CN102958543A - 用于糖尿病治疗的模板化的胰岛细胞和小胰岛细胞簇 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有附着于其的多层胰岛细胞或小胰岛细胞簇的支架和用于培养胰岛的具有凹坑的微型模具，其中胰岛形成受所述凹坑的形状和尺寸的影响。

Description

用于糖尿病治疗的模板化的胰岛细胞和小胰岛细胞簇

相关申请的交叉引用

本申请是2006年10月30日提交的美国申请11/589,063的部分继续申请。上述申请通过引用并入。

关于联邦资助的研究或开发的声明

不适用

技术领域

本发明一般地涉及用于建立可存活的胰岛细胞、胰岛和小胰岛细胞簇的组合物和方法。

背景技术

在美国，糖尿病病例的增加已经被称作流行性的。糖尿病是第三大疾病致死原因，仅次于心脏病和癌症成为美国公民的主要杀手。由于无法解释的原因，1型糖尿病的发生在世界上日益增加，在过去的十年中发病年龄已经下降了3-5年，所以许多儿童现在在入学以前发生糖尿病。结果是，许多糖尿病患者将在他们的大部分寿命中面临发生与1型糖尿病有关的慢性并发症的风险。由于大部分与糖尿病有关的慢性并发症的发生风险与血糖控制有关，大量注意指向新颖的疗法（诸如胰岛移植），以改善血糖控制。

在二十世纪八十年代首次尝试了胰岛移植。胰岛移植在人类中的最初成功率是令人失望的，仅5%的接受移植物的患者取得部分功能。参见Sutherland等人,Evolution of kidney,pancreas,and islet transplantation for patients withdiabetes at the University of Minnesota,Am.J.Surg.166:456491(1993)。失败包括，孤立的个体成功史实现了长期反转他们的糖尿病1-2年的时段，这鼓舞研究人员继续该方案来治疗糖尿病。在2000年，使用省略糖皮质激素的抑制方案（现在称作埃德蒙顿方案），在7位糖尿病患者上成功地进行了胰岛移植。参见Ridgway等人,Pancreatic islet cell transplantation:progress in the clinicalsetting,Treat.Endocrinol.2(3):173-189(2003)。因而，胰岛移植结果已经限制改善。参见Shapiro等人,Clinical results after islet transplantation,J.Investig.Med.49(6):559-562(2001);Balamurugan等人,Prospective and challenges of islettransplantation for the therapy of autoimmune diabetes,Pancreas 32(3):231243(2006)。然而，尽管这些结果产生了乐观，仍然存在使用胰岛移植作为糖尿病的实际治疗的屏障，考虑到大多数个体需要多个移植物来实现胰岛素独立性，一个屏障是有限数目的供体器官。

许多因素可能影响移植成功，包括胰岛的物理特征。约20年前，研究人员详细地描述了胰岛的大小和形状，并确定了估测胰岛体积的方法。参见Bonnevie-Nielsen等人,Pancreatic islet volume distribution:direct measurement inpreparations stained by perfusion in situ,Acta Endocrinol.(Copenh)105(3):379-84(1984)。多年来，由于下述几个原因，传统上已经认为大胰岛是移植部位所希望的：(1)认为大胰岛的存在是良好胰消化的标志，因为胰岛可通过过度消化而破碎，和(2)使用体积来确定移植所需的胰岛的最小数目，且因为胰岛直径的倍增等同于它的体积的8倍增加，大胰岛对制品中的胰岛等效物的数目做出巨大贡献。

近年来，研究人员已经将氧、葡萄糖和胰岛素在胰岛中的运输模型化。参见Dulong等人,Contributions of a finite element model for the geometricoptimization of an implantable bioartificial pancreas,Artif.Organs 26(7):583-9(2002)。如果周围细胞的氧消耗速率超过氧扩散进胰岛中的速率，氧的有限运输可以扩大胰岛核心中的细胞死亡。例如，最近的研究指示，当暴露于低氧条件时，更大的胰岛表现出增加的坏死。实际上，当胰岛直径超过100-150μm时，几乎所有的β细胞死亡。参见Giuliana等人,Central necrosis in isolatedhypoxic human pancreatic islets;evidence for postisolation ischemia,CellTransplantation 14767-76(2005);MacGregor等人,Small rat islets are superior tolarge islets in in vitro function and in transplantation outcomes,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.290(5):E771-779(2006)。得到的氧化性应激可以加重细胞凋亡和对移植的免疫应答。参见Bottino等人,Response of human islets to isolationstress and the effect of antioxidant treatment,Diabetes 53(10):2559-68(2004)。甚至在尚未发生细胞死亡的情况下，胰岛核心中的代谢速率可能降低。

葡萄糖和胰岛素的迟缓运输也会降低胰岛的功能性。与在胰岛核心中包含的那些细胞相比，在胰岛内的葡萄糖梯度会造成周围细胞接触到远远更高的葡萄糖浓度。参见Kauri等人,Direct measurement of glucose gradients and masstransport within islets of Langerhans,Biochem.Biophys.Res.Commun.304(2):371-7(2003)。该梯度的形状与胰岛直径和葡萄糖代谢速率直接相关。增加胰岛直径会增加在胰岛内的所有平面中的该扩散和消耗屏障。

为了发现生产胰岛素的β细胞的其它来源，还已经尝试在体外培养β细胞。这些方法已经聚焦于：培养来自胎儿组织的β细胞，或从生产胰岛的干细胞或祖细胞衍生出这样的细胞。参见，例如Peck等人,美国专利号6,703,017;Brothers,WO 93/00411(1993);Neilsen,WO 86/01530(1986);Zayas,EP 0363125(1990);Bone等人,Microcarriers;A New Approach to Pancreatic Islet Cell Culture,In Vitro Vol.18,No.2Feb.(1982)。不幸的是，这样的技术通常是耗时的，且需要珍贵的胎儿组织或干细胞作为它们的来源的可用性，并产生培养的β细胞的汇合单层。因而，仍然需要使用更有效的、可利用的且可靠的技术来建立可存活的胰岛细胞。

在克服构建大完整胰岛时所遇到的扩散屏障的尝试中，发明人做出了不同的尝试来在用于植入的聚合物微球上培养多个胰岛细胞层。将图1A所示的微球工程设计成在完整胰岛的大小范围内。通过使β细胞附着于微球的外表面，理论上认为，几乎不存在或不存在由扩散屏障导致的细胞死亡。使用不同的培养环境做了多种尝试，以优化所述细胞向微球的附着，包括使用极高密度的悬浮细胞。但是，该方法会快速地耗尽营养物介质，且细胞存活较差。其它技术包括这样的细胞：所述细胞缓慢地“滴”在微球上以增加细胞与微球的物理相互作用，或在微重力室中共培养细胞和微球数天。尽管有些β细胞会附着于聚合物微球上，它们的分布是不均匀的，且从未一致地实现多个附着细胞层(图1B)。

发明内容

在一个实施方案中，本发明涉及一种可植入的装置，其包括：基本上平面的由生物材料构成的支架，所述支架具有主表面；和以多层附着于生物材料支架的表面的单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇。所述单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇优选地衍生自成年完整胰岛。可以将细胞粘附分子(例如整联蛋白、钙粘着蛋白、选择素和免疫球蛋白)附着于支架，以促进单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇向所述支架的附着。此外，可以受控地从所述支架释放出一种或多种血管生成因子、免疫抑制剂(包括自身免疫抑制剂)、抗生素、抗氧化剂、抗-细胞因子或抗-内毒素，以提高胰岛细胞和小胰岛细胞簇的生存力。

在另一个方面，所述生物材料支架是柔性的生物材料，且可以由生物相容的和/或可生物降解的聚合物构成，诸如聚(DL-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLG)、聚乳酸(PLA)或聚(乳酸-共聚-羟乙酸)(PLGA)。

在另一个方面，所述多层包含生产胰岛素的β细胞和其它胰岛细胞类型的组合。所述多层优选地是约1-2至5个细胞厚，并形成约10-50μm厚的多层。所述多层优选地具有基本上均匀的厚度，使得细胞厚度在生物材料支架的表面上变化不超过1-2个细胞。

在另一个方面，从完整成年胰岛衍生出所述单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇，其中使用酶消化和/或在钙清空的培养基中培养。

本发明也提供了一种形成可植入的装置的方法。具体地，提供了从完整胰岛衍生出单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇的技术(例如酶消化、钙清空或它们的组合)。另外，提供了用于附着单个胰岛细胞和/或小胰岛细胞簇的方法，所述方法包括：离心细胞悬浮液，和使用细胞粘附分子来改善向支架表面的附着。

在另一个方面，本发明提供了一种使用本发明的可植入装置来治疗糖尿病的方法。描述了用于植入所述装置的方法和用于治疗糖尿病的技术。

在一个实施方案中，本发明是用于培养细胞的表面，所述表面包括具有基本上平面的顶部表面的基质，其中所述表面包括多个凹坑（divot）。每个凹坑包括内部底部表面和内部侧壁表面。所述底部表面是圆形的，且每个凹坑的具有100-200μm的直径(±20)和50-150μm的深度(±20)。

在另一个实施方案中，本发明是一种用于培养细胞的装置，所述装置包括上述的表面，并另外包括用于支持所述平面表面的系统。所述系统形成底部表面和内部侧壁表面和内部体积，所述底部和侧壁基本上不透过液体。当使用所述装置时，将细胞和培养基分布进内部体积中。在一个优选的实施方案中，所述细胞是胰岛细胞。在另一个优选的实施方案中，所述细胞是选自下述的非胰岛细胞：干细胞、细胞培养系、新鲜分散的细胞或原代细胞。在另一个优选的实施方案中，所述细胞是胰岛细胞，且所述凹坑具有100μm(±20%)的直径和60μm(±20%)的深度。

在另一个实施方案中，本发明是一种用于培养细胞的方法，所述方法包括：将细胞引导至包括多个凹坑的表面，其中每个凹坑具有100-200μm的直径(±20%)和50-150μm的深度(±20%)，并将所述装置暴露于细胞培养条件。在一个优选的实施方案中，所述细胞是胰岛细胞，且所述细胞在暴露于所述装置和支持性培养条件以后再聚集成小胰岛。在一个优选的实施方案中，所述细胞以每1个凹坑大约20-150个细胞的比率沉降在凹坑中。

在另一个优选的实施方案中，已经从胰岛培养物分散所述细胞，且将非天然分子工程设计成得到的小胰岛。在另一个优选的实施方案中，所述非胰岛细胞选自：干细胞、细胞培养系、新鲜分散的细胞或原代细胞。

在另一个实施方案中，本发明是一种用于测试多个细胞样品对导入的化学品的反应的方法，所述方法包括下述步骤：(a)在包括多个凹坑的装置中培养细胞，其中每个凹坑具有100-200μm的直径(±10%)和50-150μm的深度(±10%)，(b)将测试化学品引导至每个凹坑，和(c)分析所述细胞对所述测试化学品的反应。

在另一个实施方案中，本发明是分离的胰岛群体，其中所有胰岛中的至少80%具有低于90μm的直径，且其中所述胰岛具有比天然大胰岛低的扩散屏障。优选地，所述胰岛具有比天然小胰岛和大胰岛高的细胞生存力，且胰岛的胰岛素生产特征在于，水平是天然的分离的胰岛大于10倍。在一个优选的实施方案中，大多数胰岛是球形的。在一个优选的实施方案中，所述胰岛包含胰腺α细胞、胰腺β细胞和胰腺δ细胞。在一个优选的实施方案中，所述胰岛中的至少85%是可存活的。在一个优选的实施方案中，所有胰岛中的至少80%具有小于50μm的直径。在一个优选的实施方案中，所述胰岛中的至少50%具有小于37μm的直径。在一个优选的实施方案中，与分离自天然小胰岛或天然大胰岛的β细胞相比，所述胰岛β细胞生产更大量的胰岛素。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一幅彩色绘制的图。在请求并支付必要的费用后，含有彩图的该专利或专利申请公开文本的复制件将由美国专利和商标局提供。

图1A和B解释了以前在微球聚合物上培养β细胞的尝试，所述微球聚合物用于植入患者中。在该照片中，显示了附着于用聚氨基葡糖聚合物包被的PLGA微球上的细胞的不均匀分布。在长期温育β细胞以后，仅可以得到部分细胞单层。

图2的图对比了培养的大鼠大胰岛(大于125μm)、小胰岛(小于125μm)和分散的β细胞的随时间而变化的细胞生存力。在第3天以后，大胰岛的降低的生存力是统计上显著的(p<0.05)。

图3A和B总结了小胰岛(小于125μm)或大胰岛(大于125μm)向糖尿病大鼠中的移植的结果。当使用小胰岛时，在约80%的时间内观察到向血糖正常的成功恢复，但是当移植大胰岛时，移植物没有成功地恢复正常血糖水平。通过证实在移植后60天每组动物的血糖水平，可以最好地解释该现象。接受大胰岛的动物在移植后仍然是高血糖的，而接受小胰岛的大鼠是血糖正常的。*指示0.01的显著差异。

图4是在移植后约8周从肾囊取出的胰岛移植物，并针对胰岛素进行免疫标记。左图的照片显示了使用小胰岛(小于125μm)时相对更多的胰岛素免疫标记(红色)和在移植物中建立的毛细管网络。相比而言，大胰岛(大于125μm)的移植物表现出极微小的胰岛素免疫标记和显著的纤维化(右图)。所述照片是4只不同动物的代表。

图5显示了为了鉴别β细胞用双硫腙染色的大鼠小胰岛细胞簇。因为为极端薄的Z切片设置共焦孔，在亚基内、但是低于焦点平面的细胞是模糊的，且没有显示红色。但是，共焦平面向那些细胞的调节指示，它们也显然被双硫腙染色。

图6(图A)显示了使用酶促分散从完整成年胰岛制备的小胰岛细胞簇的活/死染色。该小胰岛细胞簇具有大约40μm的直径。在图6的右上图(图B)中，显示了用钙清空的培养基培养完整胰岛所衍生出的小胰岛细胞簇。所述小胰岛细胞簇被展开或打开，所以培养基能够环绕簇中的细胞。在图6(图C)中，显示了使用钙清空和酶促分散衍生出的小胰岛细胞簇。片段的直径是大约15μm。图6(图D)显示了通过钙清空和酶消化的组合、随后手工移液所衍生出的单个胰岛细胞。红色指示死细胞，绿色的细胞是活细胞。在图B中的比例条适用于图A-C。

图7是根据本发明生产贴剂的示意图，所述贴剂具有与其附着的胰岛细胞多层。

图8是β细胞向(A)聚氨基葡糖(Mw=100kDa)和(B)层粘连蛋白的附着的光学显微照片。插图显示了在层粘连蛋白上的β细胞的光学和荧光显微照片，其中用细胞色素B(cytoch B，绿色)进行肌动蛋白染色。

图9显示了当将胰岛细胞铺层在由50:50ALGA-羧基(5.5kDa)制成的聚合物贴剂上时的结果。使用共焦显微镜，光学地观察所述贴剂的断面。提供照片，以得到显示的Z断面切片。上图解释了具有一层或两层细胞的贴剂，然后添加显示的额外细胞层。通过将它们在板式离心机中在约3500rpm离心约10分钟，将细胞铺层在支架上。在重复冲洗以后，所述层仍然附着于聚合物支架上。

图10的示意图描绘了具有凹坑的微型模具（micro-mold）的一般设计。在该实施例中，PDMS是构成微型模具的外壳的材料，且蚀刻的玻璃是在其中蚀刻凹坑的基质。

图11的显微照片显示了微型模具中的空凹坑的俯视图；这里描绘的凹坑的图案是微型模具设计B的代表。

图12是由面形测定器产生的图，其解释了单个凹坑的深度和所述凹坑的圆底形状。

图13的示意图解释了用于微型模具生产的台架。微型模具的组件和用于构建微型模具的台架是：[1]大铜管；[2]小铜管；[3]PDMS聚合物，其构成容纳具有凹坑的表面的系统；[4]扁平的表面，诸如被包围在铝箔中的大玻璃正方形，其用作在上面构建所述微型模具的基质；[5]微型模具外壳的垂直壁；[6]微型模具的基质，在这里显示为达到2mm的深度；和[7]蚀刻的玻璃，它是具有凹坑的基质。

图14的显微照片显示了在第2和5天在微型模具的凹坑内的胰岛细胞再聚集。

图15的显微照片显示了与凹坑区域邻近的、具有凹坑的基质的未形成凹坑的边缘；凹坑含有小的再聚集的胰岛细胞，但是落在未形成凹坑的表面上的那些细胞已经再聚集成大的巨型胰岛（mega-islets）。

图16的显微照片显示了聚集在可商业得到的平板的孔的边缘处的活胰岛细胞；胰岛细胞的再聚集不象在微型模具中一样是球形的，所述再聚集的胰岛细胞群远远大于在微型模具中形成的90μm胰岛。

图17A和B的一组示意图显示的微型模具的2种可能的凹坑图案；图17A是这样的设计：其中凹坑彼此靠近，当尝试使在单个微型模具中形成的再聚集体的数目最大化时，这是有用的；图17B是这样的设计：其中凹坑彼此隔开，当操作单个凹坑中的细胞处理时，这是有用的。

图18的显微照片显示了被包含在单个凹坑内的2个再聚集的胰岛。

图19A和B的一组显微照片显示了在再聚集的胰岛中的生存力染色；红色指示死细胞。图19A表明，再聚集在微型模具内的胰岛含有非常少的死细胞，在上边的胰岛中仅一个死细胞被染色，而在下边的胰岛中没有细胞死亡的证据。图19B显示了在微型模具的未形成凹坑的表面上形成的巨型胰岛，其中在视图的共焦平面中存在至少23个死胰岛细胞。

图20的图将天然小胰岛和天然大胰岛的生存力与再聚集的胰岛进行了对比。所有胰岛取自同一只大鼠，并将一部分分离的胰岛分散成胰岛细胞用于再聚集。在第5天，从微型模具取出再聚集的胰岛，并将所有胰岛暴露于活/死生存力染料。在再聚集的胰岛中的活细胞百分比高于天然的大或小胰岛。

图21显示了在微型模具凹坑中再聚集以后6天的2个代表性的胰岛，它们已经经过三重染色，以鉴别β细胞(绿色)、α细胞(红色)和δ细胞(蓝色)。上边的胰岛测得43x 55μm的直径(在X和Y方向测量)，下面的胰岛测得48x 65μm的直径。

图22显示了在微型模具凹坑中形成的第6天再聚集的胰岛，其已经经历针对胰岛素(绿色)和胰岛素原(红色)的染色。该胰岛具有45x 54μm的直径(在X和Y方向测量)。

图23的图描绘了暴露于不同的葡萄糖条件的3类胰岛中的胰岛素分泌。将天然小胰岛和在微型模具凹坑中再聚集的胰岛暴露于低葡萄糖条件(3mM)；收集分泌进培养基中的胰岛素，并定量，如Y轴所示。将天然小胰岛、天然大胰岛和在微型模具凹坑中再聚集的胰岛暴露于高葡萄糖条件(20mM)；收集分泌进培养基中的胰岛素，并定量，如Y轴所示。

图24的示意流程图解释了使用本发明的微型模具来再聚集最佳地限定尺寸的胰岛的一般方法。

图25的示意流程图解释了本发明的微型模具用于高处理量药物试验的一种示例性用途。

图26显示了在含有2-[N-(7-硝基苯基-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-D葡萄糖(2-NBDG;20mM)的培养基中的再聚集的胰岛。圆圈指示胰岛的位置。2-NBDG（一种荧光葡萄糖类似物）完全掺入每个再聚集的胰岛中。

图27显示了负印章（negative stamp）(由金属或SU-8制成)的设计，其可以用于建立生物聚合物模具。终产物具有与在玻璃模具中建立的那些类似的凹坑。

图28A和B解释了这样的负印章设计：其包括标记，以鉴别每个凹坑在每个微型模具的凹坑区域内的位置。如图28A所示，可以以比玻璃蚀刻方法高的精确度为凹坑底部设计不同的形状。图28B显示了最终的生物聚合物模具的一部分，其含有具有区分标记的凹坑。

图29A和B对比了具有大约相同尺寸的2个胰岛。图29A是球形再聚集的胰岛的一个实例。图29B描绘了天然小胰岛。2个胰岛的形状、大小和光滑的囊样外缘是类似的。

具体实施方式

A.一般描述

在本说明书中引用的所有专利申请、专利和出版物通过引用整体并入本文。在不一致的情况下，以本公开内容（包括定义）为准。

本文使用的术语“朗格汉斯岛”或“胰岛”表示，胰腺中的一组专门化的细胞，所述细胞生产和分泌激素。胰岛通常含有一种或多种下述细胞类型：(1)生产胰高血糖素的α细胞，所述胰高血糖素会升高血液中的葡萄糖(糖)的水平；(2)生产胰岛素的β细胞；(3)生产生长激素抑制素的δ细胞，所述生长激素抑制素会抑制体内的众多其它激素的释放；(4)生产胰腺肽的PP细胞；(5)分泌血管活性肠肽的D1细胞；或(6)分泌胰泌素、促胃动素和P物质的EC细胞。

本文使用的术语“胰岛细胞”表示在胰岛中发现的任意细胞。在本发明中使用的胰岛细胞优选地是生产胰岛素的β细胞与其它胰岛细胞类型的组合。

本文使用的术语“小胰岛细胞簇”或“胰岛片段”表示，结合到一起的胰岛细胞集合，通常在簇中含有小于约25个胰岛细胞。小胰岛细胞簇优选地具有这样的形态：其使得簇内的任意细胞的(例如营养物、氧、葡萄糖等的)扩散屏障不超过约7个细胞。通常，所述扩散屏障是小于约5个细胞，且可以低至4、3或2个细胞。“小胰岛细胞簇”优选地包含β细胞作为优势细胞类型，且可以任选地包括一种或多种其它胰岛细胞类型。所述小胰岛细胞簇可以具有多种形状(例如，通常是球形的、伸长的或以其它形状不对称的)。小胰岛细胞簇的实例显示在图5和6(A)、6(B)和6(C)中。优选地，通过分散从供体胰腺分离出的完整的更大的胰岛而衍生出“小胰岛细胞簇”。

本文使用的术语“天然胰岛”表示从动物胰腺衍生出的胰岛。天然胰岛可以表征为，具有大于125μm、优选地大于150μm的直径的“天然大胰岛”，或具有小于125μm的直径的“天然小胰岛”。

本文使用的术语“巨型胰岛”表示具有大于约300μm的直径的再聚集的胰岛。

本文使用的术语“成年完整胰岛”表示从成年哺乳动物胰腺衍生出的天然大胰岛或天然小胰岛，其中所述胰岛已经被分离。

本文使用的术语“分散的胰岛细胞”表示细胞悬浮液，优选地如下衍生出：破碎大胰岛，使得胰岛细胞均匀地分布在悬浮液中。优选地，悬浮液中不小于90%的胰岛细胞是单个细胞，其它胰岛细胞形成双联体(结合到一起的2个细胞)和三联体(结合到一起的3个细胞)和非常少的彼此结合的更大的细胞集合。

本文使用的术语“再聚集的胰岛”表示结合到一起的胰岛细胞集合，其优选地如下衍生出：将大胰岛破碎成单个胰岛细胞，并将那些单个胰岛细胞一起成群地培养，以形成胰岛。优选地，单个胰岛细胞再聚集成胰岛会受到微型模具中的凹坑的物理尺寸的影响。用于形成再聚集的胰岛的单个胰岛细胞的数目取决于所述胰岛产物的希望大小。

本文使用的术语“扩散屏障”表示，分子从高浓度区域(例如，在细胞外的氧或葡萄糖浓度)向低浓度区域(例如，在细胞内的氧或葡萄糖浓度)的运动的抑制。大胰岛表现出相对较高的氧扩散屏障，这会限制它们的生存力和移植实用性。在微型模具中再聚集的胰岛比天然大胰岛更小，并表现出相对较低的扩散屏障，这会促进在再聚集的胰岛内的细胞生存力。

本文使用的术语“细胞生存力”表示，基于总细胞样品，活的或死的细胞的量的量度。本文定义的高细胞生存力表示这样的细胞群：其中所有细胞中的大于85%是可存活的，优选地大于90-95%，且更优选地，通过高细胞生存力表征的群体含有超过99%的可存活的细胞。

本文使用的意图接触生物流体或组织(诸如通过植入或移植进受试者中)的材料称作“生物材料”。希望的是，生物材料会诱导所述材料和生理环境之间的最小反应。在下述情况下，认为生物材料是“生物相容的”：在放入生理环境中以后，存在微小的炎症反应，没有过敏反应的证据，且在生物材料表面上存在最小限度的细胞生长。在植入宿主哺乳动物中以后，生物相容的生物材料不会引起足以有害地影响微囊功能的宿主反应；这样的宿主反应包括：在生物材料上或周围的纤维变性结构的形成，生物材料的免疫学排斥，或有毒的或热原性的化合物从生物材料中释放进周围的宿主组织中。

本文使用的术语“蚀刻”表示，使用酸在基质中建立凹坑的化学过程。

本文使用的术语“凹坑”是指，在基质中的局限性的孔或室，其包括底部表面和侧壁(即挖空的空间，其具有宽度和深度)。在一个实施方案中，为了胰岛的再聚集，凹坑具有小于100μm的直径和小于60μm的深度。例如，所述凹坑可以具有80μm的直径和48μm的深度。在其它实施方案中，在希望再聚集胰岛的情况下，所述凹坑具有80-120μm的直径和48-72μm的深度。为了其它目的，诸如培养用于药物试验的微型肿瘤，最佳凹坑具有100-200μm的直径和60-100μm的深度。

本文使用的术语“具有凹坑的基质”表示，已经被修饰成含有分散的单个凹坑的固体支持物或任意材料。

本文使用的术语“微型模具”表示，具有由多个凹坑构成的表面的装置，其中所述凹坑具有100-200μm的直径。微型模具中的凹坑的物理图案可以由微型模具的生产商指定。所述微型模具优选地包含2个主要部分：i)具有凹坑的基质，和ii)用于容纳具有凹坑的基质并在其中含有细胞和培养基的系统。所述微型模具用于引导或决定置于其中的细胞的生长或再聚集。

本文使用的术语“模具外壳”表示这样的结构：所述结构用于支持具有凹坑的基质和加入其中的任意液体和细胞材料。

本文使用的术语“外壳支架”表示，在构建所述微型模具的过程中，用于支持和影响材料形式的临时框架。

本文使用的术语“溅射”是指，用于将薄膜包衣沉积在基质上的气态沉积方法。

B.附着成多层的胰岛细胞

在一个实施方案中，本发明涉及一种生产用于植入的可存活的单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇的方法。在一个方面，分离自非胎儿供体胰腺的单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇以多层附着于合适的生物材料支架的表面。

在一个方面，单个胰岛细胞（优选地β细胞）附着于生物材料支架上。在另一个方面，不同胰岛细胞类型的组合附着于生物材料支架上。在另一个方面，由2、3、4、5、6、7、8、9或10个细胞构成的小胰岛细胞簇附着于生物材料支架上。

在另一个实施方案中，1-2、3、4或5层胰岛细胞的多层附着于生物材料支架上。在所述生物材料支架上的胰岛细胞和小胰岛细胞簇形成约10-50μm厚、最优选约20-40μm厚的细胞多层。

在一个方面，所述胰岛细胞多层优选地具有基本上均匀的厚度，使得细胞厚度在生物材料支架的表面上变化不超过1-2个细胞。

在一个方面，所述单个胰岛细胞和/或小胰岛细胞簇直接地分离自供体成年受试者的胰腺，并从完整胰岛中分离出。适合将所述胰岛分成单个细胞和/或小胰岛细胞簇的方法包括：酶消化和基于金属的分散(钙清空)或它们的组合。

在另一个方面，所述生物材料支架由这样的材料构成：所述材料会提供合适的单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇向所述支架的附着。预见到，不同类型的材料（包括无机和有机材料）可以用作本发明的生物材料支架。这些材料的非限制性实例包括：聚(原酸酯)、聚(酸酐)、聚(磷酸酯)、聚(磷腈)和其它。其它非限制性的材料包括，例如，多糖、聚酯(诸如聚(乳酸)、聚(L-赖氨酸)、聚(羟乙酸)和聚(乳酸-共聚-羟乙酸))、聚(乳酸-共聚-赖氨酸)、聚(乳酸-接枝-赖氨酸)、聚酸酐(诸如聚(脂肪酸二聚体)、聚(富马酸)、聚(癸二酸)、聚(羧基苯氧基丙烷)、聚(羧基苯氧基己烷)、这些单体的共聚物等等)、聚(酸酐-共聚-酰亚胺)、聚(酰胺)、聚(原酸酯)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚氨酯、聚(有机磷腈)、聚(磷酸酯)、聚(乙烯醋酸乙烯酯)和其它酰基取代的醋酸纤维素和它们的衍生物、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氨基酸)、聚(丙烯酸酯)、聚缩醛、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(苯乙烯)、聚(氯乙烯)、聚(氟乙烯)、聚(乙烯基咪唑)、氯磺酸酯化的聚烯烃、聚氧化乙烯、共聚物、聚苯乙烯和它们的混合物或共聚物)。在某些优选的方面，生物材料包括多糖、海藻酸盐、羟丙基纤维素(HPC)、N异丙基丙烯酰胺(NIPA)、聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯亚胺、聚氨基葡糖(CS)、甲壳质、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸软骨素、明胶等和它们的衍生物、共聚物及混合物。其它合适的生物材料包括在下述文献中描述的那些尼龙、透明质烷、聚四氟乙烯、聚乙烯基甲酰胺和其它材料：Vats等人,Scaffolds and biomaterials for tissueengineering:a review of clinical applications,Clin.Otolaryngol.Allied Sci.28(3):165-72(2003);Wang等人,An encapsulation system for the immunoisolation ofpancreatic islets,Nat.Biotechnol.15(4):358-62(1997);Orive等人,Cellencapsulation:promise and progress,Nat.Med.9(1):104-7(2003)，它们通过引用并入。

在优选的方面，所述生物材料支架由可生物降解的材料构成。合适的可生物降解的生物材料包括聚(DL-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLO)、聚乳酸(PLA)或聚(乳酸-共聚-羟乙酸)(PLGA)。PLG是一种经过充分研究的用于药物递送的聚合物，并被FDA批准用于多个体内用途。参见Berkland等人,Fabrication of PLGmicrospheres with precisely controlled and monodisperse size distributions,J.Control.Release May 18,73(l):59-74(2001)，它通过引用并入。

在另一个方面，所述生物材料支架全部或部分地包有包衣，所述包衣会增加胰岛和β细胞附着。示例性的包衣包括纤连蛋白、聚乙二醇乙酸酯、层粘连蛋白、聚乙烯醇(PVA)、乙烯-马来酸交替共聚物(PEMA)和聚氨基葡糖(CS)。

所述支架也可以具有附着于其上面的一种或多种胰岛细胞粘附分子(“CAM”)，以促进单个细胞向所述支架的附着和/或小胰岛细胞簇向所述支架的附着。在其它用途中，以前已经证实CAM会促进细胞向用于组织工程的聚合物的附着(Dunehoo等人,Cell adhesion molecules for targeted drug delivery,J.Pharm.Sci.95:1856-1872(2006))。细胞粘附分子(CAM)包括，但不限于：整联蛋白(例如，a_vb₃、a_vb₅、LFA-1、VLA-4)、钙粘着蛋白(例如，E-、P-和N-钙粘着蛋白)、选择素(例如，E-、L-和P-选择素)、免疫球蛋白超家族(例如，ICAM-1、1CAM-2、VCAM-1和MadCAM-1)、细胞外基质蛋白(例如，纤连蛋白、玻璃体结合蛋白、纤维蛋白原、胶原、层粘连蛋白和von Willebrand因子)、线性和环状细胞粘附肽和衍生自RGD肽、ICAM-1肽、VCAM-1肽、钙粘着蛋白肽和LFA-1肽的肽拟似物。CAM是组织再生、细胞形态、移位、有丝分裂、胞质分裂、吞噬作用和维持细胞极性的必需分子。CAM是存在于细胞表面上的糖蛋白，其起细胞-与-细胞和细胞-与-细胞外基质(ECM)附着的受体的作用。以前已经证实，细胞粘附分子（诸如RGD肽）可以帮助组织工程、组织再生、伤口愈合、再建性外科手术、神经再生、骨移植和器官移植的过程。另外，已经证实，E-钙粘着蛋白在β-细胞附着中是重要的(Hauge-Evans等人,Pancreaticbeta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrientstimuli:enhanced Ca2+and insulin secretory responses of MINE pseudoislets,Diabetes,48:1402-1408(1999))。在一个方面，所述细胞粘附分子使用共价键锚定在所述聚合物上，所述共价键包括、但不限于肽、硫醚、二硫化物或酯键。可以将间隔分子添加在细胞粘附分子和所述聚合物之间，以允许在所述聚合物上的粘附分子和在细胞表面上的细胞附着受体之间的自由相互作用。将不同细胞附着于布满RGD肽的聚合物上的研究已经证实，就细胞表面受体对RGD肽的最佳识别而言，聚合物和RGD肽之间的最佳间隔物是约11-46埃。所述间隔物可以由下述材料制成，但不限于：聚乙二醇(PEGS)、聚氨基酸(例如，聚-Gly、聚-Lys、聚-Ala)、聚氨基己酸(聚-Aca)和2种或3种氨基酸重复的组合(例如，聚-Aca-Gly)。除了共价键以外，可以如下附着所述细胞粘附分子：首先将可以吸附进贴剂的聚合物网络中(例如静电地、疏水地或通过其它非共价相互作用)的细胞粘附分子附着到所述聚合物上，然后附着所述胰岛细胞。

在另一个方面，所述生物材料支架具有促进所述单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇向它的表面的附着的形状。所述支架通常具有基本上平面的表面，诸如在贴剂或圆盘上的表面。在所述优选的实施方案中，所述生物材料支架包含基本上平面的柔性贴剂材料。

所述生物材料支架具有适合附着单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇的尺寸。例如，在一个方面，所述平面贴剂通常具有约0.2-3厘米量级的尺寸。所述贴剂的厚度通常是约50μm至1厘米的量级。

在另一个方面，所述生物材料支架可以受控地释放一种或多种生长因子、免疫抑制剂、抗生素、抗氧化剂、抗-细胞因子、抗-内毒素、T-细胞附着阻滞剂、血管生成因子、营养物或它们的组合。

示例性的生长因子包括，表皮调节素、表皮生长因子(“EGF”)、内皮细胞生长因子(“ECGF”)、成纤维细胞生长因子(“FGF”)、神经生长因子(“NGF”)、白血病抑制因子(“LIF”)和骨形态发生蛋白-4(“BMP-4”)、肝细胞生长因子(“HGF”)、血管内皮生长因子-A(“VEGF-A”)、胆囊收缩素八肽、胰岛素-样生长因子和甚至胰岛素本身。通常参见Miao等人,In vitro and in vivoimprovement of islet survival following treatment with nerve growth factor,Transplantation Feb 27;81(4):519-24(2006);Ta等人,The defined combination ofgrowth factors controls generation of long-term replicating islet progenitor-likecells from cultures of adult mouse pancreas,Stem Cells,Mar 23(2006);Johannson,Islet endothelial cells and pancreatic beta-cell proliferation:studies in vitro andduring pregnancy in adult rats,Endocrinology May;147(5):2315-24(2006),EpubJan 26(2006);Kuntz等人,Effect of epiregulin on pancreatic beta cell growth andinsulin secretion,Growth Factors Dec 23(4):285-93(2005);Vasadava,Growthfactors and beta cell replication,Int.J.Biochem.Cell Biol.38(5-6):931-50(2006),Epub Aug 31Review(2005);Kuntz等人,Cholecystokinin octapeptide:a potentialgrowth factor for pancreatic beta cells in diabetic rats,JOP，Nov 10;5(6):464-75(2004)。

示例性的免疫抑制剂是众所周知的，且可以是甾体类或非甾体类。优选的甾体类试剂是泼尼松。优选的非甾体类试剂包括在所谓的埃德蒙顿方案中的那些：西罗莫司(雷帕鸣,Wyeth-Ayerst Canada)、他克莫司(Prograf，Fujisawa Canada)和抗-IL2R达珠单抗(赛尼哌,Roche Canada)。其它免疫抑制剂包括15-脱氧司加林、环孢菌素、雷帕霉素、雷帕鸣(西罗莫司/雷帕霉素)、FK506或利索茶碱(LSF)。

可用于实践本发明的示例性抗生素包括、但不限于：阿莫西林、青霉素、磺胺药物、红霉素、链霉素、四环素、克拉霉素、ciproflozacin、特康唑、阿奇霉素等等。

各种抗氧化剂是本领域技术人员众所周知的。特别优选的是：包括硫醇基团的分子，诸如还原的谷胱甘肽(GSH)或它的前体、谷胱甘肽或谷胱甘肽类似物、谷胱甘肽单酯和N-乙酰基半胱氨酸。其它合适的抗氧化剂包括：超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、维生素E、Trolox、硫辛酸、拉扎洛依、丁羟基茴香醚(BHA)、维生素K等等。例如，可以使用在约2至约10mM的浓度范围内的谷胱甘肽。参见，例如，美国专利号5,710,172、5,696,109和5,670,545。

合适的抗-细胞因子是本领域众所周知的，且包括二甲基硫脲(约10mM)、西替沃酮(约5mM)、普伐他汀钠(PRAVACHOL,约20mg/kg)、L-NG-单甲基精氨酸(L-NMMA,2mM)、乳铁蛋白(约100μg/ml)、4-甲基泼尼松龙(约20μg/ml)等等。

抗-内毒素也是本领域已知的，且包括L-N^G-单甲基精氨酸(L-NMMA,约2mM)、乳铁蛋白(约100ug/ml)、N-乙酰基半胱氨酸(NAC,约1mM)、腺苷受体拮抗剂诸如苄胺茶碱(茶碱)和抗-脂多糖化合物诸如棘霉素(约10nM)等等。

在另一个方面，将T-细胞附着阻滞剂提供给含有胰岛细胞的植入的生物聚合物，以抑制免疫反应。这些阻滞剂的添加会预防胰岛移植的排斥。已经证实，T-细胞附着阻滞剂会抑制器官移植和自身免疫疾病中的T-细胞活化和免疫应答（参见Yusuf-Makagiansar等人,inhibition  of LFA-1/ICAM-1andVLA-4/VCAM-I as a therapeutic approach to inflammation and autoimmunediseases,Medicinal Chemistry Reviews 22,146-167(2002);Anderson and Siahaan,Targeting  1CAM-1/LFA-1interaction for controlling autoimmune diseases:Designing peptide and small molecule inhibitors,Peptides 24,487-501(2003))。T-细胞附着阻滞剂包括、但不限于：(a)针对ICAM-1、LFA-1、B7、CD28、CD2和VLA-4的单克隆抗体，(b)可溶性的蛋白和它的片段诸如ICAM-1、VCAM-1、MadCAM-1，(c)RGD肽和肽拟似物，(d)VCAM-1肽和肽拟似物，(e)ICAM-1肽和肽拟似物，和(f)LFA-1肽和肽拟似物。另外，已经证实，衍生自谷氨酸脱羧酶65(GAD65)和GAD双功能肽抑制剂(GAD-BPI)的肽(例如GAD_208-217)会诱导免疫耐受性并抑制T-细胞的胰岛浸润(胰岛炎)。已经证实，GAD_208-217在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中会阻断攻击β细胞的T-细胞的活化，这通过在T-细胞:APC相互作用过程中调节TCR-MHC-Ag复合物形成(Signal-1)而实现(Tisch等人,Induction of GAD65-specific regulatory T-cells inhibits ongoingautoimmune diabetes in nonobese diabetic mice,Diabetes 47:894-899(1998))。优选的GAD-BPI包含与LFA-1肽的一部分相连的GAD_208-217(序列EIAPVFVLLE-[Ac-G-Ac-G-Ac]-ITDGEATDSG)，且已经被证实会在NOD小鼠中阻断T-细胞活化和胰岛炎，如在下述文献中所述：Murray等人,标题为“Signal-1/signal-2bifunctional peptide inhibitors”的公开的美国专利号2005/0107585，它通过引用并入。因而，这些分子可以共同施用，以预防胰岛移植物的排斥。这些分子也可以经由控释机制来递送，以预防胰岛移植物的排斥。因而，可以将所述分子捕集在所述生物材料支架内，然后使β细胞附着所述支架。

使用在下述文献中阐述的方案，可以实现这样的试剂的控释：Raman等人,Modeling small-molecule release from PLG microspheres:effects of polymerdegradation and nonuniform drug distribution,J.Control.Release.Mar2;103(1):149-58(2005);Berkland等人,Precise control of PLG microsphere sizeprovides enhanced control of drug release rate,J.Control.Release.Jul18;82(1):137-47(2002);Schwendeman,Recent advances in the stabilization ofproteins encapsulated in injectable PLGA delivery systems,Crit.Rev.Ther.DrugCarrier Syst.19(1):73-98(2002);Sershen等人,Implantable,polymeric systems formodulated drug delivery,Adv.Drug Deliv.Rev.5;54(9):1225-1235(2002)，它们都通过引用并入。

C.在凹坑化的微型模具上生产胰岛

本发明也涉及可存活的小胰岛的体外生产方法。在一个方面，将分离自非胎儿供体胰腺的分散的胰岛细胞成群地放入微型模具的单个凹坑中，并培养以形成再聚集的胰岛，所述胰岛的形状和尺寸都受凹坑尺寸的影响。

所述微型模具的凹坑具有适合形成小胰岛的大小。例如，在一个方面，所述微型模具通常具有直径在约30-35mm量级的尺寸，但是该尺寸不受生产方法的限制，且可以放大至30x 30cm。所述凹坑通常具有直径在约100-200μm(±20%)和深度在60-100(±20%)μm量级的尺寸。优选地，为了生产胰岛，所述凹坑具有100μm(±20%)的直径和60μm(±20%)的深度。

在另一个方面，所述微型模具可以用于制备适合移植或体外研究的最佳地成形的且设定大小的胰岛群体。例如，在一个方面，在微型模具中产生的胰岛群体具有50μm或更小的平均直径。在其它方面，所述群体的特征在于至少85%的可存活的细胞、优选地大于90%或95%的可存活的细胞，更优选地所述群体的特征在于大于99%的可存活的细胞。

在另一个方面，在微型模具中产生的胰岛群体可以以高胰岛素分泌水平为特征。例如，在微型模具中再聚集的小胰岛的特征在于，与天然小胰岛相比，更大的胰岛素分泌水平，优选地多了超过20倍的胰岛素分泌，更优选地多了超过100倍的胰岛素分泌。例如，再聚集的胰岛测得大约10ng/IE的分泌，如图23所示。这是来自Crim等人（2010）的最佳计算值的41倍。对比实验室之间的胰岛素分泌数据的一个困难是，许多研究人员没有报道单位胰岛体积的胰岛素分泌。在Crim等人的情况下，他们报道了每50个胰岛的胰岛素分泌，但是没有指示所述胰岛的平均大小。因而，仅仅可以假定，它们的50个胰岛各自等同于以前定义的1胰岛当量(IE)的胰岛体积。我们的实验室总是报道通过除以IE而关于胰岛和细胞的总体积标准化的胰岛素分泌。利用关于Crim论文所做的假定，与Crim等人报道的最佳条件相比，本文所述的再聚集的胰岛响应于高葡萄糖而释放出超过40倍的胰岛素。

在本发明的一个实施方案中，所述微型模具将用于建立可用于体外测试和其它体外用途的细胞。在该实施方案中，所述微型模具表面优选地由玻璃制成，模具侧壁(外壳系统)由PDMS制成。

在另一个实施方案中，建立可植入的且由生物相容的材料制成的微型模具。在该实施方案中，优选的材料是以前描述的任意数目的生物聚合物。

在另一个方面，将所述微型模具凹坑设计成为非胰岛细胞提供最佳的物理再形成条件。预见到，可以在本发明的凹坑中形成不同类型的细胞。非限制性实例包括，长神经元途径、肾小球样滤器、血管、替换胞室等。干细胞或重新程序化的细胞在小的界限清楚的形状（诸如微型模具）中的聚集，也是本发明的适当用途。优选的细胞类型包括这样的细胞：其中3-D结构对于细胞功能而言是重要的。

一般而言，图24是显示本发明的方法的示意图。将取自胰腺或其它胰岛源的天然大胰岛簇分散成单个胰岛细胞，并加载到具有凹坑的微型模具上。“分散的细胞”是指，大多数(通常至少90%)的细胞是单个细胞，更少比例的细胞结合到一起成为双联体或三联体。以导致分散的细胞群体沉降到每个凹坑中的方式，将分散的细胞放入所述微型模具中。优选地，30-150个细胞沉降在每个凹坑中。

实施例5公开了一种将胰岛分散成单个细胞并在微型模具中温育所述细胞的优选方法。优选地，所述解离是在KU糖尿病研究实验室（KU DiabetesResearch Laboratory）中配制的培养基混合物中。该混合物包括9份不含钙-镁的汉克平衡盐溶液和1份木瓜蛋白酶(50单位/ml)。相比而言，使用胰蛋白酶或除了木瓜蛋白酶以外的酶，实现大部分胰岛解离。所述解离在37℃在旋转下进行。最后，如下将胰岛分散成单个细胞：手工地抽吸它们，并用血球计数器观察，直到至少90%的细胞分离成单个细胞。实施例5也公开了用于在所述微型模具中再聚集胰岛细胞的优选条件。一般而言，所述细胞保持作为单个细胞或松散附着的细胞群体至第2天，如图14所示。但是，在第5天或第6天之前，在凹坑中的那些相同细胞已经重组成3D结构，所述结构经常是球形(例如参见图18-19A和21)。通常，在第5天之前，再聚集的胰岛可以耐受从模具中取出，并作为独立的胰岛起作用。在该时段内，所述细胞呈现天然胰岛的三维形状。在所述凹坑中形成的胰岛的平均直径小于50μm。实施例5描述了在所述微型模具中形成的小胰岛的形态性质。

在本发明的一个实施方案中，可以将以低浓度分散的细胞加入所述微型模具中，使得少至2或3个细胞落入每个凹坑中，并使得在凹坑内的细胞能够生长和分裂。以此方式在凹坑中培养的细胞团的形状和大小会受所述凹坑的物理尺寸的影响。优选地，给微型模具加载浓缩的胰岛细胞，使得少至2或3个胰岛细胞占据每个凹坑，其中胰岛细胞生长和聚集在一起，以形成小胰岛，优选地具有30-40μm的直径。

在本发明的另一个实施方案中，可能希望在再聚集时将化学品或生物分子掺入工程设计的胰岛中。这些分子包括生长因子、细胞因子、趋化因子、DMARD(缓解疾病的抗风湿性药物)、抗炎药和抗生素。可以将增加在移植部位处的氧张力的分子或微型装置掺入再聚集的胰岛中，特别当使用可植入的微型模具基质时。可以在再聚集时添加的其它非限制性的分子类别包括：用于诱导胰岛素释放的药物、小分子、肽、蛋白、抗体(例如针对CD11a、CD11b、CD11c、CD18)和核酸(例如DNA或RNA)。

通常可以在加载进所述微型模具中时将这样的分子掺入胰岛中。将所述分子加入含有分散的细胞的培养基中，使得它们在聚集过程中被细胞摄入或附着于细胞上。或者，可以在再聚集之前，经由标准的转染方法修饰所述细胞，这会导致用户的靶蛋白的生产增加或减少。在形成再聚集体以后，用携带化学品诸如免疫抑制剂或其它目标分子（诸如生长因子）的生物聚合物包囊新形成的胰岛。或者，使用可植入的微型模具，可以用候选分子浸渍所述模具。

可以将本发明的方法设计成形成细胞聚集体，用于随后的移植或用于药物或装置测试。实施例5描述了用于再聚集移植和药物筛选所用的细胞的优选方法和实现该目的的优选方法。

在另一个方面，本发明也涉及一种用于高处理量筛选药物、化学品或其它小分子的方法。预见到，在本发明的微型模具中的凹坑的图案和尺寸可以设计成适应每个凹坑中的单个插入。

在另一个方面，从适合移植进动物宿主中的生物聚合物，制备所述凹坑化的微型模具。我们预见到，再聚集进可植入的微型模具中的细胞可以附着或未附着于具有凹坑的基质上。对于体外工作，非粘附的基质表面（诸如玻璃）是优选的。但是，对于可植入的模具或生物聚合物贴剂，粘附基质会增加移植过程的效率，减少移植过程中和以后的胰岛损失。已经测试了所述细胞向生物聚合物的附着，并描述在表1和图8中。

本发明的其它方面以及附带的优点和新颖的特征将在下面的描述和实施例中部分地阐述，且在本领域技术人员审查下述内容以后会部分地显而易见，或可以从本发明的实践中获知。借助于在所附的权利要求中具体地指出的手段和组合，可以实现和获得本发明的目标和优点。

实施例1：胰岛的大小影响生存力和移植成功

本实施例研究了胰岛大小如何影响在大鼠中的移植成功。

在该实施例中，描述了用于分离胰岛的技术，并测量了细胞生存力。

移植了大胰岛(大于125μm)和小胰岛(小于125μm)，以便评估胰岛大小对移植成功的影响。如下面讨论的，小的大鼠胰岛在体外功能和体内移植结果方面优于大胰岛。这些实验也描述在MacGregor等人,Small rat islets are superiorto large islets in in vitro function and in transplantation outcomes,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.May;290(5):E771-9(2006)中，它通过引用整体并入。

大鼠胰岛分离

为了分离大的和小的胰岛，通过腹膜内注射氯胺酮和赛拉嗪的混合物，麻醉成年雄性DA大鼠。暴露腹腔，并夹住与肠相连的胰腺导管。经由胆总管，在原位给胰腺插入套管，并通过将冷的胶原酶溶液抽入导管中进行扩张。以450U/ml，将胶原酶(CLS-1,Worthington Biochemical Corp,Lakewood,NJ)溶解于20ml Leibovitz L15中。随后，切离扩张的胰腺，转移至50ml离心管，并在轻轻翻转下在37℃培养箱中温育约20-30分钟。在温育以后，轻轻摇动所述试管，以逐出胰岛。将所述试管的内容物放入含有10%新生小牛血清的稀释的冰冷的汉克平衡盐溶液(“HBSS”)中。在1x g沉降消化物，并去除上清液。加入更多的HBSS/血清，并重该过程。使洗涤的消化物穿过500微米不锈钢筛，并在冷冻离心机中在300x g沉降约1分钟。将沉淀物与10mL 1.110克/mL的Histopaque(密度=1.1085,Sigma Diagnostics Inc.,St.Louis,Missouri)相混合，并在800x g离心10分钟。梯度收集胰岛漂浮物，并分别沉降，然后放入含有10%胎牛血清的Ham氏F12培养基中，并放入含有5%CO₂的37℃培养室中。

产率

为了产率测量，检查每批胰岛的一式三份样品，每份样品包含大约2%的胰岛级分。计数单个胰岛，并测量它们的直径。对于不规则形状的胰岛，在胰岛的不同位置做3-4次直径测量，并使用平均值。计算胰岛体积，并转化成样品和整个胰岛级分的胰岛当量。将小胰岛定义为，与具有约125μm或更大直径的大胰岛相比，具有小于约125μm的直径的那些。

为了使小胰岛与大胰岛分离，将新鲜的胰岛或培养过夜的胰岛沉降，然后放入1-2ml L15培养基中。然后在5%BSA于L15中的单阶梯度中，使所述胰岛快速地分层。在1x g沉降经验地设定的时间段，直到在试管的底部观察到大胰岛。在此时，抛弃顶部的2毫升(不含有BSA)梯度，小心地取出除了底部2ml以外的全部，以限定小胰岛群体。将沉降的胰岛和在底部2毫升中的那些组合成大胰岛级分。如果必要的话，重复所述梯度，以优化大和小胰岛的分离。沉降最终的胰岛级分，并放入Ham氏F12和无葡萄糖的RPMI 1640(葡萄糖=5mM)的1:1混合物中培养，直到进行葡萄糖灵敏度实验。

生存力

为了测试生存力，将胰岛放入500μl体积的含有活/死荧光团、Sytox(Molecular Probes,1μM)和钙黄绿素(Molecular Probes,0.5μM)的L-15培养基中，并在37℃温育约15-30分钟。用由下述物质(mM)组成的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗胰岛：137NaCl、2.7KC1、4.3Na₂HPO₄和1.4KH₂PO₄、pH 7.4，并放入位于糖尿病研究实验室中的Olympus Fluoview 300共焦显微镜上的Attofluor室(Molecular Probes)中。使用40X或60X物镜，获取照片。在从培养基中取出胰岛的20分钟内，收集所有照片。使用He:Ne和氩激光，收集每个胰岛的3个同时照片和第三个明视野照片。

如图2所示，在仅4天以后，维持在培养物中的不论人的还是大鼠的大完整胰岛(大于125μm)通常表现出显著百分比的坏死的(12.6%)和细胞凋亡的(6.3%)细胞，细胞死亡随时间增加。更小的胰岛(小于125μm)表现出延长的生存力，但是在更晚的时间点(超过1周)仍然表现出急剧的细胞死亡。跟踪这些小胰岛的生存力最多1周，并发现，它们维持99-86%的高生存力百分比。这与10个完整的大胰岛形成对比，所述大胰岛在培养几天以后具有下降至低于50%的生存力水平。如图2所示，单个地分散的胰岛细胞在培养物中维持与小完整胰岛类似的高生存力特性。

通过鉴别在所述视野中的胰岛，并包围目标区域，完成活/死分析。从所有照片中减去背景荧光。通过使用Photoshop(Adobe)从目标视野中形成色调直方图，并计算绿色色调(活的)和红色色调(死的)中的总像素，计算生存力百分比。将代表活细胞除以总胰岛面积的比率计算为活的百分比值。使用Scion软件计算胰岛直径和周长，使得可以根据胰岛的大小分类生存力值。

移植研究

还研究了胰岛大小对移植成功的影响。在所述实验中，通过腹膜内地注射链脲霉素(65mg/kg)(1次注射)，在受体动物中诱导糖尿病。当血糖水平大于250mg/dl连续3天时，认为大鼠患有糖尿病。

用戊巴比妥45mg/kg麻醉大鼠。将大鼠剃毛并用聚维酮碘擦洗清洁以后，在左侧腹上在体壁中制作切口。将肾递送进伤口中，并在肾囊中制作小切口。使用小内径移液器，将大或小胰岛放在所述囊下面。将所述肾放回原始位置，并用创伤夹封闭切口。在胰岛移植后3天，给受体施用牛/猪锌-胰岛素(NPI-1Iletin I)注射剂(2次/天)，以减少高血糖症对新移植的胰岛的应激。

结束大的或小的大鼠胰岛的移植(n=10移植/组)。链脲霉素诱导的糖尿病的DA大鼠在肾囊下接受大的(大于150μm)或小的(小于125μm)同源胰岛的边缘块(1000IE)。监测血糖水平8周。图3(A)和3(B)显示了来自每组的前5次移植的结果。所有大胰岛受体在移植后保持高血糖(10/10)。相比而言，10个小胰岛受体中的8个在移植后7-10天具有与正常水平接近或在正常水平的血糖水平，它们在整个8周时段内保持正常。

在移植后8周，从肾囊取出胰岛移植物。固定所述组织，并关于胰岛素进行免疫标记。图4(左图)显示了来自接受小胰岛移植的动物的移植物，并血糖正常持续8周。在所述移植物中，存在胰岛素的大量染色。相比而言，图4(右图)显示了接受大胰岛移植的动物，所述动物继续高血糖持续8周时段，并在所述移植物中几乎没有表现出胰岛素的免疫标记。

总之，前述实验证实，更小的胰岛(小于125μm)在生存力、体内功能试验和移植结果方面优于大胰岛(超过125μm)。另外，小胰岛的平均胰腺产率是大胰岛的约3倍，且更小的胰岛具有高大约20%的可存活性。最重要的是，当移植进糖尿病动物中时，小胰岛远远胜过大胰岛。

实施例2：大胰岛向单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇的转化

本实施例解释了将完整胰岛破碎或分散成小胰岛细胞簇(诸如图5所示的簇)和单个胰岛细胞的方法。使用常规酶消化，建立图6(A)中的小胰岛细胞簇，而用分级的钙清空形成图6(B)中的小胰岛细胞簇。如图6(A)中的照片所解释的，酶促分散会将所述胰岛破碎成小胰岛细胞簇，但是它不会“打开”所述簇，所以在所述簇内部的细胞具有几个细胞厚的扩散屏障。相比而言，就使用钙清空形成的小胰岛细胞簇而言(图6(B))，所述簇具有“打开的”形态学，所以当小胰岛细胞聚簇时，每个细胞具有更小的扩散屏障。预见到，酶消化和钙清空的组合也可以用于将完整胰岛转化成小胰岛细胞簇，如图6(C)所示。

a.酶消化

不同的酶混合液可以用于将完整胰岛破碎成小胰岛细胞簇和单个胰岛细胞。示例性的酶消化方法参见美国专利号6,783,954，它通过引用并入。在该实例中，使用的12种酶混合液取得不同程度的成功，包括1种含有木瓜蛋白酶的混合液。

为了分离胰岛，通过腹膜内注射氯胺酮和赛拉嗪，麻醉Sprague-Dawley大鼠。暴露腹腔，并夹住与肠相连的胰腺导管。经由胆总管，在原位给胰腺插入套管，并通过将冷的胶原酶溶液抽入导管中进行扩张。随后，切离扩张的胰腺，转移至离心管，并在轻轻翻转下在37℃温育约30分钟。使洗过的消化物穿过筛，并在冷冻离心机中沉降。将沉淀物与Histopaque(密度=1.1085,SigmaDiagnostics Inc.,St.Louis,MO)相混合，并离心。然后将胰岛放入含有10%胎牛血清的Ham氏F12培养基中，并放入含有5%CO₂的37℃培养室中。

β细胞分离的标准方案包括：在含有4.8mM Hepes的Hanks平衡盐溶液(“HBSS”)中温育完整胰岛(使用本文所述的技术分离)。参见Balamurugan等人,Flexible management of enzymatic digestion improves human islet isolationoutcome from sub-optimal donor pancreata.Am.J.Transplant 3(9):113542(2003)。对于酶消化，将最后的9ml含有1ml木瓜蛋白酶(50单位/ml)的Hanks平衡盐溶液加入所述胰岛中。先用移液器轻轻上下抽吸胰岛，以确保完全冲洗。使胰岛沉降至试管的底部，并取出大部分上清液。在37℃缓慢地旋转在所述酶中的胰岛(约10rpm)约30分钟。在此时，一些单个的分散的细胞形成小胰岛簇，并从所述溶液中取出。通常，将所述细胞转移至作为最终培养基的CMRL1066或Memphis SMF中。

用双硫腙对细胞染色，用鉴别在所述簇内的β细胞，如图5和6(A)(酶)通常所示。

b.基于金属的破碎

使用基于金属的破碎方案，也可以将完整胰岛破碎成小胰岛细胞簇和单个胰岛细胞。基于金属的破碎的令人感兴趣的发现是，得到的小胰岛细胞簇具有更低的紧凑性，或具有“打开的”形态学。细胞粘附分子（诸如E-钙粘着蛋白）会将所述胰岛保持在一起，但是需要二价金属才能发挥功能。参见Hauge-Evans等人,Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integratedresponses to nutrient stimuli:enhanced Ca2+and insulin secretory responses ofMIN6 pseudoislets,Diabetes 48(7):1402-8(1999)。因而，在无钙的培养基中培养胰岛约1小时，会产生“松散的”且破碎的胰岛结构(参见图6(B))，与此相比，使用单独的酶会产生更密集的胰岛结构(参见图6(A))。此外，在使用钙清空“松散”所述胰岛以后，剩余的β细胞簇可被传统的酶更容易地分散(参见图6(C))。

基于金属的破碎的细节如下。为了得到单个胰岛细胞和小胰岛细胞簇，将胰岛放入不含钙-镁的Hanks平衡盐溶液+4.8mM Hepes中。在约37℃温育约30分钟以后，移出细胞，将它们分散成小胰岛细胞簇或单个细胞。将所述细胞转移至作为最终培养基的CMRL 1066。在必要时，用双硫腙鉴别小胰岛细胞簇或β细胞。参见Mythili等人,Culture prior to transplantation preserves theultrastructural integrity of monkey pancreatic islets,J.Electron Microsc.(Tokyo)52(4):399-405(2003)。

如图6(B)所示，通过单独的钙清空衍生出的小胰岛细胞簇具有不规则的管状排列，这对于簇核心的灌注而言可能是最佳的。另外，从基于金属的分散衍生出的簇仅需要约1小时即可生成，而酶破碎方案需要最多48小时。

c.酶消化和金属分散的组合

还使用酶消化和金属清空的组合作为分散技术，进行了实验。用9ml汉克平衡盐溶液(不含有钙或镁，含有4.8mM Hepes)冲洗完整的胰岛。先用移液器轻轻上下抽吸胰岛，以确保完全冲洗。使胰岛沉降至试管的底部，并取出大部分上清液。重复地洗涤胰岛，以去除所有钙和镁。

将最后的9ml不含有钙和镁的汉克平衡盐溶液（含有1ml木瓜蛋白酶(50单位/ml)）加给所述胰岛。缓慢地旋转(10rpm)在所述酶中的胰岛30分钟。在此时，可以从所述溶液中取出小胰岛簇。在中等速度强烈地抽吸2-3次，产生单个细胞。

在1500相对离心力、25℃离心细胞5分钟。使用适当的培养基(取决于随后的试验)，重新悬浮单个细胞。在37℃和5%CO₂，在培养箱中储存细胞。如图6(C)所示，酶和钙清空方法的组合产生小胰岛细胞簇或单个细胞。此外，所述组合是总体上更快的分散方案，但是必须小心地避免过度消化和损伤细胞。

在这些实验中，使用YO-PRO-1和碘化丙啶(Vibrant Apoptotic试验,Molecular Probes)来测定坏死的和细胞凋亡的细胞。对于所述试验，将细胞与PBS一起放入Olympus Fluoview 300激光共焦显微镜上的Attofluor室(Molecular Probes)中。在从培养基取出细胞20分钟内，收集所有照片。使用He:Ne和氩激光，收集每个胰岛的3个同时照片和第三个明视野照片。通过使用透射光鉴别所述视野中的细胞，完成活/死分析。绿色的细胞指示细胞凋亡，而黄色/红色指示坏死性细胞死亡。缺少荧光发射的细胞是活细胞。将荧光照片与透射光照片(灰色)叠加。

实施例3：将单个胰岛细胞和小胰岛簇制备在贴剂生物材料支架上

前述实施例指示，小胰岛细胞簇和甚至单个β细胞应当代表用于运输氧、葡萄糖等的最高可实现的自由表面积。因而，在该实施例中，将单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇模板化在生物材料支架材料（诸如在图7中一般地显示的贴剂）上，以形成胰岛细胞多层。

支架材料的筛选

在该实施例中，通过测量所述胰岛细胞向所述生物材料的相对附着，研究了可用于制备本发明的支架的不同生物材料的优化。优选地，所述支架材料易于操纵，无需将所述组织和生物材料解离以实现容易的植入。表1解释了为与β细胞的相互作用而选择的多种生物材料。这些材料中的几种具有作为植入物的使用历史。

在一个典型的实验中，首先制备列出的生物材料的1%储备溶液。将大多数材料溶解于在中性pH的去离子水中。聚氨基葡糖需要约5.5的更低pH来溶解(使用盐酸)，其它材料需要有机溶剂；例如在乙醇中的Cellform^TM和在二氯甲烷中的聚(DL-乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA)。通常可溶于水中的聚合物(例如硫酸葡聚糖、海藻酸盐等)可以交联，以形成膜基质。将大约25μL的每种储备溶液加入96-孔平板的3个单个孔中，并蒸发或真空干燥，从而将薄生物材料膜沉积在每个孔的底部。残余的溶剂含量是微量的，不会在细胞中诱导毒性。还为细胞附着预筛选几种蛋白，所述蛋白可商业化地提供来促进在孔板上的细胞附着(例如纤连蛋白、层粘连蛋白等)。

在96-孔平板中温育β细胞的稀释悬浮液过夜，并洗涤3次，以去除未结合的β细胞。β细胞悬浮液是均匀的，并假定每个孔中的相同的等分试样含有类似量的β细胞。将所有细胞计数标准化为来自不包括生物材料膜的孔的细胞计数。一般而言，轻度疏水的聚合物较好地附着β细胞(表1)。

表1：选择的生物材料的相对β细胞附着

生物材料		相对细胞附着
			空孔(对照)		1
50:50PLGA羧基	Mw=5.5kDa	9.8±0.9
			层粘连蛋白		8.7±0.6
硫酸葡聚糖	Mw=500kDa	7.4+3.0
			50:50PLGA-甲基酯	iv=0.31dL/g	6.8±0.7
聚乙烯吡咯烷酮		5.8±1.2
			硫酸葡聚糖	MW=8kDa	5.4±1.0
50:50PLGA-甲基酯	iv=0.9dL/g	5.2±0.8
			50:50PLGA-甲基酯	iv=0.58dL/g	4.4±0.7
Pluronic		4.0±1.5
			50:50PLGA-羧基	iv=0.12dL/g	3.9±0.7
聚乙烯亚胺	Mw=25kDa	3.8±0.2
			纤连蛋白		3.7±0.7
PEG丙烯酸酯		3.1±0.5
			聚氨基葡糖	Mw=15kDa	3.1±0.1
胶原IV		2.9±1.4
			PEG	Mw=8kDa	2.8±1.1
海藻酸盐		2.4±1.2
			明胶		2.0±0.2
肝素		1.7±0.2
			CellformTM		1.7±0.7
聚氨基葡糖	Mw=100kDa	1.5±0.7
			聚乙烯亚胺	Mw=800Da	1.2±1.0
聚乙烯吡咯烷酮		n.d．
			聚(乙烯醇)		n.d.
聚(丙烯酸)		n.d.

iv=固有粘度

通过在涂布生物材料并洗涤3次以后24小时计数附着的细胞的数目，测定细胞附着。使用下述计算式，将所述计数标准化为附着于缺少生物材料的孔底部(参见空孔、对照)上的细胞的数目：在目标孔中附着的细胞的数目/在空孔中的细胞的数目。一式三份地重复每个实验。

一般而言，轻度疏水的聚合物较好地附着β细胞。光学显微照片指示，细胞形态学也受所述生物材料的影响。在聚氨基葡糖(MW=100kDa)上的β细胞表现出光滑的、圆形的表面，而在层粘连蛋白上的β细胞表现出伸展的且波缘的形态学(参见图8)。在层粘连蛋白基质上的β细胞中的肌动蛋白的荧光染色，强烈地揭示荧光细胞骨架焦点，这提示牢固的细胞附着。

胰岛细胞贴剂的制备

在该实施例中，所述胰岛细胞结合到包含PLGA的生物材料支架贴剂上。在血管化的胰岛中，平均β细胞距离血管不超过约25μm。参见Wayland,Microcirculation in pancreatic function,Microsc.Res.Tech.37(5-6):418-33(1997)。因为β细胞具有约10μm的直径，预期约3个细胞的细胞层厚度会最准确地模仿天然β细胞环境。

一般而言，如以前所述，从大鼠胰腺分离出胰岛，并分散成单个细胞或小细胞簇。将在HBSS培养基(0.5ml)中的胰岛细胞和小胰岛细胞簇加入每个孔中，并在生物材料上培养3-4小时。将在孔中含有生物聚合物的平板在室温在约3500rpm离心约10分钟，以辅助所述细胞附着生物聚合物。从每个孔取出一半培养基，用含有新鲜胰岛细胞或小胰岛细胞簇悬浮液的培养基替换，并进行附着(通过重力或通过离心)。这重复3次。这些实验的结果如图9所示。与未经过离心的在聚合物上的细胞培养物相比，当使用离心方法时，在重复的洗涤以后，可以将额外的胰岛细胞层附着于聚合物贴剂上。在重复的培养基更换下，约3-5个细胞层在0.58dL/g(在HFIP中)或0.9dL/g聚合物保持一致地附着于50:50PLGA。为了控制β细胞层的厚度，可以控制在重复的沉积循环中加入每个孔中的细胞培养物的体积和/或加入每个孔中的等分试样的数目。

实施例4：在生物材料支架上的胰岛细胞的预示性测试

在该实施例中，进一步研究了具有与其相连的胰岛细胞多层的生物材料贴剂。将进行生存力测量和胰岛素生产试验。另外，将研究作为用于治疗糖尿病的可植入装置的装置。

生存力测量。如以前所述，进行细胞凋亡实验和坏死实验的对比。在第0、1、3、7、14和30天，计算3个样品的每个β细胞层的横断面积的活细胞百分比，用于与天然胰岛进行对比。将数据绘制为可存活细胞的百分比相对于时间，我们将使用t-检验确定不同数目的β细胞层的生存力趋势之间是否存在统计上显著的差异。另外，记录归因于坏死或细胞凋亡的细胞死亡的百分比。

胰岛素生产试验。使用静止温育(ELISA)，在低葡萄糖(3mM)、高葡萄糖(30mM)和高葡萄糖/去极化(25mM K+)条件下(Dean 1989)，测量胰岛素生产。在37℃和5%CO₂，用新鲜培养基预温育在12-孔平板中的每个孔。对于实验测量，在含有3或30mM葡萄糖的新鲜培养基中温育不同的β细胞贴剂2小时。在30mM葡萄糖（含有25mM KCl和适当地还原的NaCl）中，温育一个额外的孔组。对于测试的每种条件，一式三份地评价每种贴剂类型。使用ELISA免疫测定，测定培养基样品的胰岛素含量。将结果表示为一式三份样品的平均值和标准差，并使用t-检验对比统计显著性。MacGregor等人,Small rat islets are superior to large islets in in vitro function and in transplantationoutcomes,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.290(5);E771-779(2006)。

贴剂和胰岛的植入。在成年受体糖尿病抗性的BioBreeding(DRBB)Worcester大鼠中诱导的糖尿病是与人类的I型糖尿病平行的自身免疫糖尿病模型。4周龄大鼠购自Biomedical Research Models,Inc，将动物随机地分成2组：贴剂受体和胰岛受体(每组6只)。对于糖尿病的诱导，用抗-RT6单克隆抗体(DS4.23杂交瘤(由马萨诸塞大学医学中心的Dale L.Greiner博士友情提供；2ml组织培养基，每周注射5次))和非特异性的免疫系统活化剂聚I:C(Sigma;5ug/g体重，每周注射3次)的组合治疗DRBB大鼠。在3-周时段内施用注射剂。在重复的高血糖症(血糖水平>250mg/dl连续3天)当天，认为动物患有糖尿病，并中断治疗(Semis 2004)。使用该方法，95%的大鼠在第3周结束之前变成糖尿病患者。在肾囊下植入β细胞贴剂和胰岛。DA(Dark Agouti)大鼠充当β细胞供体。用戊巴比妥(45mg/kg)麻醉大鼠，并将肾递送进在左侧腹在体壁中制作的切口中。在肾囊中制作适当的切口，并将β细胞贴剂放在所述囊下面。植入最小4个含有不同的生物材料和/或细胞层厚度的贴剂。胰岛植入物通常需要更小的切口和穿过小内径移液器的输注。受体组将接受1000或2000IE胰岛用于移植或在贴剂基质上的当量β细胞。如果移植成功必需的最少胰岛(1000IE)并与更高的胰岛体积(2000IE)相对比，性能的显著改善(贴剂类型相对于胰岛)应当是可检测的。在胰岛移植后，施用牛/猪锌-胰岛素(NPHIletin I)注射剂(2次/天)3天，以减少高血糖症的应激。

血糖过多的体内测定。监测大鼠的血糖4周，以测定贴剂或胰岛植入物是否可以诱导血糖正常。在动物的血糖控制以后，每天进行血糖测量。通过在前3周每天从尾巴获得血液样品，然后使用Freestyle葡萄糖计(TheraSense)每周测量2次，监测血糖水平。通常，在胰岛移植的24小时内实现糖尿病的反转，使用贴剂会得到类似的结果。

外植的β细胞贴剂的分析。在14或30天以后，取回贴剂或胰岛，用于免疫染色(胰岛素和胰高血糖素)、生存力测量和细胞凋亡的检测。在某些情况下，在分析之前，达到血糖正常的大鼠维持8周。使用针对胰岛素和胰高血糖素的抗体，完成在所述切片上的免疫组织化学。使用比色测量分析，处理照片，以测定每种染料阳性的横截面积。制备并分析阴性对照载玻片。最初，我们使用双硫腙染料来鉴别β细胞。使用末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)介导的dUTP切口-末端标记(TUNEL)试验，进行DNA-碎片裂，其指示细胞的细胞凋亡。如我们以前所做的，将贴剂或胰岛制备在石蜡中，用于使用10%福尔马林的组织学。使用TUNEL试剂盒(原位细胞死亡检测试剂盒,RocheDiagnostics)来标记组织切片。由不知情的研究人员分析贴剂和胰岛的TUNEL+细胞的数目和分布。将组织切片的照片重构成胰岛的完整3D照片。以此方式，可以鉴别在单个胰岛中的细胞凋亡的细胞。用苏木素对切片复染色，并在光学显微镜下显影。为了鉴别在所述胰岛内的胰岛素分泌细胞，使用抗-胰岛素抗体来标记样品，并用罗丹明第二抗体进行检测。我们预期在移植后收集最小10个胰岛/大鼠，用于细胞凋亡分析。在必要时制备阴性对照载玻片。除了TUNEL分析以外，将贴剂固定，用于随后的使用核心显微术设备的电子显微术。以此方式，鉴别β细胞层和浸润细胞。

实施例5：使用微型模具制备最佳地设定大小的细胞

在该实施例中，开发和设计了用于再聚集细胞的额外装置，并描述了用于制备微型模具的方法，所述微型模具具有蚀刻在基质表面中的多个单个的凹坑。

一般而言，将胰腺破碎成天然大胰岛(大于150μm)和天然小胰岛(小于125μm)。分离大和小胰岛，并将小胰岛放入培养物中(在有些实施方案中，所述小胰岛培养物在以后加回再聚集的胰岛)。将大天然胰岛分散成单细胞悬浮液，并使其沉降在所述微型模具中。通过加载进微型模具中的细胞的数目，可以操纵生产的胰岛的大小。取决于细胞悬浮液，通常20-100(+/-20%)个细胞会落入每个凹坑中以彼此结合，形成新的再聚集的小胰岛。在促进形成类似于天然小胰岛的3D结构的条件下，培养在单个凹坑中的单个细胞，其中再聚集的胰岛的大小和形状受所述凹坑的大小和形状的影响。通过浓缩来改变在所述凹坑中的细胞的数目(通过测定悬浮液中的细胞密度)的能力，允许我们生产非常小的(小于30μm)或中等尺寸的(50-90μm)再聚集的胰岛。当形成其它3D细胞结构（如用于化学疗法测试的微型肿瘤）时，该控制可能被证实是重要的。

不同于上面实施例3的生物材料支架贴剂，在该实施例中描述的凹坑化的微型模具不需要细胞附着于基质表面。如下面讨论的，将再聚集在微型模具中的胰岛细胞最佳地设定大小，并通过高生存力百分比和高胰岛素分泌水平来表征从微型模具衍生出的可存活的细胞群。

微型模具的开发

作为再聚集物理环境的凹坑。在使单个细胞再聚集体成最佳地设定大小的小胰岛的工作中，我们假定，在物理受限的环境中形成胰岛，会引导在再聚集过程中的细胞团的形状。为此，我们确定，最佳的再聚集物理环境会与希望的细胞终产物的形状和大小类似。在我们的第一个实验中使用的尺寸范围(100μm直径和60μm深度)对于生产直径小于50μm(平均而言)的再聚集的胰岛而言是最佳的。60μm深度允许容易地取回再聚集的胰岛，无需将它们破碎成更小的碎片。在每个再聚集环境中的圆形底部会引导细胞团再聚集成大致球形的形状。我们将具有指定的尺寸（包括圆形底部）的这些再聚集物理环境称作“凹坑”。所述凹坑的尺寸和布局可以根据用户的需要而变化。

微型模具设计。在制备最佳地设定大小的小胰岛群体的工作中，我们设计了一种微型模具，所述微型模具具有包含众多凹坑的表面。在该微型模具中的凹坑的尺寸和它们在所述微型模具内相对于彼此的空间关系由用户指定。使用AutoCAD软件来建立所述微型模具的电子模板。所述模板描绘了在模具表面上的凹坑的大小、形状和分布。具有凹坑的基质设置在更大的外壳内，所述外壳能够无泄漏地容纳液体，在本文中也称作模具外壳(图10)。所述微型模具和在所述微型模具内的凹坑的尺寸可以根据用户的需要而变化。例如，如果目标是使用所述模具进行药物试验，可以测试更大的和/或更深的凹坑，从而在每个凹坑中容纳更大体积的测试化合物。如果目标细胞不是胰岛，可以以其它方式指定所述凹坑的尺寸，以满足目标细胞类型的最佳再聚集或生长标准。

具有凹坑的表面的基质。当选择基质时，存在几种重要的物理性质。就使用缓冲的氢氟(HF)酸溶液的湿法蚀刻而言，使用基于二氧化硅(SiO₂)的物质是优选的。HF酸通过与SiO₂分子反应而蚀刻基质。另外，就所述微型模具的体外应用而言，优选地选择细胞不会附着的基质，从而允许从凹坑更容易地去除再聚集的胰岛。透明基质允许在显微镜下观察在凹坑内的内容物，不必转移至另一个平板上。可灭菌的基质会提供可重复使用的模具。选择玻璃作为不可植入的微型模具的理想基质，因为它会表现出所有这些特征。另外，用户可以在生产过程中指定玻璃的厚度和尺寸，这允许进一步定制微型模具。玻璃也会提供低成本的解决方案，但是，该材料不是可植入的。

为了开发模具外壳，所述基质的几种性质是必要的。选择用于构建模具外壳的材料应当具有根据用户规范进行塑造的能力。这意味着，它开始时是作为可以倒入模具中的液体，并随着时间和温度进行设定，以形成包围蚀刻的基质的固体部件。所述聚合物优选地是可灭菌的。它通常是疏水的，以防止液体渗漏出模具。Sylgard 184聚二甲基硅氧烷(PDMS)理想地用于这些模具。它可以被灭菌，是疏水的，可以容易地倒入模具中，并固化成固体产物。另外，它可以在-45至200℃的温度范围内长时间地使用，允许冷冻和蒸汽灭菌。PDMS具有约2小时的工作时间，然后可以在室温固化(约48小时)或热固化(最高到大约200℃)。满足生产规范的PDMS具有粘附玻璃基质的能力，这会进一步保护免于模具中的液体的泄漏(Mata等人,2005)。用玻璃和PDMS设计的微型模具具体地设计成用于体外实验，且不适用于体内用途。下面描述了用于体内目的的可植入的模具，它们不使用光刻技术，而是通过首先制备负印章来生产。

迄今制备的微型模具原型由玻璃基质构成，在所述玻璃基质中蚀刻出凹坑。可以切割凹坑基质，以满足用户的需要。例如，可以将基质切割成标准的显微镜载玻片的大小。在迄今制备的一个原型中，将碱石灰玻璃基质切成33mm直径和3mm厚的圆形。

基质表面的制备。用氮气清洁要凹坑化的基质的表面，以去除大颗粒。使用酸和碱洗液（piranha solution）来深度清洁基质，以去除有机化合物和可能干扰金属沉积和光刻的物质。随后，将所述基质烘烤30-60分钟。技术人员可以使用其它方法来从表面基质去除大颗粒和有机化合物。清洁基质表面以后，使用Lesker薄膜沉积系统将金属层(300nm铬)飞溅在基质上。用于将薄金属层施加于基质上的替代技术是本领域已知的，且可以使用。

光刻技术。使用旋转涂布机(Brewer CEE100可编程的旋转涂布机)，将AZ1518正性光刻胶(1ml)涂层施用于沉积的金属的上面。将所述旋转涂布机设定成产生1.8微米光刻胶层，然后在100℃软烘烤2分钟。冷却后，将具有光掩模的玻璃暴露于紫外线(ABM UV Flood & Mask Alignment System)4秒，随后在AZ 300MIF显影剂中浸泡30秒。轻轻摇动基质。然后在100℃烘烤基质8-10分钟。随后如下将在光刻胶中显影的图案蚀刻进铬层中：将它浸泡在CR7S铬蚀刻剂中，并搅拌，以辅助蚀刻工艺。需要浸泡30-45秒才能使照片出现。用水轻轻洗涤所述基质，并用氮干燥，以准备用于湿法蚀刻工艺。这产生一块具有铬层和光刻胶层的玻璃，其在表面上含有开放的斑点，在所述斑点中不存在铬或光刻胶。这些未掩模的斑点将玻璃表面暴露于湿法蚀刻工艺，而被铬和光刻胶覆盖的区域会保护玻璃表面免于蚀刻溶液。这会导致在未掩模区域中蚀刻凹坑。湿法蚀刻在20:14:66比率的HF:HNO₃:H₂O溶液中完成。将基质在溶液中浸泡18分钟，同时放在低速定轨摇床上。在该浸泡期间，酸通过与SiO₂反应而蚀刻玻璃，从而溶解未被铬和光刻胶掩模覆盖的可见玻璃部分，这会在所述表面上产生均匀的凹坑(图11)。该溶液会产生4-5μm深度/分钟的大约蚀刻速率(取决于溶液的新鲜度)。在定轨摇床上振荡会确保表面的均匀蚀刻。

随后在碳酸钙中、然后在水中洗涤所述基质，以中和和去除多余的酸，并最后用氮干燥。如果多余的铬保留在基质上，需要另外在铬蚀刻剂中浸泡并用丙酮和水洗涤，以去除任何残余物。最后，用氮干燥基质。使用面形测定器，测量凹坑深度和直径(图12)。在迄今制备的原型中，凹坑大小的变异性尚未成为问题；原型凹坑测得指定尺寸的±10%。

我们预见到可以用于制备模具的2种其它预示方法：

SU-8负模：在该实施方案中，再次使用玻璃作为基质。所述玻璃经历与以前类似的光刻工艺，但是改变了原始设计，以建立负模板模具，其然后可以转换成微型模具，但是将列出的生物聚合物之一倒在印章上，并使它固化。简而言之，将SU-8光刻胶旋转涂布成厚层(层厚度应当等于凹坑的理想深度)。然后将它软烘烤，用光掩模覆盖(如上所述)，并暴露于紫外线，在暴露后再次烘烤，在SU-8显影剂中显影，并最后暴露于显影后烘烤。这会产生一块具有凹坑负突出（基于设计规范）的玻璃。该负模板然后用于在给定的生物聚合物或PDMS中浇铸模具，其中在固化后建立模具印痕。然后从固化聚合物中取出印章。完成的聚合物类似于PDMS/玻璃微型模具，且具有确定尺寸的凹坑。该操作的一个优点是，对于药物试验或其它用途而言，可以在设计步骤中用唯一标识符(例如，文字、数字)标记每个凹坑，并在完成的模具中呈现为每个凹坑的可见印痕(参见图28)。在生产商的加工指南(SU-82000-Permanent EpoxyNegative Photoresist,MicroChem,Newton,MA)中描述了一种更详细的工艺。

蚀刻的金属负模：在该实施方案中，使用金属浇铸模具，制备聚合物模具。通过在CAD软件中设计3-D模型，可以生产金属铸件。在图27中提供了一种可能的设计。用激光蚀刻金属，以建立与上述的SU-8模具类似的浇铸模具。将聚合物倒在金属铸件上，并固化，以建立新的微型模具。另外，如果必要的话，可以将文字或数字整合进3-D模型中，以标记上述的每个凹坑，剩下可见的印痕。

使SU-8和蚀刻的金属模板显影，以实现从用于体外和体内用途的给定材料生产模具的方法。更具体地，这些方法可以使用生物聚合物来制备可以植入的模具。这些方法还应当允许更详细的设计(诸如凹坑标记)和在凹坑制备、形状和大小方面的更多控制(凹坑测量的变异性应当小于指定尺寸的±1%)。

具有凹坑的基质的外壳的构建。构建所述微型模具的下一步是，开发一个系统，在所述系统中将放置和固定具有凹坑的表面，并充当用于培养的更大容器(参见图10中的PDMS“外壳”)。

使用Dow Corning Sylgard 184聚二甲基硅氧烷(PDMS)，构建模具外壳的基底[6]和垂直壁[5](图13)。在50ml离心管中，以10份基质:1份固化剂的比率混合PDMS(约2小时工作时间)。将所述试管混合均匀，以彻底分散基质和固化剂。在该过程中，可以使用涡旋来辅助混合。在1000-1500rpm离心PDMS1分钟，以去除空气泡。除了PDMS以外的材料可以用于构建适合微型模具的外壳。例如，适合微型模具（意图用于多次使用的体外用途）的材料包括、但不限于：用具有凹坑的表面形成要植入的微型模具(体内用途)，并用生物聚合物形成模具的侧壁。但是，侧壁的高度是最小的，且可以在移植之前去除，以减少移植材料的总体积。

适合意图用于体内用途的微型模具的材料包括，但不限于：聚(原酸酯)、聚(酸酐)、聚(磷酸酯)、聚(磷腈)和其它。其它非限制性的材料包括，例如，多糖、聚酯(诸如聚(乳酸)、聚(L-赖氨酸)、聚(羟乙酸)和聚(乳酸-共聚-羟乙酸))、聚(乳酸-共聚-赖氨酸)、聚(乳酸-接枝-赖氨酸)、聚酸酐(诸如聚(脂肪酸二聚体)、聚(富马酸)、聚(癸二酸)、聚(羧基苯氧基丙烷)、聚(羧基苯氧基己烷)、这些单体的共聚物等等)、聚(酸酐-共聚-酰亚胺)、聚(酰胺)、聚(原酸酯)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚氨酯、聚(有机磷腈)、聚(磷酸酯)、聚(乙烯醋酸乙烯酯)和其它酰基取代的醋酸纤维素和它们的衍生物、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氨基酸)、聚(丙烯酸酯)、聚缩醛、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(苯乙烯)、聚(氯乙烯)、聚(氟乙烯)、聚(乙烯基咪唑)、氯磺酸酯化的聚烯烃、聚氧化乙烯、共聚物、聚苯乙烯和它们的混合物或共聚物)。在某些优选的方面，生物材料包括多糖、海藻酸盐、羟丙基纤维素(HPC)、N异丙基丙烯酰胺(NIPA)、聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯亚胺、聚氨基葡糖(CS)、甲壳质、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸软骨素、明胶等和它们的衍生物、共聚物及混合物。其它合适的生物材料包括在下述文献中描述的那些尼龙、透明质烷、聚四氟乙烯、聚乙烯基甲酰胺和其它材料：Vats等人,(2003);Wang等人,(1997)；和Orive等人,(2003)。

使用铜支架，形成模具外壳的形状(图13)。将一个大铜管(1.75英寸直径)[1]开口侧向下地放置在扁平的表面[4](例如，包装在铝箔中的大玻璃正方形)上。将PDMS加至管开口的中心至2mm的深度，以形成模具外壳的基底[6]。然后在烘箱中在100℃烘烤整个结构45分钟。在烘烤以后，将具有凹坑的基质凹坑侧向上地放置在位于固化的PDMS基底[6]上面的铜管(斜线描绘了蚀刻的玻璃[4]相对于大铜管的位置)的中央。

将小量PDMS加至具有凹坑的基质的边缘，以将它固定在固化的PDMS基底[6]的中央。然后在100℃烘烤该结构30分钟。将小铜管[2](1英寸直径)安置在蚀刻的基质的上面中心处，并将PDMS倒入大[1]和小[2]铜管之间的间隙中。小心地进行该步骤，以避免PDMS飞溅到模具的中心中。倒入大[1]和小[2]铜管之间的间隙中的PDMS的量决定了模具外壳[5]的高度。模具外壳的高度和宽度可以由用户指定。然后在100℃烘烤所述微型模具（包括铜外壳支架）过夜(至少12小时)，以完全固化PDMS。

在过夜烘烤以后，如下去除铜支架机构。冷却整个结构[1-7]，以使PDMS收缩，从而允许从铜管支架去除模具。冷却所需的确切时间取决于温度；在-20℃时，30-60分钟是足够的。小心地取下底部箔/玻璃层[4]和小铜管[2]。接着，从所述微型模具分离大铜管[1]。

微型模具的灭菌。优选地，本发明的含有凹坑的表面能够被灭菌。在一个实施方案中，当完成的微型模具不具有台架时，在必要时可以将它洗涤并灭菌备用。乙醇和蒸汽灭菌是优选的灭菌方法，但是技术人员已知的其它灭菌方法是合适的。当在所述微型模具中使用PDMS时，不应当使用丙酮。同样地，不应当使用会破坏在具有凹坑的基质或模具外壳中使用的材料的完整性的灭菌操作。灭菌允许所述微型模具重复地用于体外用途。显然，用于体内植入的模具不具有该要求。

在微型模具内的细胞再聚集

向微型模具递送细胞。从任意胰岛细胞源，可以得到用于再聚集体胰岛的单个的分散的胰岛细胞。在该实施例中，经由胆总管给动物胰腺在原位插管，并通过将冷的胶原酶溶液(Worthington,Lakewood,NJ)抽入导管中进行扩张。随后，切离扩张的胰腺，转移至离心管，并在轻轻旋转下在37℃温育30分钟。然后使洗过的消化物穿过筛，并在冷冻离心机中沉降。将得到的沉淀物与Histopaque(密度=1.1085,Sigma Diagnostics Inc.,St.Louis,Missouri)相混合，并离心。然后如下清洁胰岛的外分泌组织：使用含有5%小牛血清的Hanks平衡盐溶液(HBSS)，穿过40μ筛进行过滤，并放入含有DMEM/F12培养基、10%胎牛血清(FBS)、EGF(20ng/mL)和1%抗生素的培养皿中。在37℃、5%CO₂下维持所述胰岛过夜。

为了将胰岛分散成单个细胞，如下将分离的胰岛消化成可存活的细胞悬浮液：将它们放入50ml离心管中，离心，并将沉淀物转移至1.5ml微量离心管。在用不含钙-镁的HBSS洗涤2次以后，加入9份不含钙-镁的HBSS和1份木瓜蛋白酶(5U ml终浓度)的混合物。在旋转器上在37℃温育20min以后，用移液器移出胰岛，将它们分散成单个细胞。

在微型模具中温育细胞。将单个分散的细胞转移至微型模具中的专门的聚集培养基(DMEM/F12培养基，含有10%胎牛血清(FBS)、EGF(20ng/mL)、ITS(1g/L)、BSA(2g/L)、烟酰胺(10nmol/L)、艾塞那肽-4(5nmol/L)和1%抗生素)(Kikugawa等人2009)中，进行最后的培养。向该聚集培养基中，我们已经加入了高钙条件(2-4mM)，这会增强胰岛再聚集。在分散时，使用血球计数器，用显微镜检查细胞的等分试样。测定单个细胞相对于双联体或三联体的百分比。将成功的细胞分散定义为，具有最少90%的可存活的单个细胞，其它10%包含双联体和三联体。通过获知分散系中的细胞的密度（经由使用血球计数器进行细胞计数），我们能够估测每个凹坑的细胞的数目。但是，我们还已经在已经加载所述微型模具以后计数细胞/凹坑，其随实验不同而变化，基于培养基细胞密度，但是范围为20-150。基于加载进模具中的培养基中的细胞密度，可以操纵细胞数目/凹坑，这会为用户提供控制目标3D细胞结构的最终大小的优点。

轻轻摇动所述微型模具，然后静置15分钟，使得细胞沉降进单个凹坑中。在37℃、5%CO₂下维持胰岛最多9天，每天更换培养基。如下容易地更换具有60μm深度凹坑的微型模具中的培养基：从模具壁附近轻轻取出(利用抽吸)旧培养基，并向模具中轻轻移入新鲜培养基。

在微型模具内的细胞簇的再聚集。最初，细胞随机地落在每个孔的底部上。沉降在每个凹坑中的细胞的数目由悬浮液中的细胞密度决定。为了在加载所述微型模具以前测定细胞密度，取出胰岛细胞悬浮液的等分试样，并使用血球计数器在显微镜下计数细胞/体积。获知模具中的凹坑的数目和每个再聚集的胰岛的目标大小，可以根据起始细胞密度浓缩或稀释悬浮液中的细胞数目。如果模具含有10,000个凹坑且希望的结果是100个细胞/凹坑，则在加载进所述微型模具中的培养基中必须存在1,000,000个细胞。图14显示了从第2天开始并进行至第5天，在微型模具中的细胞发展。在第3天和第4天之间，细胞开始呈现天然胰岛的三维形状。在凹坑内形成的胰岛都限于小于90μm的直径(平均直径小于50μm)。该尺寸是重要的，因为我们已经公开的资料表明，50μm是确保向胰岛的核心细胞供给营养的临界尺寸(Williams等人,2010)。大于50μm的胰岛表现出核心细胞死亡，而小于50μm的那些胰岛在培养中很少表现出核心细胞死亡。每个凹坑的弯曲的底部有助于使细胞彼此靠近，以最佳地形成球形再聚集的胰岛。图14显示了使用面形测定器对单个凹坑深度的测量。该单个凹坑的深度稍微大于60μm，且底部是弯曲的，这会将细胞推向凹坑的中央进行聚集。

从早期原型得到的结果例证了在制备最佳尺寸和形状的再聚集的胰岛中的成功。该早期原型具有包围凹坑区域的未形成凹坑的基质表面区域(图15)。当接种时，一些细胞落在原型微型模具的未形成凹坑的表面上。尽管一些落在未形成凹坑的表面上的细胞停留在单个细胞形式或生长成小细胞簇，其它细胞形成巨型胰岛：不受凹坑规范限制的巨大复合物(图15)。在该早期原型模具内，细胞（分离自同一个动物，在相同的培养基中培养，并在相同的基质材料上再聚集）生成2种不同的细胞再聚集体：i)形成在凹坑内的那些形成小的确定形状的胰岛，和ii)形成在扁平表面上的那些（不限于凹坑的物理限制）形成细胞的大聚集块，它们具有差的扩散性质。一些无限制的胰岛生长至400μm直径的大小。这些结果会提供优良的概念证据（proof-of-concept）：物理地限制细胞的再聚集会产生最佳地限定尺寸的胰岛。

实验数据提示，在微型模具中再聚集的胰岛表现出的扩散性质与天然小胰岛表现出的扩散性质类似。为了测定在微型模具中再聚集的胰岛的扩散性质，将再聚集的胰岛暴露于含有葡萄糖的荧光类似物(2-NBDG)的培养基10分钟。所述荧光葡萄糖类似物完全渗入再聚集的胰岛的核心，这指示葡萄糖扩散屏障相对较低(图26)。相比而言，以前的工作证实，天然大胰岛具有显著的扩散屏障，所述扩散屏障会抑制葡萄糖渗入胰岛核心中和细胞的摄取，甚至在暴露于2-NBDG数小时以后(Williams等人,2010)。这些数据共同地指示，在微型模具中再聚集的胰岛具有比天然大胰岛低的扩散屏障。

在微型模具中形成的细胞与在商业上可得到的多孔平板中形成的那些的对比。将在模具中的再聚集胰岛的结果与在可商业得到的微量培养板中的再聚集胰岛进行了对比。商业平板含有正方形的孔，所述孔测得500μm的直径。在商业平板中培养分散的胰岛细胞，并如预测的那样形成胰岛-样簇。进行几次观察。首先，在商业平板中形成的胰岛细胞在孔的角落（在这里它们可以接触壁）中聚集并彼此结合。图16显示了形成再聚集的胰岛的细胞的一个典型实例，所述胰岛接触商业孔的侧壁。这些细胞使用接触导向来重新形成。

其次，但不限于大小，越来越多的细胞结合到一起，产生具有差生存力的巨大胰岛(一些具有超过400μm的直径)。由于没有小微型模具限制每个孔内的细胞的数目，并将物理尺寸设计成最佳地指导再聚集的胰岛的形状，所以得到的胰岛非常大，且含有高百分比的死细胞。在商业可得到的平板中再聚集的胰岛的生存力试验中，在培养6天时观察到超过50%的细胞死亡。在这些大开口中，细胞经常保持为单个，其表现出差的细胞生存力。能够沿着孔的壁或角落簇集的那些细胞从未形成球形（指示天然胰岛），且具有差的生存力。

第三，在商业模具中形成的细胞簇不会再聚集成我们使用所述微型模具能够得到的球形胰岛-样组织。再聚集的胰岛的成球能力可能是预示成功的体外功能的一项重要特征。将大多数多孔平板生产成具有扁平的底部孔和正方形侧壁，如图16所示。在商业平板中再聚集的细胞，诸如不会彼此粘附成天然回忆球（native-reminiscent sphere）的那些，并因此更不可能象天然胰岛一样有效地起作用。尽管具有圆形底部的1536孔板是可商业得到的，在500μm直径的任意孔中形成的胰岛细胞会因为太大而难以克服扩散屏障。这些结果支持了下述观念：当前的可商业得到的模具就最佳胰岛形成而言是不适当的基质。

从模具取出再聚集的细胞簇。在有些情况下，希望以不会破坏细胞的完整性或生存力的方式，从所述微型模具中取出再聚集的胰岛细胞。这可以如下容易地实现：将大移液器轻轻地直接放置在凹坑上面，并施加抽吸。从所述凹坑中与培养基一起取出再聚集的胰岛。随后用新鲜培养基洗涤所述微型模具，并直接地移到所述凹坑上，会取出模具中的几乎所有的再聚集的胰岛。

在微型模具中形成的细胞再聚集体的表征。测量从微量培养板取出的胰岛的大小和生存力。天然大鼠胰岛的直径范围是20-350μm。当在微型模具(100μm直径,60μm深)的凹坑内再聚集时，100%的胰岛具有小于90μm的直径；每个再聚集的胰岛的平均直径是36.6±1.2μm(共焦显微术测量超过500个单个的再聚集的胰岛)。最初，我们发现少数更大的结构，我们认为它们代表从未完全消化成单个细胞的胰岛并因此从未落入凹坑中。此后，在分散操作中更加小心地制备胰岛悬浮液，所述悬浮液含有90%的单个细胞，剩余的细胞主要是双联体或三联体。我们使用微型模具模式A和B(图17)估测，得到的所有聚集体中的85-90%具有小于90μm的直径。由于没有理解的原因，在凹坑中的一些细胞分裂成多个胰岛，而不是在每个凹坑中形成一个再聚集的胰岛。图18显示了在一个凹坑内的2个再聚集的胰岛的一个实例。

在形态学上，再聚集的胰岛看起来与相同大小的天然胰岛相同。它们的形状是球形，具有胞外胰岛的囊-样外表面，如图29所示。相比而言，图15表明，在没有微型模具下聚集的细胞没有形成球形或明显的囊。

使用细胞凋亡/坏死细胞染色(Invitrogen,含有Yo-Pro-1和碘化丙啶的Vybrant细胞凋亡试验)，在再聚集的胰岛上完成生存力实验。该双标记试验会测量膜完整性和DNA破碎。使用我们以前公开的方法(MacGregor等人,2006;Williams等人,2010)，在所述两种标记中温育再聚集的胰岛1小时。随后，用PBS冲洗胰岛，并放入在Fluoview 300共焦显微镜上的Attofluor室中。将再聚集的胰岛光学地切片，并存储来自胰岛中心的照片，用于以后分析。将在含有染料的胰岛内的区域计算为总胰岛区域的百分比，以测定生存力。5天龄再聚集的胰岛的生存力测量证实了在细胞内非常高的生存力，并揭示非常少的死细胞/胰岛。再聚集的胰岛的总生存力是99.76%。该值高于以前在文献中关于天然大和小胰岛以及关于单个胰岛细胞分散系所报道的值(Williams等人,2010;Song等人,2009)。

图19显示了典型胰岛的生存力染色的实施例。在这些实验中，红色染色指示由坏死导致的细胞死亡，绿色细胞染色指示由细胞凋亡导致的细胞死亡。

图19A显示了在所述微型模具中再聚集的胰岛中鉴别的仅有的非常少的死细胞之一。染成红色的细胞正在发生由坏死导致的细胞死亡。在分离的组织中，经常首先发生细胞坏死。在500个测试的胰岛中，仅观察到2个细胞凋亡的(绿色)细胞。相比而言，当来自相同动物的细胞在微型模具表面上形成大巨型胰岛时，在所述块中存在大量死细胞。图19B捕获了含有23个死细胞的视图的一个平面。调节显微镜的焦面，证实在所述块的所有平面内存在更多死细胞。因而，在凹坑中再聚集成正确大小的细胞具有非常高的生存力，而在凹坑外面再聚集成大块的细胞表现出显著的细胞死亡。这些结果支持所述微型模具的成功，因为位于模具的没有凹坑的区域上的细胞具有比在凹坑中形成的那些远远更差的生存力。

在微型模具中形成的所有细胞的生存力超过来自相同动物的天然大和小胰岛的生存力(图20)。如以前所述，使用Invitrogen的Vybrant细胞凋亡试验，在大鼠大胰岛、小胰岛和再聚集的胰岛之间对比了生存力。在分离后6天，在2组天然胰岛中存在活细胞百分比的一些变异性，但是在再聚集的胰岛中几乎不存在死细胞，这导致误差棒太小而难以在图中可见地表示。在微型模具中再聚集的胰岛表现出比天然小胰岛高大约10%的生存力比天然大胰岛高大约40%的生存力(图20)。

从微型模具制备细胞群。在天然胰岛(大的和小的)中存在3大类细胞，它们占所述胰岛的总细胞的约90%。分泌胰高血糖素的α细胞占所述胰岛的所有细胞的约20%。生产胰岛素的β细胞占总细胞数目的60-65%，生产生长激素抑制素的δ细胞占所述胰岛细胞组合物的5-10%。已经证实，在本发明的微型模具中工程设计的胰岛含有α、β和δ细胞。例如，图21描绘了在再聚集以后6天在本发明的微型模具中形成的2个代表性的胰岛；β细胞被染成绿色，α细胞被染成红色，δ细胞被染成蓝色。这些工程设计的胰岛似乎具有比一般的天然胰岛低的β细胞百分比。但是，与天然小胰岛相比，α:β:δ细胞的细胞相对组成和它们的构造可能类似于天然小胰岛。天然大鼠大和小胰岛构造成，胰高血糖素阳性的和生长激素抑制素阳性的细胞位于胰岛的外层上。胰岛素阳性的细胞存在于中央。这样，在小胰岛中的胰岛素阳性的细胞(β细胞)的百分比更低，但是每个胰岛含有大量胰岛素。尽管我们尚未在足以确定地做出结论的再聚集的胰岛中计算β/α/δ细胞(胰岛素/胰高血糖素/生长激素抑制素阳性的细胞)的百分比，β细胞相对于所有其它细胞的百分比可能类似于天然小胰岛。一个重要的差别是，在再聚集的胰岛中，α、β和δ细胞与分散在再聚集的胰岛中的细胞一起以随机模式构造。这是与在人胰岛中观察到的相同的构造(Hahnvan Dorshe等人,1988;Bosco等人,2010)。因而，再聚集的胰岛表现出更随机的细胞构造模式（暗示天然人胰岛)。

胰岛素生产。重要的是，证实在微型模具中工程设计的胰岛能够生产新的胰岛素分子。首先合成胰岛素作为前体分子，称作胰岛素原。将6天龄再聚集的胰岛关于胰岛素原水平进行染色，以测定它们是否生产新的胰岛素。图22显示了关于成熟的胰岛素(绿色)和胰岛素原分子(红色)进行染色的再聚集的胰岛的一个实施例。如预期的，β细胞被双重标记。照片表明，在再聚集的胰岛中正在合成新的胰岛素，甚至在培养6天时。

胰岛负责在进餐后响应于高葡萄糖暴露将胰岛素释放进血液中。胰岛素分泌的缺乏是1型糖尿病患者不能维持正常血糖水平的原因。为了测定对葡萄糖的细胞反应，将在本发明的微型模具中再聚集的胰岛和天然小胰岛暴露于低葡萄糖条件(3mM)。收集并定量由两种胰岛类型分泌进培养基中的胰岛素(图23)。在低葡萄糖条件下(30分钟)，再聚集的胰岛释放的胰岛素是天然小胰岛的100倍(天然小胰岛生产比天然大胰岛更多的胰岛素)。当暴露于高葡萄糖(20mM)时，再聚集的胰岛继续分泌比天然大或小胰岛明显更多的胰岛素。为了证实再聚集的胰岛是在分泌胰岛素而不是泄漏胰岛素，我们使用小膜非渗透的葡聚糖(10kD)完成了额外实验。该尺寸的分子小到足以穿过在细胞内的核被膜上的核孔复合体。但是，质膜不含有能够穿过该尺寸的分子的蛋白复合体。将葡聚糖(20mM)加入含有再聚集的胰岛的培养基中，并捕获共焦照片，甚至在暴露4小时以后葡聚糖不能进入细胞中，这提示所述细胞不是渗漏的或膜损坏的。另外，如果细胞实际上渗漏胰岛素而不是分泌胰岛素，我们应当已经在坏死/细胞凋亡试验中在再聚集的胰岛中观察到更高水平的红色或绿色染色，如图22所示。这些数据共同地提示，在微型模具中再聚集的胰岛确实生产比它们的天然小或大胰岛副本更高量的胰岛素。

据我们所知，尚未报道天然的或改变的胰岛细胞在这些水平的胰岛素分泌，这使得我们的结果是非常独特的。Weir等人报道了将小型再聚集的胰岛包囊进具有高古洛糖醛酸含量的海藻酸盐中(O’Sullivan等人,2010)。Weir如下制备了这些胰岛聚集体：简单地将胰岛分散成单个细胞，然后允许它们没有限制地重新定形。Weir的工作证实，在正常的氧水平，它们的小胰岛释放出与天然胰岛一样多的胰岛素，但是在低氧中，Weir胰岛释放出比天然胰岛更多的胰岛素。但是，Weir的最好表现的胰岛分泌的胰岛素与我们的在微型模具中再聚集的胰岛相比少了20倍。我们的再聚集的胰岛在高葡萄糖中的胰岛素分泌的相对下降的原因在此时是未知的，且在工程设计的胰岛可以移植进糖尿病动物中之前必须确定。尽管相对下降，与天然胰岛相比在低和高葡萄糖条件下胰岛素分泌的急剧增加是微型模具再聚集方法的一个重要的且独特的属性。

胰岛的添加剂。可以与在微型模具中的再聚集胰岛过程一起使用的替代性的方法和材料几乎没有限制。首先，在再聚集时可以将许多分子掺入工程设计的胰岛中。这些包括、但不限于：生长因子、免疫调节剂、免疫抑制剂、细胞因子、趋化因子、DMARD(缓解疾病的抗风湿性药物)、抗炎药和抗生素。可以将增加移植部位处的氧张力的分子或微型装置掺入再聚集的胰岛中，特别当使用可植入的微型模具基质时。可以在再聚集时加入的其它非限制性的分子类别包括：诱导胰岛素释放的药物、小分子、肽、蛋白、抗体(例如针对CD11a、CD11b、CD11c、CD18)和核酸(例如DNA或RNA)。

讨论。我们的凹坑化的微型模具不同于在本领域中用于再聚集细胞的其它支架。以前，其他人已经尝试使用悬滴方法来形成胰岛(例如，Lehmann等人,2007)。在所述悬滴方法中，将细胞放入溶液中，在培养皿盖上形成液滴，然后将培养皿盖上侧朝下地反转，使得所述细胞落在溶液悬滴的底部，它们可能在这里形成胰岛。但是，所述悬滴方法是耗时的且易于污染，因为在“液滴”中的培养基不能更换。

微型模具的体外实用性。本发明的微型模具可以设计成在体外形成细胞聚集体，用于以后移植或用于药物或装置测试以及其它用途。

制备用于移植的细胞(预示实施例)。设计成产生用于移植的细胞的一种优选的微型模具是这样的单个装置：它是可灭菌的，可重复使用的，且当填充时不会泄漏培养基或细胞(图24)。首先，需要从胰腺中分离出胰岛。从大胰岛分离出健康的小胰岛。可以将大胰岛分散成单个细胞或双联体，将它们加载进微型模具中。在培养3-6天以后，取出细胞，与天然小胰岛混合，并移植进糖尿病受体中。

将微型模具A(图17A)设计成用于胰岛再聚集，其具有100μm直径和60μm深度的凹坑。我们已经发现，60μm深度是最佳的，因为它允许从所述凹坑中容易地取出再聚集的胰岛。所述凹坑排列成交替图案，使得在凹坑之间存在最小间距(图17A)。凹坑之间的平均距离小于30μm。

在图15中看到的未形成凹坑的表面完全隐蔽在预见到的微型模具中用于制备移植所用细胞的凹坑中。该排列允许在要使用的微型模具上形成最大的凹坑空间——导致在每个模具中产生最大数目的再聚集体和最大效率，使得漂浮在模具表面上的任意细胞可能落入凹坑中，从而限制用于再聚集的可存活细胞的损失。

在一个模具上可得到的凹坑的数目将随模具的大小而变化。使用微型模具A设计(图17A)的直径为大约1.5英寸的模具含有10,000-12,000个凹坑/模具。所述凹坑的间距也取决于模具的需要。对于移植所用组织的再聚集，原始组织产生再聚集的胰岛的数目的效率是重要的。落入凹坑中的细胞的百分比越大，制备新胰岛的效率越好。所以我们的为胰岛移植所设计的模具具有20-30μm的凹坑间距。

药物筛选(预示实施例)。使用微型模具的药物筛选是基于下述概念：排列成3D结构（象微型肿瘤或小胰岛一样）的细胞会对它们的环境做出反应，所述反应不同于在盘中扁平地生长或再聚集的细胞。例如，微型肿瘤或胰岛可以形成在所述微型模具的凹坑中，然后可以将潜在的治疗剂（诸如抗癌药物）单个地施加于每个凹坑或加入整个平板中。然后可以检查3D结构的形成并观察变化，诸如降低的细胞生存力或簇大小，这将指示测试化学品的不希望的效应。在第一个实例中，可以在一块长度为大约35mm的玻璃上测试许多不同的药物。对于第二个方案，将测试单一药物，但是在一个模具中，可以定量许多单独的反应。

癌症药物试验的一种可能的定量是生存力(活/死染色)，这可以针对每种肿瘤进行。尽管使用所述微型模具设计来测试潜在的癌症药物是有吸引力的，所述模具可用于在3D排列的细胞上最佳地实现的所有药物试验。

将微型模具B(图17B)设计成用于将单一干预递送至每个孔。因而，它可适用于药物试验。对于该设计，所述凹坑具有大约180μm的直径，在每个凹坑之间具有120μm的间距。所述间距可以根据需要增加或减小。图11显示了具有单个空凹坑的微型模具B的底面的照片。微型模具B含有2,700-3,000个凹坑/模具，远远少于在设计A中。在设计B中的凹坑之间的间距更大，以确保仅向一个凹坑中的准确药物递送。凹坑图案的规范和间距由用户设定，且取决于使用的药物递送系统。使用模具在每个凹坑中的细胞上测试数千种化合物，允许用户在直径小于2英寸的模具中完成对2000-3000种不同药物的药物筛选(图24)。为单独的药物使用每个模具的高处理量药物筛选允许数千单个细胞簇做出反应，并测量为单个反应而不是平均反应。可以使用与纳米递送系统配用的高处理量药物筛选，使得每个凹坑含有不同的测试药物。或者，可以从数千个暴露于相同处理和培养条件的样品收集数据点(图24)。

非胰岛细胞的制备(预示实施例)。可以为多种细胞聚集形状设计模具，所述形状包括、但不限于长神经元途径、肾小球样滤器、血管、替换胞室等。干细胞或重新程序化的细胞在小的、界限清楚的形状（诸如微型模具）中的聚集，也是本发明的适当用途。

一种典型用途是，将培养的细胞系繁殖和聚集成模具。在该情况下，以1-50个细胞/凹坑(取决于用户的需要)的非常低的密度，将悬浮液中的细胞加载进模具中。培养的细胞系含有分裂细胞，它们被允许在凹坑中生长一段时间，所述时间取决于用户的需要。其它细胞源包括来自动物或人类的新鲜分散的细胞。加载新鲜分散的细胞的方法类似于关于胰岛所述的一般方法。将选择的组织（例如血管）暴露于消化酶，直到单个细胞或双联体处于悬浮液中。由用户将细胞以选择的密度加载进模具中的选择的培养基中。最后，可以将干细胞程序化，以生产不同的成年细胞类型。这些细胞也可以加载进微型模具中，以增强3D结构形成。

微型模具的体内实用性。(预示实施例)本文所述的微型模具可用于体外用途。

在用于移植的模具中再聚集胰岛(预示实施例)。从生物聚合物构建的微型模具可以用于制备可植入的产品(图23)。在这样的情况下，会改变模具的微环境，使得再聚集的胰岛附着于生物聚合物上，并将整个“贴剂”移植进受体中。上述的生物聚合物适合制备这样的可植入的微型模具。在模具中的凹坑可以用于制备孔，所述孔允许细胞首先沉降在凹坑中（它们在这里的再聚集受到凹坑尺寸的引导），然后附着于生物聚合物凹坑。

为了在生物聚合物中产生凹坑，使用本领域已知的方案(例如，Dean等人2007)，设计蜡底片。对于可植入的模具，将胰岛留在模具中，并通过外科手术放入受体中。可植入的模具具有这样的模具设计：所述设计具有在凹坑之间的开口，所述开口允许神经和血管浸润所述胰岛。此外，可以用例如神经元和血管生长因子浸渍可植入的材料，并且所述模具也可以含有免疫抑制剂来保护胰岛免于免疫排斥。

使用几种公开的方法，可以植入含有胰岛的模具。如Qi等人（2010）所公开地，可以将微型模具放入腹腔中。在麻醉下切开腹腔，将所述模具轻轻地放入筋膜下空间。用于植入所述微型模具的替代性部位包括：皮下插入物，特别是在预处理以后，以增加与所述区域的维管联结，如Veriter等人（2010）所述。在人移植中，经由门静脉，将胰岛放入肝中(Koh等人,2010)。对于微型模具，通过门静脉的输注是不可能的，但是可以使用更侵入性的外科手术将所述模具放入肝中或在肾囊下(MacGregor等人,2006)。

参考文献

就它们提供示例性操作细节或其它细节来补充本文所述的那些而言，下述参考文献具体地通过引用并入本文。

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从前述内容可见，本发明非常适合实现上文所述的所有目标和目的以及显而易见的和本发明固有的其它优点。由于可以做出本发明的许多可能的实施方案而不脱离其范围，应当理解，本文所述的所有内容应当解释为示例性的，而不是限制性含义。尽管已经显示和讨论了具体的实施方案，当然可以做出不同的修改，且本发明不限于本文所述的部件和步骤的具体形式或排列，除非这样的限制被包括在下述的权利要求中。此外，应该理解，不论其它特征和子组合，某些特征和子组合具有实用性且可以采用，这被权利要求预见到，且在权利要求的范围内。

Claims (25)

1.一种可植入的装置，其包括：

基本上平面的由生物材料构成的支架，所述支架具有主表面；和

附着于所述生物材料支架的所述表面以形成胰岛细胞多层的单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇，所述单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇衍生自成年完整胰岛，其中所述小胰岛细胞簇具有小于125μm的直径。

2.一种用于形成可植入的装置的方法，所述方法包括：

从胰腺得到完整胰岛；

从所述完整胰岛衍生出单个胰岛细胞或小胰岛细胞簇；和

使所述单个胰岛细胞和小胰岛细胞簇以多层附着于基本上平面的可植入的生物材料支架的主表面。

3.一种用于培养细胞的表面，所述表面包括：

基质，所述基质具有基本上平面的顶部表面，其中所述表面包括多个凹坑；

其中每个凹坑包括内部底部表面和内部侧壁表面，其中所述底部表面是圆形的，且其中每个凹坑具有100-200μm的直径(±20%)和50-150μm的深度(±20%)；

其中细胞分布在各个凹坑中。

4.一种用于培养细胞的装置，所述装置包括根据权利要求3所述的表面，且另外包括用于容纳所述平面表面的系统，其中所述系统形成底部表面和内部侧壁表面和内部体积，所述底部和侧壁基本上不透过液体，其中细胞和培养基分布在所述内部体积中。

5.根据权利要求3所述的装置，其中所述细胞是胰岛细胞。

6.根据权利要求3所述的装置，其中所述细胞是非胰岛细胞。

7.根据权利要求3所述的装置，其中所述凹坑具有100μm(±20%)的直径和60μm(±20%)的深度。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述平面表面由玻璃制成。

9.根据权利要求3所述的装置，其中所述平面表面由生物相容的材料制成，且适合植入人患者中。

10.根据权利要求3所述的装置，其中所述装置是可灭菌的。

11.一种用于培养细胞的方法，所述方法包括：将细胞引导至包括多个凹坑的表面，其中每个凹坑具有100至200μm的直径(±20%)和50至150μm的深度(±20%)，并将所述装置暴露于细胞培养条件。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞是胰岛细胞，且其中所述细胞在暴露于所述装置和支持性培养条件以后再聚集成小胰岛。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞以每1个凹坑大约20-150个细胞的比率沉降在所述凹坑中。

14.根据权利要求11所述的方法，其中从胰岛培养物分散出所述细胞并将化学品或生物分子掺入得到的小胰岛中。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞是非胰岛细胞。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述凹坑具有100μm(±20%)的直径和60μm(±20%)的深度。

17.一种用于测试多个细胞样品对导入的化学品的反应的方法，所述方法包括下述步骤：(a)在包括多个凹坑的装置中培养细胞，其中每个凹坑具有100至200μm的直径(±10%)和50至150μm的深度(±10%)，(b)将测试化学品引导至每个凹坑，和(c)分析所述细胞对所述测试化学品的反应。

18.分离的胰岛群体，其中所有胰岛中的至少80%具有低于90μm的直径，所述胰岛具有比天然大胰岛低的扩散屏障，且其中所述胰岛具有比天然小胰岛和大胰岛高的细胞生存力，且其中胰岛的胰岛素生产特征在于，水平是天然的分离的胰岛的大于10倍。

19.根据权利要求18所述的群体，其中大多数胰岛是球形的。

20.根据权利要求18所述的群体，其中所述胰岛包含胰腺α细胞、胰腺β细胞和胰腺δ细胞。

21.根据权利要求18所述的群体，其中所述胰岛中的至少85%是可存活的。

22.根据权利要求18所述的群体，其中所有胰岛中的至少80%具有小于50μm的直径。

23.根据权利要求18所述的群体，其中所述胰岛中的至少50%具有小于37μm的直径。

24.根据权利要求18所述的群体，其中与分离自天然小胰岛或天然大胰岛的β细胞相比，所述胰岛β细胞生产更大量的胰岛素。

25.根据权利要求18所述的群体，其中所述胰岛具有比天然大胰岛低的扩散屏障，且其中所述胰岛具有比天然小胰岛和大胰岛高的细胞生存力。

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