BR112012025172B1 - células de ilhotas gabaritadas e agrupamentos de células de ilhotas pequenas para tratamento de diabetes. - Google Patents

Abstract

células de ilhotas gabaritadas e agrupamentos de células de ilhotas pequenas para tratamento de diabetes. um andaime tendo células ilhotas ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas fixados ao mesmo em uma camada múltipla e um molde tendo tufos para cultivar ilhotas, em que a formação de ilhotas é influenciada pela forma e pelas dimensões dos tufos, são divulgados.

Description

(54) Título: CÉLULAS DE ILHOTAS GABARITADAS E AGRUPAMENTOS DE CÉLULAS DE ILHOTAS PEQUENAS PARA TRATAMENTO DE DIABETES.

(51) Int.CI.: A61L 27/14; A61K 35/12; A61K 35/39; A61L 27/18; A61L 27/38 (30) Prioridade Unionista: 06/04/2010 US 12/798,529 (73) Titular(es): UNIVERSITY OF KANSAS (72) Inventor(es): CORY BERKLAND; LISA A. STEHNO-BITTEL; TERUNA SIAHAAN; KARTHIK RAMACHANDRAN (85) Data do Início da Fase Nacional: 02/10/2012

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CÉLULAS DE ILHOTAS GABARITADAS E AGRUPAMENTOS DE CÉLULAS

DE ILHOTAS PEQUENAS PARA TRATAMENTO DE DIABETES

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido é uma continuação em parte de pedido US 11/589.063 depositado em 30 de outubro de 2006. O pedido acima mencionado é incorporado por referência.

DECLARAÇÃO REFERENTE A PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL

N/D

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção geralmente refere-se às composições e processos para criação de células de ilhotas viáveis, ilhotas e agrupamentos de células de ilhotas pequenas.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

O aumento nos casos de diabetes mellitus nos Estados Unidos foi chamado de epidêmico. A diabetes é a terceira causa principal de morte por doenças e compete com doença cardíaca e câncer como uma causa principal de morte dos cidadãos americanos. Por razões não explicadas, a ocorrência de diabetes tipo 1 está aumentando em todo o mundo, e a idade de início reduziu em ter a cinco anões na última década de modo que muitas crianças agora desenvolvem diabetes antes de entraram na escola. O resultado é que mais pessoas com diabetes irão gastar uma grande parte de suas vidas em risco de desenvolver as complicações crônicas relacionadas a diabetes tipo 1. Uma vez que o risco para o desenvolvimento da maior parte das complicações crônicas associadas com diabetes está relacionada a controle glicêmico, a atenção

2/86 significativa é direcionada para novas terapias, como transplante de ilhotas, para melhorar o controle glicêmico.

Os transplantes de ilhotas foram primeiro tentados nos anos 1980s. As taxas de sucesso inicial para transplante de ilhotas em humanos foram decepcionantes com somente 5% de pacientes recebendo transplantes conseguindo função parcial. Ver Sutherland et al, Evolution of kidney, pancreas, and islet transplantation for patients with diabetes na Universidade de Minnesota, Am. J. Surg. 166: 456491 (1993). Entre as falhas foram historias isoladas de sucesso de indivíduos que conseguiram reversão prolongada de suas diabetes por um período de 1 a 2 anos, o que encorajou pesquisadores a continuarem esta abordagem para o tratamento da diabetes. Em 2000, os transplantes de ilhotas foram realizados com sucesso em sete pacientes com diabetes usando um regime de supressão que omitiu glicocorticoides, agora referenciado como protocolo de Edmonton. Ver Ridgway et al, Pancreatic islet cell transplantation: progress in the clinicai setting, Treat. Endocrinol. 2(3): 173-189 (2003). Assim, os resultados do transplante de ilhotas melhoraram notoriamente. Ver Shapiro et al, Clinicai results after islet transplantation, J. Investig. Med. 49(6): 559-562 (2001); Balamurugan et al, Prospective and challenges of islet transplantation for the therapy of autoimmune diabetes, Pancreas 32(3): 231243 (2006). Ainda, independente do otimismo gerado por estes resultados, as barreiras ao uso de transplante de ilhotas como um tratamento prático para diabetes ainda existe, com uma barreira sendo o número limitado de órgãos doadores considerando que a maior parte dos indivíduos requer vários transplantes para conseguir a independência da insulina.

Muitos fatores têm um efeito no sucesso do transplante, incluindo as

3/86 características físicas da ilhota. Cerca de 20 anos atrás, pesquisadores descreverem em detalhe o tamanho e formato de ilhotas e determinaram um método para estimar o volume da ilhota. Ver Bonnevie-Nielsen et al , Pancreatic islet volume distribution: direct measurement in preparations stained by perfusion in situ, Acta Endocrinol. (Copenh) 105(3): 379-84 (1984). Por muitos anos, grandes ilhotas foram tradicionalmente consideradas desejáveis para locais de transplante, por várias razões: (1) a presença de ilhotas grande é considerada um marco de uma boa digestão pancreática, uma vez que as ilhotas podem ser fragmentadas por excessiva digestão, e (2) volume é usado para determinar o número mínimo de ilhotas necessário para transplante e porque a duplicação de diâmetro de ilhota é equivalente a um aumento de oito vezes em seu volume, ilhotas maiores conferem uma contribuição maior ao número de ilhotas equivalentes na preparação.

Nos anos recentes, pesquisadores modelaram o transporte de oxigênio, glicose, e insulina através da ilhota. Ver Dulong et al., Contributions of a finite element model for the geometric optimization of an implantable bioartificial pancreas, Artif. Organs 26(7): 583-9 (2002). O transporte limitado de oxigênio pode propagar a morte celular no centro de ilhotas se a taxa de consumo de oxigênio por células periféricas excede a taxa de difusão de oxigênio na ilhota. Por exemplo, estudos recentes indicam que ilhotas maiores apresentam necrose aumentada quando expostas a condições de hipóxia. De fato, quase todas as células beta morreram quando o diâmetro da ilhota excedeu 100-150 pm. Ver Giuliana et al, Central necrosis in isolated hypoxíc human pancreatic islets; evidence for postisolation ischemia, Cell Transplantation 147 67-76 (2005); MacGregor et al, Small rat islets are superior to large islets in vitro function and in

4/86 transplantation outcomes, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290(5): E771-779 (2006). O estresse oxidativo resultante pode agravar a apoptose e a resposta imune no transplante. Ver Bottino et al., Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment, Diabetes 53(10): 2559-68 (2004). Mesmo em casos onde a morte não ocorreu, uma taxa metabólica reduzida no centro da ilhota é provável.

O transporte retardado de glicose e insulina ainda diminui a funcionalidade de ilhotas pancreáticas. O gradiente de glicose dentro de uma ilhota faz com que as células periféricas entrem em contato com concentrações muito maiores de glicose do que aquelas contidas no centro da ilhota. Ver Kauri et al., Direct measurement of glucose gradients and mass transport within islets of Langerhans, Biochem. Biophys. Res. Commun. 304(2): 371-7 (2003). O formato deste gradiente é diretamente relacionado ao diâmetro da ilhota e a taxa de metabolismo de glicose. Aumentando o diâmetro da ilhota aumenta esta barreira de difusão e consumo em todos os planos dentro da ilhota.

Para encontrar outra fonte de células beta produtoras de insulina, houve esforços para cultivar as células beta em cultura in vitro. Estes métodos focaram no cultivo de células beta de tecido fetal ou derivando ditas células de células tronco que produzem ilhotas ou células progenitoras. Ver, por exemplo Peck et al.

, Patente US 6.703.0 17; Brothers, WO 93/004 11 ( 1 993 ); Neilsen, WO 86/01530 (1986); Zayas, EP 0363 125 (1990); Bone et al, Microcarriers; A New Approach to Pancreatic Islet Cell Culture, In Vitro Vol. 18, N.° 2 Feb. (1982). Infelizmente, ditas técnicas são geralmente demoradas and requerem a capacidade de um tecido fetal rato ou células-tronco como suas fontes e resulta em uma monocamada confluente de células beta cultivadas. Assim, ainda resta

5/86 uma necessidade para criar células de ilhota viáveis mais eficientes, disponíveis e técnicas confiáveis.

Em uma tentativa de superar esta barreira de difusão encontrada na arquitetura de grandes ilhotas intactas, várias tentativas foram feitas pelos presentes inventores para crescer várias camadas de células de ilhotas em microesferas de polímero para implantação. As microesferas mostradas na FIG. 1 A foram projetadas para estar dentro da faixa de tamanho de ilhotas intactas. Unindo células beta à superfície externa da microesfera, foi teorizado que deve haver pouca ou nenhuma morte devido às barreiras de difusão. Várias tentativas foram deitas usando diferentes ambientes de cultura para otimizar a ligação das células às microesferas, incluindo o uso de células em suspensão de densidade extremamente alta. No entanto, este método rapidamente esgotou o meio de nutrientes e a sobrevivência da célula foi fraca. Outras técnicas incluíram as células que foram gotejadas lentamente nas microesferas para aumentar a interação física das células com a microesfera ou cocultivaram as células e microesferas em uma câmara de microgravidade por vários dias. Quando algumas células beta poderíam se ligar às microesferas de polímero, suas distribuições estavam desiguais, e várias camadas de células ligadas não nunca foram consistentemente conseguidas (FIG. IB).

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada para um dispositivo implantável compreendendo um andaime substancialmente planar compreendido de um biomaterial contendo uma superfície principal, e células de ilhota individuais ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas unidas em uma camada múltipla à superfície do andaime de biomaterial. As células de ilhota

6/86 individuais ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas são preferencialmente derivados de ilhotas intactas adultas. Moléculas de adesão celular (por exemplo, integrinas, caderinas, selectinas, e imunoglobulinas) podem ser unidos ao andaime para facilitar a ligação de células de ilhota individuais ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas ao andaime. Ainda, um ou mais fatores de angiogênese, agentes imunossupressores (incluindo supressores autoimunes), antibióticos, antioxidantes, anti-citocinas, ou anti-endotoxinas podem ser liberados de modo controlável a partir do andaime para melhorar a viabilidade de células de ilhotas e agrupamentos de células de ilhotas pequenas.

Em outro aspecto, o Andaime de biomaterial é um biomaterial flexível, e pode ser compreendido de um polímero biocompatível e/ou biodegradável, como poli(DL-lactida-co-glicolida) (PLG), ácido poliláctico (PLA), ou poli(ácido láctico-coglicólico) (PLGA).

Ainda em outro aspecto, a camada múltipla compreende uma combinação de células beta produtoras de insulina e outros tipos de células de ilhotas. A camada múltipla é preferencialmente cerca de 1-2 a 5 células de espessura, e forma uma camada múltipla cerca de 10 a 50 pm de espessura. A camada múltipla preferencialmente tem uma espessura uniforme de modo que a espessura de célula varie em não mais do que 1 a 2 células através de superfície de Andaime de biomaterial.

Ainda em outro aspecto, as células de ilhota individuais ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas são derivadas de ilhotas adultas intactas usando digestão enzimática e/ou cultura em um meio esgotado de cálcio.

A presente invenção ainda fornece um método de formação do dispositivo 25 implantável. Em particular, as técnicas para derivar células de ilhota individuais ou

7/86 agrupamentos de células de ilhotas pequenas a partir de ilhotas intactas são fornecidas (por exemplo, digestão enzimática, esgotamento de cálcio, ou uma combinação dos mesmos). Além disso, os métodos para ligação das células de ilhota individuais e/ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas são fornecidos, o que inclui centrifugação de uma suspensão de células e o uso de moléculas de adesão celular para melhorar a ligação da superfície do andaime.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de uso de dispositivos implantáveis da presente invenção como um tratamento para diabetes. Os métodos para implantar os dispositivos e técnicas para tratamento de diabetes são descritos.

Em uma modalidade, a invenção é uma superfície para cultivar células compreendendo um substrato compreendendo uma superfície superior substancialmente planar, em que a superfície compreende uma pluralidade de tufos. Cada tufos compreende uma superfície interior e uma superfície de parede lateral interior. A superfície inferior é rodeada e cada tufo está entre 100-200 pm de diâmetro (±20) e 50-150 pm em profundidade (±20).

Em outra modalidade, a invenção é um dispositivo para cultivar células compreendendo a superfície descrita acima e, além disso, compreendendo um sistema para manter a superfície planar. O sistema forma uma superfície inferior e uma superfície de parede lateral interior e um volume interior, o inferior e paredes laterais substancialmente juntos aos líquidos. Quando o dispositivo é usado, as células e meio de cultura são distribuídos no volume interior. Em uma modalidade preferencial, as células são células de ilhotas. Em outra modalidade preferencial, as células são não células de ilhotas selecionadas do grupo que consiste de células-tronco, linhagens de cultura de células, células primárias ou recém8/86 dispersas. Em outra modalidade preferencial, as células são células de ilhotas e os tufos são 100 pm (± 20%) em diâmetro e 60 pm (± 20%) em profundidade.

Em outra modalidade, a invenção é um método para cultivar células compreendendo introduzir células a uma superfície compreendendo uma pluralidade de tufos, em que cada tufo está entre 100 e 200 pm em diâmetro (±20%) e 50 e 150 pm em profundidade (±20%), e expondo o dispositivo às condições de cultura de células. Em uma modalidade preferencial, as células são células de ilhota e as células se reagregam em pequenas ilhotas após exposição ao dispositivo e condições de cultura de suporte. Em uma modalidade preferencial, as células se assentam nos tufos em uma razão de aproximadamente 20-150 células por 1 tufo.

Em outra modalidade preferencial, as células foram dispersas de uma cultura de ilhota e moléculas não nativas são projetadas nas ilhotas pequenas resultantes. Em outra modalidade preferencial, as células não ilhotas são selecionadas do grupo que consiste de células-tronco, linhagens de culturas de células, células primárias ou recém-dispersas.

Em outra modalidade, a invenção é um método para testar uma pluralidade de amostras de células para resposta a um produto químico introduzido compreendendo as etapas de (a) cultivar células em um dispositivo compreendendo uma pluralidade de tufos, em que cada tufo está entre 100 e 200 pm em diâmetro (±10%) e 50 and 150 pm em profundidade (±10%), (b) introduzir um produto químico de teste a cada tufo, e (c) analisar a resposta das células a um produto químico teste.

Em outra modalidade, a invenção é uma população isolada de ilhotas em que pelo menos 80% de todas as ilhotas estão abaixo de 90 pm em diâmetro e

9/86 em que as ilhotas têm barreiras de difusão em relação às ilhotas grandes nativas. Preferencialmente, as ilhotas têm uma viabilidade celular relativa à ilhotas pequenas nativas e grandes, e produção de insulina em ilhotas é caracterizada por níveis que são maiores do que 10 vezes mais do que as ilhotas isoladas nativas. Em uma modalidade preferencial, uma maior parte de ilhotas é esférica. Em uma modalidade preferencial, as ilhotas compreendem células alfa pancreáticas, células beta pancreáticas e células delta pancreáticas. Em uma modalidade preferencial, pelo menos 85% das ilhotas são viáveis. Em uma modalidade preferencial pelo menos 80% de todas as ilhotas são menos do que 50 pm em diâmetro. Em uma modalidade preferencial pelo menos 50% das ilhotas são menos do que 37 pm em diâmetro. Em uma modalidade preferencial, as células beta de ilhotas produzem insulina em quantidades maiores comparadas a células betas de ilhotas pequenas nativas ou ilhotas grandes nativas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Esta patente ou depósito de patente contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenhos em cor serão fornecidos pelo Escritório na solicitação e pagamento de taxas necessárias.

As FIGS. 1 A e B ilustram tentativas anteriores para crescer células beta em polímeros de microesferas para implantação em um paciente. Nas imagens, uma distribuição de células desigual é mostrada ligada a um PLGA microesfera revestida com polímero de quitosana. Uma monocamada parcial de células foi tudo que pode ser obtido após uma incubação em longo prazo com células beta.

A FIG. 2 é um gráfico que compara a viabilidade celular para ilhotas

10/86 grandes de rato cultivadas (mais do que 125 pm), pequenas ilhotas (menos do que 125 pm), e células beta dispersas como uma função do tempo. A viabilidade reduzida de grandes ilhotas é estatisticamente significativa (p < 0,05) além do dia

3.

As FIGS. 3 A e B sumarizam os resultados do transplante de pequenas ilhotas (menos do que 125 pm) ou grandes ilhotas (mais do que 125 pm) em ratos diabéticos. Um retorno bem sucedido a euglicemia foi observado cerca de 80% do tempo quando pequenas ilhotas foram usadas, mas os transplantes foram não bem sucedidos na restauração de níveis normais de glicose plasmática quando as ilhotas grandes foram transplantadas. Isto pode ser mais bem ilustrado mostrando o nível de glicose plasmática do animal em cada grupo 60 dias após o transplante. Os animais que receberam ilhotas grandes permaneceram hiperglicêmicos após o transplante, enquanto os ratos que receberam pequenas ilhotas foram euglicêmicos. * indica diferença significativa de 0,01.

A FIG. 4 é um enxerto de ilhota removido de cápsula cerca de oito semanas após o transplante e imunorotulado para insulina. A imagem no painel a esquerda mostra insulina relativamente mais imunomarcada (vermelho) e uma rede capilar estabelecida em um enxerto usando pequenas ilhotas (menos do que 125 pm). Em contraste, enxertos de ilhotas grandes (maior do que 125 pm) mostrasse imunomarcação de insulina e fibras significativa (painel a direita). As imagens são representativas de quatro animais diferentes.

A FIG. 5 mostra um agrupamento de célula de ilhotas pequenas de rato corado com ditizona para identificar células beta. Porque a abertura confocal foi definida para uma seção de Z extremamente fina, as células dentro da subunidade, mas abaixo do plano de foco, são borradas e não aparecem

11/86 vermelhas. No entanto, o ajuste no plano confocal para as células indicou que eles também claramente foram coradas com ditizona.

A FIG. 6 (painel A) mostra a coloração viva/morta de um agrupamento de célula de ilhota feita a partir de uma ilhota adulta intacta usando dispersão enzimática. Este aglomerado de célula da ilhota é aproximadamente 40 pm em diâmetro. No painel superior direito da FIG. 6 (painel B), um aglomerado de célula de ilhota pequena derivada do cultivo de uma ilhota intacta com um meio esgotado de cálcio é mostrado. O aglomerado de célula de ilhota foi desenrolado ou aberto assim que o meio foi capaz de cercar as células no agrupamento. Na FIG. 6 (painel C), um agrupamento de células de ilhota derivado usando a depleção de cálcio e dispersão enzimática é mostrado. O diâmetro do fragmento foi aproximadamente 15 pm. A FIG. 6 (painel D) mostra células de ilhota individuais derivadas de uma combinação de depleção de cálcio e digestão enzimática, seguido por pipetagem manual. O vermelho indica as células mortas e células verdes são vivas. Barra de escala no painel B aplica-se dos Painéis A a C.

A FIG. 7 é uma representação esquemática da produção de um adesivo contendo uma camada múltipla de células da ilhota ligadas a este em conformidade com a presente invenção.

A FIG. 8 são micrografias ópticas de adesão de célula beta a (A) quitosana (Mw = 100 kDa) e (B) laminina. A inserção mostra micrografias ópticas e fluorescentes de uma célula beta em laminina com corante cytoch B (verde) para actina.

A FIG. 9 demonstra os resultados quando camadas de células da ilhota em um adesivo de polímero composto 50: 50 ALGA-carboxil (5,5 kDa). Os adesivos foram opticamente seccionados usando um microscópio confocal. As imagens

12/86 foram processadas para obter a fatia de seção Z mostrada. O painel superior ilustra um adesivo com uma ou duas camadas de células e camadas celulares adicionais foram adicionadas, em seguida, como mostrado. As células foram separadas em camadas no andaime girando-as em uma centrífuga de placa em cerca de 3500 rpm por cerca de 10 minutos. As camadas permaneceram unidas ao andaime de polímero após lavagem repetida.

A FIG. 10 é uma descrição esquemática do desenho geral de um micro molde com tufos. Neste exemplo PDMS é o material compreendendo o alojamento do micro molde e vidro jateado é o substrato em que os tufos são jateados.

A FIG. 11 é uma micrografia mostrando uma visão de baixo para cima de tufos vazios em um micro molde; o padrão de tufos descrito aqui é representativo do desenho do micro molde B.

A FIG. 12 é um gráfico gerado por um perfilômetro ilustrando a profundidade de um tufo único e a forma de fundo redondo do tufo.

A FIG. 13 é um diagrama esquemático ilustrando o andaime utilizado para a produção do micro molde. Componentes do micro molde e andaime para construir o micro molde são: [1] um tubo de cobre grande; [2] um tubo de cobre pequeno; [3] polímero PDMS, que compreende o sistema que aloja a superfície em tufo; [4] uma superfície plana, como um quadrado grande de vidro embrulhado em folha de alumínio, usado como uma base em que constrói o micro molde; [5] as paredes verticais do alojamento micro molde; [6] a base do micro molde, mostrada aqui verteram a uma profundidade de 2 mm; e [7] o vidro jateado, que é o substrato em tufo.

A FIG. 14 é uma micrografia que mostra reagregação de célula de ilhota

13/86 dentro dos tufos de um micro molde nos dias 2 e 5.

A FIG. 15 é uma micrografia mostrando a borda sem tudo do substrato em tufo adjacente ao campo de tufos; os tufos contém pequena reagregação de células de ilhota, mas as células que caem na superfície sem tufos se reagregaram em grande mega-ilhotas.

A FIG. 16 é uma micrografia mostrando células de ilhotas vivas congregadas na borda de um poço em uma placa disponível comercialmente; a reagregação de células da ilhotas não é esférica como no molde micro, e o grupo reagregado de células da ilhota é muito maior do que 90 pm de ilhotas formadas em micro moldes.

A FIG. 17 A e B são um conjunto de diagramas esquemáticos mostrando dois possíveis padrões de tufo possível para o micro molde; Fig. 17A é um desenho onde tufos estão próximos um do outro, que seria útil ao tentar maximizar o número de reagregados formado em um único molde micro; Fig. 17 B é um desenho onde tufos são espaçados mais distante um do outro, que seria útil ao manipular o tratamento de células em tufos individuais.

A FIG. 18 é uma micrografia mostrando duas ilhotas reagregadas contidas em um único tufo.

A FIG. 19 A e B é um conjunto de micrografias que mostram a viabilidade corando em ilhotas reagregadas, vermelho indica células mortas. A FIG. 19 A mostra que ilhotas reagregadas dentro de micro moldes contêm poucas células mortas, apenas uma célula morta é corada na ilhota superior, enquanto não há nenhuma evidência de morte celular na ilhota menor. A FIG. 19 B mostra uma mega-ilhota formada na superfície sem tudo do micro molde, em que há pelo menos 23 células de ilhotas mortas no plano confocal de vista.

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A FIG. 20 é um gráfico comparando a viabilidade de ilhotas pequenas nativas e grandes nativas com ilhota desagregada. Todas as ilhotas foram retiradas dos mesmos ratos e uma porção de ilhotas isoladas foi dispersada em células da ilhota para reagregação. No dia cinco, as ilhotas reagregadas foram retiradas do micro molde e todas as ilhotas foram expostas à corantes de viabilidade de vivas/mortas. O percentual de células vivas em ilhotas reagregadas foi maior do que para as ilhotas pequenas ou grandes nativas.

A FIG. 21 mostra duas ilhotas representativas 6 dias após reagregação em tufos de micro molde que foram corados triplamente para identificar células beta (verde), células alfa (vermelho) e células delta (azul). A ilhota superior mede 43 x 55 pm em diâmetro (medida nas direções X e Y), e a ilhota de fundo mede 48 x 65 pm em diâmetro.

A FIG. 22 mostra uma ilhota reagregada no dia 6 formada em um tufo micro molde que foi corado para insulina (verde) e proinsulina (vermelha). Esta ilhota é 45 x 54 pm em diâmetro (medida nas direções X e Y).

A FIG. 23 é um gráfico descrevendo secreção de insulina em três tipos de ilhotas exposta a diferentes condições de glicose. Pequenas ilhotas nativas e ilhotas reagregadas em tufos micro molde foram expostas a baixas condições de glicose (3 mM); insulina secretada no meio foi coletada e quantificada como indicado pelo eixo Y. Pequenas ilhotas nativas, ilhotas grandes nativas e ilhotas reagregadas em tufos micro molde foram expostas a altas condições de glicose (20 mM); insulina secretada no meio foi coletada e quantificada como indicado pelo eixo Y.

A FIG. 24 é um fluxograma esquemático ilustrando o método geral para usar o molde micro atual para reagregar as ilhotas de tamanho ideal.

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A FIG. 25 é um fluxograma esquemático ilustrando um uso exemplar do micro molde presente para testes de drogas de alto rendimento.

A FIG. 26 mostra ilhotas reagregadas em meios contendo glicose 2-[N-(7nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino]-2-deoxi-D (2-NBDG; 20 mM). Círculos indicam a localização das ilhotas. 2-NBDG, um análogo de glicose fluorescente, é totalmente integrado em cada ilhota reagregada.

A FIG. 27 mostra um desenho para o cunho negativo (feito de metal ou SU8) que podería ser usado para criar os moldes de biopolímero. O produto final teria tufos semelhantes aos criados em moldes de vidro.

A FIG. 28 A e B ilustram o desenho do cunho negativo incluindo rótulos para identificar a localização de cada tufo dentro de um campo de tufos em cada micro molde. Como mostrado na FIG. 28 A, diferentes formatos poderia ser projetados para o fundo do tufo com mais precisão do que o método de jateamento de vidro. A FIG. 28 B demonstra uma porção de um molde de biopolímero final contendo tufos com distinção entre marcadores.

A FIG. 29 A e B compara duas ilhotas de aproximadamente o mesmo tamanho. A FIG. 29 A é um exemplo de uma ilhota esférica reagregada. A FIG. 29 B descreve uma ilhota pequena nativa. A forma, tamanho e borda externa tipo capsular mole são semelhantes para ambas ilhotas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

A. Em geral

Todos os pedidos de patentes, patentes, e publicações citadas nesta especificação são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. No caso de inconsistências, a presente revelação, incluindo definições, vai prevalecer.

Como usado aqui, a termo o termo “ilhota de Langerhabs ou “ilhota”

16/86 refere-se a um grupo de células especializadas no pâncreas que produzem e secretam hormônios. Uma ilhota geralmente contém um ou mais dos seguintes tipos de células: (1) células alfa que produzem o glucagon, que eleva o nível de glicose (açúcar) no sangue; (2) células beta que produzem insulina; (3) células delta que produzem somatostatina que inibe a liberação de vários outros hormônios no corpo; (4) células PP produtoras de peptídeo pancreático; (5) células D1, que secretam peptídeo vasoativo intestinal; ou (6) células EC que secretam secretina, motilina e substância P.

Conforme usado aqui, o termo “célula de ilhota” refere-se a qualquer uma das células encontradas em uma ilhota. As células da ilhota usadas na presente invenção são preferencialmente uma combinação de células beta que produzem insulina além de outros tipos de células de ilhotas.

Conforme usado aqui, o termo agrupamento de célula de ilhota pequena” ou “fragmento de ilhota” refere-se a uma coleção de células de ilhota unidas, geralmente menos do que cerca de 25 células de ilhotas no agrupamento. O agrupamento de células de ilhotas pequenas preferencialmente tem uma morfologia que a barreira de difusão para qualquer célula dentro do agrupamento (por exemplo, para nutrientes, oxigênio, glicose, etc.) é não mais do que cerca de 7 células. Tipicamente, a barreira de difusão é menos do que cerca de 5 células, e pode ser tão baixo quanto 4, 3, ou 2 células. O “agrupamento de células de ilhota pequena” preferencialmente compreende células beta como o tipo de célula predominante, e pode opcionalmente incluir um ou mais outros tipos de célula de ilhota. Os agrupamentos de células de ilhotas pequenas podem ter uma variedade de formas (por exemplo, geralmente esférica, alongada, ou de outra forma assimétrica). Exemplos de agrupamentos de células de ilhotas pequenas são

17/86 mostrados nas FIGS. 5 e 6(A), 6(B), e 6(C). Os agrupamentos de células de ilhotas pequenas são preferencialmente derivados por dispersão de ilhotas maiores intactas isoladas a partir de um pâncreas doador.

Conforme usado aqui, o termo ilhota nativa refere-se a ilhotas derivadas de um pâncreas de animal. Ilhotas nativas podem ser caracterizadas como ilhotas grandes nativas contendo um diâmetro maior do que 125 pm, preferencialmente maior do que 150 pm, ou ilhotas pequenas nativas contendo um diâmetro de menos do que 125 pm.

Conforme usado aqui, o termo mega-ilhota refere-se a uma ilhota reagregada contendo um diâmetro maior do que cerca de 300 pm.

Conforme usado aqui, o termo ilhota intacta adulta refere-se a uma ilhota grande nativa ou ilhota pequena nativa derivada de um pâncreas mamífero de adulto, em que a ilhota não foi quebrada.

Conforme usado aqui, o termo células de ilhota dispersa refere-se a uma suspensão de células, preferencialmente derivado por rompimento de ilhotas grandes de modo que as células da ilhota são uniformemente distribuídas em suspensão. Preferencialmente, não menos do que 90% de células de ilhota em suspensão, o restante compreendendo dubletos (duas células unidas) e tripletos (três células unidas), e grupos maiores muito pequenos de células unidas a outras.

Conforme usado aqui, o termo ilhota reagregada refere-se a uma coleção de células de ilhotas unidas, preferencialmente derivadas por quebra de ilhotas grandes em células de ilhotas únicas e cultivando as células de ilhotas juntas nos grupos para formar ilhotas. Preferencialmente, a reagregação de células de ilhotas únicas em ilhotas é influenciada pelas dimensões físicas dos tufos no

18/86 micro molde. O número de células de ilhota individuais usadas para formar uma ilhota reagregada é dependente do tamanho desejado do produto ilhota.

Conforme usado aqui, o termo barreira de difusão refere-se à inibição de movimento de molécula a partir de uma área de alta concentração (por exemplo, concentração de oxigênio ou glicose fora da célula) a uma área de baixa concentração (por exemplo, concentração de oxigênio ou glicose dentro de uma célula). Ilhotas grandes apresentam barreiras de difusão relativamente altas de oxigênio, o que limita sua viabilidade e utilidade para transplante. Ilhotas reagregadas em moldes micro são pequenas em relação a ilhotas grandes nativas e exibem uma barreira de difusão relativamente baixa, o que contribui para a viabilidade celular dentro de ilhotas reagregadas.

Conforme usado aqui, o termo “viabilidade celular” refere-se a uma medida da quantidade de células que estão vivas ou mortas, baseado em uma amostra de célula total. Viabilidade de célula alta, conforme definido aqui, refere-se a uma população de células em que mais do que 85% de todas as células são viáveis, preferencialmente mais do que 90-95%, e mais preferencialmente uma população caracterizada pela viabilidade celular alta contém mais de 99% de células viáveis.

Conforme usado aqui, materiais destinados que entram em contato com fluidos biológicos ou de tecidos (como implantação ou transplante em um sujeito) são denominados “biomateriais”. É desejável que os biomateriais induzam reações mínimas entre o material e o ambiente fisiológico. Biomateriais são considerados biocompatíveis se, após ser colocado no ambiente fisiológico, há uma reação inflamatória mínima, sem evidência de reação anafilática, e crescimento celular mínimo na superfície do biomaterial. Após a implantação em um mamífero hospedeiro, um biomaterial biocompatível não induz uma resposta

19/86 no hospedeiro suficiente para afetar prejudicialmente a função da microcápsula; ditas respostas de hospedeiro incluem a formação de estruturas fibróticas em ou em torno do biomaterial, rejeição imunológica do biomaterial, ou liberação de compostos tóxicos ou pirogênicos do biomaterial no tecido circundante do hospedeiro.

Conforme usado aqui, o termo cáustico refere-se a um processo químico usado ácido para criar tufos em um substrato.

Conforme usado aqui, o termo tufo significa um poço localizado ou câmara em um substrato compreendendo um fundo e uma parede lateral (ou seja, um espaço esburacado, contendo largura e profundida). Em uma modalidade, para a reagregação de ilhotas um tufo é menos do que 100 pm em diâmetro e 60 pm em profundidade. Por exemplo, o tufo podería ser 80 pm em diâmetro e 48 pm em profundidade. Em outras modalidades, onde se deseja ilhota reagregadas, os tufos são entre 80 - 120 pm em diâmetro e 48 - 72 pm em profundidade. Para outras finalidades, como crescimento de mini-tumores para teste de drogas, o diâmetro ideal de tufo podería ser entre 100 e 200 pm em diâmetro e 60 a 100 pm em profundidade.

Conforme usado aqui, o termo substrato em tufo refere-se a um suporte sólido ou qualquer outro material que foi modificado para conter tufos individuais discretos.

Conforme usado aqui, o termo micro molde refere-se a um dispositivo contendo uma superfície compreendida de uma pluralidade de tufos, em que os tufos medem entre 100 e 200 pm em diâmetro. O padrão físico de tufos no micro molde pode ser especificado pelo fabricante do micro molde. O micro molde preferencialmente compreende duas partes principais, ί) o substrato em tufo e ii)

20/86 um sistema para alojar o substrato em tufo e contém células e meio nestes. O molde de micro é usado para orientar ou determinar o crescimento ou reagregação de células colocadas nele.

Conforme usado aqui, o termo alojamento de molde refere-se à estrutura para alojar ambos o substrato em tufo e qualquer líquido e materiais celulares adicionados a estes.

Conforme usado aqui, o termo andaime de alojamento refere-se a uma estrutura temporária que é usada para suportar e influenciar a forma de materiais durante a construção do micro molde.

Conforme usado aqui, o termo evaporação catódica significa um método de deposição de vapor usado para depositar uma superfície de filme fina no substrato.

B. Células de Ilhotas Unidas como uma Camada Múltipla

Em uma modalidade, a presente invenção destina-se a um método para produzir células viáveis de ilhota individuais ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas para implantação. Em um aspecto, células de ilhotas individuais ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas isoladas de pancreases doadoras não fetais estão conectadas em uma camada múltipla à superfície de um andaime de biomaterial adequado.

Em um aspecto, células de ilhota individuais, preferencialmente células beta, estão conectadas ao andaime do biomaterial. Em outro aspecto, uma combinação de vários tipos de células da ilhota está conectada ao andaime do biomaterial. Ainda outro aspecto, agrupamentos de células de ilhotas pequenas composto de dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez células estão conectados ao andaime do biomaterial.

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Em outra modalidade, uma camada múltipla de um para dois, três, quatro ou cinco camadas de células da ilhota estão conectadas ao Andaime de biomaterial. As células de ilhotas e agrupamentos de células de ilhotas pequenas no Andaime de biomaterial a partir de uma camada múltipla de células cerca de 10 a 50 pm de espessura, mais preferencialmente cerca de 20 a 40 pm em espessura.

Em um aspecto, a camada múltipla de ilhotas de células preferencialmente tem uma espessura uniforme de modo que a espessura de célula varie em não mais do que 1 a 2 células através de superfície de Andaime de biomaterial.

Em um aspecto, as células de ilhota individuais e/ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas são isoladas diretamente a partir de pâncreas de sujeito adulto doador e separada de ilhotas intactas. Métodos adequados para a divisão de ilhotas em células individuais e/ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas incluem digestão enzimática e dispersão a base de metal (depleção de cálcio) ou uma combinação destes.

Em outro aspecto, o andaime de biomaterial é composto de um material que fornece para a célula da ilhota individual adequada ou agrupamento de células de ilhotas pequenas a aderência ao andaime. É contemplado que os vários tipos de materiais, incluindo materiais orgânicos e inorgânicos, podem ser usados como o andaime de biomateriais da presente invenção. Exemplos não limitantes destes materiais incluem poli(ortoésteres), poli(anid retos), poli(fosfoésteres), poli(fosfazenos) e outros. Outros materiais não limitantes incluem, por exemplo, polisscarídeos, poliésteres (como poli(ácido láctico), poli(Llisina), poli(ácido glicólico) e poli(ácido láctico-co-glicólico)), poli(ácido láctico-colisina), poli(ácido láctico-graft-lisina), polianidretos (como poli(dímero de ácido

22/86 graxo), poli(ácido fumárico), poli(ácido sebácico), poli(carboxifenoxi propano), poli(carboxifenoxi hexano), copolímeros destes monômeros e semelhantes), poli(anidreto-co-imidas), poli(amidas), poli(orto ésteres), poli(iminocarbonatos), poli(uretanos), poli(organofasfazenos), poli(fosfates), poli(etilene vinil acetato), and outros acetatos de célula acil substituídos e derivados dos mesmos, poli(caprolactona), poli(carbonatos), poli(aminoácidos), poli(acrilatos), poliacetais, poli(cianoacrilatos), poli(estirenos), poli(vinil cloreto), poli(vinil fluoreto), poli(vinil imidazol), clorosulfonado poliolefinas, óxido de polietileno, copolímeros, poliestireno, e misturas ou copolímeros dos mesmos). Em certos aspectos preferenciais, os biomateriais incluem polisscarídeos, alginato, hidroxipropil celulose (HPC), Nisopropilacrilamida (IPA), polietilene glicol, polivinil álcool (PVA), polietilenimina, quitosana (CS), quitina, dextrano sulfato, heparina, condroitina sulfato, gelatina, etc., e seus derivados, copolímeros, e misturas dos mesmos. Outros biomateriais apropriados incluem aquelas náilon, hialuronan, politetrafluoroetileno, polivinil formamida, e outros descritos em Vats et al, Scaffolds and biomateriais for tissue engineering: a review of clinicai applications, Clin. Otolaryngol. Allied Sei. 28(3): 165-72 (2003); Wang et al, An encapsulation system for the immunoisolation of pancreatic islets, Nat. Biotechnol. 15(4): 358-62 (1997); Orive et al, Cell encapsulation: promise and progress, Nat. Med. 9( 1): 104-7 (2003), que são incorporados por referência.

Em aspectos preferenciais, o andaime de biomaterial é composto de um material biodegradável. Biomateriais biodegradáveis apropriados incluem poli(DLlactida-co-glicolida) (OLP), ácido poliláctico (PLA) ou poli (ácido láctico-coglicólico) (PLGA). PLG é um polímero bem-estudado para liberação da droga e é aprovado pela FDA para um número de aplicações in vivo. Ver Berkland et al,

23/86

Fabrication of PLG microspheres with precisely controlled and monodisperse size distributions, J. Contrai. Release May 18, 73(l): 59-74 (2001), que é incorporado por referência.

Em outro aspecto, o Andaime de biomaterial é revestido em todo ou em parte com um revestimento que aumenta a adesão de ilhota e célula beta. Revestimentos exemplares incluem fibronectina, polietileno glicol acetato, laminina, polivinil álcool (PVA), polietileno-alt-ácido maleico (ΡΕΜΑ), e quitosana (CS).

O andaime pode ainda ter uma ou mais moléculas de adesão celular a ilhotas (CAMs) unidas a esta para facilitar a ligação de célula individual e/ou ligação de agrupamento de célula de ilhota pequena ao andaime. Em outras aplicações, CAMs anteriormente demonstraram facilitar a ligação a célula ao polímero para engenharia do tecido (Dunehoo et al, Cell Adhesion Molecules for targeted drug delivery, J. Pharm. Sei. 95 : 1856- 1872 (2006)). Moléculas de adesão celular (CAMs) incluem, entre outras, integrinas (por exemplo, a_vb3, a_vbs, LFA-1, VLA-4), caderinas (por exemplo, E-, P-, e N-caderinas), selectinas (por exemplo, E-, L-, e P-selectinas), a superfamília de imunoglobulina (por exemplo, ICAM-1, I CAM-2, VCAM-1, e MadCAM-1), proteínas de matriz extracelulár (por exemplo, fibronectina, vitronectina, fibrinogênio, colágeno, laminina, e fato de von Willebrand), peptídeos de adesão de célula lineares e cíclicos e peptidomiméticos que são derivados de peptídeos RGD, peptídeos ICAM-1, peptídeos VCAM- 1, peptídeos caderina, e peptídeos LFA-1. CAMs são essenciais moléculas para a regeneração do tecido, morfologia celular, locomoção, mitose, citocinese, fagocitose e a manutenção da polaridade celular. CAMs são glicoproteínas encontradas na superfície das células que atuam como receptores de adesão de

24/86 célula para célula e célula de matriz extracelular (ECM). Mostrou-se anteriormente que moléculas de adesão celular como peptídeos RGD pode ajudar o processo de engenharia do tecido, regeneração de tecido, cicatrização de ferida, cirurgia de reconstrução, regeneração neural, enxertos ósseos, e transplante de órgão. Além disso, E-caderina demonstrou ser importante na adesão de célula β (HaugeEvans et al., Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MINE pseudoislets, Diabetes, 48: 1402- 1408 (1999)). Em um aspecto, as moléculas de adesão celular são ancoradas no polímero usando uma ligação covalente inclui, entre outros, um peptídeo, tioéter, dissulfeto, ou ligação de éster. Uma molécula espaçadora pode ser adicionada entre a molécula de adesão celular e polímero para permitir a livre interação entre as moléculas de adesão sobre o polímero e os receptores de adesão celular na superfície da célula. Estudos para células diferentes unidas ao polímero cravejado com peptídeos RGD demonstraram o espaçador ideal entre polímero e o peptídeo RGD é cerca de 11-46 angstroms para reconhecimento ideal dos peptídeos RGD pelos receptores de superfície celular. O espaçador pode ser feito de, entre outros, a polietilenoglicois (PEGS), poli aminoácidos (por exemplo, poli-Gly, poliLys, poli-Ala), poli ácidos amino caproicos (poli-Aca), e combinação de duas ou três repetições de aminoácido (por exemplo, poli-Aca— Gly). Além disso, a ligação covalente, as moléculas de adesão celular podem ser adsorvidas por primeiro unindo a molécula de adesão celular que pode ser adsorvida na rede de polímero do adesivo (por exemplo, eletrostaticamente, hidrofobicamente, ou por outras interações não covalentes) nos polímeros antes da ligação às células de ilhota.

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Em outro aspecto, o andaime de biomaterial tem um formato que facilita a ligação das células de ilhota individuais ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas a sua superfície. O andaime normalmente tem uma superfície substancialmente planar, como em um adesivo ou disco. Na modalidade preferencial, o andaime de biomaterial compreende um material adesivo flexível substancialmente planar.

O andaime de biomaterial tem um tamanho adequado para a fixação das células de ilhota individuais ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas. Por exemplo, em um aspecto, o adesivo tipicamente planar tem dimensões na ordem de cerca de 0,2 a 3 centímetros. A espessura do adesivo é tipicamente na ordem de cerca de 50 pm a 1 centímetro.

Ainda outro aspecto, o andaime de biomaterial pode controlavelmente liberar um ou mais fatores de crescimento, agentes imunossupressores, antibióticos, antioxidantes, anti-citocinas, anti-endotoxinas, bloqueadores de adesão de célula T, fatores de angiogênese, nutrientes ou suas combinações.

Fatores de crescimento exemplares incluem, epiregulina, fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de célula endotelial (ECGF), fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento de nervo (NGF), fator inibidor de leucemia (LIF), e proteína morfogenética de osso 4 (BMP-4), fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator de crescimento vascular endotelial A (VEGF-A), octapeptídeo colecistoquinina, fator de crescimento tipo insulina, e até mesmo a própria insulina. Ver genericamente Miao et al, In vitro and in vivo improvement of islet survíval following treatment with nerve growth factor, Transplantation Feb 27;81 (4): 519-24 (2006); Ta et al, The defined combination of growth factors contrais generation of long-term replicating

26/86 islet progenitor-like cells from cultures of adult mouse pancreas, Stem Cells, Mar 23 (2006); Johannson, Islet endothelial cells and pancreatic beta-cell proliferation: studies in vitro and during pregnancy in adult rats, Endocrinology May; 147(5) :23 15 -24 (2006), Epub Jan 26 (2006); Kuntz et al, Effect of epiregulin on pancreatic beta cell growth and insulin secretion, Growth Factors Dec 23(4):285-93 (2005); Vasadava, Growth factors and beta cell replication, Int. J. Biochem. Cell Biol. 38(56):93 1 -50 (2006), Epub Aug 3 1 Review (2005); Kuntz et al, Cholecystokinin octapeptide: a potential growth factor for pancreatic beta cells in diabetic rats, JOP, Nov 10;5(6):464-75 (2004).

Agentes exemplares imunossupressores são bem conhecidos e podem ser esteroidais ou não esteroidais. Agentes esteroidais preferenciais são prednisona. Agentes não esteroidais preferenciais incluem aquelas no chamado Protocolo de Edmonton: sirolimus (Rapamune, Wyeth-Ayerst Canada), tacrolimus (Prograf, Fujisawa Canada), e anti_IL2R daclizumab (Zenapax, Roche Canada). Outros agentes imunossupressores incluem 15-deoxispergualin, ciclosporina, rapamicina, Rapamune (sirolimus/rapamicina), FK506, ou Lisofylline (LSF).

Antibióticos exemplares úteis para a prática desta invenção incluem, entre outros, amoxicilina, penicilina, sulfas, eritromicina, estreptomicina, tetraciclina, claritromicina, ciproflózacina, terconazol, azitromicina e semelhantes.

Vários antioxidantes são conhecidos por especialistas na técnica. Moléculas são particularmente preferenciais incluindo grupos tiois como glutationa reduzida (GSH) ou seus precursores, glutationa ou análogos de glutationa, monoéster de glutationa, e N-acetilcisteína. Outros antioxidantes adequados incluem superóxido dismutase, catalase, vitamina E, Trolox, ácido lipóico, lazaroides, hidroxianisol butilado (BHA), vitamina K e semelhantes. Glutationa, por

27/86 exemplo, pode ser usada em uma faixa de concentração de cerca de 2 a cerca de 10 mM. Ver, por exemplo, patente US 5.710.172; 5.696.109; e 5.670.545.

Anti-citocinas apropriadas são bem conhecidas na técnica e incluem dimetiltioureia (cerca de 10 mM), citiolona (cerca de 5 mM), pravastatina sódica (PRAVACHOL, cerca de 20 mg/kg), L-NG-monometilarginina (L-NMMA, 2 mM), lactoferrina (cerca de 100 pg/ml), 4-metilprednisolona (cerca de 20 pg/ml), e semelhantes.

Anti-endotoxinas são ainda conhecidas na técnica e incluem L-N^Gmonometilarginina (L-NMMA, cerca de 2 mM), lactoferrina (cerca de 100 ug/ml), N-acetilcisteína (NAC, cerca de 1 mM), antagonistas de receptor de adenosina como bamifilina (teofilina), e compostos anti-lipopolissacarídeo como equinomicina (cerca de 10 nM), e semelhantes.

Ainda em outro aspecto, um bloqueador de adesão de célula T é fornecido aos biopolímeros implantados contendo células de ilhotas para suprimir a reação imune. A adição destes bloqueadores previne a rejeição de transplante de ilhota. Os bloqueadores de adesão de célula T demonstraram suprimir a ativação de célula T e resposta imune em transplante de órgão e doenças autoimunes (ver Yusuf-Makagiansar et al, inhibition of LFA-l/ICAM-1 and VLA-4/VCAM-I as a therapeutic approach to inflammation and autoimmune diseases, Medicinal Chemistry Reviews 22, 146-167 (2002); Anderson and Siahaan, Targeting I CAMI /LFA- 1 interaction for controlling autoimmune diseases: Designing peptide and small molecule inhibitors, Peptides 24, 487-501 (2003)). Os bloqueadores de adesão de célula T incluem, entre outros, (a) anticorpos monoclonais para ICAM1, LFA-1, B7, CD28, CD2, e VLA-4, (b) proteína solúvel e seus fragmentos como ICAM- 1, VCAM-1, MadCAM- 1, (c) RGD peptídeos e peptidomiméticos, (d)

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VCAM- 1 peptídeos e peptidomiméticos, (e) ICAM-1 peptídeos e peptidomiméticos, and (f) LFA-1 peptídeos e peptidomiméticos. Além disso, peptídeos (por exemplo, GAD208-217) derivados de ácido glutâmico decarboxilase 65 (GAD65) e o inibidor de peptídeo GAD bifuncional (GAD-BPI) demonstraram induzir imunotolerância e suprime a infiltração de ilhota por células T (insulite). GAD208-217 demonstrou mostrar 0 bloqueio de ativação de células T que atacam as células beta em camundongos diabéticos não obesos (NOD) por modulação de formação de complexo TCR-MHC-Ag (Signal-1) durante a célula T:APC interaction (Tisch et al, Induction of GAD65 -specific regulatory T-cells inhibits ongoing autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice, Diabetes 47:894-899 (1998)). A preferencial GAD-BPI compreende GAD208-217 ligado a uma porção do peptídeo LFA-1 (sequência EIAPVFVLLE-[Ac-G-Ac-G-Ac]-ITDGEATDSG), e demonstrou bloquear ativação de célula T e insulite em camundongos NOD como estabelecido em Murray et al, Patente Publicada US 2005/0107585 intitulado

Signal- l/signal-2 bifunctional peptide inhibitors, que é incorporado por referência. Assim, estas moléculas podem ser coadministradas para prevenir a rejeição do transplante de ilhota. Estas moléculas podem ainda ser derivadas através de mecanismos de liberação controlados para prevenir a rejeição do transplante de ilhota. Assim, as moléculas podem ser aprisionadas dentro do andaime de biomaterial antes das células beta são unidas ao andaime.

A liberação controlada de ditos agentes pode ser realizada usando os protocolos estabelecidos em Raman et al, Modeling small-molecule release from PLG microspheres: effects of polimer degradation and nonuniform drug distribution, J. Control. Release. Mar 2; 103(1): 149-58 (2005); Berkland et al,

Precise control of PLG microsphere size provides enhanced control of drug

29/86 release rate, J. Control. Release. Jul 18; 82(1): 137-47 (2002); Schwendeman, Recent advances in the stabilization of proteins encapsulated in injectable PLGA delivery systems, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 19(1): 73 -98 (2002); Sershen et al, Implantable, polimeric systems for modulated drug delivery, Adv.Drug Deliv. Rev. 5;54(9): 1225- 1235 (2002), todos dos quais são incorporados por referência.

C. Produção de ilhotas em Micro Moldes de Tufos

A presente invenção também é direcionada para um método de produção in vitro de ilhotas pequenas. Em um aspecto, células de ilhotas dispersas isoladas de pancreases de doadores não fetais são colocadas em tufos individuais de um micro molde e cultivadas para formar ilhotas reagregadas cuja forma e tamanho são influenciados por dimensões de tufo.

Os tufos do micro molde têm um tamanho apropriado para formação de pequenas ilhotas. Por exemplo, em um aspecto, o micro molde normalmente tem dimensões na ordem de cerca de 30-35 mm em diâmetro, mas este tamanho não é limitado por métodos de produção e poderia ser aumentado até 30 x 30 cm. Os tufos normalmente têm dimensões na ordem de cerca de 100-200 pm (± 20%) em diâmetro e 60-100 (± 20%) pm em profundidade. Preferencialmente, para a produção de ilhotas os tufos são 100 pm (± 20%) em diâmetro e 60 pm (± 20%) em profundidade.

Em outro aspecto, o micro molde pode ser usado para gerar populações de ilhotas de formatos e tamanhos ideais para transplante ou estudo in vitro. Por exemplo, em um aspecto, a população de ilhotas gerada em micro moldes tem um diâmetro médio de 50 pm ou menos. Em outros aspectos, a população é caracterizada em pelo menos 85% de células viáveis, preferencialmente mais do que 90% ou 95% de células viáveis, mais preferencialmente a população é

30/86 caracterizada por mais do que 99% de células viáveis.

Ainda outro aspecto, a população de ilhotas gerada em micro moldes pode ser caracterizada por altos níveis de secreção de insulina. Por exemplo, pequenas ilhotas reagregadas em micro moldes são caracterizadas por maiores níveis de secreção de insulina em relação a ilhotas nativas pequenas, preferencialmente mais do que 20 vezes mais secreção de insulina, mais preferencialmente mais do que 100 vezes mais secreção de insulina. Por exemplo, a ilhota reagregada mediu secreção de aproximadamente 10ng/IE, mostrado na Figura 23. Este é 41 vezes maior que o melhor valor calculado de Crim et al., 2010. Uma dificuldade em comparação dos dados de secreção de insulina entre laboratórios é que muitos investigadores falham em reportar a secreção de insulina por volume de ilhota. No caso de Crim et al, eles reportaram a secreção de insulina por 50 ilhotas, mas não indicam o tamanho médio das ilhotas. Assim, pode-se somente assumir que suas 50 ilhotas foram cada uma equivalente ao volume de ilhota definido anteriormente de 1 equivalência de ilhota (IE). Nosso laboratório sempre reporta a secreção de insulina normalizada para um volume total de ilhotas e células dividindo pelo the IE. Com a suposição feita para o artigo de Crim, as ilhotas reagregadas descritas liberam mais de 40 vezes mais insulina em resposta à glicose alta do que as melhores condições relatadas por Crim et al.

Em uma modalidade da presente invenção, o micro molde será usado para criar células úteis para testes in vitro e outras aplicações in vitro. Naquela modalidade, a superfície do micro molde é preferencialmente feita de vidro com os lados do molde (o sistema de alojamento) feito de PDMS.

Em outra modalidade, o micro molde é criado para ser implantável e podería ser feito de material biocompatível. Naquela modalidade, materiais

31/86 preferenciais são qualquer número de biopolímeros descritos anteriormente.

Em outro aspecto, os micros molde de tufos são projetados para melhorar as condições de reformação física ideal para células não ilhotas. É contemplado que vários tipos de células podem ser formados nos tufos da presente invenção. Exemplos não limitantes incluem, via neuronal longa, filtros tipo glomérulos, vasos, substituição alveolar, etc. A agregação de células-tronco ou células reprogramadas em um pequeno formato bem definido, como o micro molde, poderia ainda ser um uso apropriado desta invenção. Tipos de célula preferenciais incluem aqueles em que uma estrutura 3D é importante para a função celular.

Em geral, FIG. 24 é um esquema mostrando o método da presente invenção. Agrupamentos de ilhotas grandes nativas, tomadas de um pâncreas ou fonte de ilhota, são desembolsados em células de ilhotas únicas e carregadas em um micro molde com tufos. Por células dispersas entendemos que a maior parte (tipicamente pelo menos 90%) de células são células simples, com uma proporção inferior de células unidas como dubletos ou tripletos. As células dispersas são colocadas em micro molde de modo que leve aos grupos de células dispersas fixando em cada tufo. Preferencialmente, 30-150 células se fixam em cada tufo.

O Exemplo 5 revela um método preferencial de ilhotas dispersantes em células únicas e incubação das células em micro moldes. Preferencialmente, a dissociação é uma mistura de meio formulado em KU Diabetes Research laboratory. Esta mistura inclui nove partes de solução de sal equilibrada de Hank livre de magnésio e cálcio e uma parte de papaína (50 unidades/ml). Em contraste, a maior parte da dissociação de ilhota é conseguida usando tripsina ou

32/86 enzimas além de papaína. A dissociação é realizada a 37°C, com rotação. Finalmente as ilhotas estão dispersas em células únicas manualmente por pipetagem e observando com um hemocitômetro até que pelo menos 90% das células sejam separadas em células únicas. O Exemplo 5 também revela condições preferenciais para a reagregação das células dentro de ilhotas de micro moldes. Em geral, as células permanecem como células únicas ou frouxamente ligadas aos grupos de células através do dia dois conforme observado na FIG. 14. No entanto, no dia cinco ou seis estas mesmas células no tufo se reorganizaram em uma estrutura 3D que é geralmente esférica (por exemplos, ver FIG. 18-19A e 21). Tipicamente no dia cinco as ilhotas reagregadas podem suportar a remoção de moldes e funcionar como ilhotas independentes.

Durante este período de tempo, as células assumem a forma tridimensional de uma ilhota nativa. O diâmetro médio das ilhotas formadas nos tufos é menos de 50 pm. O Exemplo 5 descreve a natureza morfológica das pequenas ilhotas formada nos moldes do micro.

Em uma modalidade da presente invenção, as células dispersadas em baixa concentração podem ser adicionadas ao micro molde, de modo que tão pouco quanto duas ou três células caem em cada tufo, e de modo que as células dentro de tufos são capazes de crescimento e divisão. A forma e o tamanho do crescimento de massa celular em um tufo dessa maneira seriam influenciadas pelas dimensões físicas do tufo. Preferencialmente, micro moldes são carregados com ilhotas de células, concentradas de modo que tão poucas como duas ou três células da ilhota ocuparão cada tufo, em que células da ilhota vão crescer e agregar junto para formar pequenas ilhotas, preferencialmente de 30-40 pm em diâmetro.

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Em outra modalidade da presente invenção, pode-se desejar incorporar produtos químicos ou moléculas biológicas em ilhotas projetadas no momento da reagregação. Essas moléculas incluem fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas, DMARDs (drogas antirreumáticas modificadoras da doença), antiinflamatórios e antibióticos. Moléculas ou dispositivos em miniatura para aumentar a tensão de oxigênio no local do transplante poderíam ser incorporados em ilhotas reagregadas, especialmente se um substrato de micro molde implantável foram usados. Outras classes não limitantes de moléculas que poderiam ser adicionadas no tempo da reagregação inclui drogas para induzir a liberação de insulina, moléculas pequenas, peptídeos, proteínas, anticorpos (por exemplo, contra CD11a, CD11b, CD11c, CD18), e ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou

RNA).

Ditas moléculas poderiam tipicamente ser incorporados nas ilhotas no momento do carregamento nos micro moldes. As moléculas poderiam ser adicionadas ao meio com as células dispersas de modo que poderiam ser tomadas pelas células ou aderirem às células durante agregação. Alternativamente, as células poderiam ser modificadas antes da reagregação através de métodos de transfecção padrão que poderia resultar em produção aumentada ou reduzida de proteína alvo do usuário. Após a formação de reagregados, as ilhotas recém-formadas poderiam ser encapsuladas com biopolímeros que poderiam conduzir produtos químicos como imunossupressores ou outras moléculas de interesse como fatores de crescimento. Alternativamente, com micro moldes implantáveis, os moldes podem ser impregnados com a molécula de escolha.

O método da presente invenção pode ser projetado para formar agregados

34/86 celulares para transplante subsequente ou para droga ou dispositivo testando. O exemplo 5 descreve métodos preferenciais para células reagregadas para transplante e triagem de droga e métodos preferenciais para fazê-lo.

Em outro aspecto, a presente invenção é ainda direcionada a um método para triagem de alto rendimento de drogas, produtos químicos ou outras moléculas pequenas. É contemplado que o padrão e dimensões de tufos no micro molde presente podem ser projetados para acomodar as intervenções individuais em cada tufo.

Em outro aspecto, os micro moldes de tufos gerados a partir de um biopolímero adequado para transplante em um animal hospedeiro. Vislumbramos que células reagregadas em um micro molde implantável podem ou não podem aderir ao substrato em tufo. Para o trabalho in vitro, uma superfície não aderente de substrato, de vidro, é preferencial. No entanto, para moldes implantáveis ou adesivos de biopolímero, substratos aderentes aumentariam a eficiência do processo de transplante com perda reduzida de ilhotas durante e após o transplante. A aderência das células para os biopolímeros foi testada e está descrita na Tabela 1 e FIG. 8.

Aspectos adicionais da invenção, juntas com as vantagens e novas características pertencentes a esta, serão estabelecidos em parte na descrição e exemplos que seguem, e em parte serão aparentes aos especialistas na técnica no exame do seguinte, ou pode ser aprendido a partir da prática da invenção. Os objetos e as vantagens da invenção podem ser realizados e alcançados por meio de instrumentos e combinações particularmente assinalados em declarações anexadas.

EXEMPLO 1: Tamanho do Ilhotas Impacta a viabilidade e sucesso do

35/86 transplante

Este exemplo investigou como o tamanho da ilhota afetou o sucesso de transplante em ratos.

Neste exemplo, técnicas de isolamento de ilhotas são descritas e viabilidade celular foi mensurada. Ambas ilhotas grandes (maior que 125 pm) e pequenas ilhotas (menos de 125 pm) foram transplantadas para avaliar o efeito do tamanho da ilhota no sucesso do transplante. Como discutido abaixo, ilhotas pequenas de ratos são superiores a grandes ilhotas na função in vitro e em resultados de transplante in vivo. Estes experimentos são ainda descritos em MacGregor et al, Small rat islets are superior to large islets in in vitro function and in transplantation outcomes, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. May,‘290(5): E7719 (2006), que é incorporado por referência em sua totalidade.

Isolamento de ilhota de rato.

Para isolar grandes e pequenas ilhotas, ratos DA adultos masculinos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de uma mistura de quetamina e xilazina. A cavidade peritoneal foi exposta e a conexão ductal pancreática para o intestino preso. O pâncreas foi canulado in situ através do dueto biliar comum e distendido bombeando uma solução fria de colagenase no duto. Collagenase (CLS-1, Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ) foi dissolvida em 20 ml de Leibovitz L15 a 450 U/ml. Posteriormente o pâncreas distendido foi extirpado, transferido para tubos de centrífuga de 50 ml e incubado por cerca de 20-30 minutos com suave caída em uma incubadora a 37°C. Após incubação, o tubo suavemente foi agitado para desinstalara as ilhotas. Os conteúdos do tubo foram colocados em solução de sal equilibrado de Hank gelada (“HBSS”) contendo 10% de soro de bezerro recém nascido. A digestão foi deixada ajustar em 1 x g e o

36/86 sobrenadante removido. Mais HBSS/soro foi adicionado e o processo repetido. O digesto lavado foi passado através de uma tela de aço inoxidável de 500 mícrons e sedimentou em cerca de 1 minuto a 300 x g em uma centrífuga refrigerada. O pellet foi misturado com 10 mL, 1,110 gm/mL Histopaque (densidade = 1,1085, Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, Missouri) e centrifugado 10 minutes a 800 x g. As ilhotas flutuantes no gradiente foram coletadas e sedimentadas separadamente, então colocados em meio de cultura Ham's F12 contendo 10% de soro bovino fetal e colocado em câmara de cultura a 37°C contendo 5% CO₂.

Rendimento

Para medidas de rendimento, as amostras em triplicada de cada lote de ilhotas foram examinadas, cada uma compreendendo aproximadamente 2% da fração de ilhota. As ilhotas individuais foram contadas e seus diâmetros medidos. Para ilhotas de formato irregular, medidas de 3 a 4 diâmetros foram tomadas em diferentes locais na ilhota e a média usada. Os volumes das ilhotas foram calculados e convertidos em ilhotas equivalentes para a amostra na fração de ilhota. Pequenas ilhotas foram definidas como aqueles que têm um diâmetro de menos do que cerca de 125 pm comparado a ilhota grande com um diâmetro igual ou superior a cerca de 125 pm.

Para separar ilhotas pequenas de grandes ilhotas, ilhotas frescas ou ilhotas cultivadas durante a noite foram sedimentadas e, em seguida, colocadas em 1-2 ml de meio LI 5. As ilhotas foram então rapidamente separadas em camadas em um gradiente de tepa única de 5% BSA em L15. A sedimentação a 1 x g permitiu que ocorresse por um período de tempo até que grandes ilhotas foram observadas na parte inferior do tubo empiricamente. Nesse ponto os dois mililitros superiores (sem BSA) do gradiente foram descartados, e todos, exceto os 2 ml

37/86 inferiores foram removidos cuidadosamente para definir a população de ilhotas. As ilhotas sedimentadas e aquelas nos 2 mililitros inferiores foram combinadas como a fração de ilhota grande. Os gradientes foram repetidos se necessário para otimizar a separação de grandes e pequenas ilhotas. Frações de ilhota finais foram sedimentados e colocados em cultura em uma mistura 1: 1 de Hanrís F 12 e

RPMI 1640 isenta de glicose (glicose = 5 mM) até que experimentos de sensibilidade de glicose fossem realizados.

Viabilidade

Para testar a viabilidade, as ilhotas foram colocadas em um volume de 500 pl de meio L-15 com fluoróforos para vivo/morto, Sytox (Molecular Probes, 1 μΜ) e calceína (Molecular Probes, 0,5 μΜ), e incubadas por cerca de 15 a 30 minutos a 37°C. As ilhotas foram lavadas com solução salina tamponada fosfato (PBS) que consiste em (em mM): 137 NaCI, 2,7 KC1, 4,3 Na₂HPO₄ e 1,4 KH₂PO₄, pH 7,4 e colocado na Câmara Attofluor (Molecular Probes) on o microscópio confocal Olympus Fluoview 300 no Diabetes Research Laboratory. As imagens foram adquiridas com objetivas de 40x ou 60x. Todas as imagens foram coletadas dentro de 20 minutos após a remoção das ilhotas do meio. Três imagens simultâneas foram coletadas para cada ilhota usando lasers de He: Ne e Argônio e uma terceira imagem de campo claro.

Como mostrado na FIG. 2, grande ilhotas intactas (maiores do que 125 pm), de humanos ou ratos, mantidas em cultura apresentam tipicamente uma percentagem significativa de células em necrose (12,6%) e apoptose (6,3%) somente quatro dias com a morte celular aumentando com o tempo. Ilhotas

38/86 μ

menores (menos de 125 m) apresentaram viabilidade estendida, mas ainda apresentavam a morte celular precipitada em pontos de tempo posteriores (além de uma semana). A viabilidade destas ilhotas pequenas foi acompanhada por até uma semana, e verificou-se que mantêm percentagens de viabilidade alta de 99 a

86%. Isto é, em comparação 10 ilhotas grandes intactas, que têm níveis de viabilidade que caem abaixo de 50%, após vários dias em cultura. Como mostrado, na FIG. 2, células das ilhotas individualmente dispersas mantêm um perfil de alta viabilidade em cultura semelhante às pequenas ilhotas intactas.

Análise de vivas/mortas foi concluída através da identificação das ilhotas no campo e que envolve as regiões de interesse. Fundo de fluorescência foi subtraído de todas as imagens. As porcentagens de viabilidade foram calculadas através do desenvolvimento de histogramas de matiz usando o Photoshop (Adobe) dos campos de interesse e cálculo total dos pixels na cor verde (vivas) e vermelha (mortas). A proporção que representa as células vivas dividida pela área total de ilhotas foi calculada como o valor percentual de vivas. Diâmetros das ilhotas e os perímetros foram calculados utilizando o software Scion de modo que valores de viabilidade podem ser classificados de acordo com o tamanho da ilhota.

Estudos de Transplante

O efeito do tamanho da ilhota em caso de sucesso do transplante, foi também investigado. Nos experimentos, a diabetes foi induzida nos animais receptores por injeção de estreptozotocina (65mg/kg) intraperitonealmente (1 injeção). Quando os níveis de glicose no sangue são maiores do que 250 mg/dl, durante três dias consecutivos, os ratos foram considerados diabéticos.

39/86

Os ratos foram anestesiados com pentobarbital 45 mg/kg. Depois de o rato ser raspado e limpo com esfregaço de betadina, uma incisão foi feita na parede do corpo, no flanco esquerdo. O rim foi liberado na ferida, e uma pequena incisão foi feita na cápsula renal. As ilhotas grandes ou pequenas foram colocadas sob a cápsula com uma pipeta de pequeno calibre. O rim foi colocado de novo na sua posição original e a incisão fechada com grampos de feridas. Injeções de zincoinsulina de vaca/suína (NPI-1 lletin I) (2 vezes/dia) foram dadas aos destinatários por três dias pós-transplante de ilhotas para reduzir o estresse da hiperglicemia sobre as ilhotas recém-transplantadas.

O transplante de ilhotas grandes ou pequenas de ratos foi concluído (n=10 transplantes/grupo). Os ratos DA diabéticos induzidos por estreptozotocina receberam uma massa marginal (1000ΓΕ) de grandes (maior do que 150pm) ou pequenas (menos do que 125pm) ilhotas singênicas sob a cápsula renal. Níveis de glicose no sangue foram monitorados, durante oito semanas. As FIGs. 3 (A) e

3 (B) mostram os resultados dos cinco primeiros transplantes para cada grupo.

Todos os destinatários de ilhotas grandes permaneceram hiperglicêmicos após o transplante (10 de 10). Em contraste, 8 de 10 receptores de ilhotas pequenas tinham níveis sanguíneos de glicose próximas ou em níveis normais de 7-10 dias após o transplante, o qual permaneceu normal durante o período de oito semanas completas.

Enxertos de ilhotas da cápsula renal im foram retirados oito semanas após o transplante. O tecido foi fixado e imunomarcado para insulina. A FIG. 4 (painel esquerdo) mostra o enxerto de um animal que recebeu o transplante de ilhotas pequenas e foi euglicêmico para oito semanas. Houve coloração substancial para a insulina no enxerto. Em contraste, a FIG. 4 (painel da direita) o animal que

40/86 recebeu o transplante de ilhotas grandes continuou a ser hiperglicêmico para o período de oito semanas e demonstrou pouca imunomarcação para a insulina nos enxertos.

Em conjunto, os experimentos anteriores mostram que as ilhotas menores (menos de 125 pm) foram superiores às ilhotas grandes (mais de 125 pm) em viabilidade, ensaios in vivo, e nos resultados de transplantes. Além disso, um pâncreas médio rendeu cerca de três vezes mais do que ilhotas pequenas do que ilhotas grandes, e as ilhotas menores foram de aproximadamente 20% mais viáveis. Mais importante ainda, a ilhotas pequenas eram muito superiores às ilhotas grandes quando transplantadas em animais diabéticos.

EXEMPLO 2:

Conversão de Ilhotas Grandes Em Células de Ilhota Individuais ou

Agrupamentos de Células de Ilhotas Pequenas

Este exemplo ilustra os métodos de fragmentação ou de dispersão de ilhotas intactas em agrupamentos de células de ilhotas pequenas (como o agrupamento mostrado na FIG. 5) e células de ilhota individuais. O agrupamento de célula de ilhota pequena na FIG. 6 (A) foi criado utilizando uma digestão enzimática convencional, enquanto que o agrupamento de célula de ilhota pequena na FIG. 6 (B) foi formado com a depleção de cálcio gradual. Como a imagem na FIG. 6(A) ilustra, a dispersão enzimática quebra a ilhota em agrupamentos de células de ilhotas pequenas, mas não abre o agrupamento de modo que as células do interior do agrupamento tenham uma barreira de difusão que é várias células de espessura. Em contraste, para os agrupamentos de células pequenas de ilhotas formadas usando a depleção de cálcio (FIG. 6(B)), o agrupamento tem uma morfologiaaberta de modo que há uma barreira de

41/86 difusão menor para cada célula de quando a célula de ilhota pequena se agrupa. Prevê-se que uma combinação de digestão enzimática e depleção de cálcio pode também ser utilizada para converter ilhotas intactas em agrupamentos de células de ilhotas pequenas, que é mostrado na FIG. 6(C).

a. Digestão Enzimática

Diferentes coquetéis de enzimas podem ser utilizados para fragmentar ilhotas intactas em agrupamentos de células de ilhotas pequenas e células de ilhotas individuais. Exemplos de métodos de digestão enzimática são revelados na Patente US 6.783.954, que é incorporado por referência. Neste exemplo, doze coquetéis enzimáticos foram usados com variados graus de sucesso, incluindo um coquetel que incluiu a papaína.

Para ilhotas pancreáticas isoladas, ratos Sprague-Dawley foram anestesiados por uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina. A cavidade peritoneal foi exposta e a conexão ductal pancreática para o intestino preso. O pâncreas foi canulado in situ através do dueto biliar comum e distendido bombeando uma solução fria de colagenase no duto. Subsequentemente, o pâncreas distendido foi excisado, transferidas para tubos de centrífuga, e incubados durante cerca de 30 minutos com suave queda em 37°C. O digesto lavado foi passado através de uma peneira e sedimentado em uma centrífuga refrigerada. O pellet foi misturado com Histopaque (densidade = 1,1085, Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO) e centrifugado. As ilhotas foram depois colocadas em meio de cultura Ham’s F 12, contendo 10% de soro bovino fetal e colocadas a

37°C em câmara de cultura contendo 5% de CO₂.

O protocolo padrão para isolamento de células beta incluiu incubar ilhotas intactas (isolamento utilizando técnicas descritas aqui) em Solução Salina

42/86

Equilibrada de Hanks (“HBBS”) com 4, 8 mM Hepes. Ver Balamurugan et al, Flexible management of enzymatic digestion improves human islet isolation outcome from sub-optimal donor pancreata. Am. J. Transplant 3(9): 1 13542 (2003). Para digestão enzimática, um volume final 9 ml de solução de sal balanceada de Hanks contendo 1 ml de papaína (50 unidades/ml) foi adicionado às ilhotas. As ilhotas foram inicialmente pipetadas para cima e para baixo suavemente para garantir completa rinsagem. As ilhotas foram deixadas depositar-se no fundo do tubo e a maior parte do sobrenadante foi removida. As ilhotas na enzima foram rodadas lentamente (cerca de 10 rpm) durante cerca de 30 minutos a 37 °C. Neste ponto, agrupamentos de ilhotas pequenas foram formados com algumas células dispersas individuais, e removidos a partir da solução. Tipicamente, as células foram transferidas para CMRL 1066 ou Memphis

SMF como os meios de cultura finais.

As células foram coradas com ditizona para identificar as células beta, dentro dos agrupamentos, como geralmente mostrado na FIG. 5 e 6(A) (enzima).

b. Fragmentação a Base de Metal

Ilhotas intactas também podem ser fragmentadas em agrupamentos de células de ilhotas de Pequenas e células de ilhota individuais utilizando uma abordagem de fragmentação a base de metal. O achado interessante da fragmentação a base de metal é que os resultantes agrupamentos de células de ilhotas pequenas são menos compactos ou têm uma morfologia “aberta”. Moléculas de adesão celular, como E-caderina, mantêm a ilhota unida, mas requerem metais bivalentes para a função. Ver Hauge-Evans et al, Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets,

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Diabetes 48(7): 1402-8 (1999). Assim, as ilhotas de cultura em meio isento de cálcio durante cerca de uma hora resulta em um “afrouxamento” e fratura da estrutura da ilhota (ver FIG. 6(B)) em comparação à utilização de enzimas isoladas, que gera uma estrutura de ilhota mais densa (ver FIG. 6(A)). Ainda, após afrouxamento as ilhotas usando depleção de cálcio, os demais agrupamentos de células beta são mais facilmente dispersos por enzimas tradicionais (ver FIG. 6(C)).

Os detalhes da fragmentação a base de metal são como a seguir. Para obter células de ilhota individuais e agrupamentos de células de ilhotas pequenas, as ilhotas estavam em solução de sal balanceada de Hanks isenta de cálcio e magnésio + 4,8 mM Hepes. Após incubação a cerca de 37°C durante cerca de 30 minutos, as células foram pipetadas, dispersando-os em agrupamentos de células de ilhotas pequenas ou células individuais. As células foram transferidas para CMRL 1066 como meio de cultura final. Quando necessário, o agrupamentos de células de ilhotas pequenas ou células beta foram identificados com ditizona. Ver Mythili et al, Culture prior to transplantation preserves the ultrastructural integrity of monkey pancreatic islets, J. Electron Microsc. (Tokyo) 52(4): 399-405 (2003).

Como mostrado na FIG. 6 (B), os agrupamentos de células de ilhotas pequenas obtidos por depleção de cálcio isolado teve um arranjo tubular irregular, a qual pode ser otimizado para a perfusão do núcleo do agrupamento. Além disso, os agrupamentos derivados de dispersão a base de metal levou somente cerca de uma hora para produzir, enquanto que a abordagem de enzima para fragmentação ocorreu até 48 horas.

c. Combinação de Digestão enzimática e Dispersão do Metal

Os experimentos foram também realizados utilizando uma combinação de

44/86 digestão enzimática e depleção de metal como uma técnica de dispersão. As ilhotas intactas foram rinsadas com 9 ml de solução salina equilibrada de Hank (sem cálcio ou magnésio) com 4, 8 mM Hepes. As ilhotas foram inicialmente pipetadas para cima e para baixo suavemente para garantir completa rinsagem. As ilhotas foram deixadas depositar-se no fundo do tubo e a maior parte do sobrenadante foi removida. As ilhotas podem ser repetidamente lavadas para remover todo o cálcio e magnésio.

Um volume final de 9 ml de solução salina equilibrada de Hank livre de cálcio e magnésio contendo 1 mL de papaína (50 unidades/ml) foi adicionado às ilhotas. As ilhotas na enzima foram rodadas lentamente (cerca de 10 rpm) durante 30 minutos. Neste ponto agrupamentos de ilhotas pequenas podem ser removidos da solução. Pipetagem forte 2-3 vezes a uma velocidade moderada resultou em células individuais.

As células foram centrifugadas durante 5 minutos a 1500 rcf, 25°C. As células individuais foram ressuspensas utilizando os meios de cultura apropriados (dependendo dos ensaios subsequentes). As células foram armazenadas em uma incubadora a 37 °C e 5% CO₂. Como mostrado na FIG. 6(C), a combinação da enzima e método de depleção de cálcio resulta em um agrupamento de células de ilhotas ou células individuais. Além disso, a combinação era um protocolo global de dispersão mais rápido, deve-se ter o cuidado para evitar super digestão e células danificadas.

Nestes experimentos, YO-PRO-1 e iodeto de propídio (Vibrant Apoptotic Assays, Molecular Probes) foram utilizados para determinar as células necróticas e em apoptose. Para o ensaio, as células foram colocadas em PBS na Câmara Attofluor (Molecular Probes) no microscópio confocal Olympus FluoView 300

45/86 laser. Todas as imagens foram coletadas dentro de 20 minutos após a remoção das células do meio. Três imagens simultâneas foram coletadas para cada ilhota usando lasers He:Ne e Argônio e uma terceira imagem de campo claro. Análise de vivas/mortas foi concluída através da identificação das células no campo utilizando luz transmitida. Células verdes indicam apoptose, enquanto amarelo/vermelho indica morte celular por necrose. Células sem emissão de fluorescência estavam vivas. As imagens de fluorescência foram sobrepostas com a imagem de luz transmitida (cinza).

Exemplo 3: Preparação de células de ilhota individuais e agrupamentos de ilhotas pequenas em um adesivo de andaime de biomaterial

Os seguintes exemplos indicam que agrupamentos de células de ilhotas pequenas e ainda células beta individuais devem representar a maior área de superfície livre atingível para transporte de oxigênio, glicose, etc. Assim, neste exemplo, as células de ilhota individuais ou agrupamentos de células de ilhotas pequenas foram moldadas em um material de andaime de biomaterial, como um adesivo como genericamente mostrado na FIG. 7, para formar uma camada múltipla de células de ilhota.

Triagem de Materiais de Andaime

Neste exemplo, a otimização de vários biomateriais úteis para preparar os andaimes da presente invenção foi investigada através da medição da adesão relativa das células das ilhotas ao biomaterial. É preferencial que o material de andaime seja fácil de manusear sem dissociar o tecido e biomaterial de suporte para permitir a fácil implantação. A Tabela 1 ilustra uma ampla variedade de biomateriais, que foram selecionados para interações com células beta. Vários destes materiais possuem uma história de utilização como implantes.

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Em um experimento típico, soluções estoque 1 % dos biomateriais listados primeiro foram preparadas. A maioria dos materiais dissolveu em água deionizada a um pH neutro. Quitosana requereu um pH mais baixo de cerca de 5, 5 para dissolver (ácido clorídrico foi usado) e outros materiais requereram solventes orgânicos; por exemplo Cellform™ em etanol e ácido poli(DL-láctico-co-glicólico) (PLGA) em diclorometano. Polímeros normalmente solúveis em água (por exemplo, dextrano sulfato, alginato, etc) podem ser de ligações cruzadas para formar a matriz de filme. Aproximadamente 25 pl de cada solução estoque foi adicionada a três poços individuais em placas de 96 poços e deixados para evaporar sob vácuo seco, assim, depositando um filme fino de biomaterial no fundo de cada poço. O teor de solvente residual é mínimo e não induziu toxicidade nas células. Várias proteínas disponíveis comercialmente para promover a adesão de células em placas de poços (por exemplo, fibronectina, laminina, etc.) foram pré-triadas para a adesão das células como tal.

Uma suspensão diluída de células beta foi incubada nas placas de 96 poços durante a noite e lavadas três vezes para remover as células beta não ligadas. A suspensão de células beta mostrou-se homogêneo e alíquotas iguais por poço foram assumidas para conter uma quantidade semelhante de células beta. Todas as contagens de células foram normalizadas para as contagens de células dos poços que não incluem uma película de biomaterial. Em geral, os polímeros hidrofóbicos moderadamente aderiram bem às células beta (Tabela 1).

Tabela 1: Adesão relativa de células beta biomateriais selecionados

Biomaterial		Adesão de célula relativa
Poço vazio (controle)		1
PLGA carboxil 50:50	Mw = 5,5 kDa	9,8 4- 0,9
Laminina		8,7 4- 0,6
Sulfato de Dextrano	Mw = 500 kDa	7,4 4- 3,0
PLGA-metiléster 50:50	iv = 0,3 dL/g	6,8 4- 0,7

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Polivinilpirrolidona		5,8 4- 1,2
Sulfato de Dextano	Mw = 8 kDa	5,4 4- 1,0
PLGA-metiléster 50:50	iv = 0,9 dl/g	5,2 4- 0,8
PLGA-metiléster 50:50	iv = 0,58 dL/g	4,4 4- 0,7
Pluronic		4,0 4- 1,5
PLGA carboxil 50:50	iv = 0,12 dL/g	3,9 4- 0,7
Polietilenoimina	Mw = 25 kDa	3,8 4- 0,2
Fibronectina		3,7 4- 0,7
PEG acrilato		3,1 4- 0,5
Quitosana	Mw =15 kDa	3,1 4- 0,1
Colágeno IV		2,9 4- 1,4
PEG	Mw = 8 kDa	2,8 Φ 1,1
Alginato		2,4 4· 1,2
Gelatina		2,0 > 0,2
Heparina		1,7 4- 0,2
Cellform™		1,7 4- 0,7
Quitosana	Mw =100 kDa	1,5 4- 0,7
Polietilenimina	Mw = 800 kDa	1,2 4- 1,0
Polivinilpirrolidona		n.d.
Poli(vinil álcool)		n.d.
Poli(ácido acrílico)		n.d.

iv = viscosidade inerente

A adesão celular foi determinada por contagem do número de células ligadas 24 horas após o plaqueamento na biomaterial e após três lavagens. As contagens foram normalizadas para o número de células que se ligam ao fundo do poço sem um biomaterial (ver poço vazio, controle), utilizando o seguinte cálculo: número de células ligadas no poço de interesse/número de células no poço vazio. Cada experimento foi repetido em triplicata.

Em geral, os polímeros moderadamente hidrofóbicos aderiram bem às células beta. Micrografias ópticas indicaram que a morfologia celular também foi afetada pelo biomaterial. As células beta em quitosana (MW= 100 kDa) apresentam uma superfície lisa, arredondada, enquanto as células beta em laminina demonstraram uma morfologia de propagação e franzida (ver FIG. 8). Coloração fluorescente de actina em células beta no substrato de laminina revelaram pontos focais do citoesqueleto fortemente fluorescentes sugerindo

48/86 firme adesão celular.

Preparação de Adesivo de Ilhota Celular

Neste exemplo, as células de ilhota estavam ligadas a um adesivo de andaime de biomaterial compreendendo PLGA. Em ilhotas de Langerhans vascularizads, as média de células beta é não mais do que cerca de 25 pm de distância de um vaso sanguíneo. Ver Wayland, Microcirculation in pancreatic function, Microsc. Res. Tech. 37(5-6): 418-33 (1997). Devido ao fato de as células beta serem cerca de 10 pm em diâmetro, prevê-se que a espessura da camada de célula de cerca de três células poderia mais precisamente imitar o ambiente da célula beta nativa.

Em geral, as ilhotas foram isoladas a partir de um pâncreas de rato e dispersas em células individuais ou agrupamentos de células pequenas, como descrito anteriormente. Ilhotas de células e agrupamentos de células de ilhotas pequenas em meio HBSS (0,5 ml) foram adicionadas a cada poço e deixadas em cultura no biomaterial por 3 a 4 horas. Placas com biopolímeros nos poços foram centrifugadas em uma centrífuga em temperatura ambiente a cerca de 3500 rpm durante cerca de 10 minutos, para auxiliar as células na adesão ao biopolímero. Metade do meio foi removida de cada poço, substituído por meio contendo uma célula de ilhota fresca ou suspensão de agrupamento de célula de ilhota pequena, e deixadas para aderir (por gravidade ou por centrifugação). Isto foi repetido três vezes. Os resultados destes experimentos são mostrados na FIG. 9. Camadas adicionais de células de ilhotas podem ser anexadas ao adesivo do polímero seguindo lavagens repetidas quando o método de centrifugação foi utilizado, em comparação com células cultivadas em polímeros sem centrifugação. Cerca de três a cinco camadas de células permanecem constantemente ligadas a 50:50

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PLGA a 0,58dL/g (in HFIP) ou 0,9 dL/g polímero com trocas repetidas de meio. Para controlar a espessura da camada de células beta, o volume de cultura de células a cada poço, e/ou o número de alíquotas adicionada a cada poço em ciclo repetido de deposição pode ser controlado.

EXEMPLO 4: Testes Proféticos de Células de Ilhotas em andaime de biomaterial

Neste exemplo, adesivos biomateriais contendo camada múltipla de células de ilhota unidas a esta serão ainda investigados. Medidas de viabilidade e ensaios de produção de insulina serão realizadas. Além disso, o dispositivo será investigado como um dispositivo implantável para o tratamento de diabetes.

Medidas de viabilidade. Experimentos de apoptose versus de necrose serão concluídos como anteriormente. O percentual de células vivas será calculado por área de seção transversal das camadas de células beta para comparação a ilhotas nativas nos dias 0, 1,3, 7, 14 e 30 para as três amostras. Os dados serão plotados como por cento de células viáveis versus tempo e iremos determinar se existe uma diferença estatisticamente significativa entre as tendências de viabilidade para diferentes números de camadas de células beta usando um teste t. Além disso, será feito o registro de percentual de morte celular, atribuída a necrose ou apoptose.

Ensaios de produção de insulina. A produção de insulina será medida usando incubação estática (ELISA) em condições de baixa glicose (3 mM), glicose alta (30 mM) e glicose alta/despolarização (25 mM) K+(Dean 1989). Cada poço em placas de 12 poços vai ser pré-incubada com meio fresco em 37°C e 5% CO2. Para medição experimental, vários adesivos de células beta vão ser incubados durante 2 horas em meio fresco contendo 3 ou 30 mM de glicose. Um

50/86 grupo adicional de poços é incubado em 30 mM de glicose, contendo 25 mM KCI com NaCI apropriadamente reduzida. Cada tipo de adesivo será avaliado em triplicata para cada condição testada. Amostras de meio vão ser analisadas para conteúdo de insulina usando um imunoensaio ELISA. Os resultados serão expressos como médias das amostras triplicadas com desvio padrão e comparados usando um teste t para significância estatística. MacGregor et al, Small rat islets are superior a large islets in vitro function and in transplantation outcomes, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290(5); E771-779 (2006).

Implantação de adesivos e ilhotas. Diabetes será induzida em rato adulto

Worcester BioBreeding resistente a diabetes (DRBB) é um modelo de diabetes autoimune que se equipara a diabetes tipo I em humanos. Ratos de quatro semanas de idade serão adquiridos de Biomedical Research Models, Inc. Os animais serão divididos aleatoriamente em 2 grupos: receptores de adesivo e receptores de ilhotas (6 por grupo). Para a indução do diabetes os ratos DRBB serão tratados com uma combinação de anticorpos monoclonais de anti-RT6 (DS4. 23 hibridoma (gentilmente fornecido por Dr. Dale L. Greiner, University of Massachusetts Medicai Center; 2 ml de meio de cultura de tecido injetado 5 vezes/semana) e ativador de sistema imune não específico poli l:C (Sigma; 5ug/g de peso corporal injetado 3 vezes/semana). As injeções serão administradas durante um período de 3 semanas. Na data de hiperglicemia repetida (níveis de glicose do sangue >250 mg/dl durante 3 dias consecutivos), os animais serão considerados diabéticos e o tratamento descontinuado (Semis 2004). Com este método, 95% dos ratos se tornam diabéticos no final da terceira semana. A implantação de adesivos de células beta e ilhotas será feita no subcápsula renal. Ratos DA (Dark Agouti) servirão como doadores de células beta. Os ratos serão

51/86 anestesiados com pentobarbital (45 mg/kg) e o rim liberado a uma incisão feita na parede corporal no flanco esquerdo. Será feita uma incisão moderada na cápsula renal, e o adesivo de células beta colocado sob a cápsula. Um mínimo de 4 adesivos com espessura de camada variável de biomaterial e/ou célula serão implantados. Implantes de ilhotas requerem uma incisão menor e infusão através de uma pipeta de orifício pequeno. Grupos de destinatários receberão 1000 ou 2000 IE de ilhotas para transplantes ou uma equivalência de células beta sobre o substrato do adesivo. Melhora significativa em desempenho (tipo de adesivo versus ilhotas) deve ser detectável se as ilhotas mínimas necessárias para sucesso (1000 IE) são transplantadas e comparadas a um volume de ilhota maior (2000 IE). Injeções de zinco-insulina de boi/porcina (NPH lletin I) (2 vezes/dia) serão administradas por 3 dias após o transplante de ilhota para reduzir o estresse de hiperglicemia.

Determinação in vivo de glicemia. A glicose do sangue de ratos será monitorada durante 4 semanas para determinar se o adesivo ou transplante de ilhotas implantes podem induzir a euglicemia. O controle glicêmico dos animais será acompanhado por retiradas diárias de sangue para medições de glicose. Níveis de glicose do plasma serão monitorados pela obtenção de amostras de sangue da cauda em uma base diária para as primeiras 3 semanas e, em seguida, 2 vezes/semana usando o medidor de glicose Freestyle (TheraSense). Geralmente a reversão do diabetes é alcançada dentro de 24 horas de transplante de ilhotas, resultados semelhantes devem ser alcançados com os adesivos.

Análise de adesivos explantados de células beta. Adesivos ou ilhotas serão recuperadas depois de 14 ou 30 dias para medição de imunocoloração (insulina e

52/86 glucagon), viabilidade e detecção de apoptose. Em alguns casos, ratos atingindo euglicemia serão mantidos durante 8 semanas antes da análise, imunohistoquímica sobre as seções serão completadas usando anticorpos para insulina e glucagon. As imagens serão processadas usando análise colorimétrica para determinar a área de seção transversal positiva para cada um dos corantes. Fatias de controle negativas serão preparadas e analisadas Inicialmente, usaremos um corante de ditizona para identificar células beta. Fragmentação de DNA, indicativa de apoptose celular, será concluída usando ensaio de marcação de nick-end dUTP mediada por deoxinucleotidil transferase terminal (TdT).

Adesivos ou ilhotas serão preparados para histologia usando formalina_t 10% incorporada em parafina como anteriormente feito. O kit TUNEL (kit de detecção de morte celular in situ, Roche Diagnostics) será usado para marcar os cortes histológicos. Os adesivos e ilhotas serão analisados para o número e a distribuição de células TUNEL+ por um investigador cego. Imagens de cortes histológicos vão ser reconstruídas em imagens 3D de ilhotas. Desta forma, células apoptóticas em todas ilhotas únicas podem ser identificadas. As seções serão contracoradas com hematoxilina e visualizadas ao microscópio de luz. Para identificar as células secretoras insulina dentro de ilhotas, anticorpo anti-insulina será utilizado para amostras marcadas e detectadas com um anticorpo secundário de rodamina. Prevemos coletar um mínimo de 10 ilhotas/rato após o transplante para análise de apoptose. Fatias de controle negativas serão preparadas conforme necessário. Além da análise TUNEL, adesivos serão fixados para microscopia eletrônica subsequents usando a instalação central do microscópio. Identificação das camadas de células beta e da infiltração de células será conduzida desta forma.

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Exemplo 5: Preparação de células de tamanhos ideais usando um micro molde

Neste exemplo, um dispositivo adicional para reagregação de células foi desenvolvido e projetado e são descritos métodos para gerar um micro molde tendo vários tufos individuais gravados na superfície do substrato.

Em geral, um pâncreas é quebrado em ilhotas grandes nativas (maior que 150 pm) e ilhotas pequenas nativas (menos de 125 pm). Grandes e pequenas ilhotas são separadas e pequenas ilhotas são colocadas em cultura (em algumas modalidades a cultura de ilhotas pequenas será posteriormente adicionada para ilhotas recém reagregadas). As ilhotas grandes nativas são dispersas na suspensão de célula única e permitiu estabelecer o micro molde. O tamanho da ilhota produzida pode ser manipulada pelo número de células carregadas no micro molde. Dependendo da suspensão de células, geralmente 20 - 100 (+/20%) as células ficam em cada tufo para ligar uns aos outros, formando uma nova ilhota reagregada. As células única em tufos individuais são cultivadas em condições para promover a formação da estrutura 3D que lembram a ilhota nativa em que o tamanho e a forma de ilhota reagregadas são influenciadas pelo tamanho e a forma do tufo. A capacidade de variar o número de células nos tufos concentrando (determinando a densidade de células em suspensão) nos permite produzir uma ilhota reagregada muito pequena (abaixo de 30 pm) ou média (5090 pm). Este controle pode vir a ser importante quando formando outras estruturas celulares 3D como os mini tumores para teste de quimioterapia.

Diferente do biomaterial de andaime adesivo do exemplo 3 supra, o micro molde em tufo descrito neste exemplo não requer células para ligar à superfície do substrato. Como discutido abaido, as células de ilhotas reagregadas em um

54/86 micro molde são de tamanho ideal, e as populações de células derivadas de micro moldes são caracterizadas por viabilidade de alto percentual e altos níveis de secreção de insulina.

Desenvolvimento de micro molde.

Tufos como o ambiente de reagregacão física. Em um esforço para reagregar células únicas em ilhotas de tamanhos ideais, temos a hipótese de que formando as ilhotas em um ambiente fisicamente constrangido guiaria a forma da massa celular durante a reagregação. Para este fim, nós determinamos que um ambiente de reagregação física ideal seria semelhante à forma e tamanho do produto final celular desejado. O intervalo de dimensão usado em nossos primeiros experimentos (100 pm de diâmetro e profundidade de 60 pm) é ideal para produção de ilhotas reagregadas sob 50pm em diâmetro (em média). A 60 pm profundidade permite fácil recuperação de ilhotas reagregadas sem quebrálas em pedaços menores. Um fundo redondo em cada ambiente de reagregação guiou reagregação da massa de célula em um formato grosseiramente esférica. Nos referimos a esses ambientes de reagregação física com dimensões especificadas, incluindo fundos arredondados como “tufos. As dimensões e deslocamentos dos tufos podem ser variadas de acordo com as necessidades do usuário.

Desenho de Micro molde. Em um esforço para gerar populações de ilhotas de tamanhos ideais, projetamos um micro molde contendo uma superfície composta por numerosos tufos. As dimensões dos tufos neste micro molde e suas relações espaciais a cada outro dentro do micro molde foram especificados pelo usuário. Software AutoCAD foi usado para criar os moldes eletrônicos dos micro moldes. O modelo delineia o tamanho, a forma e a distribuição de tufos na

55/86 superfície do molde. O substrato em tufo situa-se dentro de uma carcaça maior capaz de conter líquidos sem vazamento também referido aqui como o molde de carcaça (FIG. 10). As dimensões de ambos micro molde e tufos dentro do micro molde podem ser variadas de acordo com as necessidades do usuário. Por exemplo, se o objetivo era usar os moldes para testes drogas, um tufo maior ou mais profundo pode ser testado de modo a manter que um maior volume de composto testado por tufo. Se as células de interesse não foram ilhotas, as dimensões do tufo poderíam ser especificadas de outra forma para atingir a reagregação ideal ou critério de crescimento para o tipo de célula de interesse.

Substrato para superfície em tufo. Existem várias propriedades físicas que são importantes ao escolher um substrato. Usar uma substância a base de de dióxido de silício (SiO₂) é preferencial para corrosão úmida com uma solução de ácido fluorídrico tamponada (HF). O ácido HF grava um substrato reagindo as moléculas de S1O2. Além disso, para o uso in vitro do micro molde, é preferencial escolher um substrato aos quais as células que não aderiram, permitindo uma remoção mais fácil das ilhotas reagregadas dos tufos. Um substrato transparente permite a visualização de conteúdo dentro de tufos sob um microscópio sem ter que transferir para outra placa. Um substrato esterilizável fornece um molde reutilizável. O vidro foi escolhido como 0 substrato ideal para micro moldes não implantáveis, que apresentam todas estas características. Além disso, os usuários podem especificar a espessura e as dimensões do vidro durante a fabricação, permitindo a personalização de micro moldes. Vidro também fornece uma solução de baixo custo, no entanto, este material não é implantável.

Para desenvolver 0 alojamento do molde, várias propriedades no substrato são necessárias. O material escolhido para construir a caixa do molde deve ter a

56/86 capacidade de ser moldado de acordo com as especificações do usuário. Isso significa que começa como um líquido que pode ser derramado em um molde e assentará com tempo e temperatura para formar um item sólido circundante ao substrato gravado. O polímero é preferencialmente esterilizável. É tipicamente hidrofóbico para prevenir líquidos de vazar dos moldes. Sylgard 184 Polidimetilsiloxano (PDMS) é ideal para estes moldes. Pode ser esterilizado, é hidrofóbico, pode facilmente ser derramado em um molde e curado para um produto sólido. Além disso, pode ser usado em temperatura variando de -45 a 200°C durante um longo período de tempo, permitindo o congelamento e esterilização a vapor. PDMS tem um tempo de trabalho de cerca de 2 horas e, em seguida, pode ser curada em temperatura ambiente 48 h) ou curado em calor (até cerca de 200°C). PDMS misturado às especificações do fabricante tem a capacidade de grudar o substrato de vidro, ainda protegendo de vazamento de líquidos no molde (Mata et al., 2005). Micro moldes concebidos com vidro e PDMS foram projetados especificamente para a experimentação in vitro e não são adequados para utilização in vivo. Moldes implantáveis que poderíam ser usados para finalidades in vivo são descritos abaixo que não usam fotolitografias mas, pelo contrário, são produzidos por primeiro produzindo uma estampa negativa.

Os protótipos de micro molde geraram até agora foram compreendidos de substrato de vidro em que tufos foram gravados. O substrato de tufo pode ser cortado para atender as necessidades do usuário. Por exemplo, o substrato pode ser cortado ao tamanho de uma lâmina de microscópio padrão. Em um protótipo criado até agora o substrato de soda-cal foi cortado de modo circular a 33 mm de diâmetro e 3 mm de espessura.

Preparação de superfície de substrato. A superfície do substrato para ser

57/86 tufo foi limpa com gás de nitrogênio para remover partículas grandes. Soluções de ácido e base piranha foram usadas para limpar profundamente para remover compostos orgânicos e material que podería interferir com a deposição de metal e fotolitografia. Posteriormente, o substrato foi cozido por 30-60 minutos. Outros métodos para remover as partículas grandes e compostos orgânicos a partir de substratos de superfície podem ser empregados por especialistas na técnica. Uma vez que a superfície do substrato foi limpa, uma camada de metal (300 nm cromo) foi sputtered no substrato, usando um sistema deposição do filme fino Lesker. Técnicas alternativas para aplicar camadas de metal finas para substratos são conhecidos na técnica e podem ser utilizadas.

Fotolitografia. Um revestimento de AZ1518 positivo fotorresiste (1 ml) foi aplicado à parte superior do metal depositado usando um aplicador Spin (Brewer CEEIOO Programmable Spin Coater). O aplicador em rotação foi ajustado para produzir uma camada 1,8 mícron de fotorresiste, seguido por um cozimento suave a 100°C por 2 minutos. Após resfriamento, o vidro com fotomáscara foi exposto à luz UV (ABM UV Flood & Mask Alignment System) durante 4 segundos, seguido por imersão em um desenvolvedor AZ 300 MIF durante 30 segundos. O substrato foi agitado um pouco. O substrato foi cozido, em seguida, a 100°C por 8-10 minutos. O padrão desenvolvido no fotorresiste foi subsequentemente gravado na camada de cromo por imersão deste em um CR7S Chromium Etchant com agitação para ajudar o processo de gravação. 30-45 segundos de imersão é necessária para a imagem aparecer. O substrato foi lavado ligeiramente com água e seco com nitrogênio para preparar o processo de corrosão úmida. Este produziu uma peça de vidro em camada com cromo e fotorresiste que continha spots abertos na superfície onde cormo e fotorresiste não estavam presentes.

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Estes spots não mascarados expõem a superfície de vidro ao processo de corrosão úmida, enquanto áreas cobertas com cromo e fotorresiste protegem a superfície do vidro da solução de gravação. Isto leva a gravao de tufos nas áreas não mascaradas. Corrosão úmida foi completada em uma solução de HF: FTNO₃: H₂0 em uma proporção de 20: 14:66 respectivamente. O substrato foi imerso em solução por 18 minutos em um agitador orbital em baixa velocidade. Durante esta imersão, o ácido atacou o vidro por reagir com SiO2, assim dissolvendo porções visíveis do vidro que não foram cobertas com máscaras de cromo e fotorresiste, criando tufos uniformes sobre a superfície (FIG. 11). Essa solução resulta em uma taxa de gravação aproximada de 4 a 5 pm de espessura por minuto (dependente do frescor da solução). Agitação em um agitador orbital garante gravação uniforme da superfície.

O substrato foi subsequentemente lavado em carbonato de cálcio e em seguida água para neutralizar e remover o ácido em excesso, e finalmer^ite seco com nitrogênio. Se excesso de cromo permaneceu no substrato, a imersão adicional em Chromium Etchant e a lavagem com acetona e água para remover qualquer resquício é requerida. Finalmente, o substrato foi seco com nitrogênio. Diâmetro e profundidade de tufo foi medido utilizando um perfilômetro (FIG. 12). Em protótipos criados até o momento, variabilidade do tamanho do tufo não tem sido problemática; protótipo de tufos mediu +/-10% das dimensões especificadas.

Montamos dois outros métodos proféticos que podem ser usados para criar moldes:

SU-8 moldes negativos: Nesta modalidade, o vidro pode ser usado novamente como o substrato. O vidro passa por um processo semelhante a fotolitografia como antes, mas o desenho original é alterado para criar um molde

59/86 de modelo negativo, que pode ser convertido em um micro molde, mas vertendo um dos biopolímeros listados no cunho e permitindo que este cure. Resumidamente, SU-8 fotorresiste é revestido em giro em uma camada fina (espessura de camada deve ser igual à profunidade desejada de tufos). É então cozido suavemente, coberto com uma foromáscara (como descrito acima) e exposto à luz UV, cozido novamente pós-exposição, desenvolvido em um desenvolvedor SU-8 e finalmente exposto a um cozimento pós-desenvolvimento. Isso resulta em um pedaço de vidro que tem projeções negativas de tufos com base nas especificações do projeto. Este modelo negativo, em seguida, vai ser usado para converter moldes em um determinado biopolímero ou PDMS, criando uma impressão do molde após a cura. O cunho será então removido do polímero curado. O polímero acabado se assemelhará a micro moldes de vidro/PDMS e terá tufos de dimensões definidas. Uma vantagem deste procedimento é que para testes de drogas ou outras aplicações, cada tufo pode ser marcado durante a etapa de design com um identificador exclusivo (ex. texto, números) e estará presente nos moldes acabados como impressões visíveis por cada tufo (ver FIG. 28). Um processo mais detalhado é descrito nas orientações de processamento do fabricante (SU-8 2000 - Fotorresiste Negatico de Epoxi Permanente, MicroChem, Newton, MA).

Negativos de Molde Metal Gravado: Nesta modalidade, os moldes de polímero poderíam ser criados usando um molde de fundição de metal. A fundição de metal pode ser fabricada através da concepção de um modelo 3D no software de CAD. Um possível design é fornecido na FIG 27. O metal é gravado a laser para criar um molde de fundição semelhante aos moldes SU-8 descritos acima. O polímero é vertido sobre a fundição de metal e curado para criar um novo micro

60/86 molde. Novamente, se necessário, texto ou números podem ser incorporados no modelo 3D para marcar cada tufo como acima, deixando uma marca visível.

O modelo de metal gravado e o SU-8 foram desenvolvidos para permitir que um método para produzir moldes de um determinado material para uso in vitro e in vivo. Mais especificamente, esses métodos podem utilizar biopolímeros para criar moldes que poderão ser implantados. Estes métodos devem ainda permitir desenhos mais detalhados (como marcações de tufo) e mais controle na criação do tufo, formato e tamanho (variabilidade de medicas de tufo devem ser menos do que +/-1% de dimensões especificadas).

Construção de alojamento de substrato em tufo. O próximo passo na construção do micro molde é desenvolver um sistema em que a superfície em tufo será colocada e protegida, e que servirá como um recipiente maior para cultivo (ver PDMS “alojamento na FIG. 10).

A base [6] e as paredes verticais [5] do alojamento do molde foram construídos utilizando Dow Corning Sylgard 184 Polidimetilsiloxano (PDMS) (FIG. 13). PDMS foi misturado em uma proporção de 10 partes de base para 1 parte de agente de cura em um tubo de centrífuga de 50 ml (~ 2 horas tempo de trabalho). O tubo foi misturado bem para dispersar completamente o agente de cura e base. Um vórtice pode ser usado para ajudar na mistura durante este processo. O PDMS foi centrifugado a 1000-1500 rpm por 1 minuto para remover bolhas de ar. Materiais que não sejam de PDMS pode ser usados para construir alojamento apropriado para o micro molde. Por exemplo, materiais adequados para um micro molde significou para aplicações multi-uso in vitro incluem, entre outras, micro moldes que serão implantados (uso in vivo) serão formados com a superfície de tufos e os lados do molde de biopolímeros. No entanto, a altura dos lados será

61/86 mínima e pode ser removida antes do transplante para diminuir o volume total do material transplantado.

Materiais adequados para um micro molde proposto para aplicações in vivo incluem, entre outros, poli(ortoésteres), poli(anidretos), poli(fosfoésteres), poli(fosfazenos) e outros. Outros materiais não limiatentes incluem, por exemplo, polisscarídeos, poliésteres (como poli(ácido láctico ), poli(L-lisina), poli(ácido glicólico) e poli(láctico-co-ácido glicólico)), poli(ácido láctico -co-lisina), poli(ácido láctico -graft-lisina), polianidretos (como poli(dímero de ácido graxo), poli(ácido fumárico), poli(ácido sebácico), poli(carboxifenoxi propano), poli(carboxifenoxi hexano), copolímeros destes monômeros e semelhantes), poli(anidreto-coimidas), poli(amidas), poli(orto ésteres), poli(iminocarbonatos), poli(uretanos), poli(organofasfazenos), poli(fosfatos), poli(etileno vinil acetato), e outros acetatos de celuose acil substituídos e derivados dos mesmos, poli(caprolactona), poli(carbonatos), poli(aminoácidos), poli(acrilatos), poliacetais, poli(cianoacrilatos), poli(estirenos), poli(cloreto de vinil), poli(fluoreto de vinil), poli(imidazol de vinil), clorosulfonado poliolefinas, óxido de polietileno, copolímeros, poliestireno, e misturas ou co-polímeros dos mesmos). Em certos aspectos preferenciais, os biomateriais incluem polisscarídeos, alginato, hidroxipropil celulose (HPC), Nisopropilacrilamida (IPA), polietileno glicol, polivinil álcool (PVA), polietilenimina, quitosana (CS), quitina, dextran sulfato, heparina, condroitina sulfato, gelatina, etc., e seus derivados, copolímeros, e misturas dos mesmos. Outros biomateriais apropriados incluem aqueles como náilon, hialuronana, politetrafluoroetileno, polivinil formamida, e outros descritos em Vats et al, (2003); Wang et al, (1997); and Orive et al., (2003)].

O formato do alojamento do molde foi formado usando um andaime de

62/86 cobre (FIG. 13). Um tubo grande de cobre (1,75 polegadas da diâmetro) [1], foi colocado, abertura para baixo, em uma superfície plana [4] (por exemplo, quadrado grande de vidro embrulhado em folha de alumínio). PDMS foi adicionado ao centro da abertura do tubo a uma profundidade de 2 mm para formar a base de alojamento do molde [6]. Toda a estrutura, em seguida, foi cozida por 45 minutos a 100°C em um forno. Após o cozimento, o substrato em tufo foi colocado, tufo de lado para cima, no centro do tubo de cobre (linha picotada descreve a localização do vidro gravado [4] em relação ao tubo de cobre grande) sobre a base PDMS curada [6].

A pequena quantidade de PDMS foi adicionada às bordas do substrato em tufo para fixar no centro da base de PDMS curada [6]. A estrutura foi depois cozida por 30 minutos a 100°C. Um pequeno tubo de cobre [2] (1 polegada de diâmetro foi centrada em cima do substrato gravado e PDMS foi vertido para os espaços entre os tubos grande [1] e pequeno [2] de cobre. Este passo foi feito com cuidado para evitar derramamento do PDMS no centro do molde. A quantidade de PDMS derramada no espaço entre os tubos de cobre grande [1] e pequeno [2] determina a altura do alojamento do molde [5]. A altura e largura do alojamento do molde podem ser especificadas pelo usuário. O micro molde, incluindo o andaime de alojamento, foi então cozido durante a noite (pelo menos

12 h) a 100°C para totalmente curar o PDMS.

Após o cozimento durante a noite, o setup de andaime de cobre foi removido como a seguir. Toda a estrutura foi resfriada para encolher o PDMS, permitindo a remoção do molde do andaime a partir do tubo de cobre. O tempo exato necessário para a refrigeração é dependente da temperatura; 30-60 minutos a -20°C é suficiente. A camada inferior de folha/camada de vidro [4] e um

63/86 pequeno tubo de cobre [2] foram cuidadosamente removidos. Em seguida, o tubo de cobre grande [1] foi separado de micro molde.

Esterilização do micro molde. De preferência, uma superfície que contém o tufo da presente invenção é capaz de ser esterilizada. Em uma modalidade, quando o micro molde acabado está livre de andaime, pode ser lavado e esterilizado conforme necessário para o uso. Esterilização com etanol e vapor são os métodos preferidos de esterilização, mas outros métodos de esterilização conhecidos pelos especialistas são apropriados. Ao usar o micro molde PDMS, acetona não deve ser usada. Da mesma forma, os procedimentos de esterilização que irão comprometer a integridade dos materiais usados em substrato de tufo ou o alojamento do molde não devem ser usados. A esterilização permite que o micro molde seja usado repetidamente para uso in vitro. Obviamente, moldes utilizados para implante in vivo não teriam esse requisito.

Reagregação de célula dentro de micro moldes.

Liberação de células para micro moldes. Células de ilhotas únicas dispersas usadas para reagregar as ilhotas podem ser obtidas de qualquer fonte de células da ilhotas. Neste exemplo, o pâncreas de um animal foi canulado in situ através do dueto biliar comum e distendido bombeando uma solução fria de colagenase (Worthington, Lakewood, NJ) no duto. Posteriormente, o pâncreas distendido foi extirpado, transferido para tubos de centrífuga e incubado por 30 min com suave rotação a 37°C. O digesto lavado foi passado através de uma peneira e sedimentado em uma centrífuga refrigerada. O pellet resultante foi misturado com Histopaque (densidade = 1,1085, Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO) e centrifugado. As ilhotas foram então limpas do tecido exócrino por filtragem através de uma peneira de 40μ com solução salina balanceada de

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Hanks (HBSS) com 5% de soro de bezerro bovino e colocados em placas de Petri contendo meio de cultura DMEM/F12, 10% de soro bovino fetal (FBS), EGF (20ng/mL) e antibióticos a 1 %. As ilhotas foram mantidas durante a noite a 37°C, com 5% de CO₂.

Para dispersar ilhotas em células únicas, ilhotas isoladas foram digeridas em suspensões de células viáveis colocando-as em um tubo de centrífuga de 50 ml, centrifugando e transferindo o pellet para um tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. Depois de duas lavagens com HBSS livre de cálcio e magnésio, uma mistura de nove partes de HBSS livre de cálcio e magnésio e 1 parte de papaína (5 U ml concentração final) foi adicionado. Após incubação em rotação a 37°C por 20 min, as ilhotas foram pipetadas, dispersando-as em células únicas.

Incubação das células em micro moldes. Células dispersas únicas foram transferidas aos micro moldes em Meio Agregado especializado (meio de cultura DMEM/F 12, com 10% de soro bovino fetal (FBS), EGF (20ng/mL), ITS (Ig/L), BSA (2g/L), Nicotinamida (10nmol/L), Exendina-4 (5nmol/L) e 1% antibióticos) (Kikugawa et al. 2009) para cultura final. A este Meio Agregado, adicionamos condições de cálcio alto (2-4 mM), que aumenta a reagregação das ilhotas. No momento da dispersão, uma alíquota de células é examinada microscopicamente usando um hemocitômetro. A percentagem de células única versus dubletos ou tripletos é determinada. Uma dispersão de célula bem sucedida é definida como tendo um mínimo de 90% células viáveis com os outros 10% compreendendo dubletos e tripletos. Conhecendo a densidade de células na dispersão através da contagem de células usando o hemocitômetro, somos capazes de estimar o número de células por tufo. No entanto, também contamos as células/ tufo uma vez que micro moldes foram carregados, que variou de experimento para

65/86 experimento, com base na densidade de células do meio, mas variou de 20-150. O número de células/tufo pode ser manipulado com base na densidade de células nos meios que são carregados no molde, oferecendo vantagens para o usuário para controlar o tamanho final da estrutura celular 3D alvo.

Os micro moldes foram suavemente agitados então deixadas descansar por 15 minutos para que as células se estabeleçam em tufo individual. As ilhotas foram mantidas a 37°C, com 5% CO₂ até 9 dias com alterações de meio diariamente. Alteração de meio nos micro moldes, com 60 pm de profundidade de tufos foi realizada facilmente ser suavemente removendo (por sucção) o meio antigo próximo à parede do molde e pipetagem suavemente no molde com meio novo.

Reagregação de agrupamentos de célula dentro de micro moldes.

Inicialmente, as células aleatoriamente caíram no fundo de cada poço. O número de células que se estabelecem em cada tufo é definido pela densidade de células em suspensão. Para determinar a densidade de células antes de carregar o molde micro, uma alíquota de uma suspensão de células da ilhota é removida e as células/volume são contadas sob um microscópio usando um hemocitômetro. Sabendo o número de tufos no molde, e o tamanho alvo de cada ilhota reagregada, o número de células em suspensão pode ser concentrado ou diluído, dependendo da densidade inicial da célula. Se um molde contém 10.000 tufos e o resultado desejado é 100 células/tufo, então deve haver 1.000.000 de células no meio carregado no micro molde. A Figura 14 mostra células desenvolvendo em um micro molde, começando no dia 2 e avançando até o dia 5. Entre os dias 3 e 4, as células começaram a tomar a forma tridimensional de uma ilhota nativa. As ilhotas que se desenvolveram dentro de tufos foram todos limitadas a menos de

66/86 pm em diâmetro (diâmetro médio inferior a 50 pm). Esta dimensão é importante porque publicamos dados mostrando que 50 pm é um tamanho crítico para garantir o alimento para as células nucleares de ilhotas (Williams et al., 2010). As ilhotas maiores do que 50 pm demonstraram morte celular nuclear, enquanto que aqueles com menos de 50 pm raramente demonstraram morte celular nuclear na cultura. O fundo curvado de cada tufo ajudou a desenhar as células na direção de outra formação ideal de ilhotas esféricas reagregadas. A Figura 14 mostra as medições de profundidade de tufo único usando um perfilômetro. A profundidade deste tufo único é ligeiramente maior do que 60 pm e a parte inferior é curva, que empurra as células para o centro do tufo para agregação.

Sucesso na geração de ilhota reagregada de forma e tamanho ideal é exemplificada por resultados obtidos em um protótipo adiantado. Este protótipo adiantado compreendeu área de superfície de substrato sem tufo cercando o campo de tufos (FIG. 15). Quando semeado, algumas células caíram sobre a superfície sem tufo do micro molde protótipo. Enquanto algumas células que ficaram sobre as superfícies de sem tufos ficaram em forma de células únicas ou cresceram em agrupamentos de pequenas células, outras formaram megailhotas; enormes complexos que não foram limitados pelas especificações de tufo (FIG. 15). Dentro deste molde protótipo adiantado, células isoladas do mesmo animal, que foram cultivadas no mesmo meio e reagregadas do mesmo material de substrato produziram dois reagregados de célula diferente: i) aqueles formados dentro de tufos formaram pequenas ilhotas bem formadas, e ii) aqueles formados na superfície plana irrestrita das limitações físicas de um tufo formaram grandes conglomerados de células que são objeto de propriedades de difusão fraca.

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Algumas das ilhotas irrestritas cresceram a um tamanho de 400pm em diâmetro. Estes resultados fornecem excelente conceito de prova que fisicamente restringe a reagregação de células resulta em ilhotas de tamanho ideal.

Dados experimentais sugerem que ilhotas reagregadas em micro moldes demonstram propriedades de difusão semelhantes às apresentadas por ilhotas pequenas nativas. Para determinar as propriedades de difusão de ilhotas reagregadas em micro moldes, as ilhotas reagregadas foram expostas ao meio contendo um análogo fluorescente de glicose (2-NBDG) por dez minutos. O análogo da glicose fluorescente infiltrou-se completamente para o núcleo da ilhota reagregada indicando que a barreira de difusão da glicose é relativamente baixa (FIG. 26). Em contraste, trabalhos anteriores mostraram que grandes ilhotas nativas têm barreiras significativas à difusão que inibem a infiltração e absorção celular de glicose para o núcleo da ilhota, mesmo depois de horas de exposição a 2-NBDG (Williams et al, 2010). Coletivamente, estes dados indicam que as ilhotas reagregadas em micro moldes têm baixas barreiras de difusão em relação às ilhotas grandes nativas.

A comparação de células formadas em micro moldes para aqueles formados em placas multi-pocos comercialmente disponíveis. Os resultados de ilhotas reagregadas nos moldes foram comparados a ilhotas reagregadas em microplacas comercialmente disponíveis. As placas comerciais continham poços em formato quadrado que mediram 500pm em diâmetro. As células de ilhotas dispersas foram cultivadas em placas comerciais e agrupamentos tipo ilhotas se formaram, como previsto. Várias observações foram feitas. Primeiro, as células da ilhota formadas em placas comerciais congregadas e ligadas umas às outras nos cantos dos poços onde poderíam contatar as paredes. A Figura 16 mostra um

68/86 exemplo típico de células formando uma ilhota reagregada tocando o lado do poço comercial. Estas células usam contato de orientação para a reforma.

Segundo, sem limitações para o tamanho, mais e mais células ligadas juntas criando ilhotas gigantes (alguns mais de 400 pm em diâmetro) com viabilidade fraca. Sem pequenos micro moldes para limitar o número de células dentro de cada poço e as dimensões físicas, projetadas para orientar otimamente a forma da ilhota reagregada, as ilhotas resultantes eram muito grandes e continham uma elevada percentagem de células mortas. Os ensaios de viabilidade de ilhotas reagregadas nas placas disponíveis comercialmente, mais de 50% de morte celular foi observada com 6 dias de cultura. Estas grandes aberturas, as células muitas vezes permaneceram como singletos, mostrando viabilidade celular fraca. Aquelas células que foram capazes de agrupamento junto à parede ou canto do poço nunca formaram as formas esféricas indicativas de ilhotas nativas e tinha viabilidade fraca.

Terceiro, agrupamentos de células formadas em moldes comerciais não reagregaram no tecido tipo ilhota esférica que fomos capazes de obter usando o micro molde. A capacidade de formar esferas de ilhotas reagregadas é improvável uma característica importante preditiva de sucesso em função in vitro. A maior parte das placas multi-poços são fabricadas com poços de fundos planos e laterais quadradas, como mostrado na Figura 16. As células reagregadas em placas comerciais como essas não se fixam a cada outra em uma esfera reminiscente nativa e, portanto, são menos susceptíveis de funcionar eficientemente como uma ilhota nativa. Embora placas de 1536 poços com fundo arredondado estão disponíveis comercialmente, células da ilhota formadas em qualquer poço de 500 pm seria muito grande para superar as barreiras de difusão.

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Estes resultados suportam a noção que os moldes comercialmente disponíveis são substratos inapropriados para a formação ideal da ilhota.

Remoção de agrupamentos de células reagregadas de moldes. Em alguns casos, é desejável remover as células de ilhota reagregada do micro molde de modo que não comprometa a integridade ou viabilidade das células. Isso pode ser facilmente conseguido suavemente colocando uma pipeta grande diretamente sobre o tufos e aplicando sucção. As ilhotas reagregadas são retiradas de tufos com o meio. Posterior lavagem do micro molde com meio fresca e pipetagem diretamente sobre o tufo irão remover quase todas as ilhotas reagregadas no molde.

Caracterização da célula reagregados formadas em micro moldes. As ilhotas removidas de microplacas foram medidas para tamanho e viabilidade. Ilhotas nativas de rato de 20 - 350pm em diâmetro. Quando reagregados dentro dos tufos do micro molde (100 pm de diâmetro, 60 pm profundidade), 100% das ilhotas tiveram diâmetro menos de 90 pm; o diâmetro médio por ilhota reagregada foi de 36,6 ± 1,2 pm (medições de microscopia confocal de mais de 500 ilhotas reagregadas individuais). Originalmente, encontramos algumas estruturas maiores que acreditávamos representado ilhotas que nunca foram totalmente digeridas para células únicas e, portanto, nunca caíram nos tufos. Desde então, maior cuidado durante o procedimento de dispersão levou a suspensões de ilhotas com 90% das células em singletos e as restantes células predominantemente em dubletos ou tripletos. Estimamos, usando padrões de micro molde A e B (FIG. 17), que 85-90% de todos os agregados obtidos estão abaixo de 90pm em diâmetro. Por razões ainda não compreendidas, algumas das células nos tufos se dividiram em várias ilhotas, ao invés de formar uma ilhota

70/86 reagregada por tufo. A Figura 18 mostra um exemplo de duas ilhotas reagregadas dentro de um tufo.

Morfologicamente, as ilhotas reagregadas parecem idênticas a ilhotas nativas do mesmo tamanho. São esféricas em forma com uma superfície externa tipo cápsula cercando a ilhota, como pode ser visto na FIG. 29. Em contraste, a FIG. 15 mostra que células se agregando sem o micro molde não formam esferas ou uma cápsula aparente.

Experimentos de viabilidade foram concluídos sobre as ilhotas reagregadas usando corantes celulares de apoptose/necrose (fnvitrogen, ensaio de apoptose

Vybrant contendo Yo-Pro-1 e iodeto de propídio). Este ensaio de dupla marcação mede integridade de membrana e fragmentação de DNA. Ilhotas reagregadas foram incubadas em dois marcadores por 1 hora usando os métodos que publicamos anteriormente (MacGregor et al, 2006; Williams et al, 2010). Posteriormente, as ilhotas foram lavadas com PBS e colocados na câmara de

Attofluor no microscópio confocal Fluoview 300. Ilhotas reagregadas oticamente foram secionadas e imagens do centro da ilhota foram armazenadas para análise posterior. A área dentro da ilhota contendo corante foi calculada como uma porcentagem da área total da ilhota para determinar a viabilidade. Medições de viabilidade de ilhotas de 5 dias de idade reagregadas demonstraram viabilidade extremamente alta dentro das células e revelaram muito poucas células/ilhotas mortas. A viabilidade global de ilhotas reagregadas foi 99,76%. Este valor é maior do que reportado anteriormente na literatura para ilhotas nativas grandes e pequenas, e para dispersões de célula de ilhota única (Williams et al, 2010; Song et al, 2009).

A Figura 19 mostra exemplos de ilhotas típicas coradas para viabilidade.

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Nestes testes, a coloração vermelha indica morte celular de necrose e coloração celular verde indica morte celular de apoptose.

A Figura 19A mostra uma de algumas poucas células mortas que foram identificadas nas ilhotas reagregadas nos micro moldes. A célula corada em vermelho está em fase de morte celular, devido à necrose. No tecido isolado, necrose celular geralmente ocorre primeiro. Apenas duas células apoptóticas (verdes) foram observadas em 500 ilhotas testadas. Em contraste, quando as células do mesmo animal formaram grandes mega-ilhotas na superfície do micro molde, havia um número significativo de células mortas presentes na massa. A Figura 19B captura um plano de vista com 23 células mortas. Ajuste de plano focal do microscópio mostrou que mais células mortas estavam presentes em todos os planos da massa. Assim, células reagregadas nos tufos às ilhotas de proporções corretas tinham viabilidade muito alta, enquanto células deixaram reagregar em grandes massas fora dos tufos mostraram morte celular significativa. Estes resultados suportam o sucesso do micro molde, porque as células que pousaram nas áreas do molde sem tufos tinham viabilidade muito mais fraca do que aquelas formadas nos tufos.

A viabilidade de todas as células formadas em micro moldes excederam as grandes e pequenas ilhotas nativas dos mesmo animais (FIG. 20). A viabilidade foi comparada entre ilhota reagregadas pequenas e grande de ratos usando ensaio de apoptose Vybrant da Invitrogen, conforme descrito anteriormente. Seis dias após o isolamento, houve alguma variabilidade na percentagem de células vivas em dois grupos de ilhotas nativas, no entanto houve algumas células mortas em ilhotas reagregadas, levando a barras de erro que eram muito pequenas para representar visualmente na figura. Ilhotas reagregadas em micro moldes

72/86 apresentaram aproximadamente 10% maior viabilidade do que ilhotas pequenas nativas e aproximadamente 40% de maior viabilidade de grandes ilhotas nativas (FIG. 20).

Populações de células geradas a partir de micro moldes. Existem três tipos principais de células presentes em ilhotas nativas (grandes e pequenas) que compreendem cerca de 90% das células totais em ilhotas. As células alfa que secretam glucagon compõem cerca de 20% de todas as células da ilhota. As células beta que produzem insulina compõem 60-65% do número de células totais e células delta que produzem somatostatina compreendem 5-10% da composição celular de ilhota. Ilhotas projetadas nos micro moldes presentes demonstraram conter células alfa, beta e delta. Por exemplo, a figura 21 descreve duas ilhotas representativas formadas nos presentes micro moldes 6 dias após reagregação; as células beta são coradas de verde, as células alfa são coradas em vermelho e células delta são coradas em azul. Estas ilhotas projetadas parecem ter uma menor percentagem de células beta do que a ilhota nativa média. No entanto, quando comparado com ilhotas pequenas nativas, a composição celular relativa de células alfa: beta; delta e suas organizações podem assemelhar-se a ilhotas pequenas nativas. Ilhotas pequenas e grandes nativas de ratos são organizadas com células positivas de glucagon e positivas de somatostatina localizadas nas camadas externas da ilhota. As células positivas para insulina são encontradas no centro. Como tal, a porcentagem de células positivas de insulina (células beta) é menor na ilhota pequena, mas cada ilhota contém grandes quantidades de insulina. Embora não calculamos a porcentagem de células beta/alfa/ e delta (células positivas para insulina/glucagon/somatostatina) em suficientes ilhotas reagregadas para concluir definitivamente, é provável que a percentagem de

73/86 células beta em relação a todas as outras células se assemelhará à ilhota nativa. Uma diferença importante é que em ilhotas reagregadas, as células alfa, beta e delta são organizadas em um padrão aleatório com células dispersas em toda a ilhota reagregada. Esta é a mesma organização observada em ilhotas humanas (Hahn van Dorshe et al., 1988; Bosco et al., 2010. Assim, as ilhota reagregadas demonstram um padrão mais aleatório da organização celular, uma reminiscência de ilhotas humanas nativas.)

Produção de insulina. Foi importante verificar que ilhotas projetadas em micro moldes foram capazes de produzir novas moléculas de insulina. Insulina é sintetizada como uma molécula precursora, chamada proinsulina. Ilhotas reagregadas de seis dias de idade foram coradas para determinar se níveis de proinsulina estavam fazendo nova insulina. A Figura 22 mostra um exemplo de uma ilhota reagregada corada para moléculas de proinsulina (verde) e insulina madura (vermelho). Como esperado, as células beta foram marcadas duas vezes. A imagem mostra que nova insulina está sendo sintetizada em ilhotas reagregadas, até seis dias em cultura.

Ilhotas são responsáveis pela liberação de insulina no sangue em resposta à glicose em alta exposição depois de comer uma refeição. A falta de secreção de insulina é a causa da incapacidade de pessoas com diabetes tipo 1 de manter níveis de glicose no sangue normal. Para determinar a resposta das células à glicose, ilhotas reagregadas nos presentes micro moldes e ilhotas pequenas nativas foram expostas a condições de baixa glicose (3 mM). Insulina secretada no meio por ambos os tipos de ilhota foi coletada e quantificada (FIG. 23). Em condições de baixa glicose (30 minutos), ilhotas reagregadas liberaram 100 vezes mais insulina do que a ilhota nativa (ilhotas pequenas nativas produzem mais

74/86 insulina que ilhotas grandes nativas). Quando expostas à glicose alta (20 mM), as ilhotas reagregadas continuaram a secretar insulina significativamente mais do que ilhotas pequenas ou grandes nativas. Para confirmar que as ilhota reagregadas eram secretoras de insulina, ao invés de vazar a insulina, completamos experimentos adicionais usando uma pequena membrana de dextrano impermeante (10 kD). Uma molécula deste tamanho é pequena suficiente para passar através do complex poro nuclear no envelope nuclear dentro da célula. No entanto, a membrana plasmática não contém complexos de proteínas capazes de passar moléculas deste tamanho. O dextrano (20mM) foi adicionado ao meio contendo ilhota reagregadas e imagens confocais capturaram a incapacidade do dextran em entrar nas células mesmo após 4 horas de exposição, sugerindo que as células não vazavam ou danificavam a membrana. Além disso, se células estavam de fato vazando insulina ao invés de secreta-la, devemos observar níveis mais elevados de corante vermelho ou verde durante os ensaios de necrose/apoptose nas ilhotas reagregadas mostradas na FIG. 22. Coletivamente, estes dados sugerem que ilhotas reagregadas em micro moldes realmente produzem maiores quantidades de insulina do que suas contrapartes de ilhotas grandes ou pequenas nativas.

A nosso conhecimento, a secreção de insulina a estes níveis de células a partir de ilhotas nativas ou alteradas não foi relatada, tornando nossos resultados extremamente originais. O grupo Weir relatou encapsulamento de pequenas ilhotas reagregadas em um alginato com alto teor de ácido gulurônico (0'Sullivan et al, 2010). Weir criou estas ilhotas agregadas por simplesmente dispersando ilhotas de células únicas, em seguida, permitindo-lhes remodelar sem restrições. O trabalho de Weir mostrou que em níveis de oxigênio normais suas pequenas

75/86 ilhotas lançaram tanta insulina quanto ilhotas nativas, mas em baixa de oxigênio as ilhotas de Weir liberaram mais insulina do que ilhotas nativas. No entanto, as ilhotas de Weir de melhor desempenho secretou 20 vezes menos insulina do que nossas ilhotas reagregadas em micro moldes. A razão para o relativo declínio na secreção de insulina por nossas ilhotas reagregadas em glicose alta é desconhecida até o momento, e algo deve ser determinado antes de ilhotas projetadas serem transplantadas em animais diabéticos. Apesar do relativo declínio, o dramático aumento na secreção de insulina em ambas as condições de glicose alta e baixa, em comparação comparada a ilhotas nativas, é um atributo importante e único da reagregação do método de micro molde.

Aditivos para ilhotas. Métodos e materiais alternativos que poderíam ser utilizados no processo de ilhotas reagregadas em micro moldes são quase ilimitadas. Primeiro, existem muitas moléculas que poderíam ser incorporadas em ilhotas projetadas no momento da reagregação. Essas incluem, entre outros, fatores de crescimento, imunomoduladores, imunossupressores, citocinas, quimiocinas, DMARDs (drogas antirreumáticas modificadoras da doença), antiínflamatórios e antibióticos. Moléculas ou dispositivos em miniatura para aumentar a tensão de oxigênio no local do transplante poderiam ser incorporados em ilhotas reagregadas, especialmente se um substrato de micro molde implantável foram usados. Outras classes não limitantes de moléculas que poderiam ser adicionadas no tempo da reagregação inclui drogas para induzir a liberação de insulina, moléculas pequenas, peptídeos, proteínas, anticorpos (por exemplo, contra CD11a, CD11b, CD11c, CD18), e ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RA).

Discussão. Nosso micro molde com tufos é diferente de outros andaimes

76/86 usados na técnica de células reagregadas. Anteriormente, outros tentaram usar o método de gota em suspensão para formar ilhotas (por exemplo, Lehmann et al, 2007). No método de gota em suspensão, as células são colocadas em solução, uma gota em uma tampa da placa de Petri, que depois é virada de cabeça para baixo para que as células caiam no fundo da gota em suspensão da solução, onde podem formar uma ilhota. No entanto, o método de gota em suspensão é demorado e tende a contaminação porque o meio na “gota” não pode ser alterado.

Utilidade de micro moldes in vitro. O presente micro molde pode ser projetado para formar agregados celulares in vitro para transplante subsequente ou para droga ou dispositivo testando entre outras aplicações.

Geração de células para transplante. (Exemplo Profético) Um micro molde preferencial projetado para gerar células para transplante é um dispositivo único que é esterilizável, reutiiizável e não vaza meio ou células quando preenchido (FIG. 24). Primeiro, ilhotas precisam ser isoladas de pâncreas. As ilhotas saudáveis seriam separadas da grandes ilhotas. As grandes ilhotas seriam dispersas em células únicas ou dubletos, que são carregadas no micro molde. Depois de 3 a 6 dias na cultura, as células seriam removidas, misturadas com as pequenas ilhotas nativas e transplantadas para o diabético receptor.

Micro molde A (FIG. 17A) destina-se a reagregação de ilhota com tufos que são 100pm em diâmetro com 60pm de profundidade. Demonstramos que 60pm de profundidade é ideal, pois permite fácil remoção da ilhotas reagregadas de tufos. Os tufos são arranjados em um padrão alternando para que haja um espaço mínimo entre tufos (FIG. 17A). A distância média entre tufos é menor que 30pm.

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A superfície sem tufos observada na Figura 15 seria inteiramente coberta em tufos no micro molde vislumbrado para a geração de células para transplante. Este arranjo permite máximo espaço no micro molde a ser usado para tufos resultando em números máximos de reagregados feitos por molde, e a máxima eficiência de modo que qualquer célula flutuando na superfície do molde provavelmente vai cair em um tufo, limitando assim a perda de células viáveis para a reagregação.

O número de tufos que pode ser obtido em um molde irá variar com o tamanho do molde. Um molde de aproximadamente 1,5 polegadas em diâmetro, usando o desenho de micro molde A (FIG.17A), contém entre 10.000-12.000 tufos por molde. O espaçamento de tufos também é dependente das necessidades do molde. Para a reagregação do tecido para transplante, eficiência do tecido original ao número de ilhotas reagregadas é importante. Quanto maior a porcentagem de células que caem nos tufos, melhor a eficiência na produção de novas ilhotas.

Assim, nossos moldes concebidos para transplante de ilhotas têm um espaçamento de tufo de 20-30pm.

Triagem de drogas. (Exemplo profético) Triagem de drogas usando o micro molde é baseado no conceito de que células organizadas em uma estrutura 3D, como um mini-tumor ou uma pequena ilhota, vão responder ao seu ambiente de forma diferente do que células cultivadas ou reagregadas planas em uma placa. Por exemplo, mini-tumores ou ilhotas poderíam ser formadas em tufos de micro moldes, e, em seguida, terapêutica potencial, drogas anticâncer como, podería ser aplicado individualmente a cada tufo ou adicionado a placa inteira. Poderia então examinar a formação das estruturas 3D e observar as alterações, como viabilidade celular reduzida ou tamanho do agrupamento, que indicam um efeito

78/86 indesejável da substância química. No primeiro exemplo, muitos medicamentos diferentes podem ser testados em um pedaço de vidro que é de aproximadamente 35 mm de comprimento. Com a segunda abordagem uma única droga seria testada, mas em um molde, haveria muitas respostas individuais que podem ser quantificadas.

Uma quantificação possível para testar droga de câncer seria a viabilidade (coradas vivas/mortas), que poderia ser feita para cada tumor. Enquanto os testes de drogas potenciais de câncer usando o desenho do micro molde é atraente, o molde seria útil para todos os testes de drogas que é melhor feito em células em um arranjo 3D.

Micro molde B (FIG. 17B) destina-se a liberação de intervenções individuais para cada poço. Assim, seria aplicável para os testes de drogas. Para este projeto os tufos foram aproximadamente 180pm em diâmetro com 120pm de espaço entre cada tufo. O espaçamento pode ser aumentado ou diminuído conforme necessário. A Figura 11 mostra uma imagem do assoalho do micro molde B com tufos vazios individuais. Molde micro B contém 2.700-3.000 tufos por molde, muitos menos do que no desenho A. O espaçamento entre os tufos no desenho B é maior para assegurar a liberação precisa da droga a apenas um tufo. Especificação do padrão de tufo e espaçamento são definidos pelo usuário e dependerá do sistema de liberação de droga utilizado. Usando os moldes para testar milhares de compostos sobre as células em cada tufo permitiría que o usuário concluísse a triagem de droga completa em 2.000-3.000 diferentes drogas em um molde que é menor que 2 cm em diâmetro (FIG. 24). Triagem de drogas de alto rendimento utilizando cada molde para uma droga separada permitiría milhares de agrupamentos de células individuais para responder è ser medido

79/86 como respostas individuais ao invés de uma resposta média. Triagem de drogas de alto rendimento com sistemas de nano-liberação podería ser utilizada de modo que cada tufo poderia conter uma droga diferente para testes. Alternativamente, pode-se coletar pontos de dados de milhares de amostras expostas ao mesmo tratamento e as condições de cultura (FIG. 24).

Geração de células não ilhotas. (Exemplo profético) Moldes podem ser projetados para uma variedade de formas de agregação de célula incluindo entre outros, caminhos longos neuronais, filtros tipo glomerulares, vasos, alvéolos de substituição, etc. A agregação de células-tronco ou células reprogramadas em um pequeno e bem definido formato como um micro molde também seria uma utilização adequada desta invenção.

Uma aplicação típica poderia ser a expansão e a agregação de linhagens de células cultivadas em moldes. Neste caso, as células em suspensão seriam carregadas nos moldes em uma densidade extremamente baixa, variando de 1-50 células/tufo (dependendo das necessidades do usuário). Linhagens de células cultivadas contêm células em divisão, que seriam deixadas crescer nos tufos por um período de tempo, dependendo das necessidades do usuário. Outras fontes de células incluem células recém-dispersas de animais ou seres humanos. O processo para carregar células recém-dispersas é semelhante aos métodos gerais descritos para ilhotas. O tecido de escolha, por exemplo, um vaso, estaria exposto às enzimas digestivas até células únicas ou dubletos estavam em suspensão. As células seriam carregadas no molde na densidade e no meio de escolha pelo usuário. Finalmente, células-tronco poderíam ser programadas para produzir vários tipos de células adultas. Estas células também podem ser carregadas em micro moldes para melhorar a formação de estrutura 3D.

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Utilidade de micro moldes in vitro. (Exemplo profético) Os micro moldes aqui descritos são úteis para aplicações in vitro.

Ilhotas reagregadas em moldes para transplante. (Exemplo profético) Micro moldes construídos a partir de biopolímeros podem ser usados para gerar um produto implantável (FIG. 23). Neste caso, o micro ambiente do molde seria alterado para que ilhotas reagregadas seriam unidas ao biopolímero e o “adesivo” inteiro podería ser transplantado ao receptor. Biopolímeros descritos supra seriam adequados para gerar dito micro molde implantável. Os tufos no molde poderíam ser usados para criar poços que permitiríam que as células estabelecessem primeiro nos tufos onde sua reagregação seria guiada pelas dimensões do tufo, e segundo aderir o tufo biopolímero.

Para criar tufos no biopolímero, ceras negativas seriam projetadas usando protocolos conhecidos na técnica (por exemplo, Dean et al. 2007). Para moldes que são implantáveis, as ilhotas seriam deixadas no molde e cirurgicamente colocadas no receptor. Moldes implantáveis teriam um projeto de molde com aberturas entre os tufos que permitiría a infiltração de nervos e vasos sanguíneos para ilhotas. Além disso, materiais implantáveis poderíam ser impregnadas com, por exemplo, fatores neuronais e fatores de crescimento vasculares e os moldes também podem conter imunossupressores para proteger as ilhotas de rejeição imunológica.

Implantação do molde com ilhotas podería ser feita usando vários métodos publicados. Os micro moldes podem ser colocados na cavidade peritoneal, como publicado por Qi et al, 2010. A cavidade abdominal é aberta sob anestesia e o molde seria colocado delicadamente no espaço subfascial. Locais alternativos para implantação de micro molde incluem inserção subcutânea, especialmente

81/86 seguir pré-condicionamento para aumentar o suprimento vascular para a região, conforme descrito por Veriter et al. 2010. No transplante humano, as ilhotas são colocadas no fígado através da veia portal (Koh et al, 2010). Com micro moldes, a infusão através da veia porta não seria possível, mas os moldes poderiam ser colocados no fígado ou sob a cápsula renal com mais cirurgia invasiva (MacGregor et al, 2006).

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A partir do anterior será observado que esta invenção é uma bem adaptada para atender a todas as finalidades e objetivos aqui acima estabelecidos, junto com outras vantagens que são óbvias e que são inerentes à invenção. Uma vez que muitas possíveis modalidades podem ser feitas da invenção sem se afastar do escopo da mesma, deve ser entendido que todas as matérias aqui estabelecidas devem ser interpretadas como ilustrativas e não em um sentido limitante. Embora modalidades específicas tenham sido mostradas e discutidas, várias modificações podem, claro, ser feitas, e a invenção não é limitada às formas ou arranjos específicos de partes e etapas descritas aqui, exceto, enquanto essas limitações sejam incluídas nas seguintes reivindicações. Ainda, será entendido que certas características e subcombinações são de utilidade e podem ser empregadas sem referência a outras características e subcombinações. Isto é contemplado e está dentro do escopo das reivindicações.

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Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Substrato não implantável para a cultura de células caracterizado pelo fato de estar compreendendo:

   uma superfície granular não aderente, que compreende uma superfície superior substancialmente plana, e uma pluralidade de grânulos nela formada;

   em que cada um grânulo compreende uma superfície inferior interna e uma superfície de parede lateral interna, em que a superfície inferior é arredondada e em que cada grânulo mede entre 100 e 200 pm de diâmetro e de 50 a 150 pm de profundidade;

   em que as células podem ser distribuídas em grânulos individuais, em que as células não aderem à superfície granular, de tal modo que as células são removíveis da mesma.
2. 2. Dispositivo para a cultura de células compreendendo o substrato de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de estar compreendendo adicionalmente um sistema para manter o referido substrato planar, em que o sistema forma uma superfície inferior e uma superfície de parede lateral interna e um volume interno, sendo as paredes inferior e lateral substancialmente estanques para líquidos, em que as células e o meio de cultura são distribuídos dentro do volume interno.
3. 3. Substrato, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a superfície plana é feita de vidro.
4. 4. Método para a cultura de células, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução de células a um substrato não implantável, que compreende uma superfície superior substancialmente plana e uma pluralidade de grânulos nela formados, em que cada grânulo compreende uma superfície inferior interna e uma superfície de parede lateral interna, em que a superfície inferior é arredondada, e em que cada um grânulo mede entre 100 e 200 pm de diâmetro e de 50 a 150 pm de

   Petição 870180060118, de 12/07/2018, pág. 15/18

   2/2 profundidade, e expondo o dispositivo a condições de cultura de células, em que as células não aderem à superfície granular, de tal modo que as células são removíveis da mesma.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as células são células de ilhotas e em que as células se agregam novamente em pequenas ilhotas após exposição ao substrato e condições de cultura favoráveis.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as células se acomodam / colonizam dentro dos grânulos em uma proporção de cerca de 20 a 150 células por 1 grânulo.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as células se agregam em agregados de células tridimensionais após exposição à superfície granular e condições de cultura favoráveis.
8. 8. Substrato, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida superfície do substrato é livre de moléculas de adesão celular para facilitar a fixação celular individual à superfície.
9. 9. Substrato, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de estar os referidos grânulos gravados na superfície superior substancialmente plana do substrato.

   Petição 870180060118, de 12/07/2018, pág. 16/18

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