CN101336290A - 用于细胞和组织培养的生物反应器 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于孵育细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织(prototissue)”或类似样本的生物反应器。所述生物反应器在微重力条件下通常适合于旋转使用，并且配备具有小的内部流体体积的孵育腔，通常少于1ml。为了避免与小体积孵育相关的问题，所述生物反应器可以包括湿度室或者其他避免脱水的手段，以及基本流体紧密的闭合的通道端口，其可以避免将气泡引入孵育腔。小体积的生物反应器允许在培养物中长期地维持组织分化状态。还提供了利用生物反应器孵育细胞或组织的方法，包括产生化学组合物对长期培养物中的已分化细胞或组织样本的生物学效应的分子谱的方法。

Description

用于细胞和组织培养的生物反应器

技术领域

本发明涉及用于孵育一种或多种细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织(prototissue)”或类似样本的生物反应器。

背景技术

在基本上扁平的培养皿中的“经典的”细胞培养期间，一般来说细胞并且尤其是活组织检查趋于去分化。明显地，活组织检查表现出“冰激淋溶解效应(‘melting ice-cream effect)”，细胞从组织块迁移至培养皿的扁平支持面上。在这些“迁移性”细胞中基因表达被改变，它们开始在生物化学上表现得像分离细胞，而不是像分化组织的细胞组分。去分化的细胞表达的生化途径不同于由完整有机体中的相应细胞正常表达的那些。

与“经典的”细胞培养条件相反，“微重力”条件使培养中的许多类型的细胞保留了分化状态。微重力生物反应器通过持续旋转通常为圆柱状的或管状的孵育舱而保持微重力状态。这种旋转持续地迫使细胞趋向孵育室的中心，利用最小的剪切力使细胞悬浮于流体环境中。这诱导细胞相互作用并且诱导细胞聚集成集落。对于微重力培养，通常首先将细胞接种至小(直径大约为100μm)的珠子(这将加速微组织结构的形成，但是不是必需的)上。因为原组织由细胞在这些小珠周围生长而形成，这些小珠通常被排除或完全为细胞所覆盖。以这种方式形成的原组织变的十分高度分化，以至于类似成熟组织。

微重力生物反应器已经用于广泛的背景中。早期的研究显示，微重力生物反应器系统通过减少对细胞的剪应力而有助于细胞形成三维结构[Reduced shear stress：a major component in the abilityof mammalian tissues to form three-dimensional assemblies insimulated microgravity.Goodwin TJ，Prewett TL，Wolf DA，Spaulding GF.J Cell Biochem.1993 Mar；51(3)：301-11]。

如今大量的文献证明，在微重力生物反应器系统中生长的细胞的分化增加。对于综述请参见：[Growing tissues in microgravity.Unsworth BR，Lelkes PI.Nat Med.1998 Aug；4(8)：901-7]。例如，微重力培养诱导神经前体细胞形成细胞群集或“神经球”。这些原组织表征为原始的、但是有组织的结构，该结构具有表层的未成熟增殖细胞(回巢细胞(nesting cell)阳性和增殖细胞核抗原阳性)，其包围着更分化的细胞层(β-微管蛋白III阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性)。这些“神经球”有希望能发育成神经可移植组织(neurotransplantable tissue)。参见(例如)[Neural precursorcells form rudimentary tissue-like structures in arotating-wall vessel bioreactor.Low HP，Savarese TM，SchwartzWJ.In vitro Cell Dev Biol Anim.2001 Mar；37(3)：141-7]以及参见[Rapid differentiation of NT2 cells in Sertoli-NT2 celltissue constructs grown in the rotating wall bioreactor.Saporta S，Willing AE，Shamekh R，Bickford P，Paredes D，CameronDF.Brain Res Bull.2004 Dec 150；64(4)：347-56]

还有另一实例是，微重力培养多潜能人肾细胞系诱导表达的表型接近体内表型，如果将该细胞在其它条件下生长是不能获得该表型的[Generation of 3D retina-like structures from a human retinalcell line in a NASA bioreactor.Dutt K，Harris-Hooker S，Ellerson D，Layne D，Kumar R，Hunt R.Cell Transplant.2003；12(7)：717-31]。

已经报道了有关微重力生物反应器的一些技术问题。例如，当利用扁平培养器或利用微重力生物反应器对颞下颌关节(TMJ)盘组织进行工程化时，在总的基质含量和压缩刚度上没有显著差别，只在目视外观(gross appearance)、组织学结构和I型胶原和II型胶原的分布上有明显区别(微重力生物反应器培中的颞下颌关节盘组织具有更多II型胶原)。该作者得出结论：需要对微重力生物反应器培养系统进行改进[Detamore MS，Athanasiou KA.Use of a rotatingbioreactor toward tissue engineering the temporomandibularjoint disc.Tissue Eng.2005 Jul-Aug；11(7-8)：1188-97]。

尽管已是众所周知并且被广泛应用，目前可利用的微重力生物反应器具有重大的局限性：

目前，微重力生物反应器的最小尺寸大约为10ml。在许多情况下，更小的体积是理想的，以便减少昂贵材料的消耗和/或便于“高通量”检测。例如，更小体积的生物反应器将减少以不同浓度和在不同时间检测药物化合物时使用的细胞和化合物两者的量。材料耗费的减少在花费和毒性可能会特别高的放射性标记试验中是特别重要。一个应用实例是，在研究新药物组合物对培养细胞的基因表达或其它生物学响应的影响过程中，在多个时间点通常将检测多种浓度。为统计功效(statistical power)之故，通常将这种分析重复多次。如果使用10ml的生物反应器，在10个时间点以5种浓度重复检测一种组合物5次，则在单次试验将需要多达2.5升细胞。如果要求的放射性标记的代谢掺入为(例如)1mCi/ml，则该试验将需要2.5Ci的放射性。因此，提供孵育舱体积小很多的微重力生物反应器将是有利的。

现有技术的微重力生物反应器的另一个重大的局限性是水分损失，这会影响细胞生长。孵育期间的脱水(即使仅5-10％的脱水)可以导致pH以及其它浓度依赖性参数(例如盐、营养物质等的浓度)发生改变。许多细胞类型对它们环境高度敏感。对于这种细胞，这种环境条件中即使有小的改变都可以影响细胞生长和基因表达。该问题在小体积生物反应器中尤其显著，在小体积生物反应器中小的体积改变可以引起浓度依赖性参数发生相对大的变化。如果没有一些针对这种脱水问题的解决方法，小体积生物反应器将经历快速的水分损失，尽管在使用该生物反应器的孵育器中保持潮湿的条件(100％的相对湿度)。小体积生物反应器中的这种快速脱水的趋势，即相对量的快速改变的这种趋势大大增加了对耗时的人工监控和操作(例如进行补充或交换培养基)的需要。这种趋势有效地使得在小体积生物反应器中长期维持培养物变得不可行或不可能。因此，提供这样的微重力生物反应器将是有利的，该微重力反应器在细胞孵育舱中具有十分高的相对保水性。

现有技术的微重力生物反应器的另一局限性是用于添加或移出细胞和培养基的通口通常依赖于常规的“旋紧式”闭合器。这种闭合器和类似的闭合器具有限定的“死”体积，并且当生物反应器体积减少时闭合器的这种体积在比例上变得更大。这种不利可以通过使用基本上没有死体积的口来规避。

旋转式闭合器也可以导致孵育舱中存在气泡。生物反应器优选保持在孵育舱中没有气泡，否则的话会具有有害影响，使原组织分解。这种气泡的问题在小体积生物反应器中尤其明显，在小体积生物反应器中单个气泡可以代表相对显著的体积。针对气泡问题的一些解决方法是现有技术已知的。例如，WO 95/07344提供了用于收集气泡使其远离孵育舱的储气室。然而，由于储气室涉及的体积，这些解决方法完全不适合小体积生物反应器。因而一种更好的解决方法是提供这样一种通口的闭合机构，该闭合机构排除了将气泡引入孵育舱中的任何可能性。

常规的“旋紧式”闭合器和类似的闭合器还增加了流体紊流并且这可以导致增加的剪切力，这将对原组织具有有害的影响。微重力生物反应器要求持续旋转孵育舱，为分化的或正在分化的细胞和其它组织保持微重力条件，如果孵育舱内表面不进行适当的改变，则其可能会引起紊流。这种紊流可能导致原组织的撕裂或“剪切”。因此，提供具有能避免紊流的通口闭合机构的微重力生物反应器是有利的。

WO 95/07344、US 5153131、US 5437998、US 5665594、US 5989913和US 6,642,019各自公开了对微重力生物反应器的改进。US2005/0084965公开了用于孵育肝细胞球形体的常规的、市售微重力生物反应器。然而，这些专利或公布的专利申请没有一个解决了脱水的问题或公开了具有小的孵育舱体积或具有零体积的通口闭合器的微重力生物反应器。

因此，提供解决了这些问题的改良微重力生物孵育器是有利的。

发明内容

在优选的实施方案中，本发明提供了减轻、缓解、消除或换句话讲解决了一个或多个现有技术的上述问题。

通过提供适于旋转的生物反应器，在本发明的第一方面获得了这个目标和几个其它目标，所述的生物反应器包括：

-孵育腔，该孵育腔结合第一半透性过滤器提供了基本闭合的封闭，所述的半透性过滤器对最大具有预定分子量或大小的分子是可渗透的，允许营养物质和流体培养基流入孵育室中并将细胞和细胞聚集体保留在该孵育腔中。

-平衡室，所述平衡室提供了用于将营养因子和/或氧气以及任选的二氧化碳和/或pH控制物质提供给存在于所述孵育腔中一种或多种细胞培养物、组织活检材料或细胞群集的体积。

-传导装置，该装置提供了从所述半透性过滤器至所述平衡腔的基本上流体密封性导管，

其中所述的孵育腔具有大约25μl-大约1ml的内部流体体积。

在第二方面，本发明的实施方案提供了适于旋转的生物反应器，所述生物反应器包括：

-孵育腔，所述的孵育腔结合第一半透性膜提供了基本闭合的封闭，

-包含含水液体湿度室，该湿度室包括第二半透性膜和第三半透性膜，两者均被布置为与所述含水流体发生液体接触，所述的第三半透性膜另外被布置为与该生物反应器周围的大气发生气体交换，并且

-传导装置，该装置提供了从所述第一半透性膜至所述第二半透性膜的基本气密性的导管，

其中所述第一、第二和第三半透性膜是基本上不透水的，而对氧气和二氧化碳基本上是渗透性的，以便于：

a)所述孵育腔通过所述第一半透性膜和所述湿度室通气，并且

b)基本上保持所述孵育室中的水。

任选其中所述孵育腔具有大约25μl-大约1ml的内部流体体积。

在第三方面，本发明的实施方案提供了适于旋转的生物反应器，所述生物反应器包括：

-孵育腔，所述的孵育腔包括与柔性膜或柔性过滤器一起的内表面，

-适于填充所述孵育腔的一个或多个贯穿口，从所述孵育腔的中心轴看，所述的贯穿口以不同角度的方位角布置，

-一个或多个插入物，每个插入物适合于装配进对应的贯穿口中以给每个口提供基本上流体密封性的闭锁，

其中一个或多个插入物具有这样的末端部分，即在插入相应的口时其基本上与所述孵育腔的内表面基本对齐，由此产生基本零体积的口。

任选地，其中所述孵育腔具有大约25μl-大约1ml的内部流体体积。

在第四方面，本发明的实施方案提供了适于旋转的生物反应器，所述生物反应器包括：

-孵育腔，所述的孵育腔结合半透性膜提供了基本闭合的封闭，

其中在大气压力下，所述的半透性膜基本上是完全不透水的，而对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的，以便于：

a)所述孵育腔通过所述第一半透性膜通气，以及

b)基本上保持所述孵育室中的水。

任选地，其中所述孵育腔具有大约25μl-大约1ml的内部流体体积。

在第五方面，本发明的实施方案提供了生物反应器用于孵育一种或多种细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织”或类似样本的用途。

在第六方面，本发明的实施方案提供了孵育一种或多种细胞类型、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织”或类似样本的生物反应器。

在第七方面，本发明的实施方案提供了产生化学组合物的生物学效应的分子谱。

在第八方面，本发明的实施方案提供了编译分子谱文库的方法，所述分子谱是具有预定毒性的化学组合物的生物学效应的分子谱。

在第九方面，本发明的实施方案提供了对试验化学组合物的毒性分型的方法

本发明的优选实施方案尤其是(但不是排他地)有利于获得微重力生物反应器，该反应器具有如下优势：

1)由于较小的孵育舱体积，资源(化学物质、细胞或组织)耗费减少，从而花费相应减少。

2)由于湿度室的引入，改善了孵育室内的的保水性，从而相应改善了对用于长期生长的培养条件的保持。

3)由于孵育室内保水性的改善，在小体积生物反应器中孵育的长期培养物的持续时间增加。

4)由于基本零体积的通口的引入，流体紊流减少。

5)较小生物反应器的其它有益效果，包括：对细胞生长监控的改良，在一些实施方案中通过自动视频成像技术/照相机成像技术进行监控；使用选择的组织活检材料或培养物的较少样本改善生长因子和信号分子的生物阈值水平的获得；由于可以同时操作的单个生物反应器的数目增加，从而增加了标准尺寸的孵育器的效率。

所述的本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九方面的每个可以与任意其它方面组合。结合下文描述的实施方案，本发明的这些方面和其它方面将变得显而易见并且得以阐明。

附图说明

本发明的一些实施方案通过附图说明，其中

图1是根据本发明第一方面的生物反应器的横截面示意图，

图2是根据本发明第一方面的生物反应器的更详细的横截面示意图，尤其示出了泵送装置，

图3A是根据本发明第二方面的生物反应器的横截面示意图，

图3B是根据本发明第二方面的生物反应器的备选实施方案的横截面示意图(其中所用的膜对盐是完全不渗透的，但对气体仍然可渗透的)。

图4是根据本发明第二方面的生物反应器的湿度室的平面图(A)和横截面图(B)，

图5是根据本发明第二方面的生物反应器的更详细的横截面示意图，尤其示出了进气口，

图6是根据本发明第四方面的生物反应器的横截面示意图，

图7是示出了在具有或没有根据本发明第二方面的生物反应器的湿度室时，长期孵育下流体损失的试验结果的坐标图，

图8是根据本发明第三方面的生物反应器的横截面示意图，

图9是根据本发明第三方面的生物反应器的另一横截面示意图，

图10是生物反应器内表面的一部分和用于闭合该生物反应器的插入物的示意图，

图11A-图11D是说明操作根据本发明第三方面的生物反应器的方法的示意图的顺序，

图12分别示出了根据本发明第三方面的生物反应器的底座的横截面侧视图(A部分)和横截面前视图(B部分)。

图13是根据本发明第二方面的生物反应器的另一横截面示意图，

图14是根据本发明第三方面的生物反应器的另一横截面示意图，

图15是根据本发明第二方面的生物反应器的平面图(A)和横截面图(B)和(C)。

具体实施方式

定义

如本文所用，下列术语具有如下含义：

术语“半透性过滤器”和“半透性膜”指可以被一些(但不是全部)化学物质或生物物质渗透的过滤器或膜。该术语可互换使用，不同的是，一般来讲，“过滤器”在水可自由渗透时使用，而一般来讲，“膜”在水不可渗透以及在水可自由渗透这两种情形时使用。

术语“孵育腔”指生物反应器这样的部分，在该部分中进行细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织”或类似样品的生长、分化、孵育或其他方式的培养。术语“孵育腔”与“孵育室”和“孵育舱”可互换使用。

术语“基本上不透水的”用于描述本发明的膜的特性并且指在气相和/或液相中表现出对水和类水分子高度排斥的膜。

术语“几乎完全不透水的”用于描述本发明的膜的特性并且指这样一种膜，在1巴下水通过该膜的流速不大于0.1mL/min/cm²。

术语“对氧气和二氧化碳基本是可渗透的”用于描述本发明的膜的特性并且指空气容易通过的膜。

术语“相对保持”用于描述由于含水溶液或悬浮液在孵育腔中时操作本发明的孵育器而引起的情况，并且指初始存在的残余物质的相对量。例如，水在孵育腔(具有柔性膜)中的相对保持可以计算为操作生物反应器后腔的体积除以操作该生物反应器开始时腔的体积。

术语“有毒的”具有本领域已知的一般含义。“有毒的”物质是这样一种物质，在化学组合物中的含量为如上定义的时该物质可以损害细胞、组织或生物体的功能或引起对细胞、组织或生物体的结构的破坏。

术语“预定毒性”涉及毒性物质和非毒性物质两者。正如帕拉塞尔苏斯在16世纪所说的，“世间万物皆是毒药，无一例外，唯有量才能区分毒与药”。物质的毒性类型可以(例如)根据美国食品与药品管理局(FDA)的毒性分类方案(toxicity typing scheme)确定。根据该方案，物质的预定毒性可以属于毒性类型A、类型B等，或者可以是无毒的。

术语“细胞培养物”指通过本领域已知的任何方法获得的或初始培养的任何类型的细胞、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织”或类似样品。

术语“微重力生物反应器”指适于旋转的生物反应器。

术语“在微重力条件下孵育”指细胞培养物在适于旋转的生物反应器中生长，同时绕基本水平的中心轴旋转所述生物反应器，旋转的速率使得一种或多种细胞培养物悬浮于液体培养基中，并且继续这种旋转允许所述的一种或多种细胞培养物生长的一段时间。

术语“相对保持水的装置”用于描述生物反应器的特征，并且指与膜或过滤器结合使用的不同于灌注的任何装置，所述的膜或过滤器基本上限制了孵育室以实现水的相对保持，或者备选地，指基本上限制了孵育腔的任何单一膜，在1巴下水通过该膜的流速不大于0.1mL/min/cm²。

术语“化学组合物”具有本领域已知的通常含义。其可以包括(但不限于)一种或多种化学试剂或生物制剂(例如小分子、肽、蛋白质、碱、核酸和脂类)的任何混合物，其中所述化学试剂或生物制剂导致一种或多种细胞类型中的基因表达或蛋白质表达的改变，所述的细胞类型选自：

о角质化上皮细胞(包括表皮角质形成细胞(分化的表皮细胞)；表皮基底细胞(干细胞)；手指甲和脚趾甲的角质形成细胞、甲床基底细胞(干细胞)；髓质毛干细胞；皮质毛干细胞；表皮毛干细胞；表皮毛根细胞；赫胥黎层的毛根鞘细胞；亨勒层的毛根鞘细胞；外毛根鞘细胞；毛母质细胞(干细胞))。

о湿复层障壁上皮细胞(wet stratified barrier)(包括角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的复层扁平上皮的表面上皮细胞；角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的基底细胞(干细胞)；(膀胱和尿导管内衬的)尿路上皮细胞)。

о外分泌上皮细胞(包括唾液腺粘液细胞(分泌富含多糖的分泌物)；唾液腺浆液细胞(分泌富含糖蛋白酶的分泌物)；舌内的味腺细胞(清洗味蕾)；乳腺细胞(分泌乳汁)；泪腺细胞(分泌泪液)；耳内的耵聍腺细胞(分泌腊)；外泌汗腺暗细胞(分泌糖蛋白)；外泌汗腺明细胞(分泌小分子)；顶泌汗腺细胞(分泌有气味的分泌物，性激素敏感)；眼睑中的睫毛腺细胞(特殊汗腺)；皮脂腺细胞(分泌富含脂质的皮脂分泌物)；鼻内的嗅腺细胞(清洗嗅上皮)；十二指肠内的十二指肠腺细胞(分泌酶和碱性粘液)；精囊腺细胞(分泌精液成分，包括用于精子游泳的果糖)；前列腺细胞(分泌精液成分)；尿道球腺细胞(分泌粘液)；巴多林腺细胞(分泌阴道润滑液)；尿道腺细胞(分泌粘液)；子宫内膜细胞(分泌糖类)；呼吸道和消化道的孤立杯形细胞(分泌粘液)；胃粘膜粘液细胞(分泌粘液)；胃腺产酶细胞(分泌胃蛋白酶原)；胃腺壁细胞(分泌盐酸)；胰腺腺泡细胞(分泌碳酸氢盐和消化酶)；小肠的帕内特细胞(分泌溶菌酶)；肺的II型肺细胞(分泌表面活性剂)；肺的克拉拉细胞)。

о激素分泌细胞(包括垂体前叶细胞；促生长激素细胞；垂体催乳素细胞(lactotropes)；促甲状腺素细胞；促性腺素细胞；促肾上腺皮质激素细胞；分泌促黑素细胞激素的中间垂体细胞；分泌催产素或血管升压素的大细胞神经分泌细胞；肠道和呼吸道细胞(分泌一种或多种以下物质：5-羟色胺、内啡肽、促生长素抑制素、促胃液素、促胰液素、胆囊收缩素、胰岛素、胰高血糖素、铃蟾肽)；甲状腺细胞；甲状腺上皮细胞；滤泡旁细胞；甲状旁腺细胞；甲状旁腺主细胞；嗜酸细胞；肾上腺细胞；嗜铬细胞(分泌一种或多种类固醇激素、盐皮质激素或糖皮质激素)；精巢的间质细胞(分泌睾酮)；卵泡的内膜细胞(分泌雌激素)；破裂卵泡的黄体细胞(分泌孕酮)；肾肾小球旁器细胞(分泌肾素)；肾的致密斑细胞；肾的极周细胞；肾的系膜细胞)。

о上皮吸收细胞(肠道、外分泌腺和泌尿生殖道)(包括肠刷状缘细胞(具有微绒毛)；外分泌腺分泌管细胞；胆囊上皮细胞；肾近端小管刷状缘细胞；肾远端小管细胞；输精小管无纤毛细胞；附睾主细胞；附睾基底细胞；代谢和储藏细胞；肝实质细胞(肝细胞)；脂肪细胞(白脂肪细胞或褐色脂肪细胞)；肝脂细胞)。

о屏障作用细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)(包括I型肺细胞(被覆肺的气室)；胰管细胞(泡心细胞)；(汗腺、唾液腺、乳腺等的)非条纹管道细胞；肾小球壁细胞；肾小球足细胞；(肾中的)亨利袢细段细胞；肾集合管细胞；(精囊腺、前列腺等的)导管细胞)。

о被覆闭合的内部体腔的上皮细胞(包括血管和淋巴管内皮有窗细胞；血管和淋巴管内皮连续细胞；血管和淋巴管内皮脾细胞；滑膜细胞(被覆关节腔，分泌透明质酸)；浆膜细胞(被覆腹膜腔、胸膜腔和围心腔)；扁平细胞(被覆耳的外淋巴隙)；扁平细胞(被覆耳的内淋巴隙)；有微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(被覆耳的内淋巴隙)；无微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(被覆耳的内淋巴隙)；暗细胞(被覆耳的内淋巴隙)；前庭膜细胞(被覆耳的内淋巴隙)；血管纹基底细胞(被覆耳的内淋巴隙)；血管纹缘细胞(被覆耳的内淋巴隙)；克劳迪马斯细胞(被覆耳的内淋巴隙)；伯特歇尔细胞(被覆耳的内淋巴隙)；脉络丛细胞(分泌脑脊液)；软蛛网膜扁平细胞；眼的睫状体色素上皮细胞；眼的睫状体非色素上皮细胞；角膜内皮细胞)。

о具有推进功能的纤毛细胞(包括呼吸道纤毛细胞；(雌性体内的)输卵管纤毛细胞；(雌性体内的)子宫内膜纤毛细胞；(雄性体内的)睾丸网纤毛细胞；(雄性体内的)输精小管纤毛细胞；中枢神经系统的室管膜纤毛细胞(被覆脑腔))。

о细胞外基质分泌细胞(包括成釉质上皮细胞(分泌牙釉质)；耳前庭器官的半月平面上皮细胞(分泌蛋白聚糖)；螺旋器齿间上皮细胞(分泌覆盖毛细胞的覆膜)；疏松结缔组织成纤维细胞；角膜成纤维细胞；腱成纤维细胞；骨髓网状组织成纤维细胞；其它非上皮成纤维细胞；毛细血管外膜细胞；椎间盘的髓核细胞；成牙骨质细胞/牙骨质细胞(分泌牙根骨样牙骨质)；成牙质细胞/牙细胞(odontocyte)(分泌牙本质)；透明软骨细胞；纤维软骨细胞；弹性软骨细胞；成骨细胞/骨细胞；骨原细胞(成骨细胞的干细胞)；眼玻璃体的玻璃体细胞；耳外淋巴隙的星形细胞)。

о收缩细胞(包括红骨骼肌细胞(收缩慢)；白骨骼肌细胞(收缩快)；中间骨骼肌细胞；肌梭的核袋细胞；肌梭的核链细胞；卫星细胞(干细胞)；普通心肌细胞；结心肌细胞；浦肯野纤维细胞；平滑肌细胞(多种类型)；虹膜的肌上皮细胞；外分泌腺的肌上皮细胞)。

о血液系统和免疫系统细胞(包括红细胞(红血细胞)；巨核细胞(血小板前体)；单核细胞；结缔组织巨噬细胞(多种类型)；表皮朗格汉斯细胞；(骨内的)破骨细胞；(淋巴样组织中的)树突细胞；(中枢神经系统的)小胶质细胞；嗜中性粒细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞；肥大细胞；辅助性T细胞；抑制性T细胞；细胞毒性T淋巴细胞；B细胞；天然杀伤细胞；记忆细胞；网织红细胞；血液系统和免疫系统的干细胞和定向先祖细胞(多种类型)。

о感觉转导细胞(包括眼的光感受器视杆细胞；眼的光感受器感蓝视锥细胞；眼的光感受器感绿视锥细胞；眼的光感受器感红视锥细胞；螺旋器的听觉内毛细胞；螺旋器的听觉外毛细胞；耳前庭器官的I型毛细胞(感知加速和重力)；耳前庭器官的II型毛细胞(感知加速和重力)；I型味蕾细胞；嗅觉感受器神经元；嗅上皮的基底细胞(嗅神经元的干细胞)；I型颈动脉体细胞(血液pH感受器)；II型颈动脉体细胞(血液pH感受器)；表皮的梅克尔细胞(触觉感受器)；触敏初级感觉神经元(多种类型)；冷敏初级感觉神经元；热敏初级感觉神经元；痛敏初级感觉神经元(多种类型)；本体感受初级感觉神经元(多种类型))。

о自主神经元细胞(包括胆碱能神经细胞(多种类型)；肾上腺素能神经细胞(多种类型)；肽能神经细胞(多种类型))。

о感官和外周神经元支持细胞(包括螺旋器的内柱细胞；螺旋器的外柱细胞；螺旋器的内指细胞；螺旋器的外指细胞；螺旋器的边缘细胞；螺旋器的汉森细胞；前庭器官支持细胞；I型味蕾支持细胞；嗅上皮支持细胞；神经膜细胞；卫星细胞(包被外周神经细胞体)；肠神经胶质细胞)；

о中枢神经系统神经元和神经胶质细胞(包括神经元细胞(各种各样的类型，仍然没有很好的分类)；星形细胞(多种类型)；少突胶质细胞)。

о晶状体细胞(包括前晶状体上皮细胞；包含晶体蛋白的晶状体纤维细胞)。

о色素细胞(包括黑素细胞；视网膜色素上皮细胞)。

о生殖细胞(包括卵原细胞/卵母细胞；精子细胞；精母细胞；精原细胞(精母细胞的干细胞)；精子)。

о滋养细胞(包括卵泡细胞；(睾丸中的)支持细胞；胸腺上皮细胞)。

о干细胞(胚胎来源或成体来源的有无限能力的干细胞、全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞或前体或祖细胞)。

о源于任意上述细胞类型的所有癌细胞(包括难下定义的起源的畸胎癌)。

优选的实施方案

在优选的实施方案中，用于本发明的半透性过滤器允许最大某种分子量或大小的分子通过。具有明确孔径的半透性过滤器是本领域技术人员已知的并且是市售的。在本发明的优选实施方案中，半透性过滤器对最大预定分子量(例如50kDa、100kDa、150kDa、200kDa或250kDa)的分子是可渗透的。备选地，半透性过滤器的渗透性可以由其中的孔径确定。半透性过滤器的孔径可以少于或等于0.5μm，例如少于或等于0.3μm，优选少于或等于0.2μm，更优选少于或等于0.1μm，并最优选少于或等于0.05μm。可以使用各种各样的过滤器。这些过滤器可以由选自(但不限于)以下的材料制成：聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅橡胶、泡沫塑料、辐射处理的塑料以及类似材料。在一个优选的实施方案中，可以使用购自Whatman公司的TE 35过滤器或购自Pall Life Sciences公司的Zefluor过滤器(产品编号为66142)。

在本发明的优选实施方案中，水在1巴下通过“对水基本上是不可渗透”和“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”膜的流速不大于50ml/min/cm²，优选不大于40ml/min/cm²、更优选不大于30ml/min/cm²，甚至更优选不大于20ml/min/cm²，最优选不大于10ml/min/cm²。本领域技术人员将很容易理解，水的渗透性可以以能转换成ml/min/cm²的其它单位表示。

在本发明的优选实施方案中，空气在3毫巴下通过“对水基本上是不可渗透的”和“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”膜的流速至少为5ml/min/cm²，优选至少为10ml/min/cm²、更优选至少为15ml/min/cm²，甚至更优选至少为20ml/min/cm²，最优选至少为25ml/min/cm²。本领域技术人员将很容易理解，气体流量可以以能转换成ml/min/cm²的其它单位表示。

可以使用由各种材料组成的、“基本上不透水的”并且“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”膜，包括但不限于本领域所熟知的、由聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅橡胶、泡沫塑料、辐射处理的塑料以及类似材料膜组成的膜。合适的膜的一个实例可从Whatman公司以“TE

”商标商购获得，其为一种具有聚酯支持物的聚四氟乙烯膜，具有如下特性(由生产商所提供)：孔径为0.2μM，厚度为190μM，当用乙醇测定时在0.9巴下水流速为20ml/min/cm²，在3毫巴下气流速率为15ml/min/cm²，始泡点为1.4巴。合适的膜的另一个实例是从Millipore公司以

商标商购获得，其为一种聚偏二氟乙烯膜，具有如下特性(由生产商所提供)：孔径为0.22μM，厚度为100-150μM，在45毫巴下发生水突破，在10磅/平方英寸下气流速率＞1slpm/cm²。在一些实施方案中，膜可以是Millipore 0.22μm“Durapel”膜或Whatman TE 35和TE36膜。

在本发明的优选实施方案中，水在1巴下通过“几乎完全不渗透水”而“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”膜的流速不大于0.1ml/min/cm²，甚至更优选不大于0.05ml/min/cm²、还更优选不大于0.04ml/min/cm²，甚至更优选不大于0.03ml/min/cm²，还更优选不大于0.02ml/min/cm²，最优选不大于0.01ml/min/cm²。本领域技术人员将很容易理解，水的渗透性可以以能转换成ml/min/cm²的其它单位表示。

在本发明的优选实施方案中，空气在3毫巴下通过“几乎完全不透水的”而“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”膜的流速至少为5ml/min/cm²，优选至少为10ml/min/cm²、更优选至少为15ml/min/cm²，甚至更优选至少为20ml/min/cm²，最优选至少为25ml/min/cm²。

可以使用包含各种各样的材料的膜，所述的膜是“几乎完全不透水的”而“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”，包括但不限于最初制备用于超滤目的的膜，由于低的孔隙度和高的疏水性，这种用于超滤目的的膜在大气压力下具有十分低的透水性。这种膜包括从Amicon公司以商标以及从Pall公司以“Omega

”商标商购获得的超过滤膜。其它合适的膜包括热塑性超滤膜，该膜通过半结晶材料，例如聚(聚醚醚酮)(PEEK)和聚(苯硫醚)(PPS)的热诱导相转化法制备，如文献[Micro-and ultrafiltration filmmembranes from poly(ether ether ketone)(PEEK).Sonnenschein M，Journal of Applied Polymer Science 1999 74：1146]所描述的。也可以使用固定的稳定支撑液膜(SLM)，其包括固定于坚固的微孔性疏水支持物内的合适寡聚或多聚流体膜材料，例如在US 5507949中所公开的系统。

在优选的实施方案中，根据本发明的生物反应器的孵育腔的内部流体体积可以少于1.0mL、少于900uL、少于800uL、少于700uL、少于600uL、少于500uL、少于400uL、少于300uL、少于200uL、少于100uL、少于50uL或25uL。

许多不同的细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织”或类似样本可以用于实践本发明。不同的细胞培养方法包括(但不限于)在玻璃容器和塑料容器生长，例如充满三维细胞支持基质的培养瓶、细胞工厂或细胞cube和软塑料袋(类似输液袋)；滚瓶；转瓶；发酵罐；或多种材料的中空纤维。细胞培养物可以为细胞群集的形式，例如微载体珠上的球形体，或支架(例如可生物降解的支架，通常由聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)或这两者的混合物制成，参见文献[Characterization of knitted polymeric scaffoldsfor potential use in ligament tissue engineering.Ge Z，Goh JC，Wang L，Tan EP，Lee EH.J Biomater Sci Polym Ed.2005；16(9)：1179-92.]和[Synthesis and characterizations ofbiodegradable and crosslinkable poly(epsilon-caprolactonefumarate)，poly(ethylene glycol fumarate)，and theiramphiphilic copolymer.Wang S，Lu L，Gruetzmacher JA，CurrierBL，Yaszemski MJ.Biomaterials.2005 Aug 12；[先于印刷版的电子版]])上的细胞、组织或组织活检材料或组织类器官(tissueorganoid)。本发明尤其可以用一种或多种以下细胞类型实践：

о角质化上皮细胞(包括表皮角质形成细胞(分化的表皮细胞)；表皮基底细胞(干细胞)；手指甲和脚趾甲的角质形成细胞、甲床基底细胞(干细胞)；髓质毛干细胞；皮质毛干细胞；表皮毛干细胞；表皮毛根细胞；赫胥黎层的毛根鞘细胞；亨勒层的毛根鞘细胞；外毛根鞘细胞；毛母质细胞(干细胞))。

о湿复层障壁上皮细胞(包括角膜、舌、口腔、食官、肛管、远端尿道和阴道的复层扁平上皮的表面上皮细胞；角膜、舌、口腔、食官、肛管、远端尿道和阴道的基底细胞(干细胞)；(膀胱和尿导管内衬的)尿路上皮细胞)。

о外分泌上皮细胞(包括唾液腺粘液细胞(分泌富含多糖的分泌物)；唾液腺浆液细胞(分泌富含糖蛋白酶的分泌物)；舌内的味腺细胞(清洗味蕾)；乳腺细胞(分泌乳汁)；泪腺细胞(分泌泪液)；耳内的耵聍腺细胞(分泌腊)；外泌汗腺暗细胞(分泌糖蛋白)；外泌汗腺明细胞(分泌小分子)；顶泌汗腺细胞(分泌有气味的分泌物，性激素敏感)；眼睑中的睫毛腺细胞(特殊汗腺)；皮脂腺细胞(分泌富含脂质的皮脂分泌物)；鼻内的嗅腺细胞(清洗嗅上皮)；十二指肠内的十二指肠腺细胞(分泌酶和碱性粘液)；精囊腺细胞(分泌精液成分，包括用于精子游泳的果糖)；前列腺细胞(分泌精液成分)；尿道球腺细胞(分泌粘液)；巴多林腺细胞(分泌阴道润滑液)；尿道腺细胞(分泌粘液)；子宫内膜细胞(分泌糖类)；呼吸道和消化道的孤立杯形细胞(分泌粘液)；胃粘膜粘液细胞(分泌粘液)；胃腺产酶细胞(分泌胃蛋白酶原)；胃腺壁细胞(分泌盐酸)；胰腺腺泡细胞(分泌碳酸氢盐和消化酶)；小肠的帕内特细胞(分泌溶菌酶)；肺的II型肺细胞(分泌表面活性剂)；肺的克拉拉细胞)。

о激素分泌细胞(包括垂体前叶细胞；促生长激素细胞；垂体催乳素细胞；促甲状腺素细胞；促性腺素细胞；促肾上腺皮质激素细胞；分泌促黑素细胞激素的中间垂体细胞；分泌催产素或血管升压素的大细胞神经分泌细胞；肠道和呼吸道细胞(分泌一种或多种以下物质：5-羟色胺、内啡肽、促生长素抑制素、促胃液素、促胰液素、胆囊收缩素、胰岛素、胰高血糖素、铃蟾肽)；甲状腺细胞；甲状腺上皮细胞；滤泡旁细胞；甲状旁腺细胞；甲状旁腺主细胞；嗜酸细胞；肾上腺细胞；嗜铬细胞(分泌一种或多种类固醇激素、盐皮质激素或糖皮质激素)；精巢的间质细胞(分泌睾酮)；卵泡的内膜细胞(分泌雌激素)；破裂卵泡的黄体细胞(分泌孕酮)；肾肾小球旁器细胞(分泌肾素)；肾的致密斑细胞；肾的极周细胞；肾的系膜细胞)。

о上皮吸收细胞(肠道、外分泌腺和泌尿生殖道)(包括肠刷状缘细胞(具有微绒毛)；外分泌腺分泌管细胞；胆囊上皮细胞；肾近端小管刷状缘细胞；肾远端小管细胞；输精小管无纤毛细胞；附睾主细胞；附睾基底细胞；代谢和储藏细胞；肝实质细胞(肝细胞)；脂肪细胞(白脂肪细胞或褐色脂肪细胞)；肝脂细胞)。

о屏障作用细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)(包括I型肺细胞(被覆肺的气室)；胰管细胞(泡心细胞)；(汗腺、唾液腺、乳腺等的)非条纹管道细胞；肾小球壁细胞；肾小球足细胞；(肾中的)亨利袢细段细胞；肾集合管细胞；(精囊腺、前列腺等的)导管细胞)。

о被覆闭合的内部体腔的上皮细胞(包括血管和淋巴管内皮有窗细胞；血管和淋巴管内皮连续细胞；血管和淋巴管内皮脾细胞；滑膜细胞(被覆关节腔，分泌透明质酸)；浆膜细胞(被覆腹膜腔、胸膜腔和围心腔)；扁平细胞(被覆耳的外淋巴隙)；扁平细胞(被覆耳的内淋巴隙)；有微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(被覆耳的内淋巴隙)；无微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(被覆耳的内淋巴隙)；暗细胞(被覆耳的内淋巴隙)；前庭膜细胞(被覆耳的内淋巴隙)；血管纹基底细胞(被覆耳的内淋巴隙)；血管纹缘细胞(被覆耳的内淋巴隙)；克劳迪乌斯细胞(被覆耳的内淋巴隙)；伯特歇尔细胞(被覆耳的内淋巴隙)；脉络丛细胞(分泌脑脊液)；软蛛网膜扁平细胞；眼的睫状体色素上皮细胞；眼的睫状体非色素上皮细胞；角膜内皮细胞)。

о具有推进功能的纤毛细胞(包括呼吸道纤毛细胞；(雌性体内的)输卵管纤毛细胞；(雌性体内的)子宫内膜纤毛细胞；(雄性体内的)睾丸网纤毛细胞；(雄性体内的)输精小管纤毛细胞；中枢神经系统的室管膜纤毛细胞(被覆脑腔))。

о细胞外基质分泌细胞(包括成釉质上皮细胞(分泌牙釉质)；耳前庭器官的半月平面上皮细胞(分泌蛋白聚糖)；螺旋器齿间上皮细胞(分泌覆盖毛细胞的覆膜)；疏松结缔组织成纤维细胞；角膜成纤维细胞；腱成纤维细胞；骨髓网状组织成纤维细胞；其它非上皮成纤维细胞；毛细血管外膜细胞；椎间盘的髓核细胞；成牙骨质细胞/牙骨质细胞(分泌牙根骨样牙骨质)；成牙质细胞/牙细胞(分泌牙本质)；透明软骨细胞；纤维软骨细胞；弹性软骨细胞；成骨细胞/骨细胞；骨原细胞(成骨细胞的干细胞)；眼玻璃体的玻璃体细胞；耳外淋巴隙的星形细胞)。

о收缩细胞(包括红骨骼肌细胞(收缩慢)；白骨骼肌细胞(收缩快)；中间骨骼肌细胞；肌梭的核袋细胞；肌梭的核链细胞；卫星细胞(干细胞)；普通心肌细胞；结心肌细胞；浦肯野纤维细胞；平滑肌细胞(多种类型)；虹膜的肌上皮细胞；外分泌腺的肌上皮细胞)。

о血液系统和免疫系统细胞(包括红细胞(红血细胞)；巨核细胞(血小板前体)；单核细胞；结缔组织巨噬细胞(多种类型)；表皮朗格汉斯细胞；(骨内的)破骨细胞；(淋巴样组织中的)树突细胞；(中枢神经系统的)小胶质细胞；嗜中性粒细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞；肥大细胞；辅助性T细胞；抑制性T细胞；细胞毒性T淋巴细胞；B细胞；天然杀伤细胞；记忆细胞；网织红细胞；血液系统和免疫系统的干细胞和定向先祖细胞(多种类型)。

о感觉转导细胞(包括眼的光感受器视杆细胞；眼的光感受器感蓝视锥细胞；眼的光感受器感绿视锥细胞；眼的光感受器感红视锥细胞；螺旋器的听觉内毛细胞；螺旋器的听觉外毛细胞；耳前庭器官的I型毛细胞(感知加速和重力)；耳前庭器官的II型毛细胞(感知加速和重力)；I型味蕾细胞；嗅觉感受器神经元；嗅上皮的基底细胞(嗅神经元的干细胞)；I型颈动脉体细胞(血液pH感受器)；II型颈动脉体细胞(血液pH感受器)；表皮的梅克尔细胞(触觉感受器)；触敏初级感觉神经元(多种类型)；冷敏初级感觉神经元；热敏初级感觉神经元；痛敏初级感觉神经元(多种类型)；本体感受初级感觉神经元(多种类型))。

о自主神经元细胞(包括胆碱能神经细胞(多种类型)；肾上腺素能神经细胞(多种类型)；肽能神经细胞(多种类型))。

о感官和外周神经元支持细胞(包括螺旋器的内柱细胞；螺旋器的外柱细胞；螺旋器的内指细胞；螺旋器的外指细胞；螺旋器的边缘细胞；螺旋器的汉森细胞；前庭器官支持细胞；I型味蕾支持细胞；嗅上皮支持细胞；神经膜细胞；卫星细胞(包被外周神经细胞体)；肠神经胶质细胞)；

о中枢神经系统神经元和神经胶质细胞(包括神经元细胞(各种各样的类型，仍然没有很好的分类)；星形细胞(多种类型)；少突胶质细胞)。

о晶状体细胞(包括前晶状体上皮细胞；包含晶体蛋白的晶状体纤维细胞)。

о色素细胞(包括黑素细胞；视网膜色素上皮细胞)。

о生殖细胞(包括卵原细胞/卵母细胞；精子细胞；精母细胞；精原细胞(精母细胞的干细胞)；精子)。

о滋养细胞(包括卵泡细胞；(睾丸中的)支持细胞；胸腺上皮细胞)。

о干细胞(胚胎来源或成体来源的有无限能力的干细胞、全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞或前体或祖细胞)。

о源于任意上述细胞类型的所有癌细胞(包括难下定义的起源的畸胎癌)。

在本发明的优选实施方案中，可以应用于本发明的细胞选自肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、肌细胞或类似细胞、肝脏组织、脂肪组织(褐色或白色)、肝活检材料、肾活检材料、肌肉活检材料、卵泡、胰岛和源自于它们的所有癌细胞。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，可应用于本发明中的细胞是肝细胞，尤其是人肝细胞。

图1是根据本发明第一方面的生物反应器10的横截面示意图，该生物反应器10具有绕水平轴的高度旋转对称性，如图1中看到的。该生物反应器包括用于孵育细胞、组织等的孵育腔15。孵育腔15与第一半透性过滤器(也称为灭菌过滤器)F1结合，为孵育细胞等提供了充分闭合的封闭。为了提供营养物质和/或新鲜的液体培养基，半透性过滤器F1对最大预定分子量(例如50kDa、100kDa、150kDa、200kDa或250kDa)的分子是可渗透的。标准的透析膜可以满足这些要求。备选地，半透性过滤器F1的渗透性由其中的孔径确定。半透性过滤器F1的孔径可以少于或等于0.5μm，例如少于或等于0.3μm，优选少于或等于0.2μm，甚至更优选少于或等于0.1μm，并最优选少于或等于0.05μm。因为需要防止感染物(例如细菌、支原体或酵母)通过该过滤器进入，少于或等于0.2μm的孔径是优选的。在这个优选的实施方案中，该半透性膜的主要目的是允许交换营养物质而排斥细胞和细菌进入该孵育腔。因而，各种各样的过滤器可以用于F1。这些过滤器可以由聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅橡胶、泡沫塑料、辐射处理的塑料以及类似材料制成。由此，提供了营养物质和流体培养基流入孵育室而同时提供了细胞和细胞聚集物在孵育腔15中保持以及保护它们免于外部感染。孵育腔15具有大约25μl-大约1ml的内部流体体积。优选的是，孵育腔15的流体体积是大约50μl-大约0.5ml，更优选大约0.1ml-大约0.4ml。小的尺寸减少了使用的花费和和成功操作所必需的材料(有机材料和无机材料两者)的量。小的尺寸将便于精细监控细胞(例如通过遥感照相机)和自动化处理(例如非灌流形式的培养基交换)。

平衡室(未在图1中示出)提供了用于将营养因子和/或氧气以及任选的二氧化碳和/或pH控制物质提供给存在于孵育腔15中一种或多种细胞培养物、组织活检材料或细胞群集的体积。传导装置20(例如生物反应器10的后面部件12中的管和管状腔)提供从半透性过滤器F1至所述平衡室的基本上流体密封的导管。白色箭头指具有营养物质的新鲜培养基，黑色箭头指待返回至该平衡室(或返回至废物处置处)的用过的流体培养基。

在图1所示的实施方案中，传导装置20还包括过滤器F1前面的介质室25，以便增强传导装置20和过滤器F1之间的流体接触面积，并因而增加营养物质和/或新鲜的流体培养基流通过滤器F1。介质室25可以由一个特别设计的、围绕介质室25的环部26提供。环部26可以是紧夹在生物反应器10的后面部件12和前面部件11之间的密封O形环。类似地，过滤器F1优选在后面部件12和前面部件11之间夹紧，以提供从介质室25至孵育腔15的流体密封性和气密性的连接。为了清楚起见，在环部26和过滤器F1之间、后面部件12的外部和前面部件11的外部之间示出了小的空隙，但当组装这些组件时这些空隙通常不存在，因为生物反应器10应该尽可能的为气密性的以防止流体泄露。

在生物反应器10的前面，设置了透明区14，以使得可以从生物反应器10外面人工或用例如照相机自动视觉观察和评估细胞等的培养。透明区14可以由既透明又相对于培养过程是化学惰性的玻璃、塑料或任意其它合适材料制成。优选的材料将包括(但不限于)多种类型的玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的合适变体可以商购获得，包括商标名为

和

的市售产品。生物反应器的任何实施方案可以全部或部分由这种透明材料制成。

孵育腔15优选具有基本是圆柱形的形状，但其它形状也是可能的，例如椭圆形、球形等。优选地，生物反应器10适于通过关联的旋转装置(没有示出)绕水平旋转轴旋转，以便于细胞在孵育腔15中生长。调整旋转的速率以将细胞或原组织保持在悬浮液中，并且该速率必须随所述原组织大小的增加而变化。本领域技术人员将知道如何调整旋转速率以便将细胞或原组织保持悬浮液中。

图2是根据本发明第一方面的生物反应器10的更详细横截面图，还示出了用于使流体培养基通过传导装置20流动的泵送装置26.5、嵌入恒定环境室29中的平衡室28、用于控制流体培养基流至介质室25或从介质室25流出的控制阀27，以允许引入新鲜培养基(不必与已存在的培养基一样，即用于引入试验化合物)以及将用过的培养基排出和排出传导装置20。包括平衡室28的恒定环境室29可以适于与生物反应器10同步旋转，或者该容器29可以固定于接近生物反应器10的位置处。在后一种情形中，必须通过将容易获得的且技术人员熟知的可完全旋转的接头并入传导装置20中来避免传导装置20的扭曲。可优选的是，流体传导装置20具有基本上平行于生物反应器10的旋转轴的部分，以便于整个机构的设计。

包括前面部件11和后面部件12的生物反应器10将通过合适的扣紧装置(例如贯穿的装配螺丝18)装配于底座部件17上。为了易于将基座部件17和生物反应器10装配于合适的旋转装置(没有示出)上，基座部件17可以有利地具有螺纹端区17a。类似地，前面部件11和后面部件12另外通过装配螺丝19结合在一起，以便给孵育腔15提供流体密封性的连接，如上所解释的。为清楚起见，在环部26和过滤器F1之间、后面部件12的外部和前面部件11的外部之间以及基座部件17和后面部件12之间示出了小的空隙，但在组装时这些空隙通常不存在。

在本发明的一个实施方案中，传导装置20具有大约25μl-大约2ml，优选大约50μl-大约1ml，最优选大约0.1-0.4ml的内部流体体积。传导装置20的体积应该最小并因而与孵育腔15的体积相当。否则，由本发明提供的关于流体培养基和/或相对昂贵的试剂(例如放射性同位素)的使用的减少可能不会显著。类似地，平衡室28可以有利地具有大约25μl-大约2ml，优选大约50μl-大约1ml，最优选大约0.1-0.4ml的内部流体体积。

图3A是根据本发明第二方面的生物反应器50的横截面示意图。该生物反应器50具有绕水平轴的高度旋转对称性，如图1中看到的。该生物反应器包括与第一半透性膜M1布置在一起的孵育腔55，由此提供了基本闭合的封闭，在其中可以进行细胞、组织等的孵育。细胞的孵育可以从生物反应器50外面人工或自动通过视觉监控和评估。透明区58可以由既透明又相对于培养过程是生物和化学惰性的玻璃、塑料或任意其它合适材料制成。优选的材料将包括(但不限于)多种类型的玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的合适变体可以商购获得，包括商标名为

和的市售产品。

此外，提供了包含含水流体的湿度室60，该湿度室60另外包含第二半透性膜M2和第三半透性膜M3。后两者膜M2和M3均被布置与所述含水液体发生流体接触，并分别限定了流体的左边和右边边界，如图1所示。另外布置了第三渗透性膜M3，用于与生物反应器50周围的大气进行气体交换。生物反应器50的后面部件52具有适合接受湿度室60的凹部，以便从左边提供中间腔IC的基本气密性的闭合，如图1所示。后面部件52还与侧壁52a和52b布置在一起，该侧壁为从第一半透性膜M1至第二半透性膜M2的基本气密性的导管提供了传导装置。因而，生物反应器50的前面部件51和后面部件52可以用诸如高密度聚丙烯(HDPP)等之类的惰性塑料制成。优选的材料将包括(但不限于)多种类型的玻璃、尼龙、塑料、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。与密封装置53(例如O型密封环)结合，通过中间腔IC的气流仅可能有效通过第一膜M1(孵育腔55的形成部分)和第二和第三膜M2和M3(湿度室60的形成部分)。

第一M1半透性膜、第二M2半透性膜和第三M3半透性膜的特殊之处在于：这些膜是基本上不透水的并且对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的。由此，膜M1、M2和M3促进了孵育腔55通过第一半透性膜M1与湿度室60(穿越M2、所述含水流体和M3)进行通风。此外，由于三个膜M1、M2和M3对水的不渗透性，实现了在孵育室中对水的基本保持。膜M1、M2和M3可以用本领域熟知的多种材料制成，所述的材料包括但不限于聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅橡胶、泡沫塑料、辐射处理的塑料以及类似材料。合适的膜的另一个实例是从Whatman公司以“TE

”商标商购获得，其为一种具有聚酯支持物的聚四氟乙烯膜，具有如下特性(由生产商所提供)：孔径为0.2μM，厚度为190μM，当用乙醇测量时在0.9巴下的水流速为20ml/min/cm²，在3毫巴下气流速为15ml/min/cm2，始沸点为1.4巴。合适的膜的另一个实例是从Millipore公司以

商标商购获得，其为一种聚偏二氟乙烯膜，具有如下特性(由生产商所提供)：孔径为0.22μM，厚度为100-150μM，在45毫巴下发生水突破，在10磅/平方英寸下气流速率＞1slpm/cm2。其它实例是购自Pall LifeSciences公司的Zefluor过滤器(产品号为66142)。

由于这些材料的高度疏水性质，水和类水分子将高度地被从膜M1、M2和M3的表面排斥开。然而，一些水将不可避免地穿透膜M1、M2和M3，并且这些从湿度室60和/或孵育室55蒸发的水将在由中间腔IC形成的气密性管道中提供至少50％、优选至少70％或至少更优选至少90％，例如95％、96％、97％、98％或99％的相对湿度。

图3B示出了根据本发明第二方面的生物反应器的备选实施方案，其中所述的膜M1和M2以及中间腔IC可以由膜M12代替，该膜M12是盐不可透过的，而对气体和流体是可透过的。这种类型的膜的实例是市售的，包括例如购自Dupont公司的产品，例如以商标

销售的聚四氟乙烯膜、以商标

销售的FEP膜或聚氟乙烯膜。

该实施方案在构造上比图5所示的实施方案简单，并且所述湿度室与所述孵育室直接接触。可以在孵育室中培养的一种或多种细胞培养物对孵育室内的条件(包括存在的盐的量)的变化十分敏感。因而十分重要的是，膜M12是盐不可透过的，以使得孵育腔的盐水平基本保持恒定同时保留孵育室内的液体量。

生物反应器50通常在孵育腔55中具有含水溶液或悬浮液的情况下于37℃(用于人细胞)操作，通过一个或多个恒温器控制的加热元件加热生物反应器50，通常是在用于细胞培养的培养箱(未显示)中。如图7所示，初步的试验证明在3天后，更优选5天后，或甚至更优选10天后，孵育腔55中水的保持可以为至少80％，优选至少90％或甚至更优选至少95％，例如至少96％、97％、98％或99％。初步结果还表明，细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织”或类似样品可以长期孵育，优选至少1个月，例如2个月，最优选至少10个月。因此，通过实践本发明，细胞培养物可以长期维持在生物反应器中，而由蒸发引起的含水培养基中依赖浓度方面的变化最小。

图4是根据本发明第二方面的生物反应器的湿度室60的平面图(A)和横截面图(B)。在A部分中的横截面图中，半透性膜M2和M3通过从上面和下面封闭湿度室60的虚线示出，如横截面图A中所示的。该湿度室的直径c优选类似于孵育腔的直径，并因而范围为4-20mm，例如6、8、10、12、14、16或18mm。湿度室60的侧面部分由环部62构成，环部62由诸如尼龙、塑料、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯之类的惰性、稳定的材料制成。环部62可以用一次性材料制成，以使得在长期孵育期间湿度室60中的流体更新可以通过在生物反应器50中卸下旧的湿度室60并插入新的湿度室60而简单地完成。备选地或另外，可以通过填充口61用流体重新填充湿度室60，该注入口61通过例如无头螺丝等密闭。

图5是根据本发明第二方面的56生物反应器50更详细的横截面图，尤其示出了进气口65和该生物反应器可以安装在其上的基座部件56。进气口65给尾部腔R提供新鲜空气。任选地，进气口65连接至供气装置(未显示)或嵌在其中，以用于在尾部腔R提供可控气氛。因而，孵育腔55中细胞的换气也将由通过湿度室60的气流控制。尾部腔R由基座部件56中的凹部和密封装置(例如，夹在膜薄M3上的合适O形环)构成。为了将生物反应器50的多个部件稳固地保持在一起，提供了合适的扣紧装置。如图5所示，贯穿的装配螺丝70a使前面部件51和后面部件52(以及布置在中间的密封件53和过滤器M1)保持在一起。类似地，前面部件51和后面部件52通过贯穿的螺丝70b保持在基座部件56上。再次，为了表述清楚之故，在多个部件之间(例如57和M3之间、52和56之间、51和52之间、53和M1之间、M1和51之间等)可见小的空隙，但是当组装时这些空隙通常不存在，以便提供生物反应器50的流体密封性的和气密性的闭合。

图5的孵育腔55具有基本上圆柱的形状，腔55直径的范围为4-20mm，例如6、8、10、12、14、16或18mm。腔55的深度范围可以为2-6mm，例如2.5、3、3.5、4、4.5或5mm。因而，腔55的体积范围为约0.03-2ml。所述深度和直径的一些优选的值分别是4mm和18mm(所得流体体积约为1ml)、3mm和10mm(所得流体体积约为0.24ml)和3mm和7.5mm(所得流体体积约为0.15ml)。

生物反应器55适于通过关联的旋转装置(没有示出)绕水平旋转轴旋转。基座56具有螺纹部分56a，以便有利于容易且灵活地安装上这种旋转装置。通常，旋转轴基本上与通过孵育腔55的中心轴重合。

图6是根据本发明第四方面的生物反应器的示意图。

图7示出了装配有根据本发明第二方面的生物反应器50的湿度室60的小体积生物反应器的孵育室的流体损失(下面的曲线)和没有装配该湿度室60的小体积生物反应器的孵育室的流体损失(上面的曲线)。在实施例中，将5个1ml生物反应器充满DMEM培养基(没有细胞)并于37℃在具有5％CO₂的标准的潮湿孵育器中保持旋转。用纯水充满所述湿度室。孵育器处于正常的使用状态(即为了细胞的常规培养，打开和关闭孵育器的门)。孵育室的水分丧失以两种不同的方式测量：第一种方式是测量生物反应器内水总量的变化(左边的轴)，第二种方式是在独立试验中，测量指示剂酚红的吸光度的百分比变化(DMEM中在559nM下的最大吸光度，没有观察到DMEM的pH变化，右边的轴)。如图7所示(其示出了平均数据)，小体积生物反应器的孵育室存在显著的水分丧失，尽管该孵育器还是潮湿的。在孵育腔55前没有湿度室60的话，即使是在1/2天后也有显著的水分从腔55丧失，在5天后达到水分丧失接近40％。这种流体的高度丧失将使生长培养基浓缩，因而影响可以对基因表达有关键作用的浓度依赖性参数。流体的丧失如此之快，以致于不进行几乎持续的手工操作(即加入生长培养基)的话，就不可能进行细胞的长期生长和/或长期的药学试验或毒理学试验。相反，使用湿度室，孵育腔55对流体的相对保留量在2后高于95％，并且甚至是在5天后高于90％。因此，通过本发明的实践，可以将细胞培养物维持在分化状态无限长的时期，即可以每隔几天交换细胞培养基并且偶尔对细胞进行继代培养而无需几乎持续地努力去抵消水分从孵育腔的快速丧失。

图8是根据本发明第三方面的生物反应器100的横截面图，该生物反应器具有用于孵育细胞的孵育腔105。腔105具有内表面110。在图8所示的实施方案，从孵育腔105的中心轴看时，内表面110具有圆柱形对称性。然而，本发明的应用不限于该对称性，而是可以容易地应用于其它形状，因为最近已经观察到球形、扁球形、扩展的球形及其组合可以得到改良的培养。参见特别是美国专利6,642,019，据此以引用的方式将其全文并入本文。

在细胞的培养期间，生物反应器100将缓慢地围绕中心轴旋转，通常是以约5-15转/分钟(RPM)的旋转频率旋转。为了安装和夹紧该生物反应器部件，该生物反应器包括多个孔140(例如三个、四个或五个孔)，用于将其安装于基座构件(未显示)上，在该基座构件上可以安装生物反应器100并在孵育时旋转。

生物反应器100还包括多个贯穿口口130a和130b，其适于填充孵育腔105。在图8所示的实施方案中，反应器100包括两个口130a和130b。从孵育腔105的中心轴来看，两个口130a和130b以不同的角度的方位角排列，在所示的实施方案中第一个口130a和第二口130b以相差约65度的方位角布置。对于方位角差别没有特别的限制，但是优选角度少于90度，更优选在70和20度之间，并且最优选在35和55度之间。然而一旦认识到本发明的原理后，技术人员可以实施其它角度和口130的数目。这些口不需要具有相同的大小，并因而一个口可以较大以使得更容易通向孵育室105，例如用于插入组织活检材料。作为另外的实例，仅具有一个口的生物反应器在图14中示出。

为了关闭口130，提供了多个插入物120。对于插入物120适于装配进相应的贯穿口130以在操作生物反应器100期间基本流体密封性地锁紧每个口130。插入物120可以用尼龙、硬橡胶、聚乙烯、POM、金属或其它合适的非细胞毒性材料制造，以流体密封性地关闭口130。优选的是，插入物120具有带螺纹的外部部分，并且类似地，口130适于接受这种带螺纹的插入物120，如图8所示。插入物120另外的特征是具有这样的末端部分121，该末端部分121在插入对应的口中时基本上与孵育腔105的内表面110对齐。这将在下面进一步详细的说明，见图10。末端部分121和内表面110对齐的目的是用以产生基本上零体积的口，即腔105的流体不能流进口130内。而且，末端部分121和内表面110的对齐将使紊流最小化或消除，否则因流体流进或流出口130而有可能在腔105中产生紊流，并且最重要的是在其旋转期间有可能在腔105中产生紊流。口130具有外部凹部150，以便于有效地填充生物反应器110，消除流体的溢出，参见图11。

图9是根据本发明的三方面的生物反应器100沿图8和14所示的线X-X的另一横截面图。在图9的横截面中，仅示出了一个孔130。口130与腔105连接，以易于填充反应器100。在图8中，安装了柔性过滤器F1或柔性膜M1以便闭合腔105的尾部部分。生物反应器100优选在尾部具有凹部以有利于便利地且流体密封性地扣紧柔性过滤器F1或柔性膜M1。通常，提供了另外的扣紧装置(未显示)。如果通过其中一个口130而容易进入孵育腔，则可以附连膜M1或过滤器F1(例如焊接至生物反应器100上)。这种柔性部件M1/F1的功能是几乎使腔105中的过压相等，所述的过压是由过度填充根据本发明的腔105而引起的。用于柔性膜M1的优选材料是聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅橡胶、辐射处理塑料或高度不透水但透气的类似材料。用于柔性过滤器F1的优选材料是聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅橡胶、辐射处理塑料或高度不透水但透气的类似材料。

在生物反应器100的前面，设置了透明区111，使得可以从生物反应器100外面人工或自动视觉观察和评估细胞等的培养。透明区111可以由既透明又相对于培养过程是生物惰性和化学惰性的玻璃、塑料或任意其它合适材料制成。优选的材料将包括(但不限于)多种类型的玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。

腔105的宽度“b”范围可以为4-20mm，例如6、8、10、12、14、16或18mm。腔105的深度“a”范围可以为2-6mm，例如2.5、3、3.5、4、4.5或5mm。因而，腔105的体积范围为约0.03-2ml。“a”和“b”的一些优选的值是4mm和18mm(所得流体体积约为1ml)、3mm和10mm(所得流体体积约为0.24ml)和3mm和7.5mm(所得流体体积约为0.15ml)。内腔105的所述尺寸可适用于根据本发明的第一、第二或第三方面或其任意组合的生物反应器10、50和/或100。

图10是生物反应器100的内表面110的一部分和用于闭合腔105的插入物120的示意图，图10示出了插入物120的各种宽度是如何影响内表面110与插入物120的末端部分121的对齐。在A部分中，宽度w1与内表面部分110的曲率半径相比足够小，导致有效的是，内表面110和末端部分121之间仍然基本对齐。然而，在图10的B部分中，插入物120的宽度w2具有与内表面部分110的曲率半径相当的大小，并因而相对于A部分所示情况，内表面110和末端部分121的对齐较低，然而，对于本申请内容中待对齐的内表面110和末端部分121来说，这种对齐仍然是足够高的。

在数学方法中，可以引入对圆度(即曲率半径)或类似值的测量并结合流体动力学模型来评估紊流极限，以便避免撕裂细胞培养物或组织。因而，可以估计雷诺数来预测具有某种内表面110和末端部分121构造时紊流发生的操作条件。紊流发生通过临界雷诺数给出，临界雷诺数用插入物120引起的扰动的特征长度计算。对于本发明的构造，临界雷诺数可以通过使用插入物120的直径和/或末端部分121与内表面110之间的水平差来估计。

在一个实践方法中，邻接内表面110的末端部分121可以与内表面110齐平或水平。末端的不规则性将诱导紊流并因而需要避免。因而，可以使末端部分121的边缘齐平至内表面110的3mm，优选2mm，并且最优选1mm之内。注意到插入物120可以太短或太长-这两种选项是不期望的。

为了改善内表面110和末端部分121的对齐，可以设计末端部分121自身具有曲度，或者朝内或朝外，以便增加插入口130时的对齐。对于带螺纹的插入物120，所述的曲度理所当然应该与螺纹结构协调以便在将插入物120一直拧进流体锁紧位置时确保末端部分121与内表面110正确对齐

图11(A-D)是说明操作根据本发明第三方面的生物反应器110的方法的示意图的顺序。生物反应器包括至少第一130a和第二130b贯穿口。用于用流体210填充反应器100的注射器或吸管200也在A部分和B部分中示出。D部分中的注射器200用于从口130的外部凹部150移除过量的流体。

起初，将注射器200应用于用流体210填充腔105。当然应该布置口130a和130b，以便在填充时流体210不能流出反应器100。

如B部分中所示，生物反应器100用流体210通过第一贯穿口130a装得过满，使得生物反应器100至少在整个孵育腔105和在至少部分的第一贯穿孔130a和/或在至少部分的第二贯穿口130b中含有流体210。用于填充生物反应器的该方法可以有效地将所有气泡从生物反应器中移除。将相应的插入物120a插入第一贯穿口130a中以完全锁紧第一贯穿口130a。因而，先前位于第一贯穿口130a中的所有流体210被挤出口130a中。

在C部分中，将相应的插入物120b插入第二贯穿口130b中以锁紧第二贯穿口。因而，给孵育腔105中的流体210提供了适度的过压(Δp)，但是通过柔性膜M1或柔性过滤器F1(未显示)的功能，该过压将通过该离腔105的膜或过滤器向外弯曲来平衡，参见图8。有效的是，腔105具有可变的流体体积。优选的是，腔105中流体体积的相对增加可以为约2％-10％。过压(Δp)的范围可以为2％-10％。

图12分别示出了根据本发明第三方面的生物反应器100的底座200的横截面侧视图(A部分)和横截面前视图(B部分)。在B部分中，生物反应器100安装在底座220上，底座220和反应器100是以这样的方式布置，该布置方式使得允许生物反应器100相对小的旋转，优选通过手动操作。由此，对使用者来说更容易布置生物反应器100以用液体、细胞、营养物质填充和/或再填充、除去气泡等。

本发明的一个变体可以包括仅一个进入口130和一个对应的插入物120(参见图14)。

图13示出了根据本发明第二方面的图5所示生物反应器的备选实施方案。对部件52进行了修改以便能直接拧进部件56中。这种修改除去了用于将部件52和56固定在一起的3个螺旋，并因而简化和减少了操作该生物反应器的时间。湿度室用部件56中的两个松弛配合的O形环57保持在适当的位置，并且在需要时可以快速且简单地交换。

图14示出了生物反应器100的一个备选构造并示出了一个单一的贯穿口。利用具有小针头的注射器来注射生长培养基，将气体通过针头挤出生物反应器，以实现对这种类型的构造的填充。

图15示出了湿度室(在图4中示出)的一个备选构造，其中过滤器已经凹进去了以保护它们免受机械磨损。该设计也有助于圆环63与62的按扣闭合或超声焊接，以将过滤器牢固地固定在原位。

根据本发明的第五方面，本发明的生物反应器可用于孵育一种或多种细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织”或类似样本的生物反应器。

一个具体的实施方案涉及将本文的生物反应器用于孵育一种或多种细胞培养物的用途，其中所述一种或多种生物细胞培养物孵育一段较长时期，例如1周、2周或3周，优选至少1个月，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月，最优选至少12个月。

将根据本发明的生物反应器用于孵育一种或多种细胞培养物的的一个优点是，细胞在较长的一段时间内保持或实现高度分化的状态。此外，根据本发明的生物反应器的使用避免了利用胰蛋白酶消化以从生物反应器中获得细胞。

根据本发明的第六方面，提供了孵育一种或多种细胞培养物的方法。在一个优选的实施方案中，该方法包括以下步骤：

a)获得一种或多种待孵育的细胞培养物，

b)将所述一种或多种细胞培养物转移至根据本发明的生物反应器的孵育腔。

c)用生长培养基填充该孵育腔，

d)任选从该孵育腔除去空气(气泡)，

e)在微重力下孵育所述细胞培养物，

f)在需要时更换培养基以持续孵育所需的时间段，并且

g)任选让培养物分化并在细胞之间形成紧密连接或其它形式的紧密细胞接触(例如通过细胞间基质蛋白的分泌)。

在另一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

a)获得一种或多种待孵育的细胞培养物，

b)将一种或多种细胞培养物转移至微重力生物反应器的孵育腔中，该生物反应器配备有相对保持孵育腔中的水的装置，其中所述孵育腔具有少于1ml的内部流体体积。

c)用生长培养基填充该孵育腔，

d)任选从该孵育腔除去空气(气泡)，

e)在微重力下孵育所述细胞培养物，

f)在需要时更换培养基以持续孵育所需的时间段，并且

g)任选让培养物分化并在细胞之间形成紧密连接或其它形式的紧密细胞接触(例如通过细胞间基质蛋白的分泌)，

其中在2天后孵育腔中水的相对保持大于95％，或备选的是，其中在5天后孵育腔中水的相对保持大于95％。

备选的是，步骤b)中所用的生物反应器的孵育腔具有的内部流体体积少于900uL、少于800uL、少于700uL、少于600uL、少于500uL、少于400uL、少于300uL、少于200uL、少于100uL、少于50uL或25uL。

本领域技术人员将容易理解，步骤b)和c)可以整体进行或以任何次序和顺序分开进行。

在一个具体的实施方案中，一种或多种细胞培养物是球形体或在微载体珠上。

在另一个实施方案中，孵育一种或多种细胞培养物包括在需要时用含水液体补充本发明生物反应器的湿度室，以在根据本发明的生物反应器的气密性导管中维持相对湿度为至少50％，优选至少70％，或甚至更优选至少90％，例如至少95％、96％、97％、98％或99％。

为了减少根据本发明的生物反应器的孵育腔中气泡的量，在将细胞和生长培养基转移至孵育腔前湿润孵育腔可能是一个优点。因此，根据本发明的孵育一种或多种培养物的方法的另一个实施方案包括在将细胞和生长培养基转移至孵育腔前湿润根据本发明的生物反应器的孵育腔。

根据本发明方法孵育的细胞保持高度的分化。在如肝细胞的情形中，这意味着根据本发明方法孵育的细胞将模拟真实肝脏的行为。这在如毒理学研究中是一个优点，其中高度分化状态的细胞是实现匹配真实的功能性肝脏的应答的毒理学应答所必需的。将根据本发明的小生物反应器用于毒理学研究的另一个优点是需要较少细胞和较少生长培养基以获得有用的结果，所述毒理学研究通常需要在多个不同浓度和多个不同时间点测试。这个优点在使用人肝脏细胞使得可以在人组织微结构肝脏片(liver piece)中测定毒性时更加显著。

因此，本发明的第六方面涉及产生化学组合物的生物学效应的分子谱的方法，该方法包括以下步骤：

a)让一种或多种细胞培养物的分离群体与化学组合物接触；并且

b)记录一种或多种细胞培养物响应化学组合物的基因表达或蛋白质表达的改变以产生化学组合物生物学效应的分子谱；

其中，一种或多种细胞培养物已经根据上述方法进行了孵育。

化学组合物的毒性可以在与一种或多种细胞培养物接触后十分快地自身表达(急性毒性)。因此，本发明的一个特殊实施方案涉及如上所述产生化学组合物生物学效应的分子谱的方法，其中将一种或多种细胞培养物与化学组合物接触一段短的时间，例如最多七天，优选不多于三天，或甚至更优选不多于一天。

备选的是，化学组合物的毒性也可以在与一种或多种细胞组合物接触一段较长的时间后自身表达(慢性毒性)。因而，本发明的一个特殊实施方案涉及如上所述产生化学组合物生物学效应的分子谱的方法，其中将一种或多种细胞培养物与化学组合物接触至少一个月，优选至少两个月或甚至更优选至少三个月。

如上所述，利用根据本发明的生物反应器来孵育一种或多种细胞培养物是一个优点。类似的，化学组合物与一种或多种细胞培养物的接触可以通过将一种或多种细胞培养物与化学组合物一起孵育来进行。因此，本发明的一个优选的实施方案涉及如上所述产生化学组合物生物学效应的分子谱的方法，其中所述接触是通过根据本文描述的方法将化学组合物和一种或多种细胞培养物一起孵育。

根据本发明的产生分子谱的方法可以重复用于几种化合物。特别是，其可以重复用于几种已知毒性的化学组合物，因而产生分子谱文库。因此，本发明的第七方面涉及编译具有预定毒性的化学组合物的生物学效应的分子谱文库的方法，该方法包括以下步骤：

a)让一种或多种细胞培养物的分离群体与预定毒性的化学组合物接触；

b)记录一种或多种细胞培养物的响应化学组合物的基因表达或蛋白质表达改变以产生化学组合物生物学效应的分子谱；以及

c)通过用具有预定毒性的至少两种化学组合物重复步骤a)和b)来编译分子谱的文库或数据库；

其中，一种或多种细胞培养物已经根据上述方法进行了孵育。

编译分子谱的文库或数据库的所述方法可以包括用化学组合物接触一种或多种细胞培养物一段较长的时间(慢性毒性)或一段短的时间(急性毒性)，例如至少一个月，优选至少两个月，或甚至更优选至少三个月，或不多于七天，优选不多于三天，或甚至更优选不多于一天。在一个优选的实施方案中，所述接触是通过根据用于孵育一种或多种细胞培养物的本发明的方法将化学组合物与一种或多种细胞培养物一起孵育来进行。

一旦已经根据预定毒性的化学组合物编译了分子谱的文库或数据库，可以将所述文库或数据库与未知毒性的化学组合物的谱相比较。这提供了可靠测定化学组合物的毒性的方法，先前仅用成人组织样本(例如肝活检材料组织)来实现化学组合物的毒性的可靠测定。当然，成人组织的这种样品的可用性不是十分高的。因此，本发明的第九方面涉及测定试验化学组合物的毒性类型的方法，该方法包括以下步骤：

a)如上所述产生试验化学组合物的生物学效应的分子谱；以及

b)将步骤a)中的分子谱与根据上述方法编译的、具有预定毒性的化学组合物的生物学效应的分子谱文库相比较；

其中试验化学组合物的毒性类型通过步骤b)中的比较测定。

通过将本发明的生物反应器用于测定毒性的类型，未知毒性的化学组合物的毒性可以用小量的细胞、生长培养基和化学组合物测定。因而，通过根据本发明测定毒性类型的方法，有可能以利用成人组织时实现的可靠性(但以低很多的花费)来测定化学组合物的毒性类型。根据本发明用于测定毒性类型的方法也可应用于其中毒理学谱正常来说不能产生的情形。例如，各自独立时没有毒性的两种或多种化合物的化学组合物在一起施用时可能证明是有毒性的(这种现象称为“药物-药物”相互作用，即使不需要两种药物之间存在化学反应)。

尽管本发明已经结合具体的实施方案进行了描述，但无意于将本发明限制为本文列出的具体形式。相反，本发明的范围仅受限于附带的权利要求。在权利要求中，术语“包括”不排除其它元素或步骤的存在。此外，尽管独立的特征可以包括于不同的权利要求中，这些特征可能可以有利地进行组合，并且包括于不同权利要求中并不意味着特征的组合是不可行的和/或不利的。而且，单数的指代并不排除复数。

因而，对“一”、“一种”、“第一”、“第二”等的提及不排除复数。此外，权利要求书中的参考符号不应理解为限制范围。

特此将本文中所引用的每一篇参考文献以引用的方式全文并入本文。

实施例

实施例1：长期培养中人肝细胞的分化状态的维持：细胞蛋白质的表达

由完全分化的人肝脏表达的且通常在于标准-平铺培养条件下生长的肝细胞中找不到的特异蛋白质在用本发明的生物反应器培养的细胞中得以找到。在302天后在培养物中仍可以找到完全分化的肝细胞蛋白。

将人肝细胞在本发明的生物反应器中生长302天，并然后用[35S]-甲硫氨酸标记20小时。

使用培养基如Eagles、DMEM或RPMI 1640，在正常培养条件(例如对人细胞使用37℃)下如上所述培养一种或多种细胞培养物。取决于所考虑的具体细胞培养物，培养基需要每两天或三天进行更换。肝细胞每两天需要新鲜的培养基。培养基通过这样更换：让生物反应器停止转动，等待细胞或原组织沉向底部并然后将大约50％的培养基更换为新鲜培养基。

开始时，取决于细胞类型，细胞将快速生长，倍增时间为2-3天，而当它们分化时，倍增时间增加使得其可以达到数周或甚至数月。相应地，培养物需要进行继代培养的频率快速下降。开始，继代培养应该在第一周或第二周后进行，并在其后以相当长的间隔(例如两月一次或更长间隔)进行。在这些生物反应器中的继代培养通过简单地稀释生物反应器的内容物2至4倍来进行。没有使用胰蛋白酶或其它酶。

提取蛋白质并通过双向凝胶电泳和质谱法分析。

蛋白质通过表1中的蛋白质、登记号和蛋白质描述来确定。鉴定的亚型数目与凝胶染色点相关，所述的凝胶染色点被阳性鉴定为所考虑的蛋白质。

表1：在孵育302天后在生物反应器培养物中找到的由完全分化的肝细胞表达的并且通常不由在标准-平铺培养条件下生长的肝细胞分泌的细胞蛋白质。

实施例2：长期培养物中人肝细胞的分化状态的维持：分泌机制的生活力

在使用本发明生物反应器的微重力条件下培养的肝细胞分泌了由完全分化的正常人成熟肝细胞分泌的且通常不由在标准-平铺培养条件下生长的肝细胞分泌的特异蛋白质。

从实施例1的组织培养物的生长培养基等分样品中沉淀出蛋白质，并通过双向凝胶电泳和质谱法分析。蛋白质通过表2中的蛋白质、登记号和蛋白质描述来确定。鉴定的亚型数目与凝胶染色点相关，所述的凝胶染色点被阳性鉴定为所考虑的蛋白质。

表2：生物反应器培养基中发现的由完全分化的肝细胞分泌的且通常不由在标准-平铺培养条件下生长的肝细胞分泌的蛋白质。

Claims (56)

1.适于旋转的生物反应器，所述生物反应器包括

-孵育腔，该孵育腔结合第一半透性过滤器(F1)提供了基本闭合的封闭，所述半透性过滤器(F1)对最大具有预定分子量或大小的分子是渗透性的，允许营养物质和流体培养基流入孵育室中并将细胞和细胞聚集体保留在该孵育腔中，

-平衡室，所述平衡室提供了体积，用于给存在于所述孵育腔中一种或多种细胞培养物、组织活检材料或细胞群集提供营养因子、移除废物以及交换诸如氧气和二氧化碳的气体和/或提供pH控制物质，

-传导装置，该装置提供了从所述半透性过滤器(F1)至所述平衡室的基本流体密封的导管，

其中所述的孵育腔具有大约25μl-大约1ml的内部流体体积。

2.根据权利要求1所述的生物反应器，其中所述孵育腔的内部流体体积选自：

少于900uL、少于800uL、少于700uL、少于600uL、少于500uL、少于400uL、少于300uL、少于200uL、少于100uL、少于50uL，和25uL。

3.根据权利要求1所述的生物反应器，其中所述孵育腔具有基本圆柱的形状。

4.根据权利要求3所述的生物反应器，其中所述生物反应器适于通过关联的旋转装置绕水平旋转轴旋转，所述旋转轴基本与通过所述孵育腔的中心轴重合。

5.根据权利要求4所述的生物反应器，其中所述流体传导装置具有基本平行于旋转轴的部分。

6.根据权利要求1所述的生物反应器，所述生物反应器另外包括用于使流体培养基在平衡室和孵育腔之间循环的泵送装置。

7.根据权利要求1所述的生物反应器，其中所述的半透性过滤器对小分子是渗透性的，但是可以阻止细菌、支原体或其它生物机体通过。

8.根据权利要求1所述的生物反应器，其中所述传输装置具有的内部流体体积选自：

大约25μl至大约2ml，大约50μl至大约1ml，和大约0.200ml。

9.根据权利要求1所述的生物反应器，其中所述的平衡室具有的内部流体体积选自：

大约25μl至大约2ml，大约50μl至大约1ml，和大约0.200ml。

10.根据权利要求1所述的生物反应器，其中所述的半渗透过滤器具有的最大孔径选自：

0.2μm、少于或等于100nm、少于或等于50nm和少于或等于10nm。

11.适于旋转的生物反应器，所述生物反应器包括

-孵育腔，所述的孵育腔结合第一半透性膜(M1)提供了基本闭合的封闭，

-包含含水液体的湿度室，所述湿度室包括第二半透性膜(M2)和第三半透性膜(M3)，两者均被布置为与所述含水液体发生流体接触，所述第三半透性膜(M3)还被布置为与所述生物反应器周围的大气发生气体交换，并且

-传导装置，所述装置提供了从所述第一半透膜(M1)至所述第二半透膜(M2)的基本气密性的导管，

其中所述第一、第二和第三半透膜(M1、M2、M3)对水基本上是不渗透的，而对氧气和二氧化碳基本上是渗透性的，以便于：

a)所述孵育腔通过所述第一半透性膜(M1)和所述湿度室通风，和

b)基本上保持所述孵育室中的水。

12.根据权利要求11所述的生物反应器，其中来自所述湿度室和/或所述孵育腔的蒸发水在所述气密性导管中提供了相对湿度，所述相对湿度选自：

至少50％、至少70％和至少90％。

13.根据权利要求11所述的生物反应器，其中所述生物反应器在所述孵育腔中具有含水溶液或悬浮液的情况下于37℃操作时，在3天后所述孵育腔中的水具有选自以下的相对保持：

至少80％、至少90％和至少95％。

14.根据权利要求11所述的生物反应器，其中所述生物反应器在所述孵育腔中具有含水溶液或悬浮液的情况下于37℃操作时，在5天后所述孵育腔中的水具有选自以下的相对保持：

至少80％、至少90％和至少95％。

15.根据权利要求11所述的生物反应器，其中所述生物反应器在所述孵育腔中具有含水溶液或悬浮液的情况下于37℃操作时，在10天后所述孵育腔中的水具有选自以下的相对保持：

至少80％、至少90％和至少95％。

16.根据权利要求11所述的生物反应器，其中所述孵育腔具有基本圆柱的形状。

17.根据权利要求16所述的生物反应器，其中所述生物反应器适于通过关联的旋转装置绕水平旋转轴旋转，所述旋转轴基本与通过所述孵育腔的中心轴重合。

18.根据权利要求11所述的生物反应器，其中所述孵育腔的内部流体体积选自：

少于900uL、少于800uL、少于700uL、少于600uL、少于500uL、少于400uL、少于300uL、少于200uL、少于100uL、少于50uL，和25uL。

19.根据权利要求1或11所述的生物反应器，其中所述孵育腔适于含有一种或多种细胞培养物，所述生物反应器的特征是孵育腔由非毒性材料制成，所述的材料可用于细胞培育并且其不有助于细胞粘附。

20.根据权利要求19所述的生物反应器，其中所述孵育腔由选自以下的材料制成：多种类型的玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。

21.根据权利要求17所述的生物反应器，其中所述孵育腔适于在微载体珠上或支架上含有一种或多种类型的球形体形式的细胞培养物。

22.适于旋转的生物反应器，所述生物反应器包括

-孵育腔，所述孵育腔结合第一半透性膜(M12)提供了基本闭合的封闭，以及

-湿度室，所述湿度室包括与所述第一半透性膜(M12)发生流体接触的含水液体，所述湿度室包括布置成与所述含水液体发生流体接触的第二半透性膜(M3)，所述第二半透性膜(M3)还被布置用于与所述生物反应器周围的大气发生气体交换；

其中所述第一和第二半透性膜(M12、M3)对水基本上是不可渗透的，而对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的，并且所述第一半透性膜(M12)不能透过盐，以便于：

a)所述孵育腔通过所述第一半透性膜(M12)和所述湿度室通风，以及

b)基本上保持所述孵育室中的水。

23.根据权利要求22所述的生物反应器，其中所述孵育腔的内部流体体积选自：

少于900uL、少于800uL、少于700uL、少于600uL、少于500uL、少于400uL、少于300uL、少于200uL、少于100uL、少于50uL，和25uL。

24.根据权利要求22所述的生物反应器，其中所述孵育腔具有基本圆柱的形状。

25.根据权利要求24所述的生物反应器，其中所述生物反应器适于通过关联的旋转装置绕水平旋转轴旋转，所述旋转轴基本与通过所述孵育腔的中心轴重合。

26.适于旋转的生物反应器，所述生物反应器包括

-孵育腔，所述的孵育腔结合半透性膜提供了基本闭合的封闭，

其中在大气压力下，所述的半透性膜对水几乎完全是不渗透的，而对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的，以便于：

a)所述孵育腔通过所述第一半透性膜和所述湿度室通风，并且

b)基本上保持所述孵育室中的水。

27.适于旋转的生物反应器，所述生物反应器包括

-孵育腔，所述的孵育腔包括结合柔性膜或柔性过滤器(M1/F1)的内表面，

-适于填充所述孵育腔的一个或多个贯穿口，从所述孵育腔的中心轴看，所述的贯穿口以不同角度的方位角布置，

-一个或多个插入物，每个插入物适合于装配进对应的贯穿口中以给每个口提供基本上流体密封性的闭锁，

其中一个或多个插入物具有这样的末端部分，所述末端部分在插入相应的口时基本上与所述孵育腔的内表面基本对齐，由此产生基本零体积的口。

28.根据权利要求27的生物反应器，其中一个或多个所述贯穿口包括外部凹部。

29.根据权利要求27所述的生物反应器，其中一个或多个所述插入物包括具有螺纹的外部部分。

30.根据权利要求27所述的生物反应器，其中所述内部表面的部分具有选自圆柱、椭圆、球形和抛物面的形状。

31.用于填充根据权利要求27所述的生物反应器的方法，所述生物反应器包括在填充前是开口的至少第一贯穿口和第二贯穿口，所述方法包括以下步骤：

a)通过所述的第一贯穿口用流体过量填充所述生物反应器，使得所述生物反应器至少在整个所述孵育腔和至少部分的所述第一贯穿口和至少部分的所述第二贯穿口中含有液体，

b)将对应的插入物插入所述第一贯穿口中以锁紧所述第一贯穿口，

c)将对应的插入物插入所述第二贯穿口中以锁紧所述第一贯穿口，由此给所述孵育腔中的流体提供了适度的过压，并且，

d)让所述柔性膜基本上平衡所述的过压。

32.用于填充根据权利要求27所述的生物反应器的方法，所述生物反应器包括仅一个在填充前是开口的贯穿口，所述方法包括以下步骤：

a)通过所述贯穿口用流体过量填充所述生物反应器，使得所述生物反应器至少在整个所述孵育腔中和在至少部分所述贯穿口中含有液体，

b)将对应的插入物插入所述贯穿口中以锁紧所述贯穿口，由此给所述孵育腔中的液体提供了适度的过压，以及

d)让所述柔性膜基本上平衡所述的过压。

33.根据权利要求27和权利要求1的生物反应器。

34.根据权利要求27和权利要求11的生物反应器。

35.根据权利要求27和权利要求22的生物反应器。

36.根据权利要求27和权利要求26的生物反应器。

37.根据权利要求1、11、22、26、27或32-36任意一项所述的生物反应器用于孵育一种或多种细胞培养物的用途。

38.根据权利要求37所述的用途，其中所述一种或多种细胞培养物被孵育延长的一段时间，例如1周、2周或3周，优选至少1个月，例如2个月，最优选至少10个月。

39.孵育一种或多种细胞培养物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)获得一种或多种待孵育的细胞培养物，

b)将一种或多种细胞培养物转移至根据权利要求1-30或32-36任意一项所述的生物反应器的孵育腔中，

c)用生长培养基填充该孵育腔，

d)任选地，从该孵育腔除去空气(气泡)，

e)在微重力条件下孵育所述细胞培养物，在需要时更换生长培养基以持续孵育所需的时间段，以及

f)任选地，让所述培养物分化并在细胞间形成紧密的汇合或类似的细胞-细胞粘附结构或细胞间基质蛋白。

40.孵育一种或多种细胞培养物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)获得一种或多种待孵育的细胞培养物，

b)将一种或多种细胞培养物转移至所述微重力生物反应器的孵育腔中，所述生物反应器配备有在所述孵育腔中相对保持水的装置，其中所述孵育腔具有少于1ml的内部液体体积，

c)用生长培养基填充所述孵育腔，

d)任选地，从所述孵育腔除去空气(气泡)，

e)在微重力下孵育所述细胞培养物，

f)在需要时更换培养基以持续孵育所需的时间段，并且

g)任选地，让所述培养物分化并在细胞间形成紧密的汇合或类似的细胞-细胞粘附结构或细胞间基质蛋白，

其中在2天后，所述孵育腔中水的相对保持大于95％。

41.孵育一种或多种细胞培养物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)获得一种或多种待孵育的细胞培养物，

b)将所述一种或多种细胞培养物转移至所述微重力生物反应器的孵育腔中，所述生物反应器配备有在所述孵育腔中相对保持水的装置，其中所述孵育腔具有少于1ml的内部流体体积，

c)用生长培养基填充所述孵育腔，

d)任选地，从所述孵育腔除去空气(气泡)，

e)在微重力下孵育所述细胞培养物，

f)在需要时更换培养基以持续孵育所需的时间段，并且

g)任选地，让所述培养物分化并在细胞间形成紧密的汇合或类似的细胞-细胞粘附结构或细胞间基质蛋白，

其中在5天后所述孵育腔中水的相对保持大于95％。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中用于步骤b)中的所述孵育腔的内部流体体积选自：

少于900uL、少于800uL、少于700uL、少于600uL、少于500uL、少于400uL、少于300uL、少于200uL、少于100uL、少于50uL，和25uL。

43.根据权利要求39-42任意一项所述的方法，其中所述的一种或多种细胞培养物是在微载体或支架上的球形体。

44.根据权利要求34所述的方法，其中在有必要维持所述气密性导管中的相对湿度时，用含水液体补充或交换根据权利要求11-25或33-36中任意一项所述的生物反应器的湿度室，所述湿度为选自以下的相对湿度：

至少50％、至少70％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％。

45.根据权利要求39-42任意一项所述的方法，其中在将所述细胞转移至根据权利要求11-30或32-36任意一项所述的生物反应器的孵育腔前湿润所述孵育腔。

46.产生化学组合物生物学效应的分子谱的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将一种或多种细胞培养物的分离群与化学组合物接触；并

b)记录所述一种或多种细胞培养物中的基因表达或蛋白质表达响应所述化学组合物的变化，以产生所述化学组合物生物学效应的分子谱，

其中所述一种或多种细胞培养物已经根据权利要求39-42任意一项所述的方法进行了孵育。

47.根据权利要求46所述的方法，其中将一种或多种细胞培养物的分离群与所述化学组合物接触延长的一段时间，例如至少一个月，优选至少两个月，或甚至更优选至少三个月。

48.根据权利要求46所述的方法，其中将一种或多种细胞培养物的分离群与所述化学组合物接触短的一段时间，例如不大于五天，优选不大于三天，或甚至更优选不大于一天。

49.根据权利要求46-48任意一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞培养物选自肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、肌细胞、肝脏组织、脂肪组织(棕色或白色)、肝活检材料、肾活检材料、肌肉活检材料、卵泡、胰岛和源自于它们的所有癌细胞。

50.编译化学组合物的生物学效应的分子谱文库的方法，所述化学组合物具有预定的毒性，所述方法包括以下步骤：

a)将一种或多种细胞培养物的分离群与具有预定毒性的化学组合物接触；

b)记录所述一种或多种细胞培养物中的基因表达或蛋白质表达响应所述化学组合物的变化以产生所述化学组合物生物学效应的分子谱；并

c)通过用至少两种具有预定毒性的化学组合物重复步骤a)和b)来编译分子谱的文库

其中所述一种或多种细胞培养物已经根据权利要求39-42任意一项所述的方法进行了孵育。

51.根据权利要求50所述的方法，其中将一种或多种细胞培养物的分离群与所述化学组合物接触一段延长的时间，例如至少一个月，优选两个月，或甚至更优选三个月。

52.根据权利要求50所述的方法，其中将一种或多种细胞培养物的分离群与所述化学组合物接触短的一段时间，例如不大于三天，优选不大于两天，或甚至更优选不大于一天。

53.根据权利要求50所述的方法，其中所述接触是通过将所述化学组合物与所述一种或多种根据权利要求39-42任意一项所述方法的细胞培养物一起孵育来进行。

54.根据权利要求50-53任意一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞培养物选自肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、肌细胞、肝脏组织、脂肪组织(棕色或白色)、肝活检材料、肾活检材料、肌肉活检材料、卵泡、胰岛和源自于它们的所有癌细胞。

55.对试验化学组合物的毒性进行分型的方法，所述方法包括以下步骤：

a)产生权利要求46所述的试验化学组合物的生物学效应分子谱，和

b)将步骤a)中的所述分子谱与根据权利要求32中所述方法编译的具有预定毒性的化学组合物的生物学效应分子谱文库相比较；

其中所述试验化学组合物的毒性类型是通过步骤b)中的比较来确定。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述一种或多种细胞培养物选自肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、肌细胞、肝脏组织、脂肪组织(棕色或白色)、肝活检材料、肾活检材料、肌肉活检材料、卵泡、胰岛和源自于它们的所有癌细胞。

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