体为共价改性单体。

可以将具有一系列不同氢键电位、疏水性/亲水性和电荷态的共价改性单体结合在一起，从而制备改性藻酸盐聚合物。将共价改性单体加入到藻酸盐聚合物中，可以改变藻酸盐聚合物的理化性质。因此，通过选择性地加入共价改性单体，可以调整藻酸盐的理化性质，以适应所需的应用。

例如，可以通过加入共价改性单体来改变玻璃化转变温度(T_g)。在一些实施例中，通过差示扫描量热法(DSC)测定，改性藻酸盐聚合物粉末的T_g大于50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃、150℃、160℃、175℃、190℃或200℃。

可以通过加入疏水性和/或亲水性共价改性单体来改变藻酸盐的疏水性/亲水性。在具体实施例中，改性藻酸盐聚合物含有一种或多种疏水共价改性单体。通过使用测角仪测量水滴在改性藻酸盐聚合物膜上的接触角，可以定量评估改性藻酸盐的相对疏水性/亲水性。在一些实施例中，改性藻酸盐的接触角小于90°(即改性藻酸盐具有亲水性)。在具体实施例中，改性藻酸盐的接触角大于90°(即，改性藻酸盐具有疏水性)。在一些实施例中，改性藻酸盐的接触角大于95°、100°、105°、110°、115°或120°。

在用于细胞封装的实施例中，改性藻酸盐聚合物可以通过诸如Ca²⁺、Sr²⁺、或Ba²⁺的多价阳离子进行离子交联以形成水凝胶。

在一些实施例中，改性藻酸盐聚合物形成水凝胶，使得使用本文所述的高通量水凝胶形成测定所测量的荧光强度大于10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000或55,000。在具体实施例中，改性藻酸盐聚合物形成水凝胶，使得使用本文所述的高通量水凝胶形成测定所测量的荧光强度大于15,000。在具体实施例中，改性藻酸盐聚合物形成水凝胶，使得使用本文所述的高通量水凝胶形成测定所测量的荧光强度介于15,000和55,000之间，优选地介于20,000和55,000之间，更优选地介于25,000和55,000之间。

在用于细胞封装的实施例中，改性藻酸盐聚合物形成具有充足孔隙率的水凝胶，以允许营养物质、废物以及封装的细胞分泌的激素和/或蛋白质自由地扩散进/出胶囊，同时防止免疫细胞侵入凝胶基质。可使用BET分析测定改性藻酸盐水凝胶的孔隙率和比表面积。在进行BET分析之前，通过在真空下长时间加热改性藻酸盐凝胶来除去溶剂和挥发性杂质。随后，水凝胶样本在真空下(例如通过液氮)冷却，并通过测量在特定压力下吸附到水凝胶上的气体(通常为N₂、Kr、CO₂或Ar气体)的体积进行分析。利用变压下气体的物理吸附分析来表征改性藻酸聚合物所形成的凝胶的总表面积和孔隙率。BET分析法是确定水凝胶孔隙度的一种具体方法。

在具体实施例中，改性藻酸盐形成具有充足孔隙率的水凝胶，以允许营养物质、废物以及封装的细胞分泌的激素和/或蛋白质自由地扩散进/出胶囊，同时防止免疫细胞侵入凝胶基质。在一些实施例中，由改性藻酸盐聚合物形成的水凝胶的孔隙率相对于由未改性藻酸盐聚合物形成的水凝胶的孔隙率增加了5％、10％、15％或20％。在替代实施例中，由改性藻酸盐聚合物形成的水凝胶的孔隙率相对于由未改性藻酸盐聚合物形成的水凝胶的孔隙率降低了5％、10％、15％或20％。

在用于细胞封装的具体实施例中，改性藻酸盐具有生物相容性。可以使用实例5中所述基于荧光的体内生物相容性测定来定量确定改性藻酸盐的生物相容性。在这项测定中，采用体内荧光测定来测量组织蛋白酶活性，进而量化异物对改性藻酸盐的反应。

在一些实施例中，改性藻酸盐聚合物具有生物相容性，使得使用本文描述的体内生物相容性测定所测量的对未改性藻酸盐的归一化荧光响应小于100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％或40％。在具体实施例中，改性藻酸盐聚合物相比未改性藻酸盐诱导的异物反应更低。这表明对未改性藻酸盐的归一化荧光响应小于100％。在一些实施例中，改性藻酸盐聚合物具有生物相容性，使得使用本文描述的体内生物相容性测定所测量的对未改性藻酸盐的归一化荧光响应小于75％、更优选地小于65％、最优选地小于50％。

改性藻酸盐可经本文所述化学改性而改性至任何所需的改性密度。改性密度是对包含改性藻酸盐的胶囊或产品在给定重量、体积或表面面积上的平均改性次数(即附着的化合物)。通常，达到或高于阈值密度的密度可以提供有益的效果，例如较低的异物反应。在一些实施例中，不需要高密度。不受任何特定操作理论的约束，拒信化学改性向一个或多个免疫系统或其他身体成分发出信号、指示或由该系统或成分识别，从而产生有益的效果，例如降低异物反应。在一些实施例中，较低的改性密度可以有效地实现此目的。

有用密度包括至少、小于、大约或为每平方μm，每μg或每立方μm 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、550、600、650、700、750、800、850、900及1000个改性量。还具体考虑并公开了由这些密度中的任何一对限定的所有范围。

在一些实施例中，当胶囊或产品给药到受试者(例如，植入受试者体内)时，其将与受试者身体的体液、细胞、组织、其他组分或它们的组合接触，进而使得胶囊或产品的表面、多个表面或部分表面上的改性密度大于产品的其他表面上的改性密度。

密度也可以用X射线光电子能谱(XPS)测量的表面改性浓度来表示。XPS是一种表面敏感的定量光谱技术，可以测量材料中存在的元素的千分范围内的元素组成。

XPS光谱是通过用X射线束照射材料，同时测量从被分析材料顶部0到10nm处位置逃逸的动能和电子的数来获得的。通过测量表面存在的所有元素，可以计算出来自表面改性的元素的百分比。这可以通过，例如，取所测量的总元素信号中氮(和/或表面改性中的其他元素)的百分比来实现。氮是一种有用的表面改性指示剂，因为形成胶囊或产品的许多基质和材料含有很少的氮。为方便起见，用于指示表面改性的元素百分比可以表示为表面改性百分比。同样为方便起见，表面改性百分比可称为表面改性浓度。

有用的表面改性百分比包括约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100％的表面改性浓度。还具体考虑并公开了由这些浓度中的任何一对限定的所有范围。

有用的表面改性百分比还包括小于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100％的表面改性浓度。还具体考虑并公开了由这些浓度中的任何一对限定的所有范围。

有用的表面改性百分比也包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100％的表面改性浓度。还具体考虑并公开了由这些浓度中的任何一对限定的所有范围。

一方面，藻酸盐可用于形成胶囊。胶囊是平均直径约150μm至约5cm的颗粒。所公开的胶囊可以由交联水凝胶形成。除了封装材料之外，胶囊，例如，可以单独由交联水凝胶形成，可以具有由一个或多个聚合物壳包围的交联水凝胶芯，可以具有一个或多个交联水凝胶层，可以具有交联水凝胶涂层，或它们的组合。胶囊可以具有，例如适合细胞封装的任何形状。该胶囊可以包含分散在交联水凝胶中的一个或多个细胞，从而将细胞“包裹”起来。具体的胶囊由所公开的一种或多种改性藻酸盐形成或包括所述一种或多种改性藻酸盐。

胶囊的平均直径可为约150μm至大约8mm。胶囊的平均直径可为大约150uMs至大约5cm。具体地说，胶囊的平均直径大于1mm，更具体地是1.5mm或更大。在一些实施例中，胶囊直径可达8毫米左右。例如，胶囊的尺寸范围可为大约1mm至8mm、1mm至6mm、1mm至5mm、1mm至4mm、1mm至3mm、1mm至2mm、1mm至1.5mm、1.5mm至8mm、1.5mm至6mm、1.5mm至5mm、1.5mm至4mm、1.5mm至3mm或1.5mm至2mm。

可以通过调节胶囊的渗透性来选择进入胶囊的细胞存活所需的分子的比率以及离开胶囊膜的治疗性产品和废物的比率。还可以通过改变胶囊的渗透性来限制免疫细胞、抗体和细胞因子进入胶囊。通常，如实例所示，已知的形成水凝胶胶囊的方法可以制造通过胶囊渗透性限制免疫细胞、抗体和细胞因子进入胶囊的胶囊。由于不同的细胞类型对代谢由不同的要求，因此可以根据水凝胶中封装的细胞类型来优化膜的渗透性。胶囊的直径是影响对细胞胶囊的免疫应答以及胶囊膜间传质的重要因素。

越来越多的人认识到将体内纤维化的驱动参数应用于改性藻酸盐的性能分析。对改性藻酸盐胶囊进行腹膜内(IP)植入显示，当在未改性的藻酸盐的条件下进行交联时，改性藻酸盐可能导致胶囊出现形状异常。这些形状异常的胶囊可能会使经IP植入的改性藻酸盐胶囊的实施和解释变得复杂化。为改善胶囊的形态，开发了与改性藻酸盐微粒配合使用的配制方法，其中改性藻酸盐与少量高分子量藻酸盐混合。由这种混合物制备的颗粒具有更好的形状和稳定性。

未改性的藻酸盐通常具有大约50,000道尔顿到大约500,000道尔顿的重均分子量；然而，也可以使用具有分子量的未改性的藻酸盐。在一些实施例中，重均分子量为约50,000至约250,000道尔顿，更优选为约50,000至约150,000道尔顿。在一些实施例中，重平均分子量为约100,000道尔顿。

在其他实施例中，一种或多种另外的水凝胶形成聚合物与未改性的藻酸盐结合使用或代替未改性的藻酸盐。此类聚合物是本领域已知的。例子包括但不限于PEG、壳聚糖、葡聚糖、透明质酸、蚕丝、纤维蛋白、聚(乙烯醇)和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)。

在一些实施例中，藻酸盐由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)连接而成。在一些实例中，藻酸盐为高古罗糖醛酸(G)藻酸盐。在一些实例中，藻酸盐为甘露糖醛酸(M)藻酸盐。在一些实施例中，M：G的比率约为1。在一些实施例中，M：G的比率小于1。在一些实施例中，M：G的比率大于1。

通过扫描电子显微镜(SEM)测定，改性藻酸盐和未改性藻酸盐混合制备的颗粒在形状和大小上更均匀。

在一些实施例中，水凝胶胶囊可具有任何合适的形状。有用的形状包括球体形、类球体形、回转椭球体形、类回转椭球体形、椭圆体形、类椭圆体形、椭球体形、球体形、体育场体形、圆盘形、圆柱体形、类圆柱体形、棒体形、类棒体形、立方体形、类立方体形、长方体形、类长方体形、圆环体形、类圆环体形、以及平直形和曲面形。已经或将涂覆的产品、装置和表面可具有此类形状中的任何一种形状或适合于该产品或装置的任何形状。

球形、回转椭球形和椭球体形是具有曲面的形状，可以通过将圆、椭圆或组合围绕a、b和c这三个垂直轴中的每一个垂直轴回转而定义。对于球形而言，这三个轴的长度相同。对于扁球体(也称为扁回转椭球)，轴的长度是a＝b＞c。对于长椭球体(也称为长回转椭球)，轴的长度是a＝b＜c。对于三轴椭球体(也称为不等边椭球)，轴的长度是a＞b＞c。体育场形体是体育场体的回转体形。圆柱体是矩形在长轴上旋转所得到的的回转体形。圆盘是直径大于高度的扁形圆柱体。棒为长轴是直径的十倍或十倍以上的细长圆柱体。

“类球体形”、“类回转椭球体形”、“类椭圆体形”、“类体育场体形”、“类圆柱体形”、“类棒体形”、“类立方体形”、“类长方体形”以及“类圆环体形”分别是指表面大致形成球体、回转椭球体、椭圆体、体育场形、圆柱体、棒体、立方体、长方体或圆环体的物体。超出完美或经典的形状的是，类球体形、类回转椭球体形、类椭圆体形、类体育场形、类圆柱体形、类棒体形、类立方体形、类长方体形以及类圆环体形都可以有波动和起伏。

通常，类球体形是一个椭圆体(对于它的平均表面)，其半主轴彼此之间的距离在10％以内。球体形或类球体形的直径为平均直径，例如半主轴的平均直径。通常，类回转椭球体形是一个椭圆体(对于它的平均表面)，其半主轴彼此之间的距离在100％以内。回转椭球体形或类回转椭球体形的直径为平均直径，例如半主轴的平均直径。通常，类椭圆体形是一个椭圆体(对于它的平均表面)，其半主轴彼此之间的距离在100％以内。椭圆体形或类椭圆体形的直径为平均直径，例如半主轴的平均直径。通常，类体育场体形是一个体育场体(对于它的平均表面)，其半主轴彼此之间的距离在20％以内。体育场体形或类体育场体形的直径为平均直径，例如半主轴的平均直径。代替性地，体育场体形或类体育场体形的大小可以用长轴的平均值来表示。通常，类圆柱体形是一个圆柱体(对于它的平均表面)，其半主轴彼此之间的距离在20％以内。圆柱体形或类圆柱体形的直径为平均直径，例如半主轴的平均直径。

代替性地，圆柱体形或类圆柱体形的大小可以用长轴的平均值来表示。通常，类棒体形是一个棒体(对于它的平均表面)，其半主轴彼此之间的距离在10％以内。棒体形或类棒体形的直径为平均直径，例如半主轴的平均直径。代替性地，棒体形或类棒体形的大小可以用长轴的平均值来表示。通常，类立方体形是一个立方体(对于它的平均表面)，其边与边之间的距离在10％以内。立方体形或类立方体形的直径为平均边长。通常，类长方体形是一个长方体(对于它的平均表面)，其匹配边之间的距离在10％以内。长方体形或类长方体形的直径为平均边长。

通常，类圆环体形是一个圆环体(对于它的平均表面)，其半主轴彼此之间的距离在10％以内。圆环体形或类圆环体形的直径为平均直径，例如半主轴的平均直径。代替性地，圆环体形或类圆环体形的大小可以用环的直径来表示。

“平坦面”是指曲率为0的表面的5％以上的相连区域。“锐角”是指在表面上，表面的切线在表面周长的2％或更短的距离内变化大于10％的位置。表面中的边、角、槽、脊都是锐角的形式。

具体胶囊可以由生物相容性材料制成，具有至少1mm和小于10mm的直径，具有类回转椭球体形，并具有一个或多个附加特征：胶囊的表面孔大于0nm且小于10μm；胶囊的表面为中性或亲水性；胶囊表面所有点的的表面曲率至少为0.2，并且不大于2；以及胶囊的表面没有平坦面、锐角、槽或脊。通常，与缺乏此类胶囊上所具有的一个或多个特征的同种胶囊相比，此类胶囊在植入后引起的纤维化反应较少。

在一些实施例中，胶囊作为制剂提供，并且制剂中的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的胶囊具有本文描述的形状特征，例如，具有类回转椭球体形，或者在表面的所有点上具有至少0.2至2.0的表面曲率。

在一些实施例中，水凝胶胶囊的平均直径大于1mm，特别是1.5mm或更大。在一些实施例中，水凝胶胶囊的直径可达8mm。例如，水凝胶胶囊的尺寸范围为1mm至8mm、1mm至6mm、1mm至5mm、1mm至4mm、1mm至3mm、1mm至2mm、1mm至1.5mm、1.5mm至8mm、1.5mm至6mm、1.5mm至5mm、1.5mm至4mm、1.5mm至3mm、1.5mm至2mm、2mm至8mm、2mm至7mm、2mm至6mm、2mm至5mm、2mm至4mm、2mm至3mm、2.5mm至8mm、2.5mm至7mm、2.5mm至6mm、2.5mm至5mm、2.5mm至4mm、2.5mm至3mm、3mm至8mm、3mm至7mm、3mm至6mm、3mm至5mm、3mm至4mm、3.5mm至8mm、3.5mm至7mm、3.5mm至6mm、3.5mm至5mm、3.5mm至4mm、4mm至8mm、4mm至7mm、4mm至6mm、4mm至5mm、4.5mm至8mm、4.5mm至7mm、4.5mm至6mm、4.5mm至5mm、5mm至8mm、5mm至7mm、5mm至6mm、5.5mm至8mm、5.5mm至7mm、5.5mm至6mm、6mm至8mm、6mm至7mm、6.5mm至8mm、6.5mm至7mm、7mm至8mm、or 7.5mm至8mm。在一些实施例中，胶囊的平均直径或尺寸在1mm至8mm之间。在一些实施例中，胶囊的平均直径或尺寸在1mm至4mm之间。在一些实施例中，胶囊的平均直径或尺寸在1mm到2mm之间。在一些实施例中，胶囊作为制剂提供，并且制剂中的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的水凝胶胶囊的直径在本文描述的尺寸范围内。

在US20160030360A1、US20170239397A1、WO2012167223和WO2017075631中描述了合适的藻酸盐和改性藻酸盐，各自通过引用并入本文。

IV.治疗性应用

治疗性应用包括对癌症的治疗，例如，可以通过微型装置封装的治疗性细胞产生免疫调节蛋白。可通过治疗性生产血液因子，诸如FVIII或FIX来减轻血友病。这些蛋白质可以由封装在微型装置中的治疗性细胞产生。

本公开的一个具体实施例可能涉及治疗糖尿病，糖尿病是一种全球性流行病，目前全世界有超过2.85亿的人口患有糖尿病(Veiseh et al.，2015)。虽然对I型糖尿病(TID)患者的现行的护理标准包括严格的血糖监测方案，以及每日服用外源性胰岛素和糖尿病饮食，但这些患者仍然承受着因该病并发症而产生的不良副作用，部分原因是日常依从性问题(Veiseh et al.，2015；Pickup，2012)。此外，通过定期注射胰岛素，虽然不尽完美，但是能模拟出胰岛的β细胞分泌胰岛素的过程(Veiseh et al.，2015；Robertson，2004)。因此，通过移植外源性供体胰岛组织或细胞来帮助TID患者摆脱对胰岛素的依赖性成为糖尿病治疗研究的“圣杯”。实现这一目标的必然结果是：开发免除终生免疫抑制的方法——终生免疫抑制是同种异体或异种异体移植所必须的手段，并且本身会带来并发症，以便在临床实践中全面实施这一方法(Hirshberg，2007；Pagliuca et al.，2014)。

近日，有报道称已在体外将人类多能干细胞(hPSC)分化为功能性胰岛β细胞，首次开辟了一条无限提供人类胰岛素分泌组织的途径(Pagliuca et al.，2014；Vegas et al.，2016a)。找到可以缓解对终身免疫抑制的需求的方法对于在临床上广泛实施这一新组织来源而言至关重要(Hirshberg，2007；Shapiro，2012；Vogel，2014)。从理论上讲，细胞或组织封装可以通过保护移植物免受宿主免疫检测和随后的移植排斥反应的影响，从而摆脱对免疫抑制的需要(Dolgin，2014；Jacobs-Tulleneers-Thevissen，2013)。

V.生物传感器

本公开的另一方面涉及生物传感器。细胞，无论是真核细胞还是原核细胞，都具有结合和识别多种分析物的生物系统。正如通过医学成像和/或血液中检测到的，膜蛋白通过细胞传递信息，工程化细胞生物传感器可以提供反馈或分析响应。

各种非细胞生物传感器，包括连续血糖监测仪，都依赖于对血流的持续接触。生物传感器的血管化可为分析物提供更高的时间分辨率和更高的信号水平。通过抗纤维化材料长期接受生物传感器可以实现长期效果。

VI.示例性装置结构、组件及其变体

本发明的实施例包括基于先进的3D生物打印的模块化装置，用于实现治疗性细胞、生物传感器和其他可受益于血管化的植入物的血管化和免疫隔离。现在参考图1，示例性实施例说明了包裹不可降解聚合物的可降解聚合物。发明人已经开发了一种3D打印水凝胶内的简单平面血管结构，该3D打印水凝胶具有用于接种封装在免疫隔离化藻酸盐水凝胶中的治疗性细胞的空腔。这种方法允许对血管结构、免疫隔离和免疫调节(防止纤维化反应)进行独立控制。发明人的3D打印腔室具有生物兼容性，并且可以通过对水凝胶制剂(结合聚(乙二醇)二丙烯酸酯和MMP可降解肽-甲基丙烯酸酯)的离散优化来调节3D打印腔室的生物降解。该可生物降解腔室是一种临时基质，可促进图案化的吻合和宿主的整合，同时还在体内植入和重塑的早期阶段将免疫隔离治疗性细胞供养在其不可降解的藻酸盐中。通过这种可伸缩的设计可以堆叠或设计成多层血管，最终可以恢复胰腺功能，为患有遗传疾病的患者提供凝血因子或酶，并实现生物传感器的高效血管化。

A.生物相容性水凝胶的先进3D生物打印

尽管先前生物工程方面的工作都试图通过纳入各种细胞类型(Finkenzeller etal.，2006；Lovett et al.，2009；Wenger et al.，2005)，growth factors，ormicrofluidic networks(Andrae et al.，2008；Bauer et al.，2005)为工程化组织传质，同时还在细胞环境中提供定量的无创指标，但此类技术大都不具备产生具有复杂分级血管结构的血管化组织的能力。三维(3D)打印给组织工程领域带来了巨大的希望，因为该技术帮助研究人员控制打印体积内的各个(x，y，z)坐标。

在此，发明人介绍了一种制造生物相容性水凝胶的新方法：利用发明人开发的低成本立体光刻系统自动化制造血管化水凝胶。发明人首次展示了在本提案中所述的研究中产生高度限定的血管化结构(50μm x，y，z特征分辨率)的能力，通常具有直径约为0.5-1mm的血管通道，并且每天可轻松生产数十个支架。在此，发明人力图设计出活组织，并保持对治疗性细胞位置和周围细胞外基质(ECM)组成的控制。发明人将利用基于聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)和MMP敏感肽，且含水量达80％以上的光聚合性合成水凝胶进行此处所述的研究。PEGDA是一种具备亲水性和生物相容性的材料，该材料易于与丙烯酸酯-TMTD小分子发生作用，从而调节宿主免疫应答(39，40)。

B.支持治疗性细胞的先进血管拓扑结构

可灌注血管结构将稳定3D凝胶中治疗性细胞的内稳态和功能，对流流动将允许高密度治疗性细胞的培养，以最大限度地发挥此类工程化组织的治疗潜力。发明人的水凝胶材料是在内部合成的，并通过立体光刻系统进行定制的3D生物打印制造而成，发明人目前可以在体外水凝胶中产生各种3D血管网络。

为改善对被包埋的治疗性细胞的对流和扩散，发明人将进一步开发水凝胶腔室，从而将被包埋的治疗性细胞精确排列在血管系统旁边。发明人的3D打印立体光刻系统能够构建空腔，用于接种具有被包埋的治疗性细胞的二次藻酸盐水凝胶，并且重要的是，允许制造底层可灌注血管系统，根据发明人假设，该血管系统将促进向治疗性细胞输送营养和氧气，从而改善治疗性细胞在体内的功能。

水凝胶腔室也可以用PEGDA：PeptideMA的混合物制造，该混合物的最佳配方为10wt％的PeptideMA和3wt％的PEGDA(3.4kDa)(图8E)，在保持血管通畅的同时，还支持将人内皮细胞附着到血管壁上。在培养基中以25e6个细胞/mL的浓度将内皮细胞注入血管网络，并在4小时内每15分钟以180°的增量围绕血管轴旋转一次，进而使得内皮细胞附着在所有血管表面。将凝胶过夜培养7天，从而形成稳定的内皮单层。

通过共聚焦显微镜并结合使用VE-cadherin、ZO-1和CD31进行染色，可将内皮单层表征为健康的鹅卵石形状。可用如前所述的组胺和凝血酶来评估内皮的屏障功能(Chrobaket al.，2006)。发明人此前已经表明，图案化内皮网络可以直接与宿主血管系统吻合，并形成人/鼠的杂交血管。在此发明人将进一步表征由PEGDA：peptideMA的混合物所形成的腔室(含有0.4mg/mL的胶原酶)的降解率，其中发明人假设，该混合物将促进藻酸盐所封装的主要治疗性细胞周围的血管发育。

C.封装在TMTD藻酸盐凝胶内的治疗性细胞与血管化装置的融合

典型的细胞封装需要以下步骤：用无钙Krebs-Henseleit缓冲液(4.7mM KCl，25mMHEPES，1.2mM KH₂PO₄，1.2mM MgSO^-4×7H2O，135mM NaCl，pH≈7.4，≈290mOsm)洗涤治疗性细胞簇。洗涤之后，用离心机分离治疗性细胞，并抽取出所有上清液。然后将治疗性细胞球团重新悬浮于TMTD藻酸盐溶液中，该TMTD藻酸盐溶液将如前所述(Vegas et al.，2016a)以不同的簇密度合成。将溶液倒入上述可降解3D打印水凝胶的腔室中，然后用BaCl^-2胶凝溶液对凝胶进行交联。任何二价阳离子都可以用于交联，包括Ca²⁺、Sr²⁺溶液。交联后，将装置立即治愈细胞培养基中培育，直至移植发生前。

D.体内性能

发明人此前已经表明，图案化内皮细胞可以与宿主血管系统吻合，并在14天后形成人/鼠的杂交血管(Baranski et al.，2013)。根据发明人先前的工作，发明人预计内皮化装置应该在两周内发生吻合，并预计4周后PEGDA：PeptideMA凝胶网络将完全降解。

VII.替代性应用

A.治疗性细胞装置和/或生物传感器的使用

生物传感器，包括连续血糖监测仪以及治疗性细胞将受益于强大的血管供应。现在参考图2，治疗性细胞、生物传感器或其他植入物可装载到装置的不可降解部分中。该装置可用于提高任何类型植入物的血管化，进而为生物传感器带来更好的数据采集效果和更好的长期性能，并使得治疗性细胞具有较高的活力和功能性。

B.化合物的缓释

氧气的缓释可能会提高治疗性细胞的长期活力。现在参考图3，用于控制氧气和/或促血管生成化合物释放的方法和材料可装载到装置的可降解和/或不可降解部分。释氧化合物，诸如CaO₂，以及VEGF等促血管生成化合物可以促进装置的可降解部分中大型复杂支架的血管化。CaO^-2是一种产氧化合物。促血管生成化合物的缓释可以提升装置的血管化。结晶的VEGF和组成性地分泌VEGF的细胞是实现此类化合物缓释的可能方法。用于缓释化合物的方法和材料可加入装置的可降解和/或不可降解部分。

C.修改可降解部分的降解曲线图和刚度

可通过如下参数控制凝胶的降解曲线图和刚度。不同分子量(e.g.，6kDa)的PEGDA也可以用来改造降解曲线图。现在参考图4，可以使用不同长度的聚合物链对可降解部分进行改性。这将实现不同的生物降解曲线图。对于更大或更复杂的结构，可能需要微调降解曲线图才能成功地在体内发挥作用。修改PEGDA、GelMA、光引发剂以及光吸收剂的量(图9)。对于具有较大、复杂的血管支架的装置，可能需要放慢讲解速度。紫外线交联的强度和时间会影响凝胶的降解和硬度。

D.用于连接装置的可降解和不可降解部分的锚

随着结构日益复杂，锚提供了可降解部分和不可降解部分之间的连接作用。这使得装置的结构在手术操作和植入过程中不会出现故障。现在参考图6，锚能将装置的不可降解部分和可降解部分结合在一起。复杂的结构和较大的不可降解部分可能需要物理连接来维持其手术操作和植入中的完整性。锚可以将这两个部分成功地连接在一起。

E.装置的可堆叠性

该装置具有可堆叠性，从而允许血管系统的分层。仅需简单堆叠多个装置，便可开发出更大的治疗性构建体。现在参考图8A-F，示出了3D打印PEGDA水凝胶腔室，用于实现治疗性细胞构建体的快速血管化。图8A显示打印腔室容纳悬浮在藻酸盐(蓝色)中的原发性胰岛(绿色)，并且具有底层图案化血管网络(红色)。出于可伸缩性的考虑，腔室设计成可堆叠性。图8B示出3D打印腔室显示有可灌注血管系统(红色)和水凝胶锚，该水凝胶锚将物理捕获含有藻酸盐的胰岛水凝胶。比例尺＝1mm。(结果尚未公布)图8C示出了图8B中水凝胶锚和底层可灌注血管系统(红色)的突出显示区域的放大视图。比例尺＝1mm。(结果尚未公布)图8(D)示出了250μm的横截面视图，显示了藻酸盐接种体积(蓝色)和底层血管系统(红色)。比例尺＝1mm。(结果尚未公布)图8E示出注入血管系统的内皮细胞迅速内衬在血管上，如顶视图所示(左图)，并形成中空内腔(共焦虚拟横截面，右图)。(结果尚未公布)。在图8F中，发明人此前已经表明，图案化内皮细胞可以与宿主血管系统吻合，并在14天后形成人/鼠的杂交血管(Baranski et al.，2013)。

F.改造可降解部分的免疫调节特性和诱导降解

如图9所示，水凝胶前体具有可变性。可以针对不同水平的免疫调节活性对抗纤维化小分子的数量和/或类型进行改造。细胞粘附肽可经改造以提高内皮细胞对水凝胶的血管支架的粘附性。可以选择“MMP敏感的PEG-二丙烯酸酯”中的肽以实现其他诱导降解机制：氧化物驱动型降解、pH驱动型降解、超声波驱动型降解和热驱动型降解。

G.生物相容性水凝胶的先进3D生物打印

在此，发明人介绍了一种制造生物相容性水凝胶的新方法：利用发明人开发的低成本立体光刻系统自动化制造血管化水凝胶。发明人首次展示了在本提案中所述的研究中产生高度限定的血管化结构(50μm x，y，z特征分辨率)的能力，通常具有直径约为0.5-1mm的血管通道，并且每天可轻松生产数十个支架。在此，发明人力图设计出活组织，并保持对β细胞位置和周围细胞外基质(ECM)组成的控制。发明人将利用基于聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)和MMP敏感肽，且含水量达80％以上的光聚合性合成水凝胶进行此处所述的研究。PEGDA是一种具备亲水性和生物相容性且经FDA批准的材料，在探测基本的细胞-基质相互作用方面有广泛的用途，且该材料易于与丙烯酸酯-TMTD小分子发生作用，从而调节宿主免疫应答(Burdick and Anseth，2002；Lutolf etal.，2003)。

H.支持3D β细胞培养的先进血管拓扑结构

为改善对被包埋的β细胞的对流和扩散，发明人将进一步开发水凝胶腔室，从而将被包埋的β细胞精确排列在血管系统旁边。发明人通过立体光刻系统进行的3D打印能够构建空腔，用于接种具有被包埋的原发性胰岛的二次藻酸盐水凝胶，并且重要的是，允许制造底层可灌注血管系统，根据发明人假设，该血管系统将促进向原发性胰岛输送营养和氧气，从而改善治疗性细胞在体内的功能。水凝胶腔室也可以用PEGDA∶PeptideMA的混合物制造，该混合物的最佳配方为10 wt％的peptideMA/3wt％的PEGDA (3.4kDa)(图8E)，在保持血管通畅的同时，还支持将人内皮细胞附着到血管壁上。在培养基中以25e6个细胞/mL的浓度将内皮细胞注入血管网络，并在4小时内每15分钟以180°的增量围绕血管轴旋转一次，进而使得内皮细胞附着在所有血管表面。将凝胶过夜培养7天，从而形成稳定的内皮单层。发明人将通过共聚焦显微镜并结合使用VE-cadherin、ZO-1和CD31进行染色，以将内皮单层表征为健康的鹅卵石形状。将用如前所述的组胺和凝血酶来评估内皮的屏障功能(Chrobak etal.，2006)。发明人此前已经表明，图案化内皮网络可以直接与宿主血管系统吻合，并形成人/鼠的杂交血管。发明人假设图案化的血管系统将支持宿主移植。在此发明人将进一步表征由PEGDA：peptideMA的混合物所形成的腔室(含有0.4mg/mL的胶原酶)的降解率，其中发明人假设，该混合物将促进藻酸盐所封装的原发性胰岛周围的血管发育。

I.将封装在TMTD藻酸盐凝胶内的胰岛融合至血管化装置的方法

典型的细胞封装需要以下步骤：将从CellTrans Inc.Chicago，IL购买的同源小鼠胰岛簇在1400rpm的速度下离心1分钟，并用无钙Krebs-Henseleit缓冲液(4.7mM KCl，25mMHEPES，1.2mM KH₂PO₄，1.2mM MgSO₄ ^2-×7H₂O，135mM NaCl，pH≈7.4，≈290mOsm)洗涤该细胞簇。洗涤之后，用离心机离心胰岛细胞，并抽取出所有上清液。然后将胰岛球团重新悬浮于TMTD藻酸盐溶液中，该TMTD藻酸盐溶液将如前所述(Vegas et al.，2016a)以每0.5mL藻酸盐溶液500簇的不同簇密度合成。将溶液倒入模具中，并使用BaCl₂胶凝溶液对溶液进行交联。交联后，立即用50mL CMRL 1066改良培养基洗涤封装的胰岛簇4次，并将胰岛簇在37℃的转瓶中培养过夜，直至移植发生前。由于胰岛簇在封装过程丢失是不可避免的，因此对封装后的簇的总数重新统计。

封装后，将对细胞活力和功能进行表征。使用基于荧光显微镜测定法测量细胞活力，其中结合荧光素二乙酸酯(活细胞)和碘化丙啶(死细胞)对细胞进行染色。细胞活力的百分比将通过对100个胰岛簇取样并分析活细胞与死亡细胞的比率来确定。发明者还将在体外进行葡萄糖刺激下的胰岛素分泌测定(Vegas et al.，2016a)。

VIII.实例

包括以下实例以说明本公开的优选实施例。本领域技术人员应当理解，以下实例中所公开的技术代表发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成其实践的优选方式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定实施例进行许多改变并且仍获得相同或相似的结果。

预示性实例1

血管化装置的体内生物相容性和血管功能评价。发明人此前已经表明，图案化内皮细胞可以与宿主血管系统吻合，并在14天后形成人/鼠的杂交血管(Baranski etal.，2013)。发明人将使用健康的非糖尿病型C57/BL6nu/nu小鼠T细胞缺陷小鼠评估上述水凝胶腔室的生物相容性和血管化。他们还将评估凝胶与免疫调节化学成分的生物相容性。在此类研究中，发明人将使用非糖尿病型C57/BL6裸鼠(Jackson Laboratories，Bar HarborMaine)。利用装置的三次迭代，即单独使用TMTD藻酸盐、结合使用分隔成腔室的凝胶中的TMTD藻酸盐和中空血管，以及结合使用以TMTD藻酸盐分隔成腔室的凝胶和内皮化血管，发明人将在进行为期两周和4周的体内测试。

发明人将验证体内生物相容性，并且具有可灌注血管网络的水凝胶投影3D打印水凝胶腔室的血管功能评估将支持高密度3D β细胞培养。使用健康的C57/BL6 nu/nu小鼠对装置的三次迭代进行体内测试，即：单独使用TMTD藻酸盐(N＝5只小鼠/时间点)(左图)、结合使用分隔成腔室的凝胶中的TMTD藻酸盐以及中空血管(N＝5只小鼠/时间点)(中)，以及结合使用分隔成腔室的凝胶中的TMTD藻酸盐及内皮化血管(N＝5只小鼠/时间点)(右图)。将使用两个取回时间点，即2周和4周用于评估。

用健康的C57/BL6 nu/nu小鼠体内测试空(无胰岛)血管化装置。图8A-F中概述的迭代装置将植入如前所述的C57/BL6 nu/nu小鼠的腹膜内部位(Vegas et al.，2016a)。在本研究中，单独使用TMTD藻酸盐被引入为对照非血管化系统，分隔成腔室的凝胶中的TMTD藻酸盐结合空心血管作为第二对照系统，该第二对照系统不促进与宿主内皮细胞的吻合。每只小鼠将接受一个植入装置，N＝5只小鼠/装置迭代和取回时间点。分别于植入2周和4周后处死小鼠。根据发明人先前的工作，发明人预计内皮化装置应该在两周内发生吻合，并预计4周后PEGDA：PeptideMA凝胶网络将完全降解。在规定的时间点，即2周和4周时处死小鼠，并通过显微解剖仔细移植装置，以确保剩余藻酸盐凝胶块周围的血管网络不会被破坏。用多聚甲醛保存取回的组织和凝胶，并使用标准的组织学处理技术进行进一步处理。

对空(无胰岛)血管化装置周围的生物相容性和血管网络完整性开展体外组织学分析。然后，将对取回的装置开展以下评估，以评估血管化和生物相容性：1)通过相差显微镜和共聚焦荧光显微镜对纤维化增生(FO)进行定量；2)通过开展FACS分析以评估单个细胞悬液中炎症细胞(CD68染色的巨噬细胞、Ly6Gr+染色的中性粒细胞、平滑肌肌动蛋白染色的肌成纤维细胞和CD31内皮细胞)的数量，该细胞悬液来自：i)回收液的IP冲洗液；ii)从收取的装置表面分离出的细胞；以及3)对装置开展组织学分析以评估FO的厚度、组织炎症状态及血管化。将对组织样本进行检查，以寻找纤维化和排斥反应的根据。将使用Mason三色染色监测与纤维化相关的胶原沉积。此外，将用发明人先前开发的方法对成纤维细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和内皮细胞进行切片免疫染色。(Vegas et al.，2016a；2016b；Veisehetal.，2015a)。

将通过组织学对装置周围的血管密度进行验证，发明人预计大于90％的打印通道表面积应该由宿主内皮细胞定植。内皮细胞与宿主血管吻合的过程需要1-2周，要求在吻合过程中基质PEGDA：PeptideMA需保持完整。根据以往的经验，PEGDA：PeptideMA的比例应该可以持续两周；然而，如果凝胶降解太慢，那么发明人可以简单地改变这两种单体的比例，以达到所需的降解率。PEGDA：PeptideMA的比例增加会降低降解率，比例减小则会提高降解率。例如，单独用PEGDA创建的腔体在体内是不可降解的。

链脲佐菌素诱导(STZ诱导)装载胰岛细胞的血管网络的体内测试。发明人将利用同源移植模型评估在STZ治疗的C57/BL6 nu/nu小鼠中，装载胰岛的TMTD藻酸盐凝胶在血管化装置中的疗效。TMTD凝胶周围的血管化应该有助于提高细胞活力和增强葡萄糖刺激下的胰岛素分泌动力性。

用内皮细胞接种血管支架。血管支架可以接种内皮细胞，该内皮细胞分泌VEGF，可以改善装置的体内反应。现在参考图7，内皮细胞可用于内衬在血管支架上。内皮细胞分泌VEGF以增强装置的血管化。可以使用不同来源的内皮细胞(现成的和源自病人的)，或者根本不适用细胞。这可能会导致不同的体内装置移植。由于该装置可以接种任何来源的内皮细胞，因此使用源自患者的内皮细胞是最安全的。

现在参考图10，可在体内测试装置的两次迭代：具有中空血管的装置(左图)和具有内皮化血管的装置(右图)。此类迭代可用于验证糖尿病裸鼠中以图案化血管网络分隔成腔室且装载了胰岛的TMTD藻酸盐的体内功能性。结合使用经STZ处理的C57/BL6 nu/nu小鼠以及以下项中的内容，对装置的两次迭代进行体内测试：分隔成腔室的凝胶中装载了同源胰岛的TMTD藻酸盐和中空血管(N＝5只小鼠)(左图)；以及分隔成腔室的凝胶中装载了同源胰岛的TMTD藻酸盐和内皮化血管(N＝5只小鼠/时间点)(右图)。

发明人将同源胰岛细胞封装到TMTD藻酸盐凝胶中，从而放入血管化装置中(每个装置500个)，并评估细胞、形态、活力、葡萄糖反应性胰岛素分泌。响应于葡萄糖激发，通过活死细胞活力测定和胰岛素产生测试相结合的方法来监测凝胶组件中封装的胰岛的功能性和活力。

移植的同源胰岛将装载到STZ-B6 nu/nu小鼠的血管网络中，并在为期100天的时间内每天监测血糖水平。六只糖尿病裸鼠将经IP移植入分隔成腔室的凝胶中装载了同源胰岛的TMTD藻酸盐和中空血管，并且六只糖尿病裸鼠将经IP移植入分隔成腔室的凝胶中装载了同源胰岛的TMTD藻酸盐和内皮化血管。将对小鼠开展为期100天的监测。每天测量血糖水平。在移植后14天、28天和100天，在动物身上进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，并监测体内血糖调整和C肽分泌的动力学。在植入后一周和整个100天的监测期内，血糖水平如果低于220mg/dL则将视为治愈。然后根据长期活力和葡萄糖响应性胰岛素分泌动力学来确定封装的有效性。体内血糖量正常实验结束后，接受移植物，并进行组织病理学分析。确定移植失败的潜在原因，并检查胰岛活力(活细胞/死细胞测定)、功能性(体外葡萄糖激发测定)和生物相容性(免疫染色以表征潜在的免疫应答和纤维化)。

在糖尿病裸鼠模型中确定血管化装置中TMTD封装的胰岛的功效。先前的研究表明，在STZ STZ-B6 nu/nu小鼠中，每只小鼠500个胰岛足以实现将血糖校正至正常水平；然而，如果经过1周后糖尿病小鼠血糖还是不能校正至正常水平，发明人将用装载了较高数量的胰岛(1000和2000)的装置对更多的小鼠进行移植。

发明人将在含有可灌注血管系统的3D凝胶中开发和验证下一代β细胞的3D培养。发明人假设可灌注血管结构将稳定3D凝胶中β细胞的内稳态和功能，并且对流流动将允许高密度β细胞培养以最大限度地发挥此类工程化组织的治疗潜力。水凝胶材料是在内部合成的，并通过立体光刻系统进行定制的3D生物打印制造而成，并且发明人目前可以在体外水凝胶中产生各种3D血管网络。发明人将筛选不同的血管拓扑结构，以确定支持体内细胞活力和功能性的最高密度的主要制剂，如图11A-F中所示。

血管拓扑结构的变化。血管拓扑结构可能对高密度治疗性细胞培养有重要影响。现在参考图5，打印出的3D血管系统可以有许多可能的拓扑结构。3D血管系统的拓扑结构可能对封装的治疗性细胞和生物传感器的长期活力和性能有重要影响。本文公开的3D打印方法允许快速合成高度多样化和复杂的血管结构。该3D打印方法允许开发高度复杂的血管拓扑结构，如图11A-F中所示。

改造藻酸盐的抗纤维性和刚度可以通过多种方式对用于不可降解部分的藻酸盐进行改造：所选抗纤维化小分子可以缀合至所选剂量的藻酸盐上。此外，还可以通过改变改性藻酸盐与SLG100的比例或改变交联缓冲液(使用Ca²⁺或Sr²⁺)来改变藻酸盐的刚度。这可以改善不同植入部位的生物力学反应。

图11A-F示出了探讨可灌注水凝胶中血管效率的血管设计。3D血管几何结构将使用具有迭代复杂性的空间填充算法计算得出。图11A中，为清楚起见，以2D形式显示了示例血管拓扑结构生长算法。图11B示出了发明人还将计算空间填充算法确定为构建可灌注血管拓扑结构的良好候选算法。在图11C中，通过从包围体中减去布尔值，可以将遵循默里定律的子分支直径缩放的3D血管启发的结构转换为用于3D打印的拓扑结构。图11D-F示出了在可灌注水凝胶中制作的血管拓扑结构，如标记所示，可通过宏观摄影或μCT分析显示。发明人进一步说明，3D血管网络可以允许网络互相穿插，如(图11D-E)中(红色，蓝色)所示。

实例2-实例3的材料和方法

GelMA、PEGDA和LAP合成。如前所述，在室温下使用等摩尔量的二甲基苯基亚膦酸盐和2，3，6-三甲基苯甲酰氯在氩气中过夜制备LAP(Fairbanks et al.，2009)。在如下步骤中，聚(乙二醇)丙烯酰氯(在三乙胺存在下过夜)反应(图16A)(Miller et al.，2010)，进而合成了3.4kDa、6kDa、10kDa、20kDa和35kDa的聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)。将甲基丙烯酸酐(0.1mL/1.0g明胶)滴加到明胶混合物(A型，Bloom 300)中，该混合物在50℃下在100mM碳酸盐/重碳酸盐缓冲液(pH＝9.5)中溶解4小时，进而合成甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)(Shirahama et al.，2016)。

用投影立体光刻技术制造水凝胶。利用投影立体光刻技术(pSLA)制备单片水凝胶，该技术通过光掩膜投影逐层对光敏聚合物依次进行交联，从而生成3D体(Arcaute，K.Ann.Biomed.Eng.，34：1429-41，2006)。发明人的实验室已经开发出一种定制的pSLA 3D打印机，该打印机包含商用数字光处理(DLP)投影仪、用于z平台的步进电机和轴、RepRapArduino Mega Board(RAMBo)和3D打印外壳组件，其中该组件是使用Ultimaker 2(Ultimaker，Netherlands)由消费级聚(乳酸)(PLA)塑料丝制造而成。完整设置如前文所述(Grigoryan，B.Science 364(6439)：458-464，2019)。水凝胶是通过附着在z-平台上的载玻片表面逐层制备而成，该载玻片表面浸泡在涂有聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)(6∶1基底：催化剂)的聚合物前体溶液罐中。XY构建尺寸为64x40mm且具有50μm的XYZ分辨率，由投影仪光学元件(XY)和所用的光吸收剂(Z)所确定。光源为405nm并附接到计算机，以便控制电机、加热元件和光掩膜的投影。

水凝胶前体混合物由3.25wt％的3.4kDa PEGDA、10wt％的GelMA、17mM LAP、10％甘油和2.255mM酒石黄制备而成。酒石黄(黄色食用色素FD&C Yellow 5，E102)用作光吸收剂，且发明人先前已确定酒石黄可充当低毒性染料，很容易洗掉以形成透明的水凝胶，从而便于成像(Grigoryan，B.Science 2019)。如果细胞封装在水凝胶块中，则将所需浓度、共培养比例的细胞加入并重悬于水凝胶前体溶液中(5x10⁶个内皮细胞到1x10⁶个间充质干细胞)。将水凝胶前体混合物装载到PDMS涂覆的皿中，此时将构建平台降至第一层位置。Creation Workshop软件(envisionlabs.net/上的万维网)通过发送GCode命令来控制打印机，此类命令用于实现z-平台的垂直移动、光掩膜序列的投影以及加热元件的受控加热。GelMA对热致凝胶化敏感，因此在交联之前，将罐保持在37℃以维持水凝胶前体混合物的水溶液。每层高度设置为50μm，曝光时间根据每批GelMA调整(通常在每层10-15秒之间)，功率输出为19.5mW/cm²。在打印构建体完成后，3D水凝胶通过在水凝胶和载玻片之间使用刮刀从载玻片上刮除，并且可通过多次洗涤在PBS中膨胀过夜。

用于长期灌注的细胞培养和内皮化。在37℃、5％的CO₂的条件下，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在VascuLife培养基和补充剂(LifeLine Technologies，Frederick，MD)中培养。内皮化通道中所使用的HUVEC都在4-8代之间。将水凝胶放置在定制的PLA垫圈内，以作为灌注室紧密贴合凝胶以及入口和出口处的18号针尖。在放置水凝胶之前，将腔室粘合在载玻片上，用乙醇消毒15分钟，然后完全干燥。一旦水凝胶放入腔室内，且入口和出口处都安装有18号针，便用另一块载玻片将腔室的顶部密封起来。这种设置允许流体密封灌注通过腔化结构。

用连接至通道入口处的18号柔性针头上的1mL Normject注射器将HUVEC以30e6个/mL的浓度装载到水凝胶微通道的内腔内。出口同样置入一根18号的软针，以实现流体密封通道。在注射悬浮液后，细胞可以粘附在圆柱形底表面15min。此后每15min旋转一次，持续旋转6小时，将凝胶旋转90度，以建立粘附有HUVEC的圆柱形涂层。在灌流过程中，用新鲜的培养基冲洗掉任何未粘附的细胞。

使用高精度多通道蠕动泵ISMATEC(Cole Parmer)将灌流培养维持在5μl/min。导管通过蠕动管与IV介质袋中的luer锁紧套口相连，并连接至灌注腔室的入口。在到达水凝胶之前，两个0.22μm的滤光器顺着水流放置，其中一个放置在入口的正前方，另一个放置在介质袋和蠕动泵之间的Y接头截止阀上。在长期灌流培养过程中，根据需要通过该接头将培养基添加至袋子中。在连接至灌注腔室之前，一直预润湿到导管入口处，以便排出所有气泡。

落射荧光成像。使用尼康Eclipse Ti倒置落射荧光显微镜(Nikon instrumentsInc.，Melville，NY)和Zyla 4.2sCMOS相机(Andor，South Windsor，CT)获取拼接图像。重叠度指定为30％。

血管化凝胶的脂肪垫植入。所有涉及动物的工作都按照莱斯大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。对雄性SCID/bg小鼠(6-10周龄，查士利华，品系代号250)进行血管化凝胶的脂肪垫植入。简而言之，用2-4％异氟醚麻醉小鼠，小鼠腹部剃毛，并用必妥碘和异丙醇消毒。向小鼠施用1mg/kg的丁丙诺啡SR lab(兽医药剂)，同时向小鼠施用1mL 0.9％生理盐水以防止脱水。用解剖刀和剪刀在白线处切出刀口，并用Adson钳拉出左右性腺脂肪垫。植入前用PBS轻轻冲洗血管化水凝胶，并将性腺脂肪垫缝合至血管化水凝胶的两侧。植入过程中用0.9％无菌生理盐水轻轻冲洗凝胶以保持水合。缝合脂肪垫后，将凝胶引入腹腔，并闭合肌肉和皮肤。术后对小鼠进行监测，并根据需要给予护理和饲养。

葡聚糖注射。对于一些示例，在PBS中以25mg/mL的浓度制备70kDa的德克萨斯红缀合可固定葡聚糖(D1864，ThermoFisher)。对于其他示例，在PBS中以2.5mg/mL的浓度制备70kDa的CF680缀合可固定葡聚糖(Biotium，Cat#80129)。安乐死前15min尾静脉注射100μL葡聚糖溶液。通过手术取出凝胶，并用索尼A7R3相机(索尼)和佳能微距镜头EF 100mm 1∶2.8L IS USM(佳能)拍摄。然后将凝胶浸入4％的冰冷PFA中，并在4℃下固定48h。固定后，用PBS洗涤凝胶3次，每次洗涤20min，并保存在4℃的PBS中成像。

胰岛分离。按照莱斯大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案使用雌性斯普拉-道来氏大鼠(251-275g，查士利华，品系代号400)进行胰岛分离。首先，将大鼠处以人道的安乐死。然后，用V形切口切开腹部，切断膈肌，翻转肝脏以露出胆总管。将含1.5mg/mL胶原酶XI(C7657，Millipore Sigma)的15-20mL胰岛分离缓冲液(缓冲制剂)注入胆总管，然后经手术切除胰腺，进行大鼠胰岛酶消化处理。消化处理包括在37℃下孵育14min，用10％BSA(50-253-923，Fisher Scientific)洗涤几次，然后进行梯度密度分离(产物99-690-CIS，99-815-CIS，99-691-CIS，99-692-CIS，Corning)。用10％FBS和1％青霉素/链霉素将胰岛维持在RPMI-1640(10-040-CM，Corning)。

糖尿病诱导。按照莱斯大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案使用雄性SCID/bg小鼠(6-10周龄，查士利华，品系代号250)进行糖尿病诱导。将70mg/kg链脲佐菌素(572201，Millipore Sigma)溶于柠檬酸盐缓冲液，并向小鼠连续施药5天。

葡萄糖监测。用血糖试纸和血糖仪(BG1000，Clarity Diagnostics)对尾刺产生的一滴血中的血糖进行定量。对于连续2天每天禁食1h的小鼠，如果血糖测量值超过400mg/dL，则视为糖尿病小鼠。如果小鼠在非空腹情况下的血糖测量值小于或等于250mg/dL，则视为血糖正常。

藻酸盐块中胰岛的封装。TMTD藻酸盐和SLG100(Pronova，Sandikva，挪威)分别以5％和3％的浓度溶解在两份0.8％生理盐水溶液中。此类溶液以UPVLVG和SLG100的v/v比例为80∶20的情况下结合。藻酸盐用0.2微米注射器过滤器无菌过滤，用于重悬刚分离的大鼠胰岛。将带胰岛的藻酸盐吸移至无菌的20wt.％PEGDA模具中从而完成铸型，其中该模具预先浸泡在交联溶液中：20mM BaCl₂(Sigma-Aldrich 342920)，5wt％的甘露醇(ThermoFisher 33342)。将一层聚碳酸酯薄膜(Sterlitech 0.01微米，62x22mm，PCT00162X22100)浸泡在交联溶液中，折叠在模具的侧面，使其覆盖在模具的顶部，并延伸到底部。用钳子夹住矩形薄膜的两端，拉紧薄膜，将模具抬起，放在2-3cm高的交联剂浴(100mm x 50mm结晶皿，PYREX)中。将模具放在交联剂中保持20秒，然后移除交联剂浴，并放在干净且不吸水的表面。打开薄膜，然后将模具轻轻黏在载玻片上。(Thermo Fisher Cat.No.12-544-7)。然后将载玻片轻轻放回浴中，并将模具固定在皿和载玻片之间。然后将一个重物(VWR 50mL装满水的锥形管)放在载玻片的顶部以压制模具，并持续交联一小时。一小时后，从浴缸中取出模具，然后轻轻地剥去块。然后将块放在50mL的锥形容器中清洗，并加入20mL HEPES缓冲液，其中加入20mL，排出15mL，并在随后的每次清洗中加入15mL新的缓冲液。用完全培养基将块以相同的方式清洗三次，然后加入10mL培养基并在培养箱中保存。

胰岛活力。通过稀释在完全RMPI-1640中的Live/Dead试剂盒(L3224，ThermoFisher) 1∶200v/v Calcein AM和1∶200v/v乙锭均二聚物-1，制备活细胞/死细胞染色液。将该染色溶液加入含有封装的胰岛的孔内，其中染色溶液与培养基的比例为1∶1v/v。将封装的胰岛在37℃、5％CO₂的条件下保持30min，随后在4℃下用4％PFA固定24h。用EVOS FL(Thermo Fisher)和尼康Eclipse Ti落射荧光显微镜(尼康)对染色固定的胰岛进行成像。

葡萄糖刺激下的胰岛素释放。Krebs缓冲液(KRB)按照(Veiseh et al.，NatureMedicine 22：306-311，2016)中所述的方法制备而成。KRB由2mM葡萄糖(Sigma；G7528)(KR2)和18mM葡萄糖(KR18)制备而成。封装的胰岛在KR2(洗涤)中孵育30min，在KR2(低)中孵育1h，然后在KR18(高)中孵育1h。从低孔(KR2)和高孔(KR20)中收集上清液，然后使用超敏大鼠胰岛素ELISA(ALPCO)(一式两份)定量胰岛素浓度，而无需稀释样本。

统计分析。使用GraphPad Prism 8软件(GraphPad Software)进行统计分析；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001and****P＜0.0001。

实例3-结果

为开发一种免疫调节小分子改性、可3D打印和可降解的共聚物凝胶基质，发明人使用已建立的方法合成PEGDA、GelMA和Met-RZA15。如前所述，在室温下使用等摩尔量的二甲基苯基亚膦酸盐和2，3，6-三甲基苯甲酰氯在氩气中过夜制备LAP(图16A)(Fairbanks etal.，2009)。在如下步骤中，聚(乙二醇)丙烯酰氯(在三乙胺存在下过夜)反应(图16A)(Miller et al.，2010)，进而合成了3.4kDa、6kDa、10kDa、20kDa和35kDa的聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)。将甲基丙烯酸酐(0.1mL/1.0g明胶)滴加到明胶混合物(A型，Bloom 300)中以合成甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)，该混合物在50℃下在100mM碳酸盐/重碳酸盐缓冲液(pH＝9.5)中溶解4小时(图16B)(Shirahama et al.，2016)。使用两步法合成免疫调节小分子Met-RZA15(图16C)。在第一步中，以碘化铜为催化剂，通过点击化学反应合成RZA15(Vegas et al.，2016b)。在如下步骤中，在存在三乙胺的情况下，RZA15和甲基丙烯酰氯在氩气气氛中反应，从而合成甲基丙烯酰基改性的RZA15(Met-RZA15)(图16C)。中间体和产物通过ESI和/或NMR(¹H和¹³C)分析进行表征，以确定其质量和纯度。通过将0.5M水溶液Met-RZA15与PEGDA(3.25wt％)、GelMA(10wt％)和17mM LAP的光聚合，进而生产小分子改性凝胶。16D)。此类试剂的批量足以满足这些研究所需的大量材料。

表A

聚合物 酰化(％) 酰化(％) 引用

(内部) (文献范围)

聚合物的酰化程度与整篇文献中记录的一致且相差无几。对于像PEGDA这类双官能聚合物，官能团只存在于每个线性链的末端，需要高度的丙烯酸化才能将每个分子完全并入水凝胶网格中。由于酰化程度＞85％，我们的内部合成可与该领域的其他专家化学家相媲美，支持高质量凝胶的3D打印。对于像GelMA这类多官能聚合物，官能团以氨基酸侧链的形式存在于整个主干上，所需的丙烯酸化程度取决于应用。随着酰化程度逐渐提高，会增加凝胶硬度进而改善处理，但同时会减小孔径，抑制细胞扩散，导致胶原酶降解率变慢。因此，所有的研究都是通过适度酰化的GelMA进行的(53.4±8.3％)。通过测量明胶中具有伯胺取代基的赖氨基残基的比例，可借助1H NMR证实酰化。随着大批量生物相容性聚合物(350g PEGDA，45g GelMA)已实现最优酰化程度，我们的合成管道支持3D打印数百套用于体内和体外平行研究的血管化装置。这一规模在该领域之前未见报道，这提升了我们小组对植入的胰岛结构成功进行血管整合方面的潜力。

表B

聚合物力学分析说明，批次间的可变性较低。除了通过NMR证实可再现的酰化作用外，我们还通过量化不同批次的聚合物在剪切变形(储能模量)下表现一致的能力，进一步证明了其可再现性。使用AR-G2平行板流变仪获得这一指标。对于每个平行测试样，将45μL聚合物样本溶液(包含0.05wt％的Irgacure 2959)加入底板，并降低顶板以获得尺寸为50μm的间隙。使用5rad/s的角频率和10％的应变，聚合物溶液预处理30s，然后暴露在365nm灯产生的10mW/cm²的灯光中。在光交联反应进行的同时，监测储能模量的变化，最终产生一个可与其他样本比较的平台值。

考虑到临床目标，植入式凝胶结构必须能够在体内降解。但是如果此类凝胶在吻合前完全降解，那么外源性供体细胞将不能与与自然循环相互作用。凝胶力学中存在类似的平衡，其中凝胶必须有足够的硬度才能用于手术操作。在此，发明人发现，在0.2mg/mL胶原酶的存在下，小的(150μL)10％的GelMA凝胶可以迅速降解，并且可以通过加入PEGDA来调节降解动力学。通过将较少量的PEGDA添加至凝胶制剂中，胶原酶的降解时间延长了4倍，并且在紫外曝光期间使用平行板流变仪的测量显示，剪切刚度增加了3倍。此类数据显示，现有的10％GelMA、3.25％3.4kDa PEGDA制剂能够满足酶促及力学要求：具备支持吻合的合适的降解率及支持手术操作的合适的刚度。此外，调节此类特性的能力提供了一个独特的优化体内的血管化的机会，而不需要借助外源性基质细胞或生长因子。见图17A-B。

发明人加入了抗纤维化分子Met-RZA，以防止3D打印凝胶的纤维化。为验证Met-RZA在凝胶表面的存在形式，采用TOF-SIMS分析对凝胶表面进行表征。使用TOF-SIMS NCS仪器获得负高质量分辨率深度变化图，该仪器结合了TOF-SIMS仪器(ION-TOF GmbH，德国明斯特)和原位扫描探针显微镜(NanoScan，Switzerland).。使用30keV Bi³⁺离子束(测量电流为0.2pA)作为分析主探针(扫描面积为100×10 μm2)，光栅为64×64像素。使用-10V的表面电位调整电荷效应。循环时间固定为200μs(对应于m/z＝0-3649a.m.u质量范围)。通过TOF-SIMS分析对存在小分子的凝胶表面进行分析(Met-RZA和RZA15)(图18B-D)。负极性TOF-SIMS数据显示，与未打印有Met-RZA小分子打印的凝胶相比，打印有Met-RZA小分子打印的凝胶中的Met-RZA(质量＝459.26，1.6倍)和RZA15片段(质量＝390.98，5.6倍)的含量更高。这表明3D打印凝胶表面存在免疫保护性小分子，这将减少植入凝胶的纤维化。

发明人证明了他们不仅能够打印出通畅的血管通道，而且能够控制循环，这对于实现内皮细胞覆盖率、正确的血流动力学和无泄漏的导管插管至关重要。这一能力能够实现具有复杂3D结构的水凝胶血管网络，包括血管网络的各种拓扑结构。见图19A-D。

通过展示按照设计制造的通道的通畅性，发明人证明他们可以成功构建可灌注血管网络，以支持生物相容性血管化装置内的对流流动。这也意味着，如果发明人认为不同的血管设计更适合血管化装置内胰岛的长期活力，这种3D生物打印技术可以适应任意的血管结构。

从两种水凝胶结构的速度曲线图来看，无滑移边界条件这一假设似乎是有效的，因为可灌注体积两边的速度近似为零。如高r2值所示，最佳拟合曲线很好地表示了数据。虽然此类凝胶结构中的流体动力学会存在微小的变化，但是流动通常而言是不受任何阻碍的。因此，如果在体内发生吻合，此类水凝胶有可能调节血流，这将有助于血管集成以支持胰岛细胞。见图21A-G。

正如发明人所期望的，如果要让他们的血管化装置与宿主的循环系统完全集成，在心动周期的压力变化期间，血管不发生爆裂是至关重要的。此外，血管的周期性扩张维持了健康的血流动力学并为促进内稳态的潜在细胞群(例如，内皮、肌、基质)提供机械信号。

发明人表明，他们的血管网络在内腔保留的同时，可以完全内皮化(图23C，插图截面)。此外，他们有证据表明，HUVEC可以主动降解和入侵凝胶。他们还观察到在薄壁凝胶空间内迁移的HUVEC，这表明存在单细胞迁移(图23A，插图，箭头表示单细胞迁移)以及芽生式血管生成(图23D)。内皮细胞沿血流方向排列(图23B)，呈典型的鹅卵石形态(图23C，插图)。数天后，HUVEC在圆柱形内腔内扩散，形成融合的单层。这些内皮化凝胶在长期灌注下可以稳定维持。相信这种内皮单层已经达到静止状态，并且可以维持到准备体内植入之前。发明人认为，在血管化装置中加入内皮化网络将支持体内胰岛的活力，同时促进宿主血管系统的整合，以实现长期的活力和功能性。

数天灌注后内皮细胞的高活力表明内皮化血管网络长期保持健壮，进一步表明内皮细胞单层已经成熟。内皮细胞单层可以在这种静止状态下维持数天，而不会丧失活力。这使得移植物可以提前准备好，并在供体胰岛可用时接种。

将内皮细胞成功接种至3D打印凝胶后，通过铸型藻酸盐将胰岛导入凝胶中(图25A)。开发这种铸型方法是为了确保交联的藻酸盐包围锚(图25B)并将藻酸盐和胰岛维持在适当位置。在无菌环境下，两种类型的藻酸盐，即，用RZA15和SLG100 (NovoMatrix，Sandvika，Norway)改性的UP VLVG，按60∶40的比例混合并过滤，产生TMTD藻酸盐。将60μlTMTD藻酸盐移入凝胶腔室，用100mM CaCl₂和1mM BaCl₂溶液交联30min。重复这一操作，使得腔室内充满藻酸盐和胰岛。振镜切片证明交联成功，这显示整个块均存在固体藻酸盐。通过遵循上述步骤，可以稳定地生产浇入TMTD的凝胶。这种藻酸盐铸型过程产生了一种构建体，该构建体可以牢固使用而不会解体。藻酸盐的成功铸型实现了胰岛的封装。

TMTD经制备并与人胰岛混合。将含有藻酸盐和胰岛的凝胶与Live/Dead染色剂(在完全CMRL-1066中的1∶200钙黄绿素AM，1∶200乙锭均二聚物)一起培养30min。然后将含有胰岛的凝胶固定并成像于尼康Ti Eclipse落射荧光显微镜上。

对于GSIS，将TMTD藻酸盐和人胰岛注入3D打印血管化装置中。将3D打印血管化装置在2mM Krebs缓冲液中培养30min(预洗)、60min(洗涤)和60min(低糖)。然后在18mMKrebs缓冲液中培养60min(高糖)。采用超灵敏人ELISA(Alpco、Salem、NH)对低糖和高糖上清液进行双重分析。刺激指数由高糖时产生的胰岛素与低糖时产生的胰岛素之比计算得出。

结果显示，胰岛细胞活力＞90％刺激指数＞2，这说明发明人的胰岛封装装置和方法与脆性胰岛生物学兼容，提高了该方法在同种异体和异种异体胰岛移植中的转化价值。

为评估具有图案化血管系统的凝胶在体内的吻合性，发明人植入了经GFP-HUVEC内皮化后的凝胶(图26A)。将GFP-HUVEC接种至凝胶，并灌注培养6天(图26B)。为促进血管吻合，将高度血管化的性腺脂肪垫包裹并缝合至凝胶上(图26C)。在将小鼠安乐死之前，通过尾静脉注射人类特异性凝集素和小鼠特异性凝集素。3周后取出凝胶，固定凝胶，并保持在4℃下进行分析。3D打印通道在体内植入过程中保留了蛇形拓扑结构和通畅性，这表明在体外具有独特图案的血管系统在体内也具有类似图案。凝胶通道中血液的可视化(图26D)是表面血管与凝胶整合的好迹象。密切关联的血管(图26D)表面凝胶具有可降解性，且能够与宿主血管整合在一起。这些发现提升了该方法在体内产生图案化血管系统以用于封装胰岛移植的潜力。

实例4

开发具有多种生物材料特性的图案化多层水凝胶。图案化水凝胶以如下步骤开发：可以利用多种水凝胶制剂来构建具有各种生物材料特性的多层图案化水凝胶，包括可降解性、刚度、细胞成分、细胞粘附性。

具有可降解的底层和顶层及不可降解的中间层的三层水凝胶可以如下步骤开发：用降冰片烯官能团(norHA)改性的透明质酸、与光引发剂(例如，LAP)和可降解肽交联剂(例如，CGPQGIWGQGCR(SEQ ID NO：1))结合，产生具有可降解肽交联的图案化全合成水凝胶制剂，进而可以明确降解曲线图。

在例如使用立体光刻方法打印不可降解部分之后，可以将打印溶液更换为不可降解溶液，例如6.0kDa PEG-二丙烯酸酯。不可降解PEG-二丙烯酸酯的图案化组件可以在同一装置上打印。

最后，不可降解凝胶制剂可以更换为可降解凝胶制剂，例如，norHA+LAP+CGPQGIWGQGCR(SEQ ID NO：1)肽交联。这将使得具有不同生物材料特性的多层生物材料得以产生。

在Boc2O、DMAP和DMSO的存在下，降冰片烯与透明质酸混合，在45℃下搅拌20小时，进而降冰片烯对透明质酸进行功能化处理，并得到降冰片烯改性透明质酸(NorHA)。透明质酸凝胶(暴露于405nm蓝光下)用悬浮式细胞粘附肽打印，并且通过添加酰基膦酸锂(LAP)、细胞粘附性硫醇封端的肽(CGRGDS(SEQ ID NO：2))以及MMP敏感的二硫醇交联肽(CGPQGIWGQGCR(SEQ ID NO：1))，使得透明质酸凝胶具有可降解的肽交联。肽序列CGPQGIWGQGCR(SEQ ID NO：1)(高度降解，HD，1261.42g/mol)以及CGRGDS(SEQ ID NO：2)硫醇封端的细胞粘附肽通过Aapptec(Louisville，KY)定制合成。肽以三氟乙酸盐的形式提供，纯度＞95％。将肽抽真空，并在-80℃的氩气气氛下储存(以减少二硫的形成)备用(Miller et al.，Biomaterials，31(13：3736-43，2010)。

凝胶以如下方式打印：NorHA和6kDa PEG-二丙烯酸酯分别以4wt％溶于PBS中。在10 mM位置处加入硫醇封端的可降解交联肽CGPQGIWGQGCR (SEQ ID NO：1)。在34mM位置处加入LAP。在2.25mM位置处加入光吸收剂酒石黄。

鉴于本公开，可以在不进行过度实验的情况下进行和执行本文所公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选的实施例描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的方法以及方法的步骤或所述步骤的顺序施加变化。更具体地，将显而易见的是，化学上和生理上均相关的某些药剂可以代替本文所述的药剂，同时将实现相同或相似的结果。对于本领域的技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改都被认为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

IX.参考文献

以下参考文献以提供对本文所述的那些的示例性程序或其他细节补充的程度明确以引用方式合并于本文。

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U.S.Patent 9,452,239

U.S.Patent 9,555,007

PCT Pat.Pub.WO2016187225。

序列表

<110> 莱斯大学

<120> 用于植入式诊断和治疗的血管化装置及方法

<130> RICE.P0056WO

<140> 未知的

<141> 2020-02-17

<150> US 62/806,496

<151> 2019-02-15

<160> 2

<170> PatentIn 3.5 版

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

Cys Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln Gly Cys Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Cys Gly Arg Gly Asp Ser

1 5

Claims (26)

1.一种可植入装置，所述可植入装置包含：可降解外部壳体，所述可降解外部壳体包含可降解聚合物；以及内部不可降解部分，所述内部不可降解部分包含不可降解聚合物。

2.根据权利要求1所述的可植入装置，其中所述可降解外部壳体包含图案化结构，所述图案化结构促进所述可植入装置的血管化。

3.根据权利要求1至2所述的可植入装置，其中所述不可降解部分包含天然水凝胶或合成水凝胶。

4.根据权利要求3所述的可植入装置，其中所述合成水凝胶为聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEDGA)。

5.根据权利要求3至4所述的可植入装置，其进一步包含甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)。

6.根据权利要求3至5所述的可植入装置，其中所述水凝胶包含80％以上的水。

7.根据权利要求4至6所述的可植入装置，其中所述水凝胶包含约10％的GelMA和约3％-4％的PEDGA，所述PEDGA具有约3.4kDa的分子量。

8.根据权利要求1至3所述的可植入装置，其中所述水凝胶包括丙烯酸酯-(PEG-蛋白质)_n-PEG-丙烯酸酯的单体，任选地，其中PEG为2-35kDa，蛋白质大于100Da，且总分子量(MW)为至少500kDa或n＝2-500个重复单元。

9.根据权利要求1至3所述的可植入装置，其中所述水凝胶包括丙烯酰胺、乙烯基砜、降冰片烯取代丙烯酸酯基团、藻酸盐、蚕丝、葡聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、纤维素、肝素、聚(己内酯)或其多组分形式。

10.根据权利要求1至3所述的可植入装置，其中所述内部不可降解部分装载有：细胞；药物，即，小分子治疗剂或生物治疗剂(肽、抗体等)；或晶体。

11.根据权利要求10所述的可植入装置，其中所述细胞包括源自异种组织的细胞、源自尸体的细胞、干细胞、源自干细胞的细胞、源自细胞系的细胞、原代细胞、重编程细胞、重编程干细胞、源自重编程干细胞的细胞、基因工程改造细胞或它们的组合。

12.根据权利要求10所述的可植入装置，其中所述细胞为人类细胞。

13.根据权利要求10所述的可植入装置，其中所述细胞为胰岛素分泌细胞。

14.根据权利要求10所述的可植入装置，其中所述细胞为胰岛细胞。

15.根据权利要求1至14所述的可植入装置，其中所述可降解外部壳体或内部不可降解部分装载有释氧化合物，诸如CaO₂。

16.根据权利要求1至15所述的可植入装置，其中所述可降解外部壳体或内部不可降解部分装载有：药物，即，小分子治疗剂或生物治疗剂(肽、抗体等)；晶体，带有非结晶的促血管生成因子、结晶的促血管生成因子和/或经封装的促血管生成因子，诸如VEGF；细胞，诸如促血管生成细胞，诸如内皮细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、促血管生成巨噬细胞。

17.根据权利要求1至9所述的可植入装置，其中所述内部不可降解部分装载有生物传感器。

18.根据权利要求17所述的可植入装置，其中所述生物传感器可测量血氧、血糖、肿瘤抗原、胆固醇、肌酐、血红蛋白A1C、胰岛素、胰高血糖素、激素水平、小分子药物含量、DNA、RNA、细胞因子、循环肿瘤细胞以及其他可能的诊断指标。

19.根据权利要求1至18所述的可植入装置，其中所述可降解外部壳体和/或内部不可降解部分被图案化，诸如其中内部不可降解部分经图案化以在植入后允许血管化。

20.根据权利要求19所述的可植入装置，其中图案化部分包含血管几何形状，诸如多个分支血管，所述多个分支血管的尺寸范围为直径从数十微米到数百微米且具有基本上平滑的内壁，以最小化流体流动期间的摩擦阻力和湍流。

21.根据权利要求1至20所述的可植入装置，其中所述装置包含多层水凝胶。

22.一种监测受试者的状态或状况的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的装置植入所述受试者体内，其中所述装置包含传感器或生物传感器。

23.一种治疗受试者的身体状况或疾病的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的装置植入所述受试者体内，其中所述装置包含治疗剂。

24.一种在受试者体内搭建血管化装置的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的装置植入所述受试者体内。

25.一种在受试者体内的植入物或假体周围形成血管化组织的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的装置植入所述受试者体内，诸如其中所述植入物或假体为神经接口装置。

26.一种在受试者体内的植入物或假体周围形成增容化组织的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的装置植入所述受试者体内，诸如其中所述植入物或假体为乳房植入物或组织填充物。

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