MX2012011644A

MX2012011644A - Celulas de islote modelo y agrupamientos de celulas de islote pequeño para el tratamiento de diabetes.

Info

Publication number: MX2012011644A
Application number: MX2012011644A
Authority: MX
Inventors: Cory Berkland; Lisa A Stehno-Bittel; Teruna Siahaan; Karthik Ramachandran
Original assignee: Univ Kansas
Priority date: 2010-04-06
Filing date: 2011-03-31
Publication date: 2013-02-11
Also published as: WO2011126921A2; DK2555807T5; CA2795243C; US20140219997A1; BR112012025172B1; EP2555807B9; JP2013524787A; DK2555807T3; CN102958543A; US8735154B2; US20100233239A1; JP5956422B2; EP2555807A2; AU2011238540A1; AU2011238540B2; WO2011126921A3; BR112012025172A2; CA2795243A1; EP2555807B1; CN102958543B

Abstract

Se describe un andamiaje que tiene células de islote o agrupamientos de células de islote pequeño unidos a este en una multicapa, y un micro-molde que tiene divots para cultivar islotes, en donde la formación de islote es influenciada por la forma y dimensiones de los divots.

Description

CELULAS DE ISLOTE MODELO Y AGRÜPAMIENTOS DE CELULAS DE ISLOTE PEQUEÑO PARA EL TRATAMIENTO DE DIABETES Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente a composiciones y procesos para crear células de islote viables, islotes, y agrupamientos de células de islote pequeño .

Antecedentes de la Invención El aumento de casos de diabetes mellitus en los Estados Unidos ha sido llamado una epidemia. La diabetes es la tercera causa conducente de muerte por enfermedad y rivaliza con la enfermedad del corazón y cáncer como un asesino principal de los ciudadanos de los Estados Unidos. Por razones no explicadas, la ocurrencia de diabetes tipo l está aumentando mundialmente, y la edad de comienzo ha disminuido por tres a cinco años durante la década pasada de modo que ahora muchos niños desarrollan la diabetes antes de entrar a la escuela. El resultado es que más personas con diabetes pasarán un gran porcentaje de su vida en riesgo de desarrollar las complicaciones crónicas relacionadas con la diabetes tipo 1. Puesto que el riesgo de desarrollar la mayoría de las complicaciones crónicas asociadas con la diabetes está relacionado con el control glucémico, la atención significativa se dirige hacia nuevas terapias, tal Ref. 236098 como transplante de islotes, para mejorar el control glucémico.

Los transplantes de islotes fueron intentados por primera vez en la década de 1980. Las tasas de éxito iniciales para el transplante de islotes en humanos fueron decepcionantes con solo el 5% de pacientes receptores de transplantes logrando función parcial. Ver Sutherland et al, Evolution of kidney, páncreas, and islet transplantation for patients with diabetes at the University of Minnesota, Am. J. Surg. 166: 456491 (1993). Entre las fallas hubo historias de éxito aisladas de individuos que lograron inversión prolongada de su diabetes por un período de 1 o 2 años, lo cual alentó a los investigadores a continuar este procedimiento para el tratamiento de diabetes. En el año 2000, los transplantes de islotes fueron realizados exitosamente en siete pacientes con diabetes usando un régimen de supresión que omitió los glucocorticoides , ahora referido como el protocolo Edmonton. Ver idgway et al., Pancreatic islet cell transplantation: progress in the clinical setting, Treat. Endocrinol. 2(3):173-189 (2003). Por consiguiente, los resultados del transplante de islotes han mejorado marcadamente. Ver Shapiro et al., Clinical results after islet transplantation, J. Investig. Med. 49(6): 559-562 (2001); Balamurugan et al., Prospective and challenges of islet transplantation for the therapy of autoimmune diabetes, Páncreas 32(3): 231243 (2006). Todavía, sin considerar el organismo generado por estos resultados, aún existen barreras para el uso de transplante de islote como un tratamiento práctico para la diabetes, con una barrera siendo el número limitado de órganos donadores considerando que la mayoría de los individuos requieren múltiples transplantes para lograr la independiencia a la insulina.

Muchos factores pueden tener un efecto sobre el éxito del trasplante, incluyendo las características físicas del islote. Hace unos 20 años, los investigadores describieron en detalle el tamaño y la forma de los islotes y determinaron un método para estimar el volumen del islote. Ver Bonnevie-Nielsen et al., Pancreatic islet volu e distribution: direct measurement in preparations stained by perfusión In Situ, Acta Endocrinol . (Copenh) 105(3): 379-84 (1984) . Durante muchos años, los islotes grandes tradicionalmente han sido considerados deseables por sitios de trasplante por varias razones: (1) la presencia de islotes grandes es considerada una seña de identidad de una buena digestión pancreática, puesto que los islotes pueden ser fragmentados por digestión excesiva, y (2) el volumen se utiliza para determinar el número mínimo de islotes necesarios para el trasplante, y debido a que la duplicación de un diámetro del islote es equivalente a un aumento de ocho veces su volumen, los islotes grandes hacen una importante contribución al número de equivalentes de islote en una preparación.

En los últimos años, los investigadores han modelado el transporte de oxígeno, la glucosa y la insulina a través del islote. Ver Dulong et al., Contrlbutions of a finite element model for the geometric optimization of an implantable bioartificial páncreas, Artif. Organs 26(7): 583-9 (2002) . El transporte limitado de oxígeno puede propagar la muerte celular en el núcleo de los islotes si la tasa de consumo de oxígeno por las células periféricas excede la tasa de difusión de oxígeno en el islote. Por ejemplo, estudios recientes indican que los islotes grandes presentan necrosis aumentada cuando se exponen a condiciones hipóxicas . De hecho, casi todas las células beta murieron cuando el diámetro del islote excedió 100-150 µp. Ver Giuliana et al., Central necrosis in isolated hypoxic human pancreatic islets; evidence for postisolation ischemia, Cell Transplantation 147 67-76 (2005); MacGregor et al., Small rat islets are superior to large islets in in vitro function and in transplantation outcomes, Am. J. Physiol. Endocrinol . Metab. 290(5): E771-779 (2006) . El estrés oxidativo resultante puede agravar la apoptosis y la respuesta inmunológica en el trasplante. Ver Bottino et al., Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment, Diabetes 53 (10) : 2559-68 (2004) . Incluso en casos donde no ha ocurrido la muerte celular, es probable una disminución de la velocidad metabólica en el núcleo del islote.

El transporte retrasado de glucosa e insulina también disminuye la funcionalidad de los islotes pancreáticos. El gradiente de glucosa dentro de un islote causa que las células periféricas hagan contacto con concentraciones mucho mayores de glucosa que las contenidas en el núcleo del islote. Ver Kauri et al., Direct measurement of glucose gradiente and mass transport within islets of Langerhans, Biochem. Biophys. Res. Commun. 304(2): 371-7 (2003) . La forma de este gradiente está directamente relacionada con el diámetro del islote y la tasa de metabolismo de la glucosa. El aumento del diámetro de islote aumenta esta barrera difusional y consuntiva en todos los planos dentro del islote.

Para encontrar otra fuente de células beta productoras de insulina, también ha habido esfuerzos por cultivar células beta in vitro. Estos métodos se han enfocado en el cultivo de células beta de tejido fetal o derivación de tales células de células madre productoras de islote. Ver, por ejemplo, Peck et al., Patente de Estados Unidos No. 6,703,017; Brothers, WO 93/00411 (1993); Neilsen, WO 86/01530 (1986); Zayas, EP 0363125 (1990); Bone et al., Microcarriers; A New Approach to Pancreatic Islet Cell Culture, In vitro Vol. 18, No.2 Feb . (1982). Lamentablemente, tales técnicas son generalmente lentas y requieren la disponibilidad de tejido fetal raro o células madre como su fuente y resultan en una monocapa confluente de células beta cultivadas. Por consiguiente, permanece una necesidad de crear células de islotes viables usando técnicas más eficientes, disponibles, y confiables.

En un intento de superar la barrera difusional encontrada en la arquitectura de islotes intactos grandes, se hicieron varios intentos por los presentes inventores para hacer crecer múltiples capas de células de islote en microesferas de polímero para el implante. Las microesferas que se muestran en la figura 1A fueron diseñadas para estar dentro del intervalo de tamaño de islotes intactos . Mediante la unión de las células beta a la superficie exterior de la microesfera, se teorizó que debe existir poca o ninguna muerte celular debido a las barreras difusionales . Se hicieron múltiples intentos de usar diferentes ambientes de cultivo para optimizar la unión de las células a las microesferas, incluyendo el uso de densidad extremadamente alta de células en suspensión. Sin embargo, este método rápidamente agotó los medios de nutrientes y la supervivencia de células fue pobre. Otras técnicas incluyeron células que fueron "goteadas" lentamente sobre las microesferas para aumentar la interacción física de las células con las microesferas o co-cultivo de las células y las microesferas en una cámara de microgravedad durante varios días . Mientras que algunas células beta se unirían a las microesferas de polímero, su distribución fue desigual, y múltiples capas de células unidas nunca fueron consistentemente logradas (FIG. IB) .

Breve Descripción de la Invención En una modalidad, la presente invención se dirige a un dispositivo implantable que comprende un andamiaje sustancialmente plano comprendido de un biomaterial que tiene una superficie mayor y células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño en una multicapa a la superficie del andamiaje de biomaterial. Las células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño preferiblemente se derivan de islotes intactos adultos. Las moléculas de adhesión celular (por ejemplo, integrinas, caderinas, selectinas e inmunoglobulinas) se pueden unir al andamiaje para facilitar la unión de células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño al andamiaje. Además, uno o más factores de angiogénesis, agentes inmunosupresores (incluyendo supresores autoinmunológicos) , antibióticos, antioxidantes, anti-citocinas o anti endotoxinas pueden liberarse de manera controlable desde el andamiaje para mejorar la viabilidad de las células de islote y agrupamientos de células de islote pequeño.

En otro aspecto, el andamiaje de biomaterial es un biomaterial flexible y puede estar comprendido de un polímero biocompatible y/o biodegradable, tal como poli (DL-láctido-co-glicólido) (PLG) , ácido poliláctico (PLA) , o poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) .

En aún otro aspecto, la multicapa comprende una combinación de células de beta productoras de insulina y otros tipos de células de islote. La multicapa preferiblemente es de aproximadamente 1-2 a 5 células de espesor y forma una multicapa de aproximadamente 10 a 50 pm de espesor. La multicapa preferiblemente tiene un espesor sustancialmente uniforme de modo que el espesor de la célula varía por no más de 1 a 2 células a través de la superficie del andamiaj e de biomaterial .

En aún otro aspecto, las células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño se derivan de islotes adultos intactos usando digestión enzimática y/o cultivo en un medio agotado en calcio.

La presente invención también proporciona un método para formar el dispositivo implantable. En particular, se proporcionan técnicas para derivar células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño de islotes intactos (por ejemplo, digestión enzimática, agotamiento de calcio o una combinación de éstos) . Además, se proporcionan métodos para unir las células de islote individuales y/o agrupamientos de células de islote pequeño, que incluyen la centrifugación de una suspensión de células y la utilización de moléculas de adhesión celular para mejorar la unión a la superficie del andamiaje.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un método para utilizar los dispositivos implantables de la presente invención como un tratamiento para la diabetes. Se describen métodos para implantar los dispositivos, y técnicas para el tratamiento de la diabetes.

En una modalidad, la invención es una superficie para cultivar células que comprende un sustrato que comprende una superficie superior sustancialmente plana, en donde la superficie comprende una pluralidad de divots. Cada divot comprende una superficie inferior interior y una superficie de pared lateral interior. La superficie inferior es redondeada y cada divot está entre 100-200 µp? de diámetro (±20) y 50-150 µ?? de profundidad (±20) .

En otra modalidad, la invención es un dispositivo para cultivar células que comprende la superficie descrita anteriormente y que además comprende un sistema para contener la superficie plana. El sistema forma una superficie inferior y una superficie de pared lateral interior y un volumen interior, las paredes inferior y lateral son sustancialmente herméticas a líquidos. Cuando se utiliza el dispositivo, las células y el medio de cultivo se distribuyen en el volumen interior. En una modalidad preferida, las células son células de islote. En otra modalidad preferida, las células son células no de islote seleccionadas del grupo que consiste de células madre, líneas de cultivo celular, células primarias o recientemente dispersadas. En otra modalidad preferida, las células son células de islote y los divots son de 100 µp? ( + 20%) de diámetro y 60 pm (+ 20%) de profundidad.

En otra modalidad, la invención es un método para cultivar células que comprende introducir células a una superficie que comprende una pluralidad de divots, en donde cada divot está entre 100 y 200 µp\ de diámetro (±20%) y 50 y 150 µ?t? de profundidad (+20%) y exponer el dispositivo a las condiciones de cultivo celular. En una modalidad preferida, las células son células de islote y las células se re-agregan en islotes pequeños después de la exposición al dispositivo y condiciones del cultivo de soporte. En una modalidad preferida, las células se asientan en los divots en una relación de aproximadamente 20-150 células por 1 divot.

En otra modalidad preferida, las células han sido dispersadas de un cultivo de islote y las moléculas no nativas se diseñan en los islotes pequeños resultantes. En otra modalidad preferida, se seleccionan las células no de islote del grupo que consiste de células madre, líneas de cultivo celular, células primarias o recientemente dispersadas.

En otra modalidad, la invención es un método para probar una pluralidad de muestras de células para dar respuesta a un químico introducido que comprende las etapas de (a) cultivar células en un dispositivo que comprende una pluralidad de divots, en donde cada divot está entre 100 y 200 µ?a de diámetro (+10%) y 50 y 150 µp? de profundidad (+10%) , (b) introducir un químico de prueba en cada divot, y (c) analizar la respuesta de las células al químico de prueba .

En otra modalidad, la invención es una población aislada de islotes en donde al menos el 80% de todos los islotes están por debajo de 90 µ?? de diámetro y en donde los islotes tienen barreras de difusión bajas en relación con los islotes grandes nativos. Preferiblemente, los islotes tienen una alta viabilidad celular en relación con los islotes nativos pequeños y grandes, y la producción de insulina de islote se caracteriza por niveles que son mayores de 10 veces más que los islotes aislados nativos. En una modalidad preferida, la mayoría de los islotes son esféricos. En una modalidad preferida, los islotes comprenden células alfa pancreáticas, células beta pancreáticas y células delta pancreáticas. En una modalidad preferida, al menos el 85% de los islotes son viables. En una modalidad preferida, al menos el 80% de todos los islotes son menores de 50 pm de diámetro. En una modalidad preferida, al menos el 50% de los islotes son menores de 37 ym de diámetro. En una modalidad preferida, las células beta de islote producen insulina en cantidades mayores en comparación con las células beta aisladas · de islote pequeño nativo o islotes grandes nativos.

Breve Descripción de las Figuras Este archivo de patentes o solicitud contiene al menos una figura ejecutada en color. Las copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con figuras de color se proporcionarán por la Oficina a petición y pago de la tarifa necesaria.

Las FIGS. 1A y IB ilustran los intentos anteriores para hacer crecer células beta en polímeros de microesféricos para el implante en un paciente. En las imágenes, una distribución desigual de células se muestran unidas a una microesfera de PLGA revestida con polímero de quitosan. Una monocapa parcial de células fue todo lo que podría obtenerse después de la incubación a largo plazo con las células beta.

La FIG. 2 es una gráfica que compara la viabilidad celular para islotes de rata grandes cultivados (mayores de 125 µ?a) , islotes pequeños (menores de 125 µp?) , y células beta dispersadas como una función del tiempo. La disminución de la viabilidad de islotes grandes es estadísticamente significativa (p < 0.05) más allá del día 3.

Las FIGS. 3A y 3B resumen los resultados del trasplante de islotes pequeños (menores de 125 µp?) o islotes grandes (mayores de 125 µp?) en ratas diabéticas. Un retorno exitoso a euglucemia se observó a alrededor del 80% del tiempo cuando se utilizaron islotes pequeños, pero los trasplantes no tuvieron éxito en el restablecimiento de los niveles de glucosa en plasma normales cuando los islotes grandes fueron trasplantados. Esto puede ilustrarse mejor mostrando el nivel de glucosa en plasma del animal en cada grupo 60 días después del trasplante. Los animales que recibieron islotes grandes permanecieron hiperglucémicos después del trasplante, mientras que las ratas que recibieron islotes pequeños fueron euglucémicos . * indica la diferencia significativa de 0.01.

La FIG. 4 es un injerto de islote removido de la cápsula renal aproximadamente ocho semanas después del trasplante e inmunoetiquetado para insulina. La imagen en el panel izquierdo muestra relativamente más inmunoetiquetado de insulina (rojo) y una red capilar establecida en un injerto utilizando islotes pequeños (menores de 125 µp?) . En contraste, los injertos de islotes grandes (mayores de 125 µp?) mostraron poco inmunoetiquetado de insulina y fibrosis significativa (panel derecho) . Las imágenes son representativas de los cuatro animales diferentes.

La FIG. 5 muestra un agrupamiento de células de islote pequeño de rata teñidas con ditiazona para identificar las células beta. Debido a que la abertura confocal fue establecida para una sección Z extremadamente delgada, las células dentro de la subunidad, pero por debajo del plano de enfoque, son borrosas y no aparecen rojas. Sin embargo, el ajuste en el plano confocal a aquellas células indicó que también fueron claramente teñidas con ditiazona.

Las FIGS. 6A - 6B muestran la tinción de vivas/muertas de un agrupamiento de células de islote pequeño hecho de un islote adulto intacto usando dispersión enzimática. Este agrupamiento de células de islote pequeño es de aproximadamente 40 µp? de diámetro. En el panel derecho superior de la FIG. 6B, se muestra un agrupamiento de células de islote pequeño derivado cultivando un islote intacto con un medio agotado en calcio. El agrupamiento de células de islote pequeño fue desenvuelto o abierto de modo que el medio fue capaz de rodear las células en el agrupamiento. En la figura 6C, se muestra un agrupamiento de células de islote pequeño derivado usando tanto el agotamiento de calcio como la dispersión enzimática. El diámetro del fragmento fue de aproximadamente 15 µp. La Figura 6D muestra las células de islote individuales derivadas de una combinación de agotamiento de calcio y digestión enzimática seguido por pipeteo manual. El rojo indica que las células están muertas y el verde que las células están vivas. La barra de escala en la figura 6B se aplica a las figuras 6A hasta 6C.

La FIG. 7 es una representación esquemática de la producción de un parche que tiene una multicapa de células de islote unida a este de acuerdo con la presente invención.

Las FIGS. 8A - 8B son micrografías ópticas de adhesión de células beta a (8A) quitosan (Mw = 100 kDa) y (8B) larainina. El recuadro muestra micrografías ópticas y fluorescentes de una célula beta en laminina con tinción de citocromo B (verde) para actina.

La FIG. 9 demuestra los resultados cuando se estratifican las células de islote sobre un parche de polímero hecho de 50:50 ALGA-carboxilo (5.5 kDa). Los parches fueron seccionados ópticamente utilizando un microscopio confocal . Las imágenes fueron interpretadas para obtener la porción de sección Z que se muestra. El panel superior ilustra un parche con una o dos capas de células, y luego se agregaron capas de células adicionales como se muestra. Las células fueron estratificadas sobre el andamiaje girándolas en una centrífuga de placa a aproximadamente 3500 rpm durante aproximadamente 10 minutos . Las capas permanecieron unidas al andamiaje de polímero después del enjuague repetido.

La FIG. 10 es un esquema que representa el diseño general de un micro-molde con divots. En este ejemplo PDMS es el material que comprende el alojamiento del micro-molde y vidrio grabado es el sustrato en el que están grabados los divots .

La FIG. 11 es una micrografía que muestra una vista de arriba hacia abajo de divots vacíos en un micro-molde; el patrón de divots representado aquí es representativo del diseño de micro-molde B.

La FIG. 12 es una gráfica generada por un perfilómetro que ilustra la profundidad de un divot único y la forma de fondo redondo del divot .

La FIG. 13 es un esquema que ilustra el andamiaje utilizado para la producción de micro-molde. Los componentes del micro-molde y andamiaje para construir el micro-molde son: [1] un tubo de cobre grande; [2] un tubo de cobre pequeño; [3] polímero PDMS, el cual comprende el sistema que aloja la superficie de divot; [4] una superficie plana, tal como un gran cuadrado de vidrio envuelto en papel aluminio, utilizada como una base sobre la que se construye el micro-molde; [5] las paredes verticales del alojamiento del micro-molde; [6] la base del micro-molde, que se muestra aquí vertida a una profundidad de 2 mm; y [7] el vidrio grabado, el cual es el sustrato de divot .

La FIG. 14 es una micrografía que muestra la reagregación de células de islote dentro los divots de un micro-molde en los días 2 y 5.

La FIG. 15 es una micrografía que muestra el borde no de divot del sustrato de divot adyacente al campo de divots; los divots contienen pequeñas células de islote reagregadas, pero aquellas células que cayeron sobre la superficie no de divot se han reagregado en grandes mega-islotes .

La FIG. 16 es una micrografía que muestra las células de islote vivas congregadas en el borde de una cavidad en una placa comercialmente disponible; la reagregación de células de islote no es esférica como en el micro-molde, y el grupo reagregado de células de islote es mucho mayor que los islotes de 90 µta formados en micro-moldes .

Las FIG. 17A y 17B son un conjunto de esquemas que muestran dos patrones de divot posibles para el micro-molde; La FIG. 17A es un diseño donde los divots están cerca uno del otro, lo cual sería útil cuando se intenta maximizar el número de reagregados formados en un micro-molde único; La FIG. 17 es un diseño donde los divots están espaciados más uno del otro, lo cual sería útil cuando se manipula el tratamiento de células en divots individuales.

La FIG. 18 es una micrografía que muestra dos islotes reagregados contenidos dentro de un divot único.

La FIG. 19A y 19B es un conjunto de micrografías que muestran la viabilidad de tinción en islotes reagregados; el rojo indica células muertas. La FIG. 19A muestra que los islotes reagregados dentro del micro-molde contienen muy pocas células muertas, sólo una célula muerta está teñida en el islote superior, mientras que no existe evidencia de muerte celular en el islote inferior. La FIG. 19B muestra un mega-islote que se formó en la superficie no de divot del micro-molde, en donde hay al menos 23 células de islote muertas en el plano de visión confocal.

La FIG. 20 es una gráfica que compara la viabilidad de islotes grandes nativos y pequeños nativos con el islote reagregados. Todos los islotes fueron removidos de las mismas ratas y una porción de los islotes aislados fue dispersada en las células de islote para reagregación. En el día cinco, los islotes reagregados fueron removidos del micro-molde y todos los islotes fueron expuestos a teñidos de viabilidad de vivo/muerto. El porcentaje de células vivas en los islotes reagregados fue mayor que aquel para los islotes nativos grandes o pequeños .

La FIG. 21 muestra dos islotes representativos 6 días después de la reagregación en divots de micro-molde que han sido triple teñidos para identificar las células beta (verde) , células alfa (rojo) , y células delta (azul) . El islote superior mide 43 x 55 µp? de diámetro (medido en las direcciones x e Y) , y el islote de fondo mide 48 x 65 µp? de diámetro .

La FIG. 22 muestra un islote reagregado de 6 días formado en un divot de micro-molde que ha sido teñido para insulina (verde) y proinsulina (rojo) . Este islote es de 45 x 54 µp? de diámetro (medido en las direcciones X e Y) .

La FIG. 23 es una gráfica que representa la secreción de insulina en tres tipos de islote expuestos a condiciones diferentes de glucosa. Los islotes pequeños nativos e islotes reagregados en divots de micro-molde fueron expuestos a condiciones de baja glucosa (3 mM) ; la insulina secretada en el medio fue recolectada y cuantificada como se indica por el eje Y. Los islotes pequeños nativos, islotes grandes nativos e islotes reagregados en divots de micro-molde fueron expuestos a condiciones de alta glucosa (20 mM) la insulina secretada en el medio fue recolectada y cuantificada como se indica por el eje Y.

La FIG. 24 es un diagrama de flujo esquemático que ilustra el método general para utilizar el micro-molde instantáneo para reagregar islotes de tamaño óptimo.

La FIG. 25 es un diagrama de flujo esquemático que ilustra un uso ejemplar del micro-molde instantáneo para pruebas de fármacos de alto rendimiento.

La FIG. 26 muestra islotes reagregados en medio que contiene 2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-l, 3-diazol-4-il) amino] -2-desoxi-D glucosa (2-NBDG; 20 mM) . Los círculos indican la ubicación de los islotes. 2-NBDG, un análogo de glucosa fluorescente, está completamente integrado en cada islote reagregado .

La FIG. 27 muestra un diseño para el sello negativo (hecho de metal o SU- 8) que podría utilizarse para crear los moldes de biopolímeros . El producto final tendría divots similares a los creados en moldes de vidrio.

Las FIGS. 28A y 28B ilustran el diseño de sello negativo que incluye etiquetas para identificar la ubicación de cada divot dentro de un campo de divots en cada micro-molde. Como se muestra en la FIG. 28A, podrían diseñarse diferentes formas para el fondo de divot con más precisión que el método de grabado de vidrio. La FIG. 28B demuestra una porción de un molde de biopolímero final que contiene divots con etiquetas distintivas.

Las FIGS. 29A y 29B comparan dos islotes de aproximadamente el mismo tamaño. La FIG. 29 A es un ejemplo de un islote reagregado esférico. La FIG. 29B representa un islote pequeño nativo. La forma, el tamaño y borde exterior tipo capsular suave son similares para ambos islotes.

Descripción Detallada De La Invención Todas las solicitudes de patentes, patentes, y publicaciones citadas en esta especificación se incorporan por referencia en su totalidad. En el caso de inconsistencias, la presente descripción, incluyendo definiciones, prevalecerá.

Como se utiliza en la presente, el término "islote de Langerhans" o "islote" se refiere a un grupo de células especializadas en el páncreas que producen y secretan hormonas. Un islote generalmente contiene uno o más de los siguientes tipos de células: (1) células alfa que producen glucagón, el cual eleva el nivel de la glucosa (azúcar) en la sangre; (2) células beta que producen insulina; (3) células delta que producen somatostatina la cual inhibe la liberación de numerosas otras hormonas en el cuerpo; (4) péptido pancreático que produce células PP; (5) células DI, las cuales secretan el péptido intestinal vasoactivo; o (6) células EC las cuales segregan secretina, motilina, y sustancia P.

Como se utiliza en la presente, el término "célula de islote" se refiere a cualquiera de las células que se encuentran en un islote. Las células de islote utilizadas en la presente invención preferiblemente son una combinación de células beta productoras de insulina con otros tipos de células de islote.

Como se utiliza en la presente, el término "agrupamiento de células de islote pequeño", o "fragmento de islote" se refiere a una colección de células de islote unidas juntos, generalmente menos de aproximadamente 25 células de islote en el agrupamiento. El agrupamiento de células de islote pequeño preferiblemente tiene una morfología de modo que la barrera difusional de cualquier célula dentro del agrupamiento (por ejemplo, para nutrientes, oxígeno, glucosa, etc.) no es más de aproximadamente 7 células. Normalmente, la barrera difusional es menor de aproximadamente 5 células, y puede ser tan baja como 4, 3 o 2 células. El "agrupamiento de células de islote pequeño" preferiblemente comprende células beta como el tipo de célula predominante y opcionalmente puede incluir uno o más tipos de células de islote. Los agrupamientos de células de islote pequeño pueden tener una variedad de formas (por ejemplo, ser generalmente esféricos, alargado, o de lo contrario asimétricos) . Se muestran ejemplos de agrupamientos de células de islote pequeño en las FIGS. 5 y 6(A), 6(B), y 6 (C) . Los "agrupamientos de células de islote pequeño" preferiblemente se derivan por dispersión de islotes grandes intactos aislados de un páncreas donante.

Como se utiliza en la presente, el término "islote nativo" se refiere a islotes derivados de un páncreas animal. Los islotes nativos pueden ser caracterizados como "islotes grandes nativos" que tienen un diámetro mayor de 125 µp?, preferiblemente mayor de 150 µ?a, o "islotes pequeños nativos" que tienen un diámetro de menos de 125 µt?.

Como se utiliza en la presente, el término "mega-islote" se refiere a un islote reagregado que tiene un diámetro mayor de aproximadamente 300 µ?t?.

Como se utiliza en la presente, el término "islote intacto adulto" se refiere a un islote grande nativo o un islote pequeño nativo derivado de un páncreas de mamífero adulto, en donde el islote no se ha separado.

Como se utiliza en la presente, el término "células de islote dispersadas" se refiere a una suspensión de células, derivadas preferiblemente por interrumpir islotes grandes de modo que las células de islote se distribuyen uniformemente en suspensión. Preferiblemente, no menos del 90% de células de islote en suspensión son células únicas, el resto comprende dobletes (dos células unidas juntas) y tripletes (tres células unidas juntas) , y muy pocos grupos grandes de células unidas entre sí.

Como se utiliza en la presente, el término "islote reagregado" se refiere a una colección de células de islote unidas juntas, preferiblemente derivadas por romper islotes grandes en las células de islote únicas y cultivar las células de islote únicas juntas en grupos para formar islotes. Preferiblemente, la reagregación de células de islote únicas en islotes está influenciada por las dimensiones físicas de los divots en el micro-molde. El número de células de islote individuales utilizadas para formar un islote reagregado depende del tamaño deseado del producto de islote.

Como se utiliza en la presente, el término "barrera de difusión" se refiere a la inhibición del movimiento de la molécula de un área de alta concentración (por ejemplo, concentración de oxígeno o glucosa fuera de una célula) a un área de baja concentración (por ejemplo, concentración de oxígeno o glucosa dentro de una célulal) . Los islotes grandes presentan barreras de difusión relativamente altas a oxígeno, lo que limita su viabilidad y utilidad de trasplante. Los islotes reagregados en micro-moldes son pequeños en relación con los islotes grandes nativos, y exhiben una barrera de difusión relativamente baja, lo que contribuye a la viabilidad celular dentro de los islotes reagregados.

Como se utiliza en la presente, el término "viabilidad celular" se refiere a una medida de la cantidad de las células que están vivas o muertas, con base en una muestra de la célula total. La alta viabilidad celular, tal como se define en la presente, se refiere a una población celular en la que más de 85% de todas las células son viables, preferiblemente más de 90-95%, y más preferiblemente una población caracterizada por alta viabilidad celular contiene más de 99% de células viables.

Como se utiliza en la presente, los materiales que son destinados a entrar en contacto con tejidos o fluidos biológicos (tales como por implante o trasplante en un sujeto) se denominan "biomateriales" . Es deseable que los biomateriales induzcan reacciones mínimas entre el material y el ambiente fisiológico. Los biomateriales son considerados "biocompatibles" si, después de ser colocados en el ambiente fisiológico, hay reacción inflamatoria mínima, no hay evidencia de reacción anafiláctica, y mínimo crecimiento celular sobre la superficie del biomaterial. En el implante en un mamífero huésped, un biomaterial biocompatible no provocar una respuesta del huésped suficiente para afectar negativamente la función de la microcápsula; tales respuestas del huésped incluyen formación de estructuras fibróticas en o alrededor del biomaterial, rechazo inmunológico del biomaterial o liberación de compuestos tóxicos o pirógenos desde el biomaterial en el tejido de huésped circundante.

Como se utiliza en la presente, el término "grabado" se refiere a un proceso químico usando ácido para crear divots en un sustrato.

Como se utiliza en la presente, el término "divot" significa una cavidad o cámara localizada en un sustrato que comprende un fondo y una pared lateral (es decir, un espacio ahuecado, que tiene anchura y profundidad) . En una modalidad, para la reagregación de islotes un divot es menor de 100 µp? de diámetro y 60 pm de profundidad. Por ejemplo, el divot podría ser de 80 µp\ de diámetro y 48 µp? de profundidad. En otras modalidades donde uno desea islotes reagregados, los divots están entre 80-120 µp? de diámetro y 48-72 m de profundidad. Para otros propósitos, tal como el crecimiento de mini-tumores para pruebas de fármacos, el diámetro de divot óptimo estaría entre 100 y 200 µ?? de diámetro y 60 a 100 µp??ß profundidad.

Como se utiliza en la presente, el término "sustrato de divot" se refiere a un soporte sólido o cualquier material que se ha modificado para contener divots individuales discretos.

Como se utiliza en la presente, el término "micro-molde" se refiere a un dispositivo que contiene una superficie comprendida de una pluralidad de divots, en donde los divots miden entre 100 y 200 µp? de diámetro. El patrón físico de divots en el micro-molde puede ser especificado por el fabricante del micro-molde. El micro-molde preferiblemente comprende dos partes principales, i) el sustrato de divot y ii) un sistema para alojar el sustrato de divot y contener células y medios en este. El micro-molde se utiliza para guiar o determinar el crecimiento o la reagregación de las células colocadas en este.

Como se utiliza en la presente, el término "alojamiento de molde" se refiere a la estructura para contener tanto el sustrato de divot como cualquier líquido y materiales celulares agregados a este.

Como se utiliza en la presente, el término "andamiaje de alojamiento" se refiere a una estructura temporal que se utiliza para apoyar e influir en la forma de los materiales durante la construcción del micro-molde.

Como se utiliza en la presente, el término "pulverización catódica" significa un método de deposición de vapor utilizado para depositar un revestimiento de película delgada sobre un sustrato.

B. Células de Islote Unidas como un Multicapa En una modalidad, la presente invención se dirige a un método para producir células de islote individuales viables o agrupamientos de células de islote pequeño para el implante. En un aspecto, las células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño aislados de páncreas de donantes no fetales se unen en una multicapa a la superficie de un andamiaje de biomaterial adecuado.

En un aspecto, las células de islote individuales, preferiblemente las células beta, se unen n el andamiaje de biomaterial. En otro aspecto, una combinación de varios tipos de células de islote se une al andamiaje de biomaterial. En aún otro aspecto, los agrupamientos de células de islote pequeño comprendidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez células se unen al andamiaje de biomaterial .

En todavía otra modalidad, una multicapa de uno a dos, tres, cuatro o cinco capas de células de islote se unen al andamiaje de biomaterial. Las células de islote y agrupamientos de células de islote pequeño en el andamiaje de biomaterial forman una multicapa de células de aproximadamente 10 a 50 µp? de espesor, más preferiblemente aproximadamente 20 a 40 µp? de espesor.

En un aspecto, la multicapa de células de islote preferiblemente tiene un espesor sustancialmente uniforme de modo que el espesor de la célula varía por no más de 1-2 células a través de la superficie del andamiaje de biomaterial .

En un aspecto, la células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño son aislados directamente desde el páncreas del sujeto adulto donante y separados de islotes intactos. Los métodos adecuados para dividir los islotes en células únicas y/o agrupamientos de células de islote pequeño incluyen la digestión enzimática y dispersión basada en metal (agotamiento de calcio) o una combinación de los mismos.

En otro aspecto, el andamiaje de biomaterial está comprendido de un material que proporciona adherencia adecuada de células de islote individuales o agrupamiento de células de islote pequeño al andamiaje. Se prevé que varios tipos de materiales, incluyendo los materiales inorgánicos y orgánicos, pueden utilizarse como el andamiaje de biomaterial de la presente invención. Los ejemplos no limitantes de estos materiales incluyen poli (ortoésteres) , poli (anhídridos) , poli (fosfoésteres) , poli (fosfacenos) , y otros. Otros materiales no limitantes incluyen, por ejemplo, polisacáridos, poliésteres (tales como poli (ácido láctico), poli (L-lisina) , poli (ácido glicólico) y poli (ácido láctico-co-glicólico) ) , poli (ácido láctico-co-lisina) , poli (ácido láctico- inj erto-lisina) , polianhídridos (tales como poli(dímero de ácido graso), poli (ácido fumárico) , poli (ácido sebácico) , poli (carboxifenoxi propano) , poli (carboxifenoxi hexano) , copolímeros de estos monómeros y similares) , poli (anhídrido-co-itnidas) , poli (amidas ) , poli (orto ásteres), poli (iminocarbonatos) , poli (uretanos) , poli (organofasfacenos) , poli (fosfatos) , poli (acetato de etilenvinilo) y otros acetatos de celulosa sustituidos con acilo y derivados de los mismos, poli (caprolactona) , poli (carbonates) , poli (aminoácidos) , poli (acrilatos) , poliacetales, poli (cianoacrilatos) , poli (estírenos) , poli (cloruro de vinilo), poli (fluoruro de vinilo), poli (vinil imidazol) , poliolefinas clorosulfonadas , óxido de polietileno, copolímeros, poliestireno, y mezclas o copolímeros de los mismos). En ciertos aspectos preferidos, los biomateriales incluyen polisacáridos , alginato, hidroxipropil celulosa (HPC) , Nisopropilacrilamida ( IPA) , polietilenglicol, alcohol polivinílico (PVA) , polietilenimina, quitosan (CS) , quitina, sulfato de dextrano, heparina, sulfato de condroitina, gelatina, etc., y sus derivados, copolímeros, y mezclas de los mismos. Otros biomateriales adecuados incluyen los nilón, hialuronan, politetrafluoroetileno, polivinil formamida, y otros descritos en Vats et al., Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications, Clin. Otolaryngol. Allied Sci. 28(3): 165-72 (2003); Wang et al., An encapsulation system for the immunoisolation of pancreatic islets, Nat. Biotechnol . 15(4): 358-62 (1997); Orive et al., Cell encapsulation: promise and progress, Nat. Med. 9(1): 104-7 (2003) , que se incorporan por referencia.

En aspectos preferidos, el andamiaje de biomaterial está comprendido de un material biodegradable . Los biomateriales biodegradables adecuados incluyen poli (DL-láctido-co-glicólido) (PLO) , ácido poliláctico (PLA) o poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) . PLG es un polímero bien estudiado para el suministro de fármacos y está aprobado por la FDA para un número de aplicaciones in vivo. Ver Berkland et al., Fabrication of PLG microspheres with precisely controlled and monodisperse size distributions, J. Control. Liberación Mayo 18, 73(l):59-74 (2001), que se incorpora por referencia.

En otro aspecto, el andamiaje de biomaterial está revestido en su totalidad o en parte con un revestimiento que aumenta la adhesión de islotes y células beta. Los revestimientos ejemplares incluyen fibronectina, acetato de polietilenglicol, laminina, alcohol polivinílico (PVA) y ácido polietilen-alt-maleico (PEMA) , y quitosan (CS) .

El andamiaje también puede tener una o más moléculas de adhesión de células de islote (CAMs, por sus siglas en inglés) unidas a este para facilitar la unión de células únicas y/o agrupamiento de células de islote pequeño al andamiaje. En otras aplicaciones, las CAMs han demostrado previamente que facilitan la unión celular al polímero para modificar el tejido (Dunehoo et al., Cell adhesión molecules for targeted drug delivery, J. Pharm. Sci. 95: 1856-1872 (2006)). Las moléculas de adhesión celular (CAMs, por sus siglas en inglés) incluyen, pero no se limitan a integrinas (por ejemplo, avb3, avb5, LFA-1, VLA-4) , caderinas (por ejemplo, E-, P-, y N-caderinas) , selectinas (por ejemplo, E-, L-, y P-selectinas) , la superfamilia de inmunoglobulinas (por ejemplo, ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, y MadCAM-1) , proteínas de matriz extracelular (por ejemplo, fibronectina, vitronectina, fibrinógeno, colágeno, laminina, y factor de von Willebrand) , péptidos de adhesión celular lineales y cíclicos y peptidomiméticos que se derivan de los péptidos RGD, péptidos de ICAM-1, péptidos de VCAM-1, péptidos de caderina, y péptidos de LFA-1. Las CAMs son moléculas esenciales para la regeneración de los tejidos, morfología celular, locomoción, mitosis, citocinesis, fagocitosis, y el mantenimiento de la polaridad de la célula. Las CAMs son glicoproteínas que se encuentran en la superficie celular que actúan como receptores para la adhesión de célula a célula y célula a matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) . Se ha demostrado previamente que las moléculas de adhesión celular tales como péptidos de RGD pueden ayudar en el proceso de modificación de tejidos, regeneración de tejido, cicatrización de heridas, cirugía reconstructiva, regeneración neural, injertos óseos, y trasplante de órganos. Además, la E-Caderina ha demostrado ser importante en la adhesión de células ß (Hauge-Evans et al., Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MINE pseudoislets, Diabetes, 48: 1402-1408 (1999)). En un aspecto, las moléculas de adhesión celular se anclan en el polímero usando unos enlaces covalentes, incluyendo pero no limitado a un enlace peptídico, de tioéter, de disulfuro, o de éster. Puede añadirse una molécula espadadora entre la molécula de adhesión celular y el polímero para permitir las libres interacciones entre las moléculas de adhesión en el polímero y los receptores de adhesión de células en la superficie celular. Los estudios en diferentes células unidas al polímero tachonadas con péptido de RGD han mostrado que el espaciador óptimo entre el polímero y el péptido de RGD es alrededor de 11-46 angstroms para el reconocimiento óptimo de los péptidos de RGD por los receptores de superficie celular. El espaciador puede ser hecho de, pero no limitado a, polietilen glicoles (PEGS) , poli aminoácidos (por ejemplo, poli-Gly, poli-Lys, poli-Ala) , poli aminoácidos caproicos (poli-Aca) , y combinación de dos o tres repeticiones de aminoácidos (por ejemplo, poli-Aca-Gly) . Además del enlace covalente, las moléculas de adhesión celular pueden ser adsorbidas uniendo primero la molécula de adhesión celular que puede ser adsorbida en la red polimérica del parche (por ejemplo, electrostáticamente, hidrofóbicamente , o por otras interacciones no covalentes) , sobre los polímeros antes de la unión a las células de islote.

En otro aspecto, el andamiaje de biomaterial tiene una forma que facilita la unión de las células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño a su superficie. El andamiaje típicamente tiene una superficie sustancialmente plana, tal como en un parche o un disco. En la modalidad preferida, el andamiaje de biomaterial comprende un material de parche flexible sustancialmente plano.

El andamiaje de biomaterial tiene un tamaño adecuado para la unión de células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño. Por ejemplo, en un aspecto, el parche plano típicamente tiene dimensiones del orden de aproximadamente 0.2 a 3 centímetros. El espesor del parche típicamente está en el orden de aproximadamente 50 pm a 1 centímetro.

En todavía otro aspecto, el andamiaje de biomaterial puede liberar de manera controlable uno o más factores de crecimiento, agentes inmunosupresores , antibióticos, antioxidantes, anti-citocinas , anti endotoxinas, bloqueadores de adhesión de células T, factores de angiogénesis , nutrientes, o combinaciones de los mismos.

Los factores de crecimiento ejemplares incluyen, epirregulina, factor de crecimiento epidérmico ("EGF", por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento de células endoteliales ("ECGF", por sus siglas en inglés), factor de crecimiento de fibroblastos ("FGF", por sus siglas en inglés), factor de crecimiento de nervios ( "NGF" , por sus siglas en inglés), factor inhibidor de leucemia ("LIF", por sus siglas en inglés) , y proteína-4 morfogenética de hueso ("BMP-4, por sus siglas en inglés"), factor de crecimiento de hepatocitos ("HGF", por sus siglas en inglés), factor-A de crecimiento vascular endotelial ("VEGF-A", por sus siglas en inglés), factor de crecimiento tipo insulina, y aún insulina. Ver generalmente Miao et al., In vifcro and in vivo improvement of islet survival following treatment with nerve growth factor, Transplantation Feb 27; 81 (4) : 519-24 (2006); Ta et al., The defined combination of growth factors controls generation of long-term replicating islet progenitor-like cells from cultures of adult mouse páncreas, Stem Cells, Mar 23 (2006) ; Johannson, Islet endothelial cells and pancreatic beta-cell proliferation: studies in vitro and during pregnancy in adult rats, Endocrinology May; 147(5) :23 15-24 (2006), Epub Jan 26 (2006); Kuntz et al., Effect of epiregulin on pancreatic beta cell growth and insulin secretion, Growth Factors Dec 23(4):285-93 (2005); Vasadava, Growth factors and beta cell replication, Int. J. Biochem. Cell Biol. 38 (5-6) : 931-50 (2006), Epub Aug 31 Review (2005); Kuntz et al., Cholecystokinin octapeptide: a potential growth factor for pancreatic beta cells in diabetic rats, JOP, Nov 10; 5(6) :464-75 (2004) .

Los agentes inmunosupresores ejemplares son bien conocidos y pueden ser esteroides o no esteroides. Los agentes esteroides preferidos son prednisona. Los agentes no esteroides preferidos incluyen aquellos en el llamado Protocolo de Edmonton: sirolimus (Rapamune, Wyeth-Ayerst Canadá), tacrolimus (Prograf, Fujisawa Canadá), y anti_IL2R daclizumab (Zenapax, Roche Canadá) . Otros agentes inmunosupresores incluyen 15-desoxiespergualina, ciclosporina, rapamicina, Rapamune (sirolimus/rapamicina) , FK506, o Lisofilina (LSF) .

Los antibióticos ejemplares útiles para la práctica de esta invención incluyen pero no están limitados a amoxicilina, penicilina, fármacos sulfa, eritromicina, estreptomicina, tetraciclina, claritromicina, ciproflozacina, terconazol, azitromicina, y similares.

Varios antioxidantes son conocidos por aquellos expertos en el arte. Particularmente preferidas son las moléculas que incluyen grupos tiol tal como glutationa reducida (GSH, por sus siglas en inglés) o sus precursores, glutationa o análogos de glutationa, monoéster de glutationa y N-acetilcisteína . Otros antioxidantes adecuados incluyen la superóxido dismutasa, catalasa, vitamina E, Trolox, ácido lipoico, lazaroides, hidroxianisol butilado (BHA) , vitamina K, y similares. La glutationa, por ejemplo, puede utilizarse en un intervalo de concentración de aproximadamente 2 a 10 mM. Ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 5,710,172; 5,696,109; y 5,670,545.

Las anti-citocinas adecuadas son bien conocidas en el arte e incluyen dimetiltiourea (aproximadamente 10 mM) , citiolona (aproximadamente 5 mM) , pravastatina sódica (PRAVACHOL, aproximadamente 20 mg/kg) , L-NG-monometilarginina (L-NMMA, 2 mM) , lactoferrina (aproximadamente 100 g/ml), 4-metilprednisolona (aproximadamente 20 \iq/ml) y similares.

Las anti endotoxinas también son conocidas en el arte e incluyen L-NG-monometilarginina (L-NMMA, aproximadamente 2 mM) , lactoferrina (aproximadamente 100 ug/ml) , N-acetilcisteína (NAC, aproximadamente 1 mM) , antagonistas del receptor de adenosina tales como compuestos de bamifilina (teofilina) , y anti-lipopolisacáridos tal como equinomicina (aproximadamente 10 nM) , y similares.

En otro aspecto, un bloqueador de adhesión de células T se proporciona a los biopolímeros implantados que contienen células de islote para suprimir la reacción inmunológica. Además estos bloqueadores previenen el rechazo del trasplante de islotes. Los bloqueadores de adhesión de células T han demostrado que suprimen la activación de células T y la respuesta inmunológica en el trasplante de órganos y enfermedades autoinmunológicas (ver Yusuf-Makagiansar et al., inhibition of LFA-l/ICAM-1 and VLA-4/VCAM-l as a therapeutic approach to infla ation and autoimmune diseases, Medicinal Chemistry Reviews 22, 146-167 (2002) ; Anderson and Siahaan, Targeting ICAM-l/LFA-1 interaction for controlling autoimmune diseases: Designing peptide and small molecule inhibitors, Peptides 24, 487-501 (2003)). Los bloqueadores de adhesión de células T incluyen pero no están limitados a (a) anticuerpos monoclonales ICAM-1, LFA-1, B7, CD28, CD2 , y VLA-4, (b) proteína soluble y sus fragmentos tales como ICAM-1, VCAM-1, MadCAM-1, (c) péptidos de RGD y peptidomiméticos , (d) péptidos de VCAM-1 y peptidomiméticos , (e) péptidos de ICAM-1 y peptidomiméticos, y (f) péptidos de LFA-1 y peptidomiméticos. Además, los péptidos (por ejemplo GAD208-217) derivados de ácido glutámico decarboxilasa 65 (GAD65) y el inhibidor de péptido bifuncional de GAD (GAD-BPI) han demostrado que inducen la immunotolerancia y suprimen la infiltración de islote por las células T (insulitis) . GAD208-2i7 ha demostrado que bloquea la activación de las células T que atacan a las células beta en ratones con diabetes no obesos (NOD) modulando la formación de complejo TCR-MHC-Ag (señal 1) durante la interacción de células T:APC (Tisch et al., Induction of GAD65-specific regulatory T-cells inhibits ongoing autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice, Diabetes 47: 894-899 (1998)). El GAD-BPI preferido comprende GAD208-217 enlazado a una porción del péptido LFA-1 (secuencia EIAPVFVLLE- [Ac-G-Ac-G-Ac] - ITDGEATDSG) , y se ha demostrado que bloquea la activación de células T e insulitis en ratones NOD como se describe en Murray et al., Patente de Estados Unidos Publicada No. 2005/0107585 titulada "Signal-l/signal-2 bifunctional peptide inhibitors", que se incorpora por referencia. Así, estas moléculas pueden ser co-administradas para prevenir el rechazo del trasplante de islote. Estas moléculas también' pueden administrarse a través de mecanismos de liberación controlada para prevenir el rechazo del trasplante de islote. Así, las moléculas pueden quedar atrapadas dentro del andamiaje de biomaterial antes de que las células beta sean unidas al andamiaje.

La liberación controlada de estos agentes puede realizarse usando los protocolos descritos en Raman et al., Modeling small-molecule reléase from PLG icrospheres : effects of poly er degradation and nonuniform drug distribution, J. Control. Reléase. Mar 2; 103 (1) : 149-58 (2005); Berkland et al., Precise control of PLG microsphere size provides enhanced control of drug reléase rate, J. Control. Reléase. Jul 18; 82(1): 137-47 (2002); Schwendeman, Recent advances in the stabilization of proteins encapsulated in injectable PLGA delivery systems, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 19(1): 73-98 (2002); Sershen et al., Implantable, polymeric systems for modulated drug delivery, Adv. Drug Deliv. Rev. 5;54(9): 1225-1235 (2002), todas las cuales se incorporan para referencia.

C. Producción de Islotes en Micro-moldes de Divot La presente invención está dirigida también a un método para la producción in vitro de islotes pequeños viables. En un aspecto, las células de islote dispersadas aisladas de pancreasas donantes no fetales se colocan en grupos en divots individuales de un micro-molde y se cultivan para formar islotes reagregados cuya forma y tamaño son influenciados por las dimensiones del divot.

Los divots del micro-molde tienen un tamaño adecuado para la formación de islotes pequeños. Por ejemplo, en un aspecto, el micro-molde normalmente tiene dimensiones del orden de aproximadamente 30-35 mm de diámetro, pero este tamaño no está limitado por los métodos de producción y podría ser aumentado hasta 30 x 30 cm. Los divots típicamente tienen dimensiones del orden de aproximadamente 100-200 µ?p (+20%) de diámetro y 60-100 µt?. (+20%) de profundidad. Preferiblemente, para la producción de islotes los divots son de 100 µ?? (± 20%) de diámetro y 60 µp? (± 20%) de profundidad.

En otro aspecto, el micro-molde puede utilizarse para generar poblaciones de islotes óptimamente conformados y dimensionados adecuados para el trasplante o estudio in vitro. Por ejemplo, en un aspecto, la población de islotes generados en micro-moldes tiene un diámetro medio de 50 ino menos. En otros aspectos, la población se caracteriza por al menos 85% de células viables, preferiblemente más de 90% o 95% de células viables, más preferiblemente la población se caracteriza por más de 99% de células viables.

En todavía otro aspecto, la población de islotes generados en micro-moldes puede ser caracterizada por altos niveles de secreción de insulina. Por ejemplo, los islotes pequeños reagregados en micro-moldes se caracterizan por mayores niveles de secreción de insulina con relación a los islotes pequeños nativos, preferiblemente mayores de 20 veces más la secreción de insulina, más preferiblemente mayores de 100 veces más la secreción de insulina. Por ejemplo, los islotes reagregados miden la secreción de aproximadamente 10 ng/lE, mostrado en la Figura 23. Esto es 41 veces mayor que el mejor valor calculado de Crim et al., 2010. Una dificultad en la comparación de datos de la secreción de insulina entre laboratorios es que muchos investigadores no informan la secreción de insulina por volumen del islote. En el caso de Crim et al, reportaron la secreción de insulina por 50 islotes, pero no indicaron el tamaño promedio de los islotes. Así, uno puede solamente asumir que sus 50 islotes fueron cada uno equivalente al volumen de islote previamente definido de la equivalencia de 1 islote (IE) . Nuestro laboratorio siempre reporta la secreción de insulina normalizada para el volumen total de islotes y células dividiendo por el IE . Con la suposición hecha por el documento de Crim, los islotes reagregados descritos aquí liberan más de 40 veces más insulina en respuesta a la glucosa alta que las mejores condiciones reportadas por Crim et al .

En una modalidad de la presente invención, el micro-molde se utilizará para crear células útiles para pruebas in vitro y otras aplicaciones in vitro. En esta modalidad, la superficie de micro-molde preferiblemente está hecha de cristal con los lados del molde (el sistema de alojamiento) hechos de PDMS.

En otra modalidad, el micro-molde es creado para ser implantable y se haría de material bio-compatible . En esta modalidad, los materiales preferibles son cualquier número de biopolímeros que se han descrito anteriormente.

En otro aspecto, los divots de micro-molde están diseñados para proporcionar condiciones de reformación física óptimas para las células no de islote. Se prevé que se pueden formar varios tipos de células en los divots de la presente invención. Los ejemplos no limitantes incluyen, trayectorias neuronales largas, filtros tipo glomerulares , vasos, alvéolos de reemplazo, etc.. La agregación de células madre o células reprogramadas en una forma pequeña, bien definida, tal como el micro-molde, también sería un uso apropiado de esta invención. Los tipos de células preferibles incluyen aquellos en los cuales es importante para la función de la célula una estructura 3-D.

En general, la FIG. 24 es un esquema que muestra el método de la presente invención. Los agrupamientos de islote grande nativo, tomados de un páncreas u otra fuente de islote, son desembolsados en células de islote únicas y cargados en un micro-molde con divots. Por "células dispersadas" se entiende que la mayoría (típicamente al menos 90%) de las células son células únicas, con una menor proporción de células unidas conjuntamente como dobletes o tripletes . Las células dispersadas se colocan en el micro-molde de manera que conduce a que grupos de las células dispersadas se asienten cada divot . Preferiblemente, 30-150 células se asientan en cada divot.

El Ejemplo 5 describe un método preferido para dispersar islotes en células únicas e incubación de las células en micro-moldes. Preferiblemente, la disociación es en una mezcla de medios formulada en el Laboratorio de Investigación de Diabetes del Reino Unido. Esta mezcla incluye nueve partes de Solución Salina Equilibrada de hank libre de calcio y magnesio y una parte de papaína (50 unidades/ml) . En contraste, la mayoría de la disociación de islote se realiza usando tripsina o enzimas distintas de la papaína. La disociación se lleva a cabo a 21°C, con rotación. Finalmente los islotes se dispersan en células únicas manualmente pipeteándolas y observándolas con un hemocitómetro hasta que al menos el 90% de las células se separan en células únicas. El Ejemplo 5 también describe condiciones preferibles para la reagregación de las células de islote dentro de los micro-moldes. En general, las células permanecen como células únicas o grupos libremente unidos de células hasta el día dos como se indica en la FIG. 14. Sin embargo, por día, cinco o seis de las mismas células en el divot se han reorganizado en una estructura 3D que a menudo es esférica (para ejemplos ver FIG. 18-19A y 21) . Normalmente por el día cinco los islotes reagregados pueden soportar la remoción de los moldes y funcionar como islotes independientes .

Durante este período de tiempo, las células toman la forma tridimensional de un islote nativo. El diámetro medio de los islotes formados en los divots es menor de 50 \xm. El Ejemplo 5 describe la naturaleza morfológica de los islotes pequeños formados en los micro-moldes.

En una modalidad de la presente invención, las células dispersadas en baja concentración pueden agregarse al micro-molde, de modo que tan pocas como dos o tres células caen en cada divot, y de modo que las células dentro de los divots son capaces de crecer y dividirse. La forma y el tamaño de la masa celular que crece en un divot de esta serían influenciados por las dimensiones físicas del divot. Preferiblemente, los micro-moldes se cargan con las células de islote, se concentran de modo que tan pocas como dos o tres células de islote ocuparían cada divot, en donde las células de islote crecerán y se agregarán conjuntamente para formar islotes pequeños de formulario, preferiblemente de 30-40 µ?? de diámetro.

En otra modalidad de la presente invención, uno puede desear incorporar productos químicos o moléculas biológicas en los islotes modificados genéticamente en el momento de la reagregación. Estas moléculas incluyen factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, DMARDs (fármacos antirreumáticos que modifican la enfermedad) , antiinflamatorios y antibióticos. Las moléculas o dispositivos en miniatura para aumentar la tensión de oxígeno en el sitio de trasplante podrían incorporarse en los islotes reagregados, especialmente si fuera utilizado un sustrato de micro-molde implantable. Otras clases no limitantes de moléculas que podrían añadirse en el momento de la reagregación incluyen fármacos para inducir la liberación de insulina, pequeñas moléculas, péptidos, proteínas, anticuerpos (por ejemplo, contra CDlla, CDllb, CDllc, CD18) , y ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN o ARN) .

Tales moléculas podrían incorporarse normalmente en los islotes en el momento de la carga en los micro-moldes. Las moléculas se añadirían al medio con las células dispersadas de modo que serían ya sea absorbidas por las células o adheridas a las células durante la agregación. Alternativamente, las células podrían ser modificadas antes de la reagregación vía métodos de transfección estándares que resultarían en la producción incrementada o disminuida de la proteína objetivo del usuario. Después de la formación de los reagregados, los islotes recién formados podrían ser encapsulados con biopolímeros que portarían químicos tales como inmunosupresores u otras moléculas de interés tales como factores de crecimiento. Alternativamente, con micro-moldes implantables, los moldes podrían ser impregnados con la molécula de elección.

El método de la presente invención puede diseñarse para formar agregados de células para trasplante subsecuente o para pruebas de fármaco o dispositivo. El Ejemplo 5 describe métodos preferibles para reagregar células para transplante y selección de fármacos y métodos preferibles para hacerlo.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida también a un método para la selección de alto rendimiento de fármacos, productos químicos, u otras moléculas pequeñas. Se prevé que el patrón y las dimensiones de los divots en el presente micro-molde pueden diseñarse para adaptarse a las intervenciones individuales en cada divot .

En otro aspecto, los micro-moldes de divot se generan desde un biopolímero adecuado para el trasplante en un huésped animal . Imaginamos que las células reagregadas en un micro-molde implantable pueden o no pueden adherirse al sustrato de divot. Para trabajos in vitro, una superficie de sustrato no adherente, tal como vidrio, es preferible. Sin embargo, para moldes implantables, o parches de biopolimeros, los substratos adherentes aumentarían la eficacia del proceso de trasplante con pérdida disminuida de islotes durante y después del trasplante. La adherencia de las células a los biopolimeros ha sido probada y se describe en la Tabla 1 y FIG. 8.

Los aspectos adicionales de la invención, junto con las ventajas y nuevas características correspondientes a las mismos, se describirán en parte en la descripción y ejemplos los cuales siguen, y en parte llegarán a ser evidentes por aquellos expertos en el arte en el examen de los siguientes, o pueden ser apendidos de la práctica de la invención. Los objetos y ventajas de la invención pueden ser realizados y alcanzados por medio de los instrumentos y las combinaciones particularmente señaladas en las reivindicaciones anexas .

EJEMPLO 1: El Tamaño del Islote Impacta a la Viabilidad y Éxito del Trasplante Este ejemplo investigó cómo el tamaño del islote afectó el éxito del trasplante en ratas.

En este ejemplo, se describen las técnicas para aislar islotes, y se midió la viabilidad celular. Ambos islotes grandes (mayores de 125 µp\) e islotes pequeños (menores de 125 pm) fueron trasplantados con el fin de evaluar el efecto del tamaño del islote en el éxito del trasplante. Como se discute a continuación, los islotes pequeños de rata son superiores a los islotes grandes en la función in vi ro y en los resultados del trasplante in vivo. Estos experimentos también se describen en MacGregor et al., Small rat islets are superior to large islets in in vitro function and in transplantation outcomes, Am. J. Physiol . Endocrinol. Metab. May; 290 (5) : E771-9 (2006), la cual se incorpora para referencia en su totalidad.

Aislamiento de islote de rata Para aislar islotes grandes y pequeños, adulto ratas DA macho adultas fueron anestesiadas por inyección intraperitoneal de una mezcla de cetamina y xilazina. La cavidad peritoneal fue expuesta y se sujetó la conexión ductal pancreática en el intestino. El páncreas fue canulado In Situ vía el conducto biliar común, y distendido bombeando una solución fría de colagenasa en el conducto. La colagenasa (CLS-1, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ) fue disuelta en 20 mi de Leibovitz L15 a 450 U/ml . Posteriormente, el páncreas distendido fue extirpado, transferido a tubos de centrífuga de 50 mi, e incubado durante aproximadamente 20-30 minutos con agitación suave en un incubador a 37 °C. Después de la incubación, el tubo se agitó suavemente para desalojar los islotes. Los contenidos del tubo se colocaron en Solución Salina Equilibrada de hank ( "HBSS" , por sus siglas en inglés) enfriada con hielo, diluida que contiene 10% de suero de ternero recién nacido. La digestión se dejó asentarse en 1 x g y el sobrenadante se removió. Se agregó más HBSS/suero y se repitió el proceso. La digestión lavada se pasó a través de una malla de acero inoxidable de 500 mieras y se sedimentó aproximadamente 1 minuto a 300 x g en una centrífuga refrigerada. La pelotilla se mezcló con 10 mL de 1.110 gm/mL de Histopaque (densidad = 1.1085, Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, Missouri) y se centrifugó 10 minutos a 800 x g. Los islotes flotantes en el gradiente se recolectaron y sedimentaron por separado, y luego se colocaron en medio de cultivo de F12 de Ham's que contiene 10% de suero bovino fetal y se colocaron en una cámara de cultivo a 37°C con 5% C02.

Rendimiento Para las mediciones de rendimiento, se examinaron muestras por triplicado de cada lote de islotes, cada una comprendiendo aproximadamente 2% de la fracción del islote. Los islotes individuales fueron contados y sus diámetros se midieron. Para islotes de forma irregular, se tomaron mediciones de 3 a 4 diámetros en diferentes ubicaciones en el islote y se utilizó el promedio. Los volúmenes de islote se calcularon y convirtieron a equivalentes de islote para la muestra y la fracción de islote completa. Los islotes pequeños se definieron como aquellos que tienen un diámetro de menos de aproximadamente 125 ym en comparación con el islote grande con un diámetro de aproximadamente 125 µ?t? o mayor .

Para separar islotes pequeños de islotes grandes, se sedimentaron islotes frescos o islotes cultivados durante la noche y después se colocaron en 1-2 mi de medio L15. Los islotes luego fueron rápidamente estratificados sobre un gradiente de etapa única de 5% BSA en L15. La sedimentación a 1 x g se permitió que ocurriera por un periodo de tiempo empíricamente establecido hasta que los islotes grandes fueron observados en el fondo del tubo. En este punto, se descartaron los dos mililitros superiores (sin BSA) del gradiente, y todos excepto los 2 mi inferiores fueron removidos cuidadosamente para definir la población de islote pequeño. Se combinaron los islotes sedimentados y aquellos en los 2 mililitros inferiores como la fracción de islote grande. Los gradientes se repitieron si fue necesario para optimizar la separación de islotes grandes y pequeños. Las fracciones de islote finales fueron sedimentadas y colocadas en el cultivo en una mezcla 1:1 de F12 de Ham's y RPMI 1640 libre de glucosa (glucosa = 5 mM) hasta que se realizaron los experimentos de sensibilidad a la glucosa.

Viabilidad Para probar la viabilidad, los islotes se colocaron en un volumen de 500 µ? de medio L-15 con fluoróforos vivos/muertos, Sytox (Sondas Moleculares, 1 µ?) y Calceína (Sondas Moleculares, 0.5 µ?) y se incubaron por aproximadamente 15 a 30 minutos a 37°C. Los islotes se enjuagaron con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) que consiste de (en mM) : 137 NaCl, 2.7 KC1, 4.3 Na2HP04 y 1.4 KH2P04, pH 7.4 y se colocaron en la Cámara Attofluor (Sondas Moleculares) en el microscopio confocal Olympus Fluoview 300 alojado en el Laboratorio de Investigación de la Diabetes. Las imágenes fueron adquiridas usando objetivos de 40X o 60X. Todas las imágenes se colectaron dentro de 20 minutos de la remoción de los islotes del medio. Las tres imágenes simultáneas se colectaron para cada islote utilizando láseres de argón y He:Ne y una tercera imagen de campo claro.

Como se muestra en la FIG. 2, los islotes intactos grandes (mayores de 125 µp\) , ya sea humanos o de rata, mantenidos en cultivo típicamente exhiben un porcentaje significativo de células necróticas (12.6%) y apoptóticas (6.3%) después de sólo cuatro días con muerte celular aumentando con el tiempo. Los islotes más pequeños (menores de 125 µt ) exhibieron viabilidad extendida, pero aún mostraron muerte celular precipitada en puntos de tiempo tardíos (más allá de una semana) . La viabilidad de estos islotes pequeños fue seguida por hasta una semana, y se encontró que mantienen altos porcentajes de viabilidad de 99 a 86%. Esto es en comparación con 10 islotes grandes intactos, los cuales tienen niveles de viabilidad que caen por debajo de 50% después de varios días en cultivo. Como se muestra en la FIG. 2, las células de islote individualmente dispersadas mantienen un alto perfil de viabilidad en cultivo similar a los islotes pequeños intactos.

El análisis de vivo/muerto se completó mediante la identificación de los islotes en el campo y rodeando las regiones de interés. La fluorescencia de fondo se sustrajo de todas las imágenes. Los porcentajes de viabilidad se calcularon desarrollando histogramas de tono usando Photoshop (Adobe) desde los campos de interés y calculando los píxeles totales en la tonalidad verde (vivas) y ro o (muertas) . La relación que representa las células vivas, dividida por el área total de islote se calculó como el porcentaje de valor de vivas. Los perímetros y diámetros de islote se calcularon utilizando software Scion de modo que los valores de viabilidad podrían ser clasificados de acuerdo con el tamaño del islote.

Estudios de Trasplante También se investigó el efecto de tamaño de islote en el éxito del trasplante. En los experimentos, se indujo la diabetes en los animales receptores inyectando estreptozotocina (65 mg/kg) por vía intraperitoneal (1 inyección) . Cuando los niveles de glucosa en la sangre son mayores de 250 mg/dl durante tres días consecutivos, las ratas fueron consideradas diabéticas.

Las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital 45 mg/kg. Después de que la rata fue rasurada y limpiada con malez de betadina, se hizo una incisión en la pared del cuerpo en el flanco izquierdo. El riñon fue liberado de la herida, y se hizo una pequeña incisión en la cápsula del riñon. Los islotes grandes o pequeños fueron colocados bajo la cápsula usando una pipeta de poro pequeño. El riñon fue colocado de nuevo en su posición original y la incisión se cerró con sujetadores para heridas. Se administraron inyecciones (2 veces/día) de insulina-zin de carne de bovino/porcino (NPI-1 Iletina I) a los receptores por tres días de post-trasplante de isleto para reducir el estrés de la hiperglucemia en los islotes recién trasplantados.

Se completaron los trasplantes de los islotes de rata grandes o pequeños (n = 10 trasplantes/grupo) . Las ratas DA diabéticas inducidas con estreptozotocina recibieron una masa marginal (1000IE) ya sea de islotes singeneicos grandes (mayores de 150 µ??) o pequeños (menores de 125 µp?) bajo la cápsula de riñon. Los niveles de glucosa en sangre fueron monitoreados durante ocho semanas. Las FIGS. 3(A) y 3(B) mostrar los resultados de los primeros cinco trasplantes para cada grupo. Todos los receptores de islotes grandes permanecieron hiperglucémicos después del trasplante (10 de 10) . En contraste, 8 de 10 receptores de islotes pequeños tuvieron niveles de glucosa en sangre cerca a o en niveles normales 7-10 días después del trasplante, que permaneció normal durante todo el período de ocho semanas.

Los injertos de islote de la cápsula de riñon se remocieron ocho semanas después del trasplante. El tejido fue fijado e immunoetíquetado para la insulina. La FIG. 4 (panel izquierdo) muestra el injerto de un animal que recibió trasplante de islote pequeño y fue euglucémico por ocho semanas. Hubo tinción sustancial para insulina en el injerto. En contraste, La FIG. 4 (panel derecho) el animal que recibió el trasplante de islotes grandes siguió siendo hiperglucémico durante el período de ocho semanas y mostró poco inmunoetíquetado para la insulina en los injertos.

Juntos, los experimentos anteriores muestran que los islotes más pequeños (menos de 125 µt?) fueron superiores a los islotes grandes (más de 125 µp?) en viabilidad, ensayos funcionales in vivo, y en los resultados del trasplante. Además, un páncreas promedio produjo aproximadamente tres veces más islotes pequeños que islotes grandes, y los islotes más pequeños fueron aproximadamente un 20% más viables. Lo más importante, los islotes pequeños fueron muy superiores a las islotes grandes cuando se trasplantaron en animales diabéticos .

EJEMPLO 2: Conversión de Islotes Grandes en Células de Islote Individuales o Agrupamientos de células de islote pequeño Este ejemplo ilustra métodos para fragmentar o dispersar islotes intactos en agrupamientos de células de islote pequeño (tal como el agrupamiento mostrado en la FIG. 5) y las células de islote individuales. El agrupamiento de células de islote pequeño en la Figura 6 (A) f e creado utilizando una digestión enzimática convencional, mientras que el agrupamiento de células de islote pequeño en la FIG. 6(B) se formó con el agotamiento graduado de calcio. Como lo ilustra en la imagen en la FIG. 6A, la dispersión enzimática descompone el islote en agrupamientos de células de islote pequeño, pero no "abre" el agrupamiento para que las células en el interior del agrupamiento tengan una barrera difusional que es de varias células de espesor. En contraste, para agrupamientos de células de islote pequeño formados usando agotamiento de calcio (FIG. 6B) , el agrupamiento tiene una morfología "abierta" de modo que hay una pequeña barrera difusional para cada célula del agrupamiento de células de islote pequeño. Se prevé que una combinación de agotamiento de calcio y digestión enzimática puede también utilizarse para convertir islotes intactos en grupos de células de islote pequeño, que se muestra en la FIG. 6C. a. Digestión Enzimática Diferentes cócteles de enzimas pueden utilizarse para fragmentar islotes intactos en agrupamientos de células de islote pequeño y células de islote individuales. Los métodos de digestión enzimática ejemplares se describen en la Patente de Estados Unidos No. 6,783,954, la cual es incorporada para referencia. En este ejemplo, se utilizaron doce cócteles de enzimas con variados grados de éxito, incluyendo un cóctel que incluyo papaína.

Para aislar islotes pancreáticos, ratas Sprague-Dawley fueron anestesiadas por una inyección intraperitoneal de cetamina y xilazina. La cavidad peritoneal fue expuesta y se sujetó la conexión ductal pancreática al intestino. El páncreas fue canulado In Situ vía el conducto biliar común, y distendido bombeando una solución fría de colagenasa en el conducto. Posteriormente, fue extirpado el páncreas distendido, transferido a tubos de centrífuga, e incubado durante aproximadamente 30 minutos con agitación suave a 37°C. La digestión lavada fue pasada a través de un tamiz y sedimentada en una centrífuga refrigerada. La pelotilla se mezcló con Histopaque (densidad = 1.1085, Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO) y se centrifugó. Los islotes luego fueron colocados en medio de cultivo F12 de Ham que contiene 10% de suero bovino fetal y se colocaron en una cámara de cultivo de 37°C que contiene 5% C02.

El protocolo estándar para el aislamiento de células beta incluyó la incubación de islotes intactos (aislamiento usando técnicas descritas en la presente) en Solución Salina Equilibrada de hanks ("HBSS") con 4.8 mM Hepes. Ver Balamurugan et al., Flexible management of enzy atic digestión improves human islet isolation outcome from sub-optimal donor pancreata. Am. J. Transplant 3(9):113542 (2003). Para la digestión enzimática, unos 9 mi finales de solución salina equilibrada de hanks que contiene 1 mi de papaína (50 unidades/ml) se añadió a los islotes. Los islotes inicialmente se pipetearon suavemente hacia arriba y abajo para asegurar un enjuague completo. Los islotes se dejaron asentar al fondo del tubo y se removió la mayoría del sobrenadante. Los islotes en la enzima se giraron lentamente (aproximadamente 10 rpm) durante aproximadamente 30 minutos a 37°C. En este punto, se formaron agrupamientos de islote pequeño con algunas células dispersadas únicas, se removieron de la solución. Típicamente, las células fueron transferidas a CMRL 1066 o Memphis SMF como el medio de cultivo final.

Las células fueron teñidas con ditiazona para identificar las células beta dentro de los agrupamientos como generalmente se muestra en las FIGS. 5 y 6A (enzima). b. Fragmentación Basada en Metal Los islotes intactos también pueden ser fragmentados en grupos de células de islote pequeño y células de islote individuales utilizando un procedimiento de fragmentación basada en metal. El hallazgo interesante de la fragmentación basada en metal es que los agrupamientos de células de islote pequeño resultantes son menos compactos o tienen una morfología "abierta" . Las moléculas de adhesión celular, tales como E-caderina, mantienen el islote junto, pero requieren metales divalentes para funcionar. Ver Hauge-Evans et al., Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are reguired for integrated responses to nutrient sti uli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets, Diabetes 48(7): 1402-8 (1999). Por consiguiente, el cultivo de islotes en medio libre de calcio durante aproximadamente una hora resulta en un "aflojamiento" y fracturación de la estructura de islote (ver FIG. 6B) en comparación con la utilización de enzimas solas, que produce una estructura de islote más densa (ver FIG. 6A) . Además, después del "aflojamiento" los islotes utilizando agotamiento de calcio, los grumos restantes de células beta son más fácilmente dispersados por enzimas tradicionales (ver FIG. 6C) .

Los detalles de la fragmentación basada en metal son como sigue. Para obtener células de islote individuales y grupos de células de islote pequeño, los islotes estuvieron en Solución Salina Equilibrada de Hanks libre de calcio y magnesio + 4.8 mM Hepes . Después de la incubación a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 30 minutos, las células se pipetearon, se dispersaron en agrupamientos de células de islote pequeño o células únicas. Las células se transfirieron a CMRL 1066 como el medio de cultivo final. Cuando sea necesario, los agrupamientos de células de islote pequeño o células beta se identificaron con ditiazona. Ver Mythili et al., Culture prior to transplantation preserves the ultrastructural integrity of monkey pancreatic islets, J. Electron Microsc. (Tokyo) 52(4): 399-405 (2003).

Como se muestra en la FIG. 6(B), los agrupamientos de células de islote pequeño derivados por agotamiento de calcio solo tuvieron una disposición tubular irregular, que puede ser óptima para perfusión del núcleo del agrupamiento . Además, los agrupamientos derivados de la dispersión basada en metal toman sólo aproximadamente una hora para producir, mientras que el procedimiento de la enzima para la fragmentación puede tomar hasta 48 horas. c. Combinación de la Digestión Enzimática y Dispersión de Metal También se realizaron experimentos utilizando una combinación de digestión enzimática y agotamiento de metal como una técnica de dispersión. Los islotes intactos se enjuagaron con 9 mi de solución salina equilibrada de hank (sin calcio o magnesio) con 4.8 mM Hepes. Los islotes se pipetearon hacia arriba y abajo inicialmente suavemente arriba y abajo para asegurar el enjuague completo. Los islotes se dejaron asentar al fondo del tubo y se removió la mayoría del sobrenadante. Los islotes podrían lavarse repetidamente para remover todo el calcio y magnesio .

Unos 9 mi finales de solución salina equilibrada de Hank libre de calcio y magnesio que contiene 1 mi de papaína (50 unidades/ml) se agregó a los islotes. Los islotes en la enzima se giraron lentamente (10 rpm) durante 30 minutos. En este punto se podrían remover agrupamientos de islote pequeño de la solución. El pipeteo fuerte 2 - 3 veces a una velocidad moderada resultó en células únicas.

Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 1500 rcf, 25°C. Las células únicas se resuspendieron utilizando el medio de cultivo apropiado (dependiendo de los ensayos subsecuentes) . Las células se almacenaron en un incubador a 37°C y 5% C02. Como se muestra en la FIG. 6C, la combinación del método de agotamiento de calcio y enzima resulta en un agrupamiento de células de islote pequeño o células únicas. Además, la combinación fue un protocolo de dispersión general más rápido, pero se debe tener precaución para evitar células sobre-digeridas y dañadas.

En estos experimentos, YO-PRO-1 y yoduro de propidio (Ensayos Apoptóticos Vibrantes, Sondas Moleculares) se utilizaron para determinar las células necróticas y apoptóticas . Para el ensayo, las células se colocaron con PBS en la cámara Attofluor (Sondas Moleculares) en el microscopio confocal de láser Olympus Fluoview 300. Todas las imágenes se recolectaron dentro de 20 minutos de remoción de las células del medio. Se recolectaron tres imágenes simultáneas para cada islote utilizando láseres de argón y He:Ne y una tercera imagen de campo claro. El análisis de vivo/muerto fue completado por identificar las células en el campo utilizando luz transmitida. Las células verdes indican apoptosis, mientras que el amarillo/rojo indica muerte de células necróticas. Las células que carecen de emisión de fluorescencia estuvieron vivas . Las imágenes de fluorescencia fueron superpuestas con la imagen de luz transmitida (gris) .

EJEMPLO 3 : Preparación de Células de Islote Individuales y Agrupamientos de Islote Pequeño sobre un Andamiaje de Biomaterial de Parche Los ejemplos anteriores indican que los agrupamientos de células de islote pequeño e incluso células beta individuales deben representar el área superficial libre más alta lograble para el transporte de oxígeno, glucosa, etc.. Por consiguiente, en este ejemplo, las células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño fueron templadas sobre un material de andamiaje de biomaterial, tal como un parche como generalmente se muestra en la FIG. 7, para formar una multicapa de células de islote .

Selección de Materiales de Andamiaje En este ejemplo, la optimización de varios biomateriales útiles para la preparación de los andamiajes de la presente invención se investigó midiendo la adhesión relativa de las células de islote al biomaterial . Es preferible que el material de andamiaje sea fácil de manejar sin disociar el tejido y el respaldo de biomaterial para habilitar el fácil implante. La Tabla 1 ilustra una amplia variedad de biomateriales los cuales fueron seleccionados para interacciones con las células beta. Varios de estos materiales poseen un historial de uso como implantes.

En un experimento típico, primero se prepararon 1% de soluciones madre de los biomateriales listados. La mayoría de los materiales se disolvieron en agua desionizada a pH neutro. El quitosan requirió un pH menor de aproximadamente 5.5 para disolverse (se utilizó ácido clorhídrico) y otros materiales requirieron solventes orgánicos; por ejemplo Cellform™ en etanol y ácido poli (DL-láctico-co-glicólico) (PLGA) en diclorometano . Los polímeros normalmente solubles en agua (por ejemplo, sulfato de dextrano, alginato, etc.) pueden ser reticulados para formar la matriz de la película. Aproximadamente 25 µ? de cada solución madre se agregaron a tres cavidades individuales en placas de 96 cavidades y se dejaron evaporar o secar en vacío, por consiguiente, depositando una película delgada de biomaterial en el fondo de cada cavidad. El contenido de solvente residual es minúsculo y no indujo toxicidad en las células. Varias proteínas ofrecidas comercialmente promover la adhesión celular en placas de cavidades (por ejemplo, fibronectina, laminina, etc.) fueron pre-seleccionadas para la adhesión celular también.

Una suspensión diluida de células beta se incubó en las placas de 96 cavidades durante la noche y se lavó tres veces para remover las células beta no unidas. La suspensión de células beta fue homogénea y se asumió que alícuotas iguales por cavidad contenían una cantidad similar de las células beta. Todos los conteos celulares se normalizaron a los conteos celulares de las cavidades que no incluían una película de biomaterial. En general, los polímeros levemente hidrofóbicos se desempeñaron bien para adherir células beta (Tabla 1) .

Tabla 1: Adhesión relativa de células beta de biomateriales seleccionados iv = viscosidad inherente La adhesión celular se determinó contando el número de células unidas 24 horas después de colocar en placa el biomaterial y después de tres lavados . Los conteos se normalizaron con el número de células que se unen a un fondo de la cavidad que carece de un biomaterial (ver cavidad vacía, control) utilizando el siguiente cálculo: número de células unidas en la cavidad de interés/número de células en la cavidad vacía. Cada experimento se repitió por triplicado.

En general, los polímeros levemente hidrofóbicos se desempeñaron bien para adherir las células beta. Las micrografías ópticas indicaron que la morfología celular también fue afectada por el biomaterial. Las células beta en quitosan (PM = 100 kDa) exhibieron una superficie redondeada lisa mientras que las células beta en laminina demostraron una morfología difundida y encrespada (ver FIGS. 8A - 8B) . La tinción fluorescente de actina en las células beta en el sustrato de laminina reveló puntos focales de citoesqueleto fuertemente fluorescentes sugiriendo adhesión celular firme.

Preparación de Parche de Células de Islote En este ejemplo, las células de islote se unieron a un parche de andamiaje de biomaterial que comprende PLGA. En los islotes de Langerhans vascularizados , la célula beta promedio es no más de aproximadamente 25 µt? lejos de un vaso sanguíneo. Ver Wayland, Microcirculation in pancreatic function, Microsc. Res. Tech. 37(5-6): 418-33 (1997). Debido a que las células beta son de aproximadamente 10 um de diámetro, se prevé que el espesor de la capa de células de aproximadamente tres células con más precisión imitaría el ambiente de células beta nativas.

En general, los islotes fueron aislados de un páncreas de rata y se dispersaron en células únicas o agrupamientos de células pequeñas como se describió anteriormente. Las células de islote y agrupamientos de células de islote pequeño en medio HBSS (0.5 mi) se agregaron a cada cavidad y se dejaron cultivar sobre el biomaterial durante 3 a 4 horas . Las placas con biopolímeros en las cavidades se giraron en una centrifuga a temperatura ambiente a aproximadamente 3500 rpm durante aproximadamente 10 minutos para ayudar a las células en la unión al biopolímero. La mitad del medio fue removida de cada cavidad, se reemplazó con medio que contiene una célula de islote fresca o suspensión de agrupamiento de células de islote pequeño, y se dejó unir (ya sea por gravedad o por centrifugación) . Esto se repitió tres veces. Los resultados de estos experimentos se muestran en la FIG. 9. Las capas adicionales de células de islote se pueden unir al parche de polímero después de lavados repetidos cuando se empleó el método de centrifugación, en comparación con las células cultivadas en polímeros sin centrifugación. Aproximadamente tres a cinco capas de células permanecieron consistentemente unidas a 50:50 PLGA a 0.58 dL/g (HFIP) o 0.9 dL/g de polímero con cambios repetidos del medio. Para controlar el espesor de la capa de células beta, ya sea el volumen del cultivo celular agregado a cada cavidad y/o el número de alícuotas agregadas a cada cavidad en el ciclo repetido de deposición puede ser controlado .

EJEMPLO 4: Pruebas Proféticas de Células de Islote en Andamiaje de Biomaterial En este ejemplo, los parches de biomaterial que tienen una multicapa de células de islote unida a estos serán investigados adicionalmente . Se realizarán mediciones de viabilidad y ensayos de producción de insulina. Además, se investigará el dispositivo como un dispositivo implantable para el tratamiento de la diabetes.

Mediciones de viabilidad. Se completarán experimentos de apoptosis contra necrosis como anteriormente. El porcentaje de células vivas se calculará por área de sección transversal de las capas de células beta para comparación con islotes nativos en los días 0, 1, 3, 7, 14 y 30 para tres muestras. Los datos se graficarán como porcentaje de células viables contra el tiempo y se determinará si existe una diferencia estadísticamente significativa entre las tendencias de viabilidad para diferentes números de capas de células beta usando una prueba t. Además, se hará el registro del porcentaje de muerte celular atribuida a la necrosis o apoptosis.

Ensayos de producción de insulina. La producción de insulina se medirá utilizando incubación, estática (ELISA) bajo condiciones de baja glucosa (3 mM) , alta glucosa (30 m ) , y alta glucosa/despolarización (25 mM +) (Dean 1989) . Cada cavidad en las placas de 12 cavidades se preincubará con medio fresco a 37°C y 5% C02. Para la medición experimental, los distintos parches de células beta se incubarán durante 2 horas en medio fresco que contiene ya sea 3 o 30 mM glucosa. Un grupo adicional de cavidades se incubó en 30 mM glucosa, que contiene 25 mM KCl con NaCl apropiadamente reducido. Cada tipo de parche será evaluado por triplicado para cada condición probada. Las muestras del medio se sometieron a ensayo para contenido de insulina utilizando un inmunoensayo ELISA. Los resultados se expresarán como promedios de las muestras por triplicado con desviación estándar y se compararán utilizando una prueba t para significancia estadística. MacGregor et al., Small rat islets are superior to large islets in in vitro function and in transplantation outcomes, Am. J. Physiol. Endocrinol . Metab. 290(5); E771-779 (2006) .

Implante de parches e islotes. Se inducirá la diabetes en ratas receptoras adultas orcester de BioCrías Resistentes a la Diabetes (DRBB, por sus siglas en inglés) , es un modelo de diabetes autoinmunológica que es paralela a la diabetes tipo I en los seres humanos. Ratas de cuatro semanas de edad serán adquiridas de Biomedical Research Models, Inc. Los animales serán divididos aleatoriamente en dos grupos: receptores de parche y receptores de islote (6 por grupo) . Para la inducción de la diabetes las ratas DRBB serán tratadas con una combinación de anticuerpo monoclonal anti-RT6 (hibridoma DS4.23 (proporcionado generosamente por el Dr. Dale L. Greiner, Centro Médico de la Universidad de Massachusetts ; 2 mi de medio de cultivo inyectados 5 veces/semana) y activador del sistema inmunológico no específico poli I:C (Sigma; 5 ug/g de peso corporal inyectados 3 veces/semana) . Las inyecciones se administrarán durante un período de 3 semanas . En la fecha de hiperglucemia repetida (niveles de glucosa en la sangre > 250 mg/dl durante 3 días consecutivos) , los animales serán considerados diabéticos y el tratamiento se suspenderá (Semis 2004) . Con este método, el 95% de las ratas llegaron a ser diabéticas al final de la 3a semana. El implante de parches de células beta e islotes se hará en la subcápsula de riñon. Ratas DA (Dark Agouti) servirán como donantes de células beta. Las ratas se anestesiarán con pentobarbital (45 mg/kg) y el riñon se liberará por una incisión en la pared del cuerpo en el flanco izquierdo. Se hará una incisión moderada en la cápsula del riñon, y el parche de células beta se colocará bajo la cápsula. Se implantará un mínimo de 4 parches con espesor de capa celular y/o biomaterial variable. Los implantes de islote típicamente requieren una incisión más pequeña y la infusión a través de una pipeta de poro pequeño. Los grupos receptores recibirán ya sea 1000 o 2000 IE de islotes para trasplantes o una equivalencia de las células beta en el sustrato de parche. La mejora significativa en el rendimiento (tipo de parche contra islotes) debe ser detectable si los islotes mínimos necesarios para el éxito (1000 IE) son transplantados y comparados con un volumen de islote más alto (2000 IE) . Las inyecciones de zinc-insulina de carne de bovino/porcino (NPH Iletina I) (2 veces/día) se administrarán por 3 días post- transplante de islote para reducir el estrés de la hiperglucemia .

Determinación In vivo de glucemia. Se monitoreará la glucosa en la sangre de ratas durante 4 semanas para determinar si los implantes de parche o islote pueden inducir la euglucemia. El control glucémico de los animales se seguirá tomando mediciones de glucosa en sangre diariamente. Los niveles de glucosa en plasma se monitorearán obteniendo muestras de sangre de la cola sobre una base diaria por las primeras 3 semanas, y luego 2 veces/semana utilizando el medidor de glucosa Freestyle (TheraSense) . Generalmente se logra la reversión de la diabetes dentro de las 24 horas del trasplante del islote, se deben lograr resultados similares con los parches .

Análisis de parches de células beta explantados.

Después de 14 o 30 días de inmunotinción (insulina y glucagón) , medición de viabilidad, y detección de apoptosis, se recuperarán los parches o islotes. En algunos casos, las ratas que lograron euglucemia se mantendrán durante 8 semanas antes del análisis. La inmunohistoquímica en las secciones será completará utilizando anticuerpos para insulina y glucagón. Las imágenes se procesarán utilizando análisis colorimétrico para determinar el área de sección transversal positiva para cada uno de los tintes. Se prepararán y analizarán placas de control negativo. Inicialmente , utilizaremos un tinte de ditiazona para identificar las células beta. La fragmentación del ADN, indicativa de la apoptosis celular, se completará utilizando ensayo de etiquetado de corte- fin dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (TUNEL) . Los parches o islotes se prepararán para histología utilizando 10% formalina incrustada en parafina se ha hecho anteriormente. El kit TUNEL (Kit de Detección de Muerte Celular In Si tu, Roche Diagnostics) se utilizará para etiquetar las secciones histológicas. Los parches e islotes se analizarán tanto por el número como la distribución de células de TUNEL+ por un investigador ciego. Las imágenes de las secciones histológicos se reconstruirán en imágenes 3D completas de islotes. De esta manera, las células apoptóticas en todos los islotes únicos pueden identificarse. Las secciones serán contrateñidas con hematoxilina y se visualizarán bajo el microscopio de luz. Para identificar las células secretoras de insulina dentro de los islotes, el anticuerpo anti-insulina será utilizado para etiquetar muestras y será detectado con un anticuerpo secundario de rodamina. Se anticipará la recolección de un mínimo de 10 islotes/rata de post-trasplantes para el análisis de la apoptosis. Las placas de control negativo se prepararán como sea necesario. Además del análisis TUNEL, los parches se fijarán para la subsecuente microscopía electrónica utilizando la instalación microscopía de núcleo. La identificación de las capas de células beta y la infiltración de células se realizará de esta manera.

EJEMPLO 5 : Preparación de células de óptimamente dimensionadas utilizando un micro-molde En este ejemplo, un dispositivo adicional para reagregar células fue desarrollado y diseñado y se describen los métodos para generar un micro-molde que tiene múltiples divots individuales grabados en la superficie del sustrato.

En general, un páncreas se descompone en islotes grandes nativos (mayores de 150 µ??) e islotes pequeños nativos (menores de 125 µ??) . Los islotes grandes y pequeños son separados, y los islotes pequeños se colocan en cultivo (en algunas modalidades el cultivo de islote pequeño más tarde se agregará a los islotes recién reagregados) . Los islotes nativos grandes son dispersados en la suspensión celular única y se dejarán sedimentar en el micro-molde. El tamaño del islote producido puede ser manipulado por el número de células cargadas en el micro-molde. Dependiendo de la suspensión celular, típicamente de 20-100 (+/-20%) células caerán en cada divot para enlazarse entre sí, formando un nuevo islote pequeño reagregado. Las células únicas en divots individuales son cultivadas bajo condiciones para promover la formación de la estructura 3D que se asemeja al islote pequeño nativo en donde el tamaño y forma de los islotes reagregados están influenciados por el tamaño y forma del divot. La capacidad de variar el número de células en los divots concentrando (determinando la densidad celular en la suspensión) permite producir un islote reagregado muy pequeño (abajo de 30 µp?) o tamaño medio (50-90 µ??) . Este control puede resultar ser importante cuando se forman otras estructuras celulares 3D como los mini-tumores para pruebas de quimioterapia.

A diferencia del parche de andamiaje de biomaterial Ejemplo 3 supra, el micro-molde de divot descrito en este ejemplo no requiere que las células se unan a la superficie del sustrato. Como se discute a continuación, las células de islote reagregadas en un micro-molde son de tamaño óptimo, viables, y las poblaciones celulares derivadas de micro-moldes se caracterizan por el alto porcentaje de viabilidad y altos niveles de secreción de insulina.

Desarrollo del micro-molde.

Divots como el ambiente de reagregación física. En un esfuerzo por reagregar células únicas en islotes pequeños de tamaño óptimo, nuestra hipótesis es que la formación de los islotes en un ambiente físicamente restringido guiaría la forma de la masa celular durante la reagregación. Con este fin, se determinó que un ambiente de reagregación física óptimo sería similar tanto a la forma como el tamaño del producto final celular deseado. El intervalo de dimensión utilizado en nuestros primeros experimentos (100 pm de diámetro y 60 µp? de profundidad) es óptimo para la producción islotes reagregados a bajo de 50 m de diámetro (en promedio) . La profundidad de 60 µp? permite la fácil recuperación de los islotes reagregados sin romperlos en piezas más pequeñas. Un fondo redondeado en cada ambiente de reagregación guió la reagregación de la masa celular en una forma aproximadamente esférica. Nos referimos a estos ambientes de reagregación física con las dimensiones especificadas, incluyendo fondos redondeados como "divots". Las dimensiones y colocación de los divots pueden variar según las necesidades del usuario.

Diseño del micro-molde. En un esfuerzo por generar poblaciones islotes pequeños de tamaño óptimo, hemos diseñado un micro-molde que contiene una superficie que comprende numerosos divots. Las dimensiones de los divots en este micro-molde y su relación espacial entre sí dentro del micro-molde fueron especificadas por el usuario. Se utilizó el software AutoCAD para crear plantillas electrónicas de los micro-moldes. La plantilla delinea el tamaño, forma y distribución de los divots en la superficie del molde. El sustrato de divot se establece dentro de un alojamiento grande capaz de contener líquidos sin fugas, también referido en la presente como el alojamiento del molde (FIG. 10) . Las dimensiones tanto del micro-molde como de los divots dentro del micro-molde pueden variar de acuerdo con las necesidades del usuario. Por ejemplo, si el objetivo fuera utilizar los moldes para pruebas de fármacos, se puede probar un divot más grande y/o más profundo con el fin de mantener un volumen más grande del compuesto probado por divot. Si las células de interés no fueran islotes, las dimensiones del divot podrían especificarse de otra manera para satisfacer los criterios de crecimiento o reagregación óptimos para el tipo de célula de interés .

Sustrato para la superficie de divot. Hay varias propiedades físicas que son importantes a la hora de elegir un sustrato. Utilizar una sustancia basada en dióxido de silicio (Si02) es preferible para el grabado húmedo con una solución de ácido fluorhídrico (HF) amortiguada. El ácido HF graba un sustrato haciendo reaccionar las moléculas de Si02. Además, para el uso in vitro del micro-molde, es preferible elegir un sustrato al cual las células no se adherirían, permitiendo la fácil remoción de los islotes reagregados de los divots . Un sustrato transparente permite ver el contenido dentro de los divots bajo un microscopio sin tener que transferirlo a otra placa. Un sustrato esterilizable proporciona un molde reutilizable . El vidrio fue elegido como el sustrato ideal para los micro-moldes no implantables, ya que exhibe todas estas características. Además, los usuarios pueden especificar el espesor y las dimensiones del vidrio durante la manufactura permitiendo la personalización adicional de los micro-moldes. El cristal también proporciona una solución de bajo costo, sin embargo, este material no es implantable .

Para el desarrollo del alojamiento del molde, son necesarias varias propiedades en el sustrato. El material elegido para construir el alojamiento del molde debe tener la capacidad de ser moldeado de acuerdo con las especificaciones del usuario. Esto significa que comienza como un líquido que puede verterse en un molde y se endurecerá con el tiempo y temperatura para formar un artículo sólido que rodea el sustrato grabado. El polímero es preferiblemente esterilizable. Típicamente es hidrofóbico para evitar que los líquidos se fuguen de los moldes. Sylgard 184 Polidimetilsiloxano (PDMS) es ideal para estos moldes. Se puede esterilizar, es hidrofóbico, se puede verter fácilmente en un molde y curar a un producto sólido. Además, se puede utilizar en temperaturas que varían desde -45 a 200 °C durante un largo período de tiempo, permitiendo tanto la esterilización con vapor como congelación. El PDMS tiene un tiempo de trabajo de aproximadamente 2 horas y luego se puede curar a temperatura ambiente (~48 hrs) o curar con calor (hasta aproximadamente 200°C) . El PDMS mezclado a las especificaciones de manufactura tiene la capacidad de pegarse al sustrato de vidrio, protegiendo adicionalmente contra la fugas de líquidos en el molde (Mata et al, 2005) . Los micro-moldes diseñados con vidrio y PDMS fueron diseñados específicamente para la experimentación in vitro y no son aptos para el uso in vivo. A continuación se describen moldes implantables que se utilizarían para propósitos in vivo que no utilizan fotolitografía, sino que más bien se producen haciendo primero un sello negativo.

Los prototipos del micro-molde generados hasta el momento estuvieron comprendidos de substrato de vidrio en el cual los divots fueron grabados. El sustrato de divot puede cortarse para satisfacer las necesidades del usuario. Por ejemplo, el sustrato puede cortarse al tamaño de un portaobjetos de microscopio estándar. En un prototipo creado hasta el momento, el sustrato de vidrio de cal sodada fue cortado circularmente a 33 mm de diámetro y 3 mm de espesor.

Preparación de la superficie del sustrato. La superficie del sustrato a ser grabada con divots se limpió con gas nitrógeno para eliminar las partículas grandes. Se utilizaron soluciones piraña ácidas y básicas para limpiar profundamente el sustrato para eliminar compuestos orgánicos y materia que pudiera interferir con la fotolitografía y la deposición de metal. Posteriormente, el sustrato fue horneado durante 30-60 minutos. Otros métodos para eliminar las partículas grandes y compuestos orgánicos de sustratos de superficie pueden ser empleados por un artesano experto. Una vez limpia la superficie del sustrato, una capa de metal (300 nm cromo) fue depositada sobre el sustrato utilizando un Sistema de Deposición de Película Delgada Lesker. Las técnicas alternativas para aplicar capas delgadas de metal al sustrato son conocidas en el arte y pueden ser utilizadas.

Fotolitografía. Una capa de Fotoresistente Positivo AZ1518 (1 mi) se aplicó a la parte superior del metal depositado utilizando un Recubridor Giratorio (Recubridor Giratorio Programable Brewer CEE100) . El recubridor giratorio fue ajustado para producir una capa de fotoresistente de 1.8 mieras, seguido de un horneado suave a 100 °C durante 2 minutos. Después del enfriamiento, el cristal con la fotomáscara fue expuesto a la luz UV (Sistema de Alineamiento de Máscara e Inundación UV ABM) durante 4 segundos seguido por inmersión en un Desarrollador MIF AZ 300 durante 30 segundos. El sustrato se agitó ligeramente. El sustrato luego se horneó a 100°C durante 8-10 minutos. El patrón desarrollado en el fotoresistente posteriormente fue grabado en la capa de cromo sumergiéndolo en un Grabador de Cromo CR7S con agitación para ayudar en el proceso de grabado. 30-45 segundos de inmersión es necesario para que aparezca la imagen. El sustrato se lavó ligeramente con agua y se secó con nitrógeno para prepararlo para el proceso de grabado húmedo. Esto produjo una pieza de vidrio estratificada con cromo y fotoresistente que contuvo puntos abiertos en la superficie donde el cromo o fotoresistente no estuvieron presentes. Estos puntos no enmascarados exponen la superficie de vidrio al proceso de grabado húmedo, mientras que las áreas cubiertas con cromo y fotoresistente protegen la superficie de vidrio de la solución de grabado. Esto conduce al grabado de divots en las áreas no enmascaradas. Se completó el grabado húmedo en una solución de HF:HN03:H20 a una relación de 20:14:66, respectivamente. El sustrato fue sumergido en la solución durante 18 minutos mientras estaba en un agitador orbital a baja velocidad. Durante esta inmersión, el ácido atacó el vidrio reaccionando con Si02/ disolviendo así las porciones visibles del vidrio que no fueron cubiertas con las máscaras de cromo y fotoresistente , creando divots uniformes sobre la superficie (FIG. 11) . Esta solución produce una velocidad de grabado aproximada de 4 a 5 µ?? de profundidad por minuto (depende de la frescura de la solución) . La agitación en un agitador orbital asegura el grabado uniforme de la superficie.

El sustrato posteriormente se lavó en carbonato de calcio y luego agua para neutralizar y eliminar el exceso de ácido, y finalmente se secó con nitrógeno. Si el exceso de cromo permaneció sobre el sustrato, se requiere inmersión adicional en Grabador de Cromo y lavado con acetona y agua para eliminar todos los restos. Finalmente, el sustrato se secó con nitrógeno. El diámetro y profundidad del divot se midió utilizando un perfilómetro (FIG. 12) . En los prototipos creados hasta el momento, la variabilidad en el tamaño del divot no ha sido problemática; los divots prototipo midieron +/-10% de las dimensiones especificadas.

Visualizamos otros dos métodos proféticos que pueden utilizarse para crear moldes: Moldes Negativos SU- 8: En esta modalidad, el vidrio se utilizará de nuevo como el sustrato. El vidrio es sometido a un proceso de fotolitografía similar como antes, pero se alteró el diseño original para crear un molde negativo de plantilla, que luego se puede convertir en un micro-molde, pero vertiendo uno de los biopolímeros listados en el sello y permitiéndole que se cure. Brevemente, el fotoresistente SU- 8 es recubierto por giro en una capa gruesa (el espesor de la capa debe ser igual a la profundidad deseada de los divots) . Luego se hornea levemente, se cubre con una fotomáscara (como se describió anteriormente) y se expuso a la luz UV, se horneó nuevamente post-exposición, desarrollado en un desarrollador SU-8, y finalmente se expuso a un horneado post-desarrollo . Esto produce una pieza de vidrio que tiene proyecciones negativas de divots basados en las especificaciones de diseño. Esta plantilla negativa se utilizará entonces para fundir moldes en un biopolímero dado o PDMS creando una impresión de molde en el curado. El sello luego se removerá del polímero curado. El polímero acabado se parecerá a los micro-moldes de PDMS/vidrio y tendrá divots de dimensiones definidas. Una ventaja de este procedimiento es que para pruebas de fármacos u otras aplicaciones, cada divot puede etiquetarse durante la etapa de diseño con un identificador único (ej . texto, números) , y estará presente en los moldes terminados como impresiones visibles por cada divot (ver FIG. 28) . Un proceso más detallado se describe en las instrucciones de procesamiento del fabricante (SU-8 2000 Fotoresistente Negativo Epoxi Permanente, MicroChem, Newton, MA) .

Negativos de Molde de Metal Grabado : En esta modalidad, moldes de polímero se crearían utilizando un molde de fundición de metal. La fundición de metal puede fabricarse diseñando un modelo 3D en el software CAD. Un diseño posible se proporciona en la FIG. 27. El metal es grabado con láser para crear un molde de fundición similar a los moldes SU-8 descritos anteriormente. El polímero se vertió sobre la fundición de metal y se curó para crear un nuevo micro-molde. Nuevamente, si es necesario, texto o números pueden incorporarse en el modelo 3D para etiquetar cada divot como anteriormente, dejando una impresión visible.

Plantillas de Metal Grabado y SU- 8 fueron desarrolladas para permitir que un método produjera moldes de un material dado para uso tanto in vitro como in vivo. Más específicamente, estos métodos pueden utilizar biopolímeros para crear moldes que se pueden implantar. Estos métodos también deberían permitir diseños más detallados (tales como etiquetas de divot) y más control en la creación de divot, forma y tamaño (la variabilidad de las mediciones de divot debe ser menor de +/-1% de las dimensiones especificadas) .

Construcción de alojamiento para el sustrato de divot. La siguiente etapa en la construcción del micro-molde es desarrollar un sistema en el cual la superficie de divot será colocada y asegurada, y que servirá como un recipiente grande para el cultivo (ver PDMS "alojamiento" en la FIG. 10) .

La base [6] y paredes verticales [5] del alojamiento del molde fueron construidas usando Dow Corning Sylgard 184 polidimetilsiloxano (PDMS) (FIG. 13) . El PDMS se mezcló en una relación de 10 partes de base a 1 parte de agente de curado en un tubo de centrífuga de 50 mi (~ 2 hr de tiempo de trabajo) . El tubo se mezcló bien para dispersar completamente la base y agente de curado. Un vórtice puede utilizarse para ayudar en el mezclado durante este proceso. El PDMS se centrifugó a 1000-1500 rpm durante 1 minuto para eliminar las burbujas de aire. Se pueden utilizar materiales diferentes de PDMS para construir el alojamiento adecuado para el micro-molde. Por ejemplo, los materiales apropiados para un micro-molde destinado a aplicaciones in vitro multiusos incluyen, pero no se limitan a, micro-moldes que se implantarán (uso in vivo) , se formarán tanto con la superficie de divot como los lados del molde de biopolímeros. Sin embargo, la altura de los lados será mínima, y puede retirarse antes del trasplante para disminuir el volumen total del material trasplantado.

Los .materiales apropiados para un micro-molde propuesto para aplicaciones in vivo incluyen, pero no se limitan a poli (ortoésteres) , poli (anhídridos) , poli (fosfoésteres) , poli (fosfacenos) , y otros. Otros materiales no limitantes incluyen, por ejemplo, polisacáridos , poliésteres (tal como poli (ácido láctico), poli (L-lisina) , poli (ácido glicólico) y poli (ácido láctico-co-glicólico) ) , poli (ácido láctico-co-lisina) , poli (ácido láctico-injerto-lisina) , polianhídridos (tal como poli (dímero de ácido graso), poli (ácido fumárico) , poli (ácido sebácico) , poli (carboxifenoxi propano) , poli (carboxifenoxi hexano) , copolímeros de estos monómeros y similares), poli (anhídrido-co-imidas) , poli (amidas) , poli (orto ésteres) , poli (caprolactona) , poli ( iminocarbonatos) , poli (uretanos) , poli (organofasfacenos) , poli (fosfatos) , poli (acetato de etilenvinilo) , y otros acetatos de celulosa sustituidos con acilo y sus derivados, poli (caprolactona) , poli (carbonates) , poli (aminoácidos) , poli (acrilatos) , poliacetales , poli (cianoacrilatos) , poli (estírenos) , poli (cloruro de vinilo) , poli (fluoruro de vinilo) , poli (vinil imidazol) , poliolefinas clorosulfonadas , óxido de polietileno, copolímeros, poliestireno y mezclas o co-polímeros de los mismos) . En ciertos aspectos preferidos, los biomateriales incluyen polisacáridos , alginato, hidroxipropil celulosa (HPC) , Nisopropilacrilamida ( IPA) , polietilenglicol, alcohol polivinílico (PVA) , polietilenimina, quitosan (CS) , quitina, sulfato de dextrano, heparina, sulfato de condroitina, gelatina, etc., y sus derivados, copolímeros y sus mezclas. Otros biomateriales adecuados incluyen aquellos de nilón, hialuronano, politetrafluoroetileno, polivinil formamida, y otros descritos en Vats et al., (2003); Wang et al., (1997); y Orive et al . , (2003) ] .

La forma del alojamiento del molde se formó utilizando un andamiaje de cobre (FIG. 13) . Un tubo de cobre grande (1.75 pulgadas de diámetro) [1], se colocó, abierto hacia abajo, sobre una superficie plana [4] (por ejemplo, cuadrado grande de vidrio envuelto en papel de aluminio) . El PDMS se agregó al centro de la abertura del tubo a una profundidad de 2 mm para formar la base del alojamiento del molde [6] . La estructura completa luego fue horneada por 45 minutos a 100 °C en un horno. Después del horneado, el sustrato de divot se colocó, divot hacia arriba, en el centro del tubo de cobre (la línea punteada representa la ubicación del cristal grabado [4] en relación con el tubo de cobre grande) en la parte superior de la base de PDMS curada [6] .

Una pequeña cantidad de PDMS se agregó a los bordes del sustrato de divot para fijarla en el centro de la base de PDMS curada [6] . La estructura luego fue horneada durante 30 minutos a 100°C. Un pequeño tubo de cobre [2] (1 pulgada de diámetro se centró en la parte superior del sustrato grabado y el PDMS se vertió en el espacio entre los tubos de cobre grandes [1] y pequeños [2] . Esta etapa se hizo cuidadosamente para evitar el derrame del PDMS en el centro del molde. La cantidad de PDMS vertido en el espacio entre los tubos de cobre grandes [l] y pequeños [2] determina la altura del alojamiento del molde [5] . La altura y anchura del alojamiento del molde pueden ser especificadas por el usuario. El micro-molde, incluyendo el andamiaje del alojamiento de cobre, luego fue horneado durante la noche (al menos 12 hrs) a 100°C para curar completamente el PDMS.

Después del horneado durante la noche, la instalación de andamiaje de cobre fue removida como sigue. La estructura completa [1-7] se enfrió para encoger el PDMS, permitiendo la remoción del molde del andamiaje de tubo de cobre. El tiempo exacto necesario para el enfriamiento es dependiente de la temperatura; 30-60 minutos a -20°C es suficiente. La capa de papel aluminio/vidrio inferior [4] y el tubo de cobre pequeño [2] fueron removidos muy cuidadosamente. A continuación, el tubo de cobre grande [1] se separó del micro-molde.

Esterilización del micro-molde . Preferiblemente, una superficie que contiene divot de la presente invención es capaz de ser esterilizada. En una modalidad, cuando el micro-molde terminado está libre de andamiajes, puede ser lavado y esterilizado como sea necesario para su uso. La esterilización con vapor y etanol son los métodos preferidos de esterilización, pero otros métodos de esterilización conocidos para el artesano experto son adecuados . Cuando se utiliza PDMS en el micro-molde, no se debe utilizar acetona. Igualmente, no deben utilizarse procedimientos de esterilización que comprometen la integridad de los materiales utilizados en el sustrato de divot o el alojamiento del molde. La esterilización permite que el micro-molde sea utilizado repetidamente para uso in vitro. Obviamente los moldes utilizados para la implante in vivo no tendrían este requisito.

Reagregación de células dentro de los micro-moldes . Suministro de células a los micro-moldes . Las células de islote dispersadas únicas utilizadas para reagregar los islotes se pueden obtener de cualquier fuente de células de islote. En este ejemplo, un páncreas de animal fue canulado In Situ vía el conducto biliar común y distendido por bombeo de una solución fría de colagenasa (Worthington, Lakewood, NJ) dentro del conducto. Posteriormente, el páncreas distendido fue extirpado, transferido a tubos de centrífuga, e incubado durante 30 min con rotación suave a 37°C. La digestión lavada luego pasó a través de un tamiz y se sedimentó en una centrífuga refrigerada. La pelotilla resultante se mezcló con Histopaque (densidad 1.1085 g/ml, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) , y se centrifugó. Los islotes luego se limpiaron de tejido exocrino por filtración a través de un tamiz de 40µ con Solución Salina Equilibrada con Hanks (HBSS) con 5% suero de ternero bovino, y se colocaron en cajas de Petri que contienen medio de cultivo DMEM/F12, 10% suero bovino fetal (SFB) , EGF (20ng/mL) y 1% antibióticos. Los islotes se mantuvieron durante toda la noche a 37 °C con 5% C02.

Para dispersar los islotes en células únicas, los islotes aislados fueron digeridos a suspensiones de células viables colocándolas en un tubo de centrífuga de 50 mi, centrifugándolas y transfiriendo la pelotilla a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mi. Después de dos lavados con HBSS libre de calcio y magnesio, se agregó una mezcla de nueve partes de HBSS libre de calcio y magnesio y 1 parte de papaína (concentración final de 5 U mi) . Después de la incubación en un agitador a 37°C durante 20 min, los islotes se pipetearon, dispersándolos en células únicas.

Incujación de células en micro-moldes . Las células dispersadas únicas se transfirieron a los micro-moldes en Medio de Agregado especializado (medio de cultivo DMEM/F12, con 10% suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) , EGF (20 ng/mL) , ITS (1 g/L) , BSA (2 g/L) , Nicotinamida (10 nmol/L) , Exendina-4 (5 nmol/L) y 1% antibióticos) (Kikuga a et al., 2009) para el cultivo final. A este Medio de Agregado, se añadieron altas condiciones de calcio (2-4 mM) , que mejora la reagregación del islote. En el momento de la dispersión, una alícuota de células se examinó microscópicamente utilizando un hemocitómetro . Se determinó el porcentaje de células únicas contra dobletes o tripletes. Se definió que una dispersión celular de éxito tiene un mínimo de 90% células viables únicas con el otro 10% comprendiendo dobletes y tripletes. Conociendo la densidad de células en la dispersión vía el conteo de células utilizando el hemocitómetro, somos capaces de estimar el número de células por divot . Sin embargo, también hemos contado las células/divot una vez que se han cargado los micro-moldes, que varió de experimento a experimento, basado en la densidad celular del medio, pero varió de 20-150. El número de células/divot puede manipularse basado en la densidad de las células en el medio que se ' cargan en el molde proporcionando ventajas al usuario para controlar el tamaño final de la estructura celular 3D objetivo.

Los micro-moldes fueron suavemente agitados y luego dejados reposar durante 15 minutos de modo que las células se asentaron en divots individuales. Los islotes fueron mantenidos a 37°C con 5% C02 por hasta 9 días con camtíios del medio diariamente. El cambio de medio en los micro-moldes, con divots de 60 pm de profundidad se realizó fácilmente removiendo suavemente (con succión) el medio viejo cerca de la pared del molde y pipeteando suavemente en el molde el medio fresco.

Reagregacion de agrupamientos de células dentro de micro-moldes. Inicialmente las células cayeron aleatoriamente en el fondo de cada cavidad. El número de células que se asientan en cada divot es establecido por la densidad de las células en suspensión. Para determinar la densidad celular antes de la carga del micro-molde, se remueve una alícuota de la suspensión de células del islote y se cuentan las células/volumen bajo un microscopio utilizando un hemocitómetro . Conociendo el número de divots en el molde, y el tamaño objetivo de cada islote reagregado, el número de células en la suspensión se puede concentrar o diluir dependiendo de la densidad celular inicial. Si un molde contiene 10,000 divots y el resultado deseado es 100 células/divot , entonces debe haber 1,000,000 de células en el medio cargado en el micro-molde. La Figura 14 muestra las células desarrolladas en un micro-molde comenzando el día 2 y avanzando hasta el día 5. Entre los días 3 y 4, las células comenzaron a tomar la forma tridimensional de un islote nativo. Los islotes que se desarrollaron dentro de los divots estuvieron todos limitados a menos de 90 pm de diámetro (el diámetro medio menor de 50 µ?t?) . Esta dimensión es importante ya que hemos publicado datos que muestran que 50 µp? es un tamaño crítico para asegurar el alimento a las células de núcleo del islote (Williams et al., 2010). Los islotes mayores de 50 µp? demostraron muerte de células de núcleo, mientras que los menores de 50 µ?? raramente demostraron muerte de células de núcleo en el cultivo. El fondo curvado de cada divot ayudó a arrastrar las células unas hacia otras para la formación óptima de los islotes reagregados esféricos. La Figura 14 muestra las mediciones tomadas de una profundidad de divot único utilizando un perfilómetro . La profundidad de este divot único es ligeramente mayor que 60 µ?? y el fondo curvado, lo cual empuja las células hacia el centro del divot para la agregación.

El éxito en la generación de islotes reagregados de forma y tamaño óptimos es ejemplificado por los resultados obtenidos de un prototipo temprano. Este prototipo temprano comprendió área superficial de sustrato no de divot que rodea el campo de divots (FIG. 15) . Cuando se siembran, algunas células cayeron sobre la superficie no de divot del micro-molde prototipo. Mientras que algunas de las células que cayeron sobre las superficies no de divot permanecieron en la forma de células únicas o crecieron en agrupamientos de células pequeñas, otras formaron mega-islotes ; enormes complejos que no fueron limitados por las especificaciones de divot (FIG. 15) . Dentro de este molde de prototipo temprano, las células aisladas del mismo animal, que fueron cultivadas en el mismo medio, y reagregadas en el mismo material de sustrato produjeron dos diferentes reagregados de células: i) los formados dentro de los divots formaron islotes pequeños en forma de cavidad, y ii) los formados en la superficie plana sin restricción a las limitaciones físicas de un divot formaron grandes conglomerados de células que están sujetos a pobres propiedades de difusión. Algunos de los islotes sin restricción crecieron a un tamaño de 400 pm de diámetro. Estos resultados proporcionan excelente prueba de concepto que restringe físicamente los resultados de la reagregación de células en islotes de tamaño óptimo.

Los datos experimentales sugieren que los islotes reagregados en micro-moldes demuestran propiedades de difusión similares a las exhibidas por islotes pequeños nativos. Para determinar las propiedades de difusión de los islotes reagregados en micro-moldes, los islotes reagregados fueron expuestos al medio que contiene un análogo fluorescente de la glucosa (2-NBDG) durante diez minutos. El análogo de glucosa fluorescente se infiltró completamente al núcleo de los islotes reagregados indicando que la barrera para la difusión de la glucosa es relativamente baja (FIG. 26) . En contraste, el trabajo previo mostró que los islotes grandes nativos tienen barreras significativas para la difusión que inhiben la absorción celular e infiltración de la glucosa en el núcleo del islote, aún después de horas de exposición a 2-NBDG (Williams et al., 2010). Colectivamente, estos datos indican que los islotes reagregados en micro-moldes tienen barreras de difusión baja con relación a los islotes grandes nativos.

Comparación de células formadas en micro-moldes con aquellas formadas en placas de multi-cavidades comercialmente disponibles. Los resultados de islotes reagregados en los moldes se compararon con los islotes reagregados en mico-placas comercialmente disponibles. Las placas comerciales contuvieron cavidades de forma cuadrada que midieron 500µ???? diámetro. Las células de islotes dispersadas fueron cultivadas en las placas comerciales y los agrupamientos tipo islote se formaron, como se predijo. Se hicieron varias observaciones. En primer lugar, las células de islote formadas en placas comerciales se congregaron y unieron entre sí en las esquinas de las cavidades donde podrían hacer contacto con las paredes. La figura 16 muestra un ejemplo típico de las células formando un islote reagregado que toca el lado de la cavidad comercial. Estas células utilizan quía de contacto para reformarse.

En segundo lugar, sin limitaciones al tamaño, cade vez más células se unen conjuntamente creando islotes gigantes (algunos de más 400 µp? de diámetro) con pobre viabilidad. Sin los micro-moldes pequeños para limitar el número de células dentro de cada cavidad y las dimensiones físicas diseñadas para guiar de manera óptima la forma de los islotes reagregados, los islotes resultantes fueron muy grandes y contuvieron un alto porcentaje de células muertas. En ensayos de viabilidad de islotes reagregados en las placas comercialmente disponibles, más de 50% de muerte celular se observó con 6 días de cultivo. En estas grandes aberturas, las células a menudo permanecieron como singletes, demostrando la pobre viabilidad celular. Las células que fueron capaces de agruparse a lo largo de la pared o esquina de la cavidad nunca formaron las formas esféricas indicativas de islotes nativos, y tuvieron pobre viabilidad.

En tercer lugar, los agrupamientos de células que se formaron en moldes comerciales no se reagregaron en el tejido tipo islote esférico que obtuviéramos utilizando el micro-molde. La capacidad de formación de esfera de los islotes reagregados probablemente es una característica importante predictiva de la función in vitro exitosa. La mayoría de las placas de multi-cavidades están fabricadas con cavidades de fondo plano y lados cuadrados como se muestra en la figura 16. Las células reagregadas en placas comerciales tales como estas no se unen entre sí en una esfera que recuerda a lo nativo, y por lo tanto tienen menos probabilidades de funcionar tan eficientemente como un islote nativo. Aunque las placas de 1536 cavidades con fondos redondos son comercialmente disponibles, las células de islote formadas en cualquier cavidad de 500 µp? de diámetro sería demasiado grande para superar las barreras de difusión. Estos resultados apoyan la noción de que los moldes actuales comercialmente disponibles son sustratos inapropiados para la formación óptima del islote.

Remoción de agrupamientos de células reagregadas de moldes. En algunos casos es deseable remover las células de islote reagregadas del micro-molde en una manera que no comprometa la integridad o viabilidad de las células . Esto puede realizarse fácilmente colocando suavemente una pipeta grande directamente sobre los divots y aplicando succión. Los islotes reagregados son removidos de los divots con el medio. El lavado subsecuente del micro-molde con medio fresco y pipeteo directamente sobre los divots removerá casi todos los islotes reagregados en el molde.

Caracterización de reagregados de células formados en micro-moldes. Los islotes removidos de las placas se midieron para el tamaño y viabilidad. Los islotes de rata nativos varían desde 20 - 350µp? de diámetro. Cuando se reagregaron dentro de los divots del micro-molde (100 m de diámetro, 60 µp? de profundidad) , 100% de los islotes tuvieron diámetro menor de 90 µ??; el diámetro medio por islote reagregado fue de 366 ± 1.2 µ?? (mediciones de microscopía confocal de más de 500 islotes reagregados individuales) . Originalmente, encontramos unas estructuras poco más grandes que la que creíamos que representaban los islotes que nunca fueron digeridos completamente a células únicas y por lo tanto nunca cayeron en los divots. Desde entonces, el mayor cuidado durante el procedimiento de dispersión ha conducido a suspensiones de islote con 90% de las células en singletes y las células restantes predominantemente en dobletes o tripletes . Estimamos, utilizando patrones de micro-molde A y B (FIGS. 17A - 17B) , que 85-90% de todos los agregados obtenidos están por debajo de 90 µ?? de diámetro. Por razones aún no entendidas, algunas de las células en los divots se dividieron en múltiples islotes en lugar de formar un islote reagregado por divot. La Figura 18 muestra un ejemplo de dos islotes reagregados dentro de un divot.

Morfológicamente, los islotes reagregados parecen idénticos a los islotes nativos del mismo tamaño. Son de forma esférica con una superficie externa tipo cápsula que rodea el islote, como puede verse en las figuras 29A - 29B.

En contraste, la FIG. 15 muestra que las células agregadas sin el micro-molde no forman esferas o una cápsula evidente.

Los experimentos de viabilidad se completaron en los islotes reagregados utilizando tintes celulares de apoptosis/necrosis (Invitrogen, Ensayo de Apoptosis Vybrant que contiene Yo-Pro-1 y yoduro de propidio) . Este ensayo de doble etiquetado mide tanto la integridad de la membrana como la fragmentación de ADN. Los islotes reagregados se incubaron en las dos etiquetas por 1 hora utilizando métodos que hemos publicado anteriormente (MacGregor et al, 2006; Williams et al., 2010). Posteriormente los islotes fueron enjuagados con PBS y colocados en la Cámara Attofluor en el microscopio confocal Fluoview 300. Los islotes reagregados se seccionaron ópticamente y las imágenes del centro del islote fueron almacenados para su posterior análisis. El área dentro del islote que contiene tinte se calculó como un porcentaje del área de islote total para determinar la viabilidad. Las mediciones de viabilidad de islotes reagregados 5 días de edad demostraron viabilidad extremadamente alta dentro de las células y revelaron muy pocas células/islotes muertos. La viabilidad general de los islotes reagregados fue de 99.76%. Este valor es mayor que el previamente reportado en la literatura para islotes nativos grandes y pequeños, y para dispersiones de células de islote únicas (Williams et al., 2010; Song et al., 2009).

Las Figuras 19A - 19B muestran ejemplos de islotes típicos teñidos para viabilidad. En estas pruebas, la tinción roja indica muerte celular por necrosis y la tinción de células verde indica muerte celular por apoptosis .

La Figura 19A muestra una de solamente unas muy pocas células muertas que se identificaron en los islotes reagregados en los micro-moldes. La célula teñida de rojo está experimentando muerte celular debido a la necrosis. En tejido aislado, la necrosis celular a menudo ocurre primero. Sólo dos células apoptóticas (verde) se observaron en 500 islotes probados. En contraste, cuando las células del mismo animal formaron grandes mega-islotes en la superficie del micro-molde, hubo números significativos de células muertas presentes en toda la masa. La Figura 19B captura un plano de vista con 23 células muertas. El ajuste del plano focal del microscopio mostró que más células muertas estuvieron presentes dentro de todos los planos de la masa. Por consiguiente, las células reagregadas en los divots a islotes de las proporciones correctas tuvieron viabilidad muy alta, mientras que las células que se dejaron reagregar en masas grandes fuera los divots mostraron muerte celular significativa. Estos resultados apoyan el éxito del micro-molde, porque las células que aterrizaron en las áreas del molde sin divots tuvieron viabilidad mucho más pobre que las formadas en divots.

La viabilidad de todas las células formadas en micro-moldes excedió aquella de los islotes nativos grandes y pequeños de los mismos animales (FIG. 20) . La viabilidad se comparó entre islotes de rata grandes, pequeños y reagregados utilizando Ensayo de Apoptosis Vybrant de Invitrogen, como se ha descrito anteriormente. Seis días después del aislamiento, hubo alguna variabilidad en el porcentaje de células vivas en los dos grupos de islotes nativos, sin embargo hubo pocas células muertas en los islotes reagregados, conduciendo a que las barras de error fueran demasiado pequeñas para representarse visualmente en la figura. Los islotes reagregados en micro-moldes exhibieron aproximadamente 10% mayor viabilidad que los islotes pequeños nativos y aproximadamente 40% mayor viabilidad que los islotes grandes nativos (FIG. 20) .

Poblaciones celulares generadas de micro-moldes . Hay tres tipos principales de células presentes en islotes nativos (tanto grandes como pequeños) que comprenden aproximadamente el 90% de las células totales en los islotes. Las células alfa que segregan glucagón integran aproximadamente el 20% de todas las células en el islote. Las células beta que producen insulina integran 60-65% de los números totales de células, y las células delta de somatostatina comprenden 5-10% de la composición de las células de islote. Se ha mostrado que los islotes modificados genéticamente en los presentes micro-moldes contienen células alfa, beta y delta. Por ejemplo, la Figura 21 representa dos islotes representativos formados en los presentes micro-moldes 6 días después de la reagregación; las células beta se tiñen de verde, las células alfa se tiñen de rojo y, las células delta se tiñen de azul. Estos islotes modificados genéticamente parecen tener un menor porcentaje de células beta que el islote nativo promedio. Sin embargo, en comparación con los islotes pequeños nativos, la composición relativa celular de células alfa : beta : delta y su organización pueden parecerse a los islotes pequeños nativos. Los islotes de rata nativos grandes y pequeños se organizan con células positivas a glucagón y positivas a somatostatina ubicadas en las capas externas del islote. Las células positivas a insulina se encuentran en el centro. Como tal, el porcentaje de células positivas a insulina (las células beta) es menor en el islote pequeño, pero cada islote contiene altas cantidades de insulina. Aunque no hemos calculado el porcentaje de células beta/alfa/y delta (células positivas a insulina/glucagón/somatostatina) en suficientes islotes reagregados para concluir definitivamente, es probable que el porcentaje de células beta en comparación con todas las otras células se asemeje al del islote pequeño nativo. Una diferencia importante es que en los islotes reagregados, las células alfa, beta y delta están organizadas en un patrón aleatorio con las células dispersadas por todo el islote reagregado. Esta es la misma organización observada en los islotes humanos (Hahn van Dorshe et al., 1988; Bosco et al, 2010. Por consiguiente, los islotes reagregados demuestran un patrón más aleatorio de organización celular, una reminiscencia de islotes humanos nativos) .

Producción de insulina. Es importante verificar que los islotes modificados genéticamente en micro-moldes fueran capaces de producir nuevas moléculas de insulina. La insulina es primero sintetizada como una molécula precursora, llamada proinsulina. Islotes reagregados de seis días de edad se tiñeron para niveles de proinsulina para determinar si estuvieron produciendo nueva insulina. La Figura 22 muestra un ejemplo de un islote reagregado teñido para insulina madura (verde) y moléculas de proinsulina (rojo) . Como era de esperarse, las células beta son etiquetadas doble. La imagen muestra que la nueva insulina está siendo sintetiza en los islotes reagregados, aún seis días en vultivo.

Los islotes son responsables de la liberación de insulina en la sangre en respuesta a la alta exposición de glucosa después de comer una comida. La falta de secreción de insulina es la causa de la incapacidad de las personas con diabetes tipo 1 para mantener los niveles normales de glucosa en la sangre. Para determinar la respuesta celular a la glucosa, los islotes reagregados en el presente micro-molde e islotes pequeños nativos fueron expuestos a condiciones de baja glucosa (3 mM) . La insulina segregada en el medio por ambos tipos de islote fue colectada y cuantificada (FIG. 23) . En condiciones de baja glucosa (30 minutos) , los islotes reagregados liberaron 100 veces más insulina que el islote pequeño nativo (los islotes pequeños nativos producen más insulina que los islotes grandes nativos) . Cuando se exponen a alta glucosa (20 mM) , los islotes reagregados continuaron segregando significativamente más insulina que los islotes nativos grandes o pequeños. Para confirmar que los islotes reagregados estuvieran segregando insulina antes que fugando insulina completamos experimentos adicionales utilizando un dextrano impermeabilizante de membrana pequeña (10 kD) . Una molécula de este tamaño es lo suficientemente pequeña como para pasar a través del complejo de poro nuclear en la envoltura nuclear dentro de la célula. Sin embargo, la membrana de plasma no contiene complejos proteicos capaces de pasar moléculas de este tamaño. El dextrano (20 mM) se agregó al medio que contiene islotes reagregados y las imágenes confocales capturaron la incapacidad del dextrano para entrar en las células aún después de 4 horas de exposición, lo que sugiere que las células no estuvieron agujereadas o dañaron la membrana. Adicionalmente, si las células estuvieran en efecto fugando insulina antes que segregándola, habríamos observado niveles mayores de tinción roja o verde durante los ensayos de necrosis/apoptosis en los islotes reagregados mostrados en la FIG. 22. Colectivamente, estos datos sugieren que los islotes reagregados en micro-moldes de hecho producen mayores cantidades de insulina que sus contrapartes islotes nativos pequeños o grandes.

A nuestro conocimiento, la secreción de insulina a estos niveles de células de islote nativo o alterado no ha sido reportada, haciendo nuestros resultados extremadamente únicos. El grupo Weir informó la encapsulación de islotes reagregados pequeños en un alginato con alto contenido de ácido gulurónico (O'Sullivan et al., 2010). Weir creó estos islotes agregados simplemente dispersando islotes a células únicas y luego dejándolos reconformarse sin restricciones. El trabajo de Weir mostró que en los niveles de oxígeno normales sus islotes pequeños liberaron tanta insulina como islotes nativos, pero a bajo oxígeno los islotes de Weir liberaron más insulina que los islotes nativos. Sin embargo, los islotes de mejor desempeño de Weir segregaron 20 veces menos insulina que nuestros islotes reagregados en micro-moldes. La razón de la relativa decadencia en la secreción de insulina por nuestros islotes reagregados en alta glucosa es desconocida en este momento, y es algo que debe ser determinado antes de que los islotes modificados genéticamente se puedan transplantar en animales diabéticos. A pesar de la relativa decadencia, el dramático aumento en la secreción de insulina en condiciones de glucosa tanto alta como baja, en comparación con los islotes nativos, es un atributo importante y único del método de reagregación de micro-molde .

Aditivos para islotes. Los métodos y materiales que podrían ser utilizados con el proceso de reagregación de islotes en micro-moldes son casi ilimitados. En primer lugar, existen muchas moléculas que podrían ser incorporadas en los islotes modificados genéticamente en el momento de la reagregación. Estas incluyen pero no se limitan a factores de crecimiento, inmunomoduladores , inmunosupresores , citocinas, quimiocinas, DMARD, por sus siglas en inglés (fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad) , antiinflamatorios y antibióticos. Las moléculas o dispositivos en miniatura para aumentar la tensión de oxígeno en el sitio de trasplante podrían incorporarse en los islotes reagregados, especialmente si se utiliza un sustrato de micro-molde implantable. Otras clases no limitantes de moléculas que podrían agregarse en el momento de la reagregación incluyen fármacos para inducir la liberación de insulina, moléculas pequeñas, péptidos, proteínas, anticuerpos (por ejemplo, contra la CDlla, CDllb, CDllc, CD18) y ácidos nucleicos (ADN o AR ) .

Discusión. Nuestro micro-molde de divot es diferente a los otros andamiajes utilizados en el arte para reagregar células. Previamente, otros han intentado utilizar el método de gota colgante para formar islotes (por ejemplo, Lehmann et al., 2007). En el método de gota colgante, las células se colocan en solución, en una gota en una tapa de caja de Petri, la cual luego se gira boca abajo de modo que las células caen al fondo de la gota colgante de solución, donde podrían formar un islote. Sin embargo, el método de la gota colgante es lento y propenso a la contaminación porque el medio en la "gota" no se puede cambiar.

Utilidad de micro-moldes in vi tro. El presente micro-molde puede diseñarse para formar agregados de células in vitro para trasplante subsecuente o para pruebas de fármacos o dispositivos entre otras aplicaciones.

Generación de células para trasplante. (Ejemplo Profético) Un micro-molde preferible diseñado para generar células para trasplante es un dispositivo único que es esterilizable , re-utilizable, y no tiene fuga de medio o células cuando se llena (FIG. 24) . En primer lugar, los islotes necesarios se aislan del páncreas. Los islotes pequeños saludables se separan de los islotes grandes. Los islotes grandes se dispersan en células únicas o dobletes, que se cargan en el micro-molde. Después de 3 a 6 días en el cultivo, las células se remueven, se mezclan con los islotes pequeños nativos, y se trasplantan en el receptor diabético.

El micro-molde A (FIG. 17A) está diseñado para la reagregación de islote con divots que son de 100 µ?? de diámetro con una profundidad de 60µp?. Hemos encontrado que la profundidad de ß?µp? es óptima, ya que permite la fácil remoción de los islotes reagregados de los divots. Los divots están dispuestos en un patrón alternado de modo que hay-espacio mínimo entre los divots (FIG. 17A) . La distancia promedio entre los divots es menor de 30 µ??.

La superficie no de divot vista en la Figura 15 estaría cubierta completamente de divots en el micro-molde previsto para la generación de células para trasplante. Este arreglo permite que sea utilizado el espacio máximo en el micro-molde para divots - resultando en números máximos de reagregados hechos por molde, y máxima eficacia de modo que cualquier célula flotando en la superficie del molde probablemente caerá en un divot, limitando así la pérdida de células viables para la reagregación.

El número de divots que puede obtenerse en un molde variará con el tamaño del molde . Un molde de aproximadamente 1.5 pulgadas de diámetro, utilizando el diseño micro-molde A (FIG. 17A) , contiene entre 10,000-12,000 divots por molde. El espaciado de los divots también es dependiente de las necesidades del molde. Para la reagregación de tejido para trasplante, la eficiencia del tejido original con el número de islotes reagregados es importante. Cuanto mayor sea el porcentaje de células que caen en los divots, tanto mejor es la eficiencia para producir los nuevos islotes. De este modo nuestros moldes diseñados para el trasplante de islotes tienen un espaciado de divot de 20-30µp\.

Selección de fármacos. (Ejemplo Profético) La selección de fármacos utilizando el micro-molde se basa en el concepto que las células dispuestas en una estructura 3D, como un mini-tumor o un islote pequeño, responderán a su ambiente de manera diferente que las células que crecen o reagregan planas en un plato. Por ejemplo, los mini-tumores o islotes podrían formarse en los divots de los micro-moldes, y luego se podrían aplicar terapéuticos potenciales, tales como fármacos anti-cáncer, ya sea individualmente a cada divot, o agregar a la placa completa. Luego se podría examinar la formación de las estructuras 3D y observar los cambios, tales como tamaño de agrupamiento o viabilidad celular disminuidos, lo que indicaría un efecto indeseable del químico de prueba. En el primer ejemplo, muchos fármacos diferentes podrían probarse en una pieza de vidrio que es de aproximadamente 35 mm de longitud. Con el segundo procedimiento se probaría un fármaco único, pero en un molde habría muchas respuestas individuales que podrían ser cuantificadas .

Una posible cuantificación para pruebas de fármacos contra el cáncer sería la viabilidad (tintes de vivas/muertas) , que podría hacerse para cada tumor. Mientras que las pruebas de fármacos contra el cáncer potenciales utilizando el diseño de micro-molde son atractivas, el molde sería útil para todas las pruebas de fármaco que se harían mejor en las células en un arreglo de 3D.

El micro-molde B (FIG. 17B) está diseñado para el suministro de intervenciones individuales a cada cavidad. Por consiguiente, sería aplicable para las pruebas de fármacos. Para este diseño los divots fueron de aproximadamente 180 µp? de diámetro con 120 m de espacio entre cada divot. El espaciado puede aumentarse o disminuirse según sea necesario. La figura 11 muestra una imagen del piso del micro-molde B con divots vacíos individuales. El micro-molde B contiene 2,700-3,000 divots por molde, muchos menos que en el diseño A. El espaciado entre los divots en el diseño B es mayor para asegurar el suministro de fármaco exacto para solamente un divot. La especificación del patrón de divot y espaciado se establece por el usuario y dependerá del sistema de suministro de fármaco utilizado. Utilizando los moldes para probar miles de compuestos en las células en cada divot permitiría que el usuario complete la selección de fármaco en 2000-3000 diferentes fármacos en un molde que es menos de 2 pulgadas (5.08 cm) de diámetro (FIG. 24). La selección de fármacos de alto rendimiento utilizando cada molde para un fármaco separado, permitiría que miles de agrupamientos de células individuales respondan y sean medidos como respuestas individuales antes que una respuesta promedio. La selección de fármaco de alto rendimiento asociada con sistemas de nano-suministro podría utilizarse de modo que cada divot podría contener un f rmaco diferente para las pruebas . Alternativamente, uno podría recolectar puntos de datos de miles de muestras expuestas al mismo trato y condiciones de cultivo (FIG. 24) .

Generación de células no de islote. (Ejemplo Profético) Los moldes pueden diseñarse para una variedad de formas de agregación de células incluyendo pero no limitados a, trayectorias neuronales largas, filtros tipo glomerulares, vasos, alvéolos de reemplazo, etc.. a agregación de células madre o células reprogramadas en una forma pequeña bien definida tal como el micro-molde también sería un uso apropiado de esta invención.

Una aplicación típica sería la expansión y la agregación de líneas celulares cultivadas en los moldes. En este caso, las células en suspensión se cargarán en los moldes a una densidad extremadamente baja que varía desde 1-50 células/divot (dependiendo de las necesidades del usuario) . Las líneas celulares cultivadas contienen células divididas, las cuales se les dejaría crecer en los divot's por una longitud de tiempo dependiendo de las necesidades del usuario. Otras fuentes de células incluirían células recién dispersadas de animales o humanos . El proceso para cargar células recién dispersadas es similar a los métodos generales descritos para islotes. El tejido de elección, por ejemplo un vaso, quedaría expuesto a las enzimas digestivas hasta que las células únicas o dobletes estuvieran en suspensión. Las células serían cargadas en el molde a la densidad y en el medio de elección por el usuario. Finalmente, las células madre podrían programarse para producir varios tipos de células adultas. Estas células también podrían cargarse en los micro-moldes para mejorar la formación de estructura 3D.

Utilidad de los micro-moldes in vivo. (Ejemplo Profético) Los micro-moldes descritos aquí son útiles para aplicaciones in vitro.

Islotes reagregados en moldes para el trasplante. (Ejemplo Profético) Los micro-moldes construidos de biopolímeros pueden utilizarse para generar un producto implantable (FIG. 23) . En tal caso, se alteraría el micro-ambiente del molde de modo que los islotes reagregados se unirían al biopolímero y el "parche" completo sería trasplantado en el receptor. Los biopolímeros descritos supra serían apropiados para generar tal micro-molde implantable. Los divots en el molde podrían utilizarse para crear cavidades que permitirían que las células se asienten en primer lugar en los divots donde su .reagregación se guiará por las dimensiones del divot, y en segundo lugar se adhieran al divot de biopolímero.

Con el fin de crear divots en el biopolímero, negativos de cera podrían diseñarse utilizando protocolos conocidos en el arte (por ejemplo, Dean et al. 2007). Para los moldes que son implantables, los islotes serían dejados en el molde y colocados quirúrgicamente en el receptor. Los moldes implantables tendrían un diseño de molde con aberturas entre los divots que permitirían la infiltración de los nervios y vasos sanguíneos a los islotes. Además, los materiales implantables podrían ser impregnados con, por ejemplo, factores de crecimiento neuronales y vasculares y los moldes también podrían contener inmunosupresores para proteger a los islotes del rechazo inmunologico.

El implante del molde con islotes podría hacerse utilizando varios métodos publicados. Los micro-moldes podrían colocarse en la cavidad peritoneal como se publicó por Qi et al, 2010. La cavidad abdominal se abre bajo anestesia y el molde se colocaría suavemente en el espacio subfascial. Los sitios alternativos para el implante del micro-molde incluyen inserción subcutánea, especialmente seguida por pre-acondicionamiento para aumentar el suministro vascular a la región como se describe por Veriter et al., 2010. En el trasplante humano, los islotes son colocados en el hígado a través de la vena portal (Koh et al., 2010) . Con los micro-moldes, la infusión a través de la vena portal no sería posible, pero los moldes podrían colocarse en el hígado o bajo la cápsula renal con cirugía más invasiva (MacGregor et al, 2006) .

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De lo anterior se verá que esta invención es una bien adaptada para lograr todos los fines y objetivos descritos anteriormente, junto con las otras ventajas las cuales son obvias y las cuales son inherentes a la invención. Puesto que muchas posibles modalidades se pueden hacer de la invención sin apartarse de su alcance, se entiende que todos los temas descritos aquí serán interpretados como ilustrativos, y no en un sentido limitante. Mientras que las modalidades específicas se han mostrado y discutido, varias modificaciones, desde luego, pueden hacer, y la invención no se limita las formas específicas o arreglo de partes y etapas descritas en la presente, excepto en la medida en que tales limitaciones se incluyan en las siguientes reivindicaciones. Además, se entenderá que ciertas características y sub-combinaciones son de utilidad y se pueden emplear sin hacer referencia a otras características y sub-combinaciones . Esto se contempla y está dentro del alcance de las reivindicaciones .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un dispositivo implantable, caracterizado porque comprende : un andamiaje sustancialmente plano comprendido de un biomaterial que tiene una superficie mayor; y células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño unidas a la superficie del andamiaje de biomaterial para formar una multicapa de células de islote, las células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño se derivan de islotes intactos adultos, en donde los agrupamientos de células de islote pequeño tienen un diámetro de menos de 125 µp?.

2. Un método para formar un dispositivo implantable, caracterizado porque comprende: obtener islotes intactos de un páncreas; derivar células de islote individuales o agrupamientos de células de islote pequeño de los islotes intactos; y unir las células de islote individuales y agrupamientos de células de islote pequeño en una multicapa a una superficie mayor de un andamiaje de biomaterial implantable sustancialmente plano.

3. Una superficie para cultivar células, caracterizada porque comprende: un sustrato que comprende una superficie superior sustancialmente plana, en donde la superficie comprende una pluralidad de divots; en donde cada divot comprende una superficie inferior interior y una superficie de pared lateral interior, en donde la superficie inferior es redondeada y en donde cada divot está entre 100-200 µp? de diámetro (± 20%) y 50-150 im de profundidad (+ 20%) ; en donde las células se distribuyen en divots individuales .

4. Un dispositivo para cultivar células, caracterizado porque comprende la superficie de conformidad con la reivindicación 3, que adicionalmente comprende un sistema para sujetar la superficie plana, en donde el sistema forma una superficie inferior y una superficie de pared lateral interior y un volumen interior, las paredes inferior y lateral, son sustancialmente herméticas a líquidos, en donde las células y medio de cultivo se distribuyen en el volumen interior.

5. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque las células son células de islote.

6. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque las células son células no de islote.

7. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque los divots son de 100 pm (± 20%) de diámetro y 60 ym(± 20%) de profundidad.

8. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la superficie plana se hace de vidrio .

9. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la superficie plana se hace de un material bio-compatible y adecuado para el implante en un paciente humano.

10. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el dispositivo es esterilizable .

11. Un método para cultivar células, caracterizado porque comprende introducir células a una superficie que comprende una pluralidad de divots, en donde cada divot está entre 100 y 200 µp? de diámetro (± 20%) y 50 y 150 µt? de profundidad (± 20%) , y exponer el dispositivo a las condiciones de cultivo celular.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las células son células de islote y en donde las células se reagregan en islotes pequeños después de la exposición al dispositivo y soportan las condiciones del cultivo.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las células se asientan en los divots en una relación de aproximadamente 20-150 células por 1 divot.

1 . El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las células se dispersan de un cultivo de islote y químicos o moléculas biológicas se incorporan en los islotes pequeños resultantes .

15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las células son células no de islote.

16. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque los divots son de 100 µ?? (+ 20%) de diámetro y 60 µ?? (+ 201) de profundidad.

17. Un método para probar una pluralidad de muestras de células para dar respuesta a un químico, caracterizado porque comprende las etapas de (a) cultivar células en un dispositivo que comprende una pluralidad de divots, en donde cada divot está entre 100 y 200 µt? de diámetro (± 10%) y 50 y 150 µp? de profundidad (± 10%) , (b) introducir un químico de prueba a cada divot, y (c) analizar la respuesta de las células al químico de prueba.

18. Una población aislada de islotes, caracterizada porque al menos 80% de todos los islotes están por debajo de 90 m de diámetro, los islotes tienen barreras de difusión baja con relación a los islotes grandes nativos, y en donde los islotes tienen alta viabilidad celular con relación a los islotes nativos pequeños y grandes, y en donde la producción de insulina del islote se caracteriza por niveles que son mayores de 10 veces más que los islotes aislados nativos.

19. La población de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque una mayoría de los islotes son esféricos.

20. La población de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque los islotes comprenden células alfa pancreáticas, células beta pancreáticas y células delta pancreáticas .

21. La población de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque al menos 85% de los islotes son viables.

22. La población de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque al menos 80% de todos los islotes son menores de 50 µp? de diámetro.

23. La población de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque al menos 50% de los islotes son menores de 37 mde diámetro.

24. La población de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque las células beta de islote producen insulina en cantidades mayores en comparación con las células beta aisladas de islotes pequeños nativo o islotes grandes nativos.

25. La población de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque los islotes tienen barreras de difusión baja con relación a los islotes grandes nativos, y en donde los islotes tienen alta viabilidad celular con relación a los islotes nativos pequeños y grandes .