CN103180431A - 生物反应器系统 - Google Patents

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Abstract

用于孵育一种或多种细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织(prototissue)”或类似样本的生物反应器或者培养容器。所述生物反应器包括孵育室、贮液器和由半透膜彼此分开的传导装置。具体而言，本发明提供了简化构建生物反应器的湿度室设计。

Description

生物反应器系统
发明领域
本发明涉及用于孵育一种或多种细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织(prototissue)”或类似样本的生物反应器或者培养容器。具体而言，本发明提供了简化构建生物反应器的新颖的湿度室设计。
发明背景
在基本上扁平的培养皿中的“经典的”细胞培养期间，一般来说细胞并且尤其是活组织检查趋于去分化。明显地，活组织检查表现出“冰淇淋溶解效应(‘melting ice-cream effect’)”，细胞从组织块迁移至培养皿的扁平支持面上。在这些“迁移性”细胞中基因表达被改变，它们开始在生物化学上表现得像分离细胞，而不是像分化组织的细胞组分。去分化的细胞表达的生化途径不同于由完整有机体中的相应细胞正常表达的那些。
与“经典的”细胞培养条件相反，“微重力”条件使培养中的许多类型的细胞保留了分化状态。微重力生物反应器通过持续旋转通常为圆柱状的或管状的孵育舱而保持微重力状态。这种旋转持续地迫使细胞趋向孵育室的中心，利用最小的剪切力使细胞悬浮于流体环境中。这诱导细胞相互作用并且诱导细胞聚集成集落。对于微重力培养，通常首先将细胞接种至小(直径大约为100μm)的珠子上(这将加速微组织结构的形成，但是不是必需的)。因为原组织由细胞在这些小珠周围生长而形成，这些小珠通常被排除或完全为细胞所覆盖。以这种方式形成的原组织变得十分高度分化，以至于类似成熟组织。
微重力生物反应器已经用于广泛的背景中。早期的研究显示，微重力生物反应器系统通过减少对细胞的剪应力而有助于细胞形成三维结构[Reduced shear stress：a major component in the ability ofmammalian tissues to form three-dimensional assemblies in simulatedmicrogravity.Goodwin TJ，Prewett TL，Wolf DA，Spaulding GF.JCell Biochem.1993 Mar；51(3)：301-11]。
如今大量的文献证明，在微重力生物反应器系统中生长的细胞的分化增加。对于综述请参见：[Growing tissues in microgravity.Unsworth BR，Lelkes PI.Nat Med.1998Aug；4(8)：901-7]。例如，微重力培养诱导神经前体细胞形成细胞群集或“神经球”。这些原组织表征为原始的、但是有组织的结构，该结构具有表层的未成熟增殖细胞(回巢细胞(nesting cell)阳性和增殖细胞核抗原阳性)，其包围着更分化的细胞层(β-微管蛋白III阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性)。这些“神经球”有希望能发育成神经可移植组织(neurotransplantable tissue)。参见(例如)[Neural precursor cells form rudimentary tissue-likestructures in a rotating-wall vessel bioreactor.Low HP，Savarese TM，Schwartz WJ.In vitro Cell Dev Biol Anim.2001Mar；37(3)：141-7.]以及参见[Rapid differentiation of NT2c ells in Sertoli-NT2 cell tissueconstructs grown in the rotating wall bioreactor.Saporta S，WillingAE，Shamekh R，Bickford P，Paredes D，Cameron DF.Brain Res Bull.2004Dec150；64(4)：347-56.]。
还有另一实例是，微重力培养多潜能人肾细胞系诱导表达的表型接近体内表型，如果将该细胞在其它条件下生长是不能获得该表型的[Generation of 3D retina-like structures from a human retinal cell linein a NASA bioreactor.Dutt K，Harris-Hooker S，Ellerson D，LayneD，Kumar R，Hunt R.Cell Transplant.2003；12(7)：717-31.]
已经报道了有关微重力生物反应器的一些技术问题。例如，当利用扁平培养器或利用微重力生物反应器对颞下颌关节(TMJ)盘组织进行工程化时，在总的基质含量和压缩刚度上没有显著差别，只在大体外观(gross appearance)、组织学结构和I型胶原和II型胶原的分布上有明显区别(微重力生物反应器培中的颞下颌关节盘组织具有更多II型胶原)。该作者得出结论：需要对微重力生物反应器培养系统进行改进[Detamore MS，Athanasiou KA. Use of a rotating bioreactor towardtissue engineering the temporomandibular joint disc.Tissue Eng.2005Jul-Aug；11(7-8)：1188-97]。
现有技术的微重力生物反应器的一个重大的局限性是水分损失，这会影响细胞生长。孵育期间的脱水(即使仅5-10％的脱水)可以导致pH以及其它浓度依赖性参数(例如盐、营养物质等的浓度)发生改变。许多细胞类型对它们的环境高度敏感。对于这种细胞，这种环境条件中即使有小的改变都可以影响细胞生长和基因表达。该问题在小体积生物反应器中尤其显著，在小体积生物反应器中小的体积改变可以引起浓度依赖性参数发生相对大的变化。如果没有一些针对这种脱水问题的解决方法，小体积生物反应器将经历快速的水分损失，尽管在使用该生物反应器的孵育器中保持潮湿的条件(100％的相对湿度)。小体积生物反应器中的这种快速脱水的趋势，即相对量的快速改变的这种趋势大大增加了对耗时的人工监控和操作(例如进行补充或交换培养基)的需要。这种趋势有效地使得在小体积生物反应器中长期维持培养物变得不可行或不可能。因此，提供这样的微重力生物反应器将是有利的，该微重力反应器在细胞孵育舱中具有十分高的相对保水性。
WO07/076865，WO95/07344，US5153131，US5437998，US5665594，US5989913和US6,642,019各自公开了对微重力生物反应器的改进。
US5,576,211描述了一种包括由膜分开的细胞培养室和营养供应室的细胞培养容器。另外，所述细胞培养容器包括用于容器中氧气和二氧化碳的交换的硅膜(silicone membrane)。所述细胞培养容器适于旋转。
然而，这些专利或公开的专利申请没有一个解决保持小生物反应器的高湿度、高气体交换率和低水损失。
因此，提供解决了这个问题的改良微重力生物反应器是有利的。
发明内容
本发明提供了减轻、缓解、消除或在其它方面解决了一个或多个现有技术的上述问题。
具体而言，本发明提供适于旋转的生物反应器，所述的生物反应器包括
-孵育室（1），所述的孵育室结合第一半透膜（M1）提供了基本闭合的封闭，
-包含含水液体的贮存器（3），所述贮存器包括布置为与所述含水液体发生流体接触的第二半透膜（M2），所述膜（M2）进一步被选来促进含水液体蒸发入传导装置（2），并且
-传导装置（2）提供从第一半透膜（M1）到第二半透膜（M2）的基本闭合的导管，所述传导装置（2）设置有通风装置，用于增强与所述生物反应器周围大气的气体交换，
其中，所述第一半透膜（M1）对氧气和二氧化碳是可渗透的以方便孵育室（1）通风，第二半透膜（M2）被选来促进含水液体从贮存器（3）蒸发入传导装置（2）。
在本发明的一个优选实施方案中，至少所述第二半透膜（M2）是高度水可渗透的。优选地，多孔膜是用来允许含水液体从贮存器进入传导装置（2）。可选地，所述第二半透膜（M2）由海绵状材料制成。结合通风装置本发明提供生物反应器确保保持高湿度、高气体交换率和低水损失，这对于小生物反应器是非常具有挑战性的。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述通风装置通过传导装置的入口开口将来自围绕生物反应器的大气的空气主动(actively)泵入生物反应器，而使多余空气通过出口开口离开传导装置。
在一个特别优选的实施方案中，通风装置由在传导装置周围的入口开口实现，即形成整流罩，当所述生物反应器旋转时促使周围的大气进入传导装置，以及使多余空气通过出口开口离开传导装置。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述传导装置（2）被富含二氧化碳的气体连续地或间歇性地冲刷。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，从贮存器和/或孵育室蒸发出的水提供传导装置（2）里的相对湿度为选自由至少50%、至少70%、和至少90%组成的组。因此，所述孵育室在37℃以含水溶液或悬浮液操作时，在3天后孵育室中水的相对持留量是初始体积的至少95%，或在5天后孵育室中水的相对持留量是初始体积的至少90%，或在10天后孵育室中水的相对持留量是初始体积的至少80%。
优选地，所述孵育室具有基本圆柱的形状。在这样的实施方案中，所述生物反应器适于通过关联的旋转装置绕水平旋转轴旋转，所述旋转轴基本与通过所述孵育室的中心轴重合。
所述孵育室的内部流体体积优选地选自：少于10mL，少于5mL，少于1mL，少于900μL，少于800μL，少于700μL，少于600μL，少于500μL，少于400μL，少于300μL，少于200μL，少于100μL，少于50μL，和25μL。
所述孵育室适于容纳一种或更多种细胞培养物，其特征在于孵育室是由无毒的材料制成，可以用于细胞培养，并且不利于细胞粘附。优选地，所述孵育室是由选自下述组的材料制成：各种玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。
在一个特别优选的实施方案中，所述孵育室适于容纳一种或多种类型细胞培养物，细胞培养物的形式为球状体、或在微载体珠或支架上的。
本发明还提供一种适于旋转的生物反应器，所述生物反应器包括：
-孵育室（1），孵育室结合第一半透膜（M1）提供基本闭合的封闭，
-通风装置，用于建立具有所希望的二氧化碳浓度的加湿空气流，以及
-传导装置（2），提供从第一半透膜（M1）到通风装置的导管，
其中，所述第一半透膜（M1）对氧气和二氧化碳是可渗透的，以方便孵育室（1）通风。
在这个实施方案中，所述传导装置（2）在末端开口以传输具有所希望的二氧化碳浓度的加湿气体；这种条件化气体可由富集具有二氧化碳（例如来自压缩贮存器）的环境空气、然后由合适的加湿装置给所述空气加湿来提供。进入传导装置（2）的空气运输可以通过泵实现，泵能够通过传导装置（2）建立合适的气流。
优选地，所述通风装置通过传导装置（2）的入口开口主动泵送来自围绕所述生物反应器的大气的空气，同时多余空气通过出口开口离开传导装置（2）。在这种方式里，所述通风装置可以提供导管内的相对湿度为选自由至少50%、至少70%、和至少90%组成的组。
本发明的优选实施方案尤其(但不是排他地)有利于获得微重力生物反应器，该反应器具有如下优势：
1）简单的气密结构。
2）由于较小的孵育舱体积，资源(化学物质、细胞或组织)耗费减少，从而花费相应减少。
3）由于贮存器的引入，改善了孵育室内的保水性，从而相应改善了对用于长期生长的培养条件的保持。
4）由于孵育室内保水性的改善，在小体积生物反应器中孵育的长期培养物的持续时间增加。
5）由于基本零体积的通口的引入，流体紊流减少。
6）较小生物反应器的其它有益效果，包括：对细胞生长监控的改良，在一些实施方案中通过自动视频成像技术/照相机成像技术进行监控；使用选择的组织活检材料或培养物的较少样本改善生长因子和信号分子的生物阈值水平的获得；由于可以同时操作的单个生物反应器的数目增加，从而增加了标准尺寸的孵育器的效率。
附图说明
本发明的一些实施方案通过附图说明，其中
图1是根据本发明的生物反应器的横截面示意图，
图2是根据本发明另一实施方案的生物反应器的横截面示意图。
发明详述
定义
如本文所用，下列术语具有如下含义：
术语“半透性过滤器”和“半透性膜”指可以被一些(但不是全部)化学物质或生物物质渗透的过滤器或膜。该术语可互换使用，不同的是，一般来讲，“过滤器”在水可自由渗透时使用，而一般来讲，“膜”在水不可渗透以及在水可自由渗透这两种情形时使用。
术语“孵育室”指生物反应器这样的部分，在该部分中进行细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织”或类似样品的生长、分化、孵育或其他方式的培养。术语“孵育室”与“孵育腔”和“孵育舱”可互换使用。
术语“对水基本上是不可渗透的”用于描述本发明的膜的特性并且指在气相和/或液相中表现出对水和类水分子高度排斥的膜。
术语“对水几乎完全是不可渗透的”用于描述本发明的膜的特性并且指这样一种膜，在1巴下水通过该膜的流速不大于0.1mL/min/cm2。
术语“对氧气和二氧化碳基本是可渗透的”用于描述本发明的膜的特性并且指空气容易通过的膜。
术语“相对保持”用于描述由于含水溶液或悬浮液在孵育室中时操作本发明的生物反应器而引起的情况，并且指初始存在的残余物质的相对量。例如，水在孵育室(具有柔性膜)中的相对保持可以计算为操作生物反应器后腔的体积除以操作该生物反应器开始时腔的体积。
术语“有毒的”具有本领域已知的一般含义。“有毒的”物质是这样一种物质，在化学组合物中的含量为如上定义的时该物质可以损害细胞、组织或生物体的功能或引起对细胞、组织或生物体的结构的破坏。
术语“预定毒性”涉及毒性物质和非毒性物质两者。正如帕拉塞尔苏斯在16世纪所说的，“世间万物皆是毒药，无一例外，唯有量才能区分毒与药”。物质的毒性类型可以(例如)根据美国食品与药品管理局(FDA)的毒性分类方案(toxicity typing scheme)确定。根据该方案，物质的预定毒性可以属于毒性类型A、类型B等，或者可以是无毒的。
术语“细胞培养物”指通过本领域已知的任何方法获得的或初始培养的任何类型的细胞、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织”或类似样品。
术语“微重力生物反应器”指适于旋转的生物反应器。
术语“在微重力条件下孵育”指细胞培养物在适于旋转的生物反应器中生长，同时绕基本水平的中心轴旋转所述生物反应器，旋转的速率使得一种或多种细胞培养物悬浮于液体培养基中，并且继续这种旋转允许所述的一种或多种细胞培养物生长的一段时间。
术语“相对保持水的装置”用于描述生物反应器的特征，并且指与膜或过滤器结合使用的不同于灌注的任何装置，所述的膜或过滤器基本上限制了孵育室以实现水的相对保持，或者备选地，指基本上限制了孵育室的任何单一膜，在1巴下水通过该膜的流速不大于0.1mL/min/cm2。
术语“化学组合物”具有本领域已知的通常含义。其可以包括(但不限于)一种或多种化学试剂或生物制剂(例如小分子、肽、蛋白质、碱、核酸和脂类)的任何混合物，其中所述化学试剂或生物制剂导致一种或多种细胞类型中的基因表达或蛋白质表达的改变，所述的细胞类型选自：
ο角质化上皮细胞(包括表皮角质形成细胞(分化的表皮细胞)；表皮基底细胞(干细胞)；手指甲和脚趾甲的角质形成细胞、甲床基底细胞(干细胞)；髓质毛干细胞；皮质毛干细胞；表皮毛干细胞；表皮毛根细胞；赫胥黎层的毛根鞘细胞；亨勒层的毛根鞘细胞；外毛根鞘细胞；毛母质细胞(干细胞))。
ο湿复层障壁上皮细胞(wet stratified barrier)(包括角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的复层扁平上皮的表面上皮细胞；角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的基底细胞(干细胞)；(膀胱和尿导管内衬的)尿路上皮细胞)。
ο外分泌上皮细胞(包括唾液腺粘液细胞(分泌富含多糖的分泌物)；唾液腺浆液细胞(分泌富含糖蛋白酶的分泌物)；舌内的味腺细胞(清洗味蕾)；乳腺细胞(分泌乳汁)；泪腺细胞(分泌泪液)；耳内的耵聍腺细胞(分泌腊)；外泌汗腺暗细胞(分泌糖蛋白)；外泌汗腺明细胞(分泌小分子)；顶泌汗腺细胞(分泌有气味的分泌物，性激素敏感)；眼睑中的睫毛腺细胞(特殊汗腺)；皮脂腺细胞(分泌富含脂质的皮脂分泌物)；鼻内的嗅腺细胞(清洗嗅上皮)；十二指肠内的十二指肠腺细胞(分泌酶和碱性粘液)；精囊腺细胞(分泌精液成分，包括用于精子游泳的果糖)；前列腺细胞(分泌精液成分)；尿道球腺细胞(分泌粘液)；巴多林腺细胞(分泌阴道润滑液)；尿道腺细胞(分泌粘液)；子宫内膜细胞(分泌糖类)；呼吸道和消化道的孤立杯形细胞(分泌粘液)；胃粘膜粘液细胞(分泌粘液)；胃腺产酶细胞(分泌胃蛋白酶原)；胃腺壁细胞(分泌盐酸)；胰腺腺泡细胞(分泌碳酸氢盐和消化酶)；小肠的帕内特细胞(分泌溶菌酶)；肺的II型肺细胞(分泌表面活性剂)；肺的克拉拉细胞)。
ο激素分泌细胞(包括垂体前叶细胞；促生长激素细胞；垂体催乳素细胞(lactotropes)；促甲状腺素细胞；促性腺素细胞；促肾上腺皮质激素细胞；分泌促黑素细胞激素的中间垂体细胞；分泌催产素或血管升压素的大细胞神经分泌细胞；肠道和呼吸道细胞(分泌一种或多种以下物质：5-羟色胺、内啡肽、促生长素抑制素、促胃液素、促胰液素、胆囊收缩素、胰岛素、胰高血糖素、铃蟾肽)；甲状腺细胞；甲状腺上皮细胞；滤泡旁细胞；甲状旁腺细胞；甲状旁腺主细胞；嗜酸细胞；肾上腺细胞；嗜铬细胞(分泌一种或多种类固醇激素、盐皮质激素或糖皮质激素)；精巢的间质细胞(分泌睾酮)；卵泡的内膜细胞(分泌雌激素)；破裂卵泡的黄体细胞(分泌孕酮)；肾肾小球旁器细胞(分泌肾素)；肾的致密斑细胞；肾的极周细胞；肾的系膜细胞)。
ο上皮吸收细胞(肠道、外分泌腺和泌尿生殖道)(包括肠刷状缘细胞(具有微绒毛)；外分泌腺分泌管细胞；胆囊上皮细胞；肾近端小管刷状缘细胞；肾远端小管细胞；输精小管无纤毛细胞；附睾主细胞；附睾基底细胞；代谢和储藏细胞；肝实质细胞(肝细胞)；脂肪细胞(白脂肪细胞或褐色脂肪细胞)；肝脂细胞)。
ο屏障作用细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)(包括I型肺细胞(被覆肺的气室)；胰管细胞(泡心细胞)；(汗腺、唾液腺、乳腺等的)非条纹管道细胞；肾小球壁细胞；肾小球足细胞；(肾中的)亨利袢细段细胞；肾集合管细胞；(精囊腺、前列腺等的)导管细胞)。
ο被覆闭合的内部体腔的上皮细胞(包括血管和淋巴管内皮有窗细胞；血管和淋巴管内皮连续细胞；血管和淋巴管内皮脾细胞；滑膜细胞(被覆关节腔，分泌透明质酸)；浆膜细胞(被覆腹膜腔、胸膜腔和围心腔)；扁平细胞(被覆耳的外淋巴隙)；扁平细胞(被覆耳的内淋巴隙)；有微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(被覆耳的内淋巴隙)；无微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(被覆耳的内淋巴隙)；暗细胞(被覆耳的内淋巴隙)；前庭膜细胞(被覆耳的内淋巴隙)；血管纹基底细胞(被覆耳的内淋巴隙)；血管纹缘细胞(被覆耳的内淋巴隙)；克劳迪马斯细胞(被覆耳的内淋巴隙)；伯特歇尔细胞(被覆耳的内淋巴隙)；脉络丛细胞(分泌脑脊液)；软蛛网膜扁平细胞；眼的睫状体色素上皮细胞；眼的睫状体非色素上皮细胞；角膜内皮细胞)。
ο具有推进功能的纤毛细胞(包括呼吸道纤毛细胞；(雌性体内的)输卵管纤毛细胞；(雌性体内的)子宫内膜纤毛细胞；(雄性体内的)睾丸网纤毛细胞；(雄性体内的)输精小管纤毛细胞；中枢神经系统的室管膜纤毛细胞(被覆脑腔))。
ο细胞外基质分泌细胞(包括成釉质上皮细胞(分泌牙釉质)；耳前庭器官的半月平面上皮细胞(分泌蛋白聚糖)；螺旋器齿间上皮细胞(分泌覆盖毛细胞的覆膜)；疏松结缔组织成纤维细胞；角膜成纤维细胞；腱成纤维细胞；骨髓网状组织成纤维细胞；其它非上皮成纤维细胞；毛细血管外膜细胞；椎间盘的髓核细胞；成牙骨质细胞/牙骨质细胞(分泌牙根骨样牙骨质)；成牙质细胞/牙细胞(odontocyte)(分泌牙本质)；透明软骨细胞；纤维软骨细胞；弹性软骨细胞；成骨细胞/骨细胞；骨原细胞(成骨细胞的干细胞)；眼玻璃体的玻璃体细胞；耳外淋巴隙的星形细胞)。
ο收缩细胞(包括红骨骼肌细胞(收缩慢)；白骨骼肌细胞(收缩快)；中间骨骼肌细胞；肌梭的核袋细胞；肌梭的核链细胞；卫星细胞(干细胞)；普通心肌细胞；结心肌细胞；浦肯野纤维细胞；平滑肌细胞(多种类型)；虹膜的肌上皮细胞；外分泌腺的肌上皮细胞)。
ο血液系统和免疫系统细胞(包括红细胞(红血细胞)；巨核细胞(血小板前体)；单核细胞；结缔组织巨噬细胞(多种类型)；表皮朗格汉斯细胞；(骨内的)破骨细胞；(淋巴样组织中的)树突细胞；(中枢神经系统的)小胶质细胞；嗜中性粒细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞；肥大细胞；辅助性T细胞；抑制性T细胞；细胞毒性T淋巴细胞；B细胞；天然杀伤细胞；记忆细胞；网织红细胞；血液系统和免疫系统的干细胞和定向先祖细胞(多种类型)。
ο感觉转导细胞(包括眼的光感受器视杆细胞；眼的光感受器感蓝视锥细胞；眼的光感受器感绿视锥细胞；眼的光感受器感红视锥细胞；螺旋器的听觉内毛细胞；螺旋器的听觉外毛细胞；耳前庭器官的I型毛细胞(感知加速和重力)；耳前庭器官的II型毛细胞(感知加速和重力)；I型味蕾细胞；嗅觉感受器神经元；嗅上皮的基底细胞(嗅神经元的干细胞)；I型颈动脉体细胞(血液pH感受器)；II型颈动脉体细胞(血液pH感受器)；表皮的梅克尔细胞(触觉感受器)；触敏初级感觉神经元(多种类型)；冷敏初级感觉神经元；热敏初级感觉神经元；痛敏初级感觉神经元(多种类型)；本体感受初级感觉神经元(多种类型))。
ο自主神经元细胞(包括胆碱能神经细胞(多种类型)；肾上腺素能神经细胞(多种类型)；肽能神经细胞(多种类型))。
ο感官和外周神经元支持细胞(包括螺旋器的内柱细胞；螺旋器的外柱细胞；螺旋器的内指细胞；螺旋器的外指细胞；螺旋器的边缘细胞；螺旋器的汉森细胞；前庭器官支持细胞；I型味蕾支持细胞；嗅上皮支持细胞；神经膜细胞；卫星细胞(包被外周神经细胞体)；肠神经胶质细胞)；
ο中枢神经系统神经元和神经胶质细胞(包括神经元细胞(各种各样的类型，仍然没有很好的分类)；星形细胞(多种类型)；少突胶质细胞)。
ο晶状体细胞(包括前晶状体上皮细胞；包含晶体蛋白的晶状体纤维细胞)。
ο色素细胞(包括黑素细胞；视网膜色素上皮细胞)。
ο生殖细胞(包括卵原细胞/卵母细胞；精子细胞；精母细胞；精原细胞(精母细胞的干细胞)；精子)。
ο滋养细胞(包括卵泡细胞；(睾丸中的)支持细胞；胸腺上皮细胞)。
ο干细胞(胚胎来源或成体来源的有无限能力的干细胞、全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞或前体或祖细胞)。
ο源于任意上述细胞类型的所有癌细胞(包括难下定义的起源的畸胎癌)。
优选的实施方案
在优选的实施方案中，用于本发明的半透性过滤器允许最大某种分子量或大小的分子通过。具有明确孔径的半透性过滤器是本领域技术人员已知的并且是市售的。在本发明的优选实施方案中，半透性过滤器对最大预定分子量(例如50kDa、100kDa、150kDa、200kDa或250kDa)的分子是可渗透的。备选地，半透性过滤器的渗透性可以由其中的孔径确定。半透性过滤器的孔径可以少于或等于0.5μm，例如少于或等于0.3μm，优选少于或等于0.2μm，更优选少于或等于0.1μm，并最优选少于或等于0.05μm。可以使用各种各样的过滤器。这些过滤器可以由选自(但不限于)以下的材料制成：聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅橡胶、泡沫塑料、辐射处理的塑料以及类似材料。在一个优选的实施方案中，可以使用购自Whatman公司的TE35过滤器或购自Pall Life Sciences公司的Zefluor过滤器(产品编号为66142)。
在本发明的优选实施方案中，水在1巴下通过“对水基本上是不可渗透的”和“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”膜的流速不大于50ml/min/cm2，优选不大于40ml/min/cm2、更优选不大于30ml/min/cm2，甚至更优选不大于20ml/min/cm2，最优选不大于10ml/min/cm2。本领域技术人员将很容易理解，水的渗透性可以以能转换成ml/min/cm2的其它单位表示。
在本发明的优选实施方案中，空气在3毫巴下通过“对水基本上是不可渗透的”和“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”膜的流速至少为5ml/min/cm2，优选至少为10ml/min/cm2、更优选至少为15ml/min/cm2，甚至更优选至少为20ml/min/cm2，最优选至少为25ml/min/cm2。本领域技术人员将很容易理解，气体流量可以以能转换成ml/min/cm2的其它单位表示。
可以使用由各种材料组成的、“对水基本上是不可渗透的”并且“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”膜，包括但不限于本领域所熟知的、由聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅橡胶、泡沫塑料、辐射处理的塑料以及类似材料组成的膜。合适的膜的一个实例可从Whatman公司以“
Figure BDA00002983576400131
”商标商购获得，其为一种具有聚酯支持物的聚四氟乙烯膜，具有如下特性(由生产商所提供)：孔度为0.2μM，厚度为190μM，当用乙醇测定时在0.9巴下水流速为20ml/min/cm2，在3毫巴下气流速率为15ml/min/cm2，始泡点为1.4巴。合适的膜的另一个实例是从Millipore公司以“
Figure BDA00002983576400132
”商标商购获得，其为一种聚偏二氟乙烯膜，具有如下特性(由生产商所提供)：孔度为0.22μM，厚度为100-150μM，在45毫巴下发生水突破，在10psi下气流速率＞1slpm/cm2。在一些实施方案中，膜可以是Millipore0.22μm“Durapel”膜或Whatman TE35和TE36膜。
在本发明的优选实施方案中，水在1巴下通过“几乎完全不渗透水”而“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”膜的流速不大于0.1ml/min/cm2，甚至更优选不大于0.05ml/min/cm2、还更优选不大于0.04ml/min/cm2，甚至更优选不大于0.03ml/min/cm2，还更优选不大于0.02ml/min/cm2，最优选不大于0.01ml/min/cm2。本领域技术人员将很容易理解，水的渗透性可以以能转换成ml/min/cm2的其它单位表示。
在本发明的优选实施方案中，空气在3毫巴下通过“对水几乎完全是不可渗透的”而“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”膜的流速至少为5ml/min/cm2，优选至少为10ml/min/cm2、更优选至少为15ml/min/cm2，甚至更优选至少为20ml/min/cm2，最优选至少为25ml/min/cm2。
可以使用包含各种各样的材料的膜，所述的膜是“对水几乎完全是不可渗透的”而“对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的”，包括但不限于最初制备用于超滤目的的膜，由于低的孔隙度和高的疏水性，这种用于超滤目的的膜在大气压力下具有十分低的透水性。这种膜包括从Amicon公司以“
Figure BDA00002983576400141
”商标以及从Pall公司以“Omega1K.
Figure BDA00002983576400142
”商标商购获得的超过滤膜。其它合适的膜包括热塑性超滤膜，该膜通过半结晶材料，例如聚(醚醚酮)(PEEK)和聚(苯硫醚)(PPS)的热诱导相转化法制备，如文献[Micro-and ultrafiltration film membranes frompoly(ether ether ketone)(PEEK).Sonnenschein M，Journal of AppliedPolymer Science199974：1146]所描述的。也可以使用固定的稳定支撑液膜(SLM)，其包括固定于坚固的微孔性疏水支持物内的合适寡聚或多聚流体膜材料，例如在US5507949中所公开的系统。
在优选的实施方案中，根据本发明的生物反应器的孵育室的内部流体体积可以少于10mL、少于5mL、少于1mL、少于900uL、少于800uL、少于700uL、少于600uL、少于500uL、少于400uL、少于300uL、少于200uL、少于100uL、少于50uL或25uL。
许多不同的细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织”或类似样本可以用于实践本发明。不同的细胞培养方法包括(但不限于)在玻璃容器和塑料容器生长，例如充满三维细胞支持基质的培养瓶、细胞工厂或细胞立方体和软塑料袋(如输液袋)；滚瓶；转瓶；发酵罐；或多种材料的中空纤维。细胞培养物可以为细胞群集的形式，例如微载体珠上的球形体，或支架(例如可生物降解的支架，通常由聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)或这两者的混合物制成，参见文献[Characterization of knitted polymeric scaffolds for potential use inligament tissue engineering.Ge Z，Goh JC，Wang L，Tan EP，LeeEH.J Biomater Sci Polym Ed.2005；16(9)：1179-92.]和[Synthesis andcharacterizations of biodegradable and crosslinkablepoly(epsilon-caprolactone fumarate)，poly(ethylene glycol fumarate)，and their amphiphilic copolymer.Wang S，Lu L，Gruetzmacher JA，CurrierBL，Yaszemski MJ.Biomaterials.2005Aug12；[先于印刷版的电子版]])上的细胞、组织或组织活检材料或组织类器官(tissueorganoid)。本发明尤其可以用一种或多种以下细胞类型实践：
ο角质化上皮细胞(包括表皮角质形成细胞(分化的表皮细胞)；表皮基底细胞(干细胞)；手指甲和脚趾甲的角质形成细胞、甲床基底细胞(干细胞)；髓质毛干细胞；皮质毛干细胞；表皮毛干细胞；表皮毛根细胞；赫胥黎层的毛根鞘细胞；亨勒层的毛根鞘细胞；外毛根鞘细胞；毛母质细胞(干细胞))。
ο湿复层障壁上皮细胞(包括角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的复层扁平上皮的表面上皮细胞；角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的基底细胞(干细胞)；(膀胱和尿导管内衬的)尿路上皮细胞)。
ο外分泌上皮细胞(包括唾液腺粘液细胞(分泌富含多糖的分泌物)；唾液腺浆液细胞(分泌富含糖蛋白酶的分泌物)；舌内的味腺细胞(清洗味蕾)；乳腺细胞(分泌乳汁)；泪腺细胞(分泌泪液)；耳内的耵聍腺细胞(分泌腊)；外泌汗腺暗细胞(分泌糖蛋白)；外泌汗腺明细胞(分泌小分子)；顶泌汗腺细胞(分泌有气味的分泌物，性激素敏感)；眼睑中的睫毛腺细胞(特殊汗腺)；皮脂腺细胞(分泌富含脂质的皮脂分泌物)；鼻内的嗅腺细胞(清洗嗅上皮)；十二指肠内的十二指肠腺细胞(分泌酶和碱性粘液)；精囊腺细胞(分泌精液成分，包括用于精子游泳的果糖)；前列腺细胞(分泌精液成分)；尿道球腺细胞(分泌粘液)；巴多林腺细胞(分泌阴道润滑液)；尿道腺细胞(分泌粘液)；子宫内膜细胞(分泌糖类)；呼吸道和消化道的孤立杯形细胞(分泌粘液)；胃粘膜粘液细胞(分泌粘液)；胃腺产酶细胞(分泌胃蛋白酶原)；胃腺壁细胞(分泌盐酸)；胰腺腺泡细胞(分泌碳酸氢盐和消化酶)；小肠的帕内特细胞(分泌溶菌酶)；肺的II型肺细胞(分泌表面活性剂)；肺的克拉拉细胞)。
ο激素分泌细胞(包括垂体前叶细胞；促生长激素细胞；垂体催乳素细胞；促甲状腺素细胞；促性腺素细胞；促肾上腺皮质激素细胞；分泌促黑素细胞激素的中间垂体细胞；分泌催产素或血管升压素的大细胞神经分泌细胞；肠道和呼吸道细胞(分泌一种或多种以下物质：5-羟色胺、内啡肽、促生长素抑制素、促胃液素、促胰液素、胆囊收缩素、胰岛素、胰高血糖素、铃蟾肽)；甲状腺细胞；甲状腺上皮细胞；滤泡旁细胞；甲状旁腺细胞；甲状旁腺主细胞；嗜酸细胞；肾上腺细胞；嗜铬细胞(分泌一种或多种类固醇激素、盐皮质激素或糖皮质激素)；精巢的间质细胞(分泌睾酮)；卵泡的内膜细胞(分泌雌激素)；破裂卵泡的黄体细胞(分泌孕酮)；肾肾小球旁器细胞(分泌肾素)；肾的致密斑细胞；肾的极周细胞；肾的系膜细胞)。
ο上皮吸收细胞(肠道、外分泌腺和泌尿生殖道)(包括肠刷状缘细胞(具有微绒毛)；外分泌腺分泌管细胞；胆囊上皮细胞；肾近端小管刷状缘细胞；肾远端小管细胞；输精小管无纤毛细胞；附睾主细胞；附睾基底细胞；代谢和储藏细胞；肝实质细胞(肝细胞)；脂肪细胞(白脂肪细胞或褐色脂肪细胞)；肝脂细胞)。
ο屏障作用细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)(包括I型肺细胞(被覆肺的气室)；胰管细胞(泡心细胞)；(汗腺、唾液腺、乳腺等的)非条纹管道细胞；肾小球壁细胞；肾小球足细胞；(肾中的)亨利袢细段细胞；肾集合管细胞；(精囊腺、前列腺等的)导管细胞)。
ο被覆闭合的内部体腔的上皮细胞(包括血管和淋巴管内皮有窗细胞；血管和淋巴管内皮连续细胞；血管和淋巴管内皮脾细胞；滑膜细胞(被覆关节腔，分泌透明质酸)；浆膜细胞(被覆腹膜腔、胸膜腔和围心腔)；扁平细胞(被覆耳的外淋巴隙)；扁平细胞(被覆耳的内淋巴隙)；有微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(被覆耳的内淋巴隙)；无微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(被覆耳的内淋巴隙)；暗细胞(被覆耳的内淋巴隙)；前庭膜细胞(被覆耳的内淋巴隙)；血管纹基底细胞(被覆耳的内淋巴隙)；血管纹缘细胞(被覆耳的内淋巴隙)；克劳迪乌斯细胞(被覆耳的内淋巴隙)；伯特歇尔细胞(被覆耳的内淋巴隙)；脉络丛细胞(分泌脑脊液)；软蛛网膜扁平细胞；眼的睫状体色素上皮细胞；眼的睫状体非色素上皮细胞；角膜内皮细胞)。
ο具有推进功能的纤毛细胞(包括呼吸道纤毛细胞；(雌性体内的)输卵管纤毛细胞；(雌性体内的)子宫内膜纤毛细胞；(雄性体内的)睾丸网纤毛细胞；(雄性体内的)输精小管纤毛细胞；中枢神经系统的室管膜纤毛细胞(被覆脑腔))。
ο细胞外基质分泌细胞(包括成釉质上皮细胞(分泌牙釉质)；耳前庭器官的半月平面上皮细胞(分泌蛋白聚糖)；螺旋器齿间上皮细胞(分泌覆盖毛细胞的覆膜)；疏松结缔组织成纤维细胞；角膜成纤维细胞；腱成纤维细胞；骨髓网状组织成纤维细胞；其它非上皮成纤维细胞；毛细血管外膜细胞；椎间盘的髓核细胞；成牙骨质细胞/牙骨质细胞(分泌牙根骨样牙骨质)；成牙质细胞/牙细胞(分泌牙本质)；透明软骨细胞；纤维软骨细胞；弹性软骨细胞；成骨细胞/骨细胞；骨原细胞(成骨细胞的干细胞)；眼玻璃体的玻璃体细胞；耳外淋巴隙的星形细胞)。
ο收缩细胞(包括红骨骼肌细胞(收缩慢)；白骨骼肌细胞(收缩快)；中间骨骼肌细胞；肌梭的核袋细胞；肌梭的核链细胞；卫星细胞(干细胞)；普通心肌细胞；结心肌细胞；浦肯野纤维细胞；平滑肌细胞(多种类型)；虹膜的肌上皮细胞；外分泌腺的肌上皮细胞)。
ο血液系统和免疫系统细胞(包括红细胞(红血细胞)；巨核细胞(血小板前体)；单核细胞；结缔组织巨噬细胞(多种类型)；表皮朗格汉斯细胞；(骨内的)破骨细胞；(淋巴样组织中的)树突细胞；(中枢神经系统的)小胶质细胞；嗜中性粒细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞；肥大细胞；辅助性T细胞；抑制性T细胞；细胞毒性T淋巴细胞；B细胞；天然杀伤细胞；记忆细胞；网织红细胞；血液系统和免疫系统的干细胞和定向先祖细胞(多种类型)。
ο感觉转导细胞(包括眼的光感受器视杆细胞；眼的光感受器感蓝视锥细胞；眼的光感受器感绿视锥细胞；眼的光感受器感红视锥细胞；螺旋器的听觉内毛细胞；螺旋器的听觉外毛细胞；耳前庭器官的I型毛细胞(感知加速和重力)；耳前庭器官的II型毛细胞(感知加速和重力)；I型味蕾细胞；嗅觉感受器神经元；嗅上皮的基底细胞(嗅神经元的干细胞)；I型颈动脉体细胞(血液pH感受器)；II型颈动脉体细胞(血液pH感受器)；表皮的梅克尔细胞(触觉感受器)；触敏初级感觉神经元(多种类型)；冷敏初级感觉神经元；热敏初级感觉神经元；痛敏初级感觉神经元(多种类型)；本体感受初级感觉神经元(多种类型))。
ο自主神经元细胞(包括胆碱能神经细胞(多种类型)；肾上腺素能神经细胞(多种类型)；肽能神经细胞(多种类型))。
ο感官和外周神经元支持细胞(包括螺旋器的内柱细胞；螺旋器的外柱细胞；螺旋器的内指细胞；螺旋器的外指细胞；螺旋器的边缘细胞；螺旋器的汉森细胞；前庭器官支持细胞；I型味蕾支持细胞；嗅上皮支持细胞；神经膜细胞；卫星细胞(包被外周神经细胞体)；肠神经胶质细胞)；
ο中枢神经系统神经元和神经胶质细胞(包括神经元细胞(各种各样的类型，仍然没有很好的分类)；星形细胞(多种类型)；少突胶质细胞)。
ο晶状体细胞(包括前晶状体上皮细胞；包含晶体蛋白的晶状体纤维细胞)。
ο色素细胞(包括黑素细胞；视网膜色素上皮细胞)。
ο生殖细胞(包括卵原细胞/卵母细胞；精子细胞；精母细胞；精原细胞(精母细胞的干细胞)；精子)。
ο滋养细胞(包括卵泡细胞；(睾丸中的)支持细胞；胸腺上皮细胞)。
ο干细胞(胚胎来源或成体来源的有无限能力的干细胞、全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞或前体或祖细胞)。
ο源于任意上述细胞类型的所有癌细胞(包括难下定义的起源的畸胎癌)。
在本发明的优选实施方案中，可以应用于本发明的细胞选自肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、肌细胞或类似细胞、肝脏组织、脂肪组织(褐色或白色)、肝活检材料、肾活检材料、肌肉活检材料、卵泡、胰岛和源自于它们的所有癌细胞。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，可应用于本发明中的细胞是肝细胞，尤其是人肝细胞。
图1是根据本发明的生物反应器的横截面示意图。该生物反应器具有绕水平轴的高度旋转对称性，如图1中看到的。该反应器包括用于孵育细胞、组织等的孵育室（1）、加湿贮存器（3）和传导装置（2）。孵育室（1）与高度多孔的半透膜（M1）结合，为孵育细胞等提供了基本上闭合的封闭。半透膜的孔径可以少于或等于0.5μm，例如少于或等于0.3μm，优选少于或等于0.2μm，甚至更优选少于或等于0.1μm，并最优选少于或等于0.05μm。因为需要防止感染物(例如细菌、支原体或酵母)通过该过滤器进入，少于或等于0.2μm的尺寸是优选的。在这个优选的实施方案中，该半透膜的主要目的是允许交换大气如氧气和二氧化碳而排斥细胞和细菌进入该孵育室。因而，各种各样的过滤器可以用于M2。这些过滤器可以由聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅橡胶、泡沫塑料、辐射处理的塑料以及类似材料制成。孵育室（3）具有大约25μl-大约1ml的内部流体体积。优选的是，孵育室15的流体体积是大约50μl-大约0.5ml，更优选大约0.1ml-大约0.4ml。小的尺寸显著减少了使用的花费和成功操作所必需的材料(有机材料和无机材料两者)的量。小的尺寸将便于精细监控细胞(例如通过遥感照相机)和自动化处理(例如非灌流形式的培养基交换)
加湿贮存器（3）给予传导装置（2）交换水汽提供体积。箭头指从周围大气和传导装置（2）交换初始气体，以及在加湿贮存器、传导装置和孵育室（1）之间交换气体和蒸汽。
在生物反应器的前面，设置了透明区(没有示出)，以使得可以从生物反应器外面人工或用例如照相机自动视觉观察和评估细胞等的培养。透明区可以由既透明又相对于培养过程是化学惰性的玻璃、塑料或任意其它合适材料制成。优选的材料将包括(但不限于)多种类型的玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的合适变体可以商购获得，包括商标名为
Figure BDA00002983576400192
Figure BDA00002983576400194
Figure BDA00002983576400195
和
Figure BDA00002983576400196
的市售产品。生物反应器的任何实施方案可以全部或部分由这种透明材料制成。
孵育室（1）优选具有基本是圆柱形的形状，但其它形状也是可能的，例如椭圆形、球形等。优选地，生物反应器适于通过关联的旋转装置(没有示出)绕水平旋转轴旋转，以便于细胞在腔中生长。调整旋转的速率以将细胞或原组织保持在悬浮液中，并且该速率必须随所述原组织大小的增加而变化。本领域技术人员将知道如何调整旋转速率以便将细胞或原组织保持在悬浮液中。
生物反应器可通过合适的扣紧装置(例如贯穿的装配螺丝)装配于基座部件上。为了易于将基座部件和生物反应器装配于合适的旋转装置(没有示出)上，基座部件可以有利地具有螺纹端区。类似地，前面部件和后面部件另外通过装配螺丝结合在一起，以便给腔提供流体密封性的连接，如上所解释的。
在本发明的一个实施方案中，传导装置(2)具有大约25μl-大约2ml，优选大约50μl-大约1ml，最优选大约0.1-0.4ml的内部流体体积。传导装置(2)的体积应该最小并因而与孵育室(1)的体积相当。孵育室(1)、传导装置(2)和贮存器(3)可以用诸如高密度聚丙烯(HDPP)等之类的惰性塑料制成。优选的材料将包括(但不限于)多种类型的玻璃、尼龙、塑料、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。与密封装置(例如O型密封环)结合，通过孵育室和贮存器的气流仅可能有效通过膜M2(孵育室的形成部分)和第二膜M1(贮存器的形成部分)。
半透膜M1的特殊之处在于该膜是对水基本上是不可渗透的并且对氧气和二氧化碳基本上是可渗透的。由此，膜M1促进了孵育室(1)的通风。半透膜M2高度透水并可从贮存器抽水。此外，由于膜M1对水的不渗透性，实现了在孵育室(1)中对水的基本保持。膜M1可以用本领域熟知的多种材料制成，所述的材料包括但不限于聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅橡胶、泡沫塑料、辐射处理的塑料以及类似材料。合适的膜的另一个实例是从Whatman公司以“
Figure BDA00002983576400201
Figure BDA00002983576400202
”商标商购获得，其为一种具有聚酯支持物的聚四氟乙烯膜，具有如下特性(由生产商所提供)：孔径为0.2μM，厚度为190μM，当用乙醇测量时在0.9巴下的水流速为20ml/min/cm2，在3毫巴下气流速为15ml/min/cm2，始沸点为1.4巴。合适的膜的另一个实例是从Millipore公司以“
Figure BDA00002983576400211
”商标商购获得，其为一种聚偏二氟乙烯膜，具有如下特性(由生产商所提供)：孔度为0.22μM，厚度为100-150μM，在45毫巴下发生水突破，在10psi下气流速率＞1slpm/cm2。其它实例是购自Pall LifeSciences公司的Zefluor过滤器(产品号为66142)。M2可以用允许水汽透过膜的任何多孔材料制成。这些膜和其改性形式可以
Figure BDA00002983576400212
注册商标购买。这些膨胀的、多孔的聚四氟乙烯膜满足防水同时也对水蒸汽流动可透过的要求。这些膨胀的多孔聚四氟乙烯膜本质上是疏水性的，并含有非常小的孔，即使在大量压力或摩擦或挠曲时抵抗液体水进入，但易于允许水蒸气流过。不同于芯吸材料，透气性是通过蒸发服装内部或膜的内表面上的液体水、随后由气流或水蒸汽透过膜扩散到外部实现的。
由于这些材料的高度疏水性质，水和类水分子将高度地被从膜M1的表面排斥开。然而，一些水将不可避免地穿透膜M1。从贮存器(1)和/或孵育室(1)蒸发的水将在由中间腔(2)形成的气密性管道中提供至少50％、优选至少70％或更优选至少90％，例如至少95％、96％、97％、98％或99％的相对湿度。
图2是根据本发明另一实施方案的生物反应器的横截面示意图。在这个实施方案中，传导装置(2)在末端开口以传输具有所希望的二氧化碳浓度的加湿气体；这种条件化气体可由富集具有二氧化碳（例如来自压缩贮存器）的环境空气、然后由合适的加湿装置给空气加湿提供。进入传导装置(2)的空气运输可以通过泵实现，泵能够通过传导装置(2)建立合适的气流。该反应器包括用于孵育细胞、组织等的孵育室(1)和传导装置(2)。孵育室(1)与高度多孔的半透膜(M1)结合，为孵育细胞等提供了基本上闭合的封闭。半透膜的孔径可以少于或等于0.5μm，例如少于或等于0.3μm，优选少于或等于0.2μm，甚至更优选少于或等于0.1μm，并最优选少于或等于0.05μm。因为需要防止感染物(例如细菌、支原体或酵母)通过该过滤器进入，少于或等于0.2μm的尺寸是优选的。在这个优选的实施方案中，该半透膜的主要目的是允许交换大气如氧气和二氧化碳而排斥细胞和细菌进入该孵育室。孵育室(1)具有大约25μl-大约1ml的内部流体体积。优选的是，孵育室15的流体体积是大约50μl-大约0.5ml，更优选大约0.1ml-大约0.4ml。小的尺寸显著减少了使用的花费和和成功操作所必需的材料(有机材料和无机材料两者)的量。小的尺寸将便于精细监控细胞(例如通过遥感照相机)和自动化处理(例如非灌流形式的培养基交换)。
本发明的生物反应器可用于孵育一种或多种细胞培养物、组织活检材料、细胞群集、组织样结构、“原组织”或类似样本的生物反应器。
一个具体的实施方案涉及将本文的生物反应器用于孵育一种或多种细胞培养物的用途，其中所述一种或多种生物细胞培养物孵育一段较长时期，例如1周、2周或3周，优选至少1个月，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月，最优选至少12个月。
将根据本发明的生物反应器用于孵育一种或多种细胞培养物的一个优点是，细胞在较长的一段时间内保持或实现高度分化的状态。此外，根据本发明的生物反应器的使用避免了利用胰蛋白酶消化以从生物反应器中获得细胞。
通过将本发明的生物反应器用于测定毒性的类型，未知毒性的化学组合物的毒性可以仅用小量的细胞、生长培养基和化学组合物测定。因而，通过根据本发明测定毒性类型的方法，有可能以利用成人组织时实现的可靠性(但以低很多的花费)来测定化学组合物的毒性类型。根据本发明用于测定毒性类型的方法也可应用于其中毒理学谱正常来说不能产生的情形。例如，各自独立时没有毒性的两种或多种化合物的化学组合物在一起施用时可能证明是有毒性的(这种现象称为“药物-药物”相互作用，即使不需要两种药物之间存在化学反应)。
尽管本发明已经结合具体的实施方案进行了描述，但无意于将本发明限制为本文列出的具体形式。相反，本发明的范围仅受限于附带的权利要求书。在权利要求书中，术语“包括”不排除其它元素或步骤的存在。此外，尽管独立的特征可以包括于不同的权利要求中，这些特征可能可以有利地进行组合，并且包括于不同权利要求中并不意味着特征的组合是不可行的和/或不利的。而且，单数的指代并不排除复数。因而，对“一”、“一种”、“第一”、“第二”等的提及不排除复数。此外，权利要求书中的附图标记不应理解为限制范围。
将本文中所引用的每一篇参考文献以引用的方式全文并入本文。特别是将详细描述具有加湿室的生物反应器的WO07/076865在此并入本文。

Claims (19)

1.适于旋转的生物反应器，所述生物反应器包括：
-孵育室（1），所述的孵育室结合第一半透膜（M1）提供了基本闭合的封闭，
-包含含水液体的贮存器（3），所述贮存器包括布置为与所述含水液体发生流体接触的第二半透膜（M2），所述膜（M2）进一步被选来促进含水液体蒸发入传导装置（2），并且
-传导装置（2）提供从第一半透膜（M1）到第二半透膜（M2）的基本闭合的导管，所述传导装置（2）设置有通风装置，用于增强与所述生物反应器周围大气的气体交换，
其中，所述第一半透膜（M1）对氧气和二氧化碳是可渗透的以方便孵育室通风，第二半透膜（M2）被选来促进含水液体从贮存器（3）蒸发入传导装置（2）。
2.根据权利要求1所述的生物反应器，其中，所述通风装置包括传导装置的入口开口，所述入口开口将来自围绕生物反应器的大气的空气主动泵入生物反应器，和允许多余空气离开传导装置的出口开口。
3.根据权利要求1所述的生物反应器，其中，所述通风装置设置有位于传导装置外周的入口开口，当生物反应器旋转时使围绕的大气进入传导装置，同时多余空气通过出口开口离开传导装置。
4.根据权利要求1-3任一项所述的生物反应器，其中，所述第二半透膜（M2）是由多孔材料制成以在传导装置里建立湿润环境。
5.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其中，所述传导装置（2）设置有通风装置，其用围绕生物反应器的大气连续地或间歇性地冲刷传导装置（2）。
6.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其中，从贮存器和/或孵育室蒸发的水提供导管内的相对湿度为选自由至少50%、至少70%、和至少90%组成的组。
7.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其中，所述孵育室在37℃以含水溶液或悬浮液操作时，该生物反应器在3天后孵育室中水的相对持留量是初始体积的至少95%。
8.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其中，所述孵育室在37℃以含水溶液或悬浮液操作时，该生物反应器在5天后孵育室中水的相对持留量是初始体积的至少90%。
9.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其中，所述孵育室在37℃以含水溶液或悬浮液操作时，该生物反应器在10天后孵育室中水的相对持留量是初始体积的至少80%。
10.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其中，所述孵育室具有基本圆柱的形状。
11.根据权利要求6所述的生物反应器，其中，所述生物反应器适于通过关联的旋转装置绕水平旋转轴旋转，所述旋转轴基本与通过所述孵育室的中心轴重合。
12.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其中，所述孵育室的内部流体体积选自：
少于10mL，少于5mL，少于1mL，少于900μL，少于800μL，少于700μL，少于600μL，少于500μL，少于400μL，少于300μL，少于200μL，少于100μL，少于50μL和25μL。
13.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其中，所述孵育室适于容纳一种或更多种细胞培养物，其特征在于孵育室是由无毒的材料制成，可以用于细胞培养，并且不利于细胞粘附。
14.根据权利要求9所述的生物反应器，其中，所述孵育室是由选自下述组的材料制成：各种玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。
15.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其中，所述孵育室适于容纳一种或多种类型细胞培养物，细胞培养物为不受支持的球状体形式或受微载体珠或支架支持的形式。
16.适于旋转的生物反应器，该生物反应器包括：
-孵育室（1），孵育室结合第一半透膜（M1）提供基本闭合的封闭，
-通风装置，用于建立具有所希望的二氧化碳浓度的加湿空气流，以及
-传导装置（2）提供从第一半透膜（M1）到通风装置的导管，
其中，所述第一半透膜（M1）对氧气和二氧化碳是可渗透的以方便孵育室（1）通风。
17.根据权利要求16的生物反应器，其中，所述通风装置设置有传导装置的入口开口，其主动泵送来自围绕生物反应器（2）的大气的空气，和多余空气通过出口开口离开传导装置（2）。
18.根据权利要求16或17的生物反应器，其中，所述通风装置提供导管内的相对湿度为选自由至少50%、至少70%和至少90%组成的组。
19.根据权利要求16-18任一项的生物反应器，其中，所述生物反应器适于通过关联的旋转装置绕水平旋转轴旋转，所述旋转轴基本与通过所述孵育室（1）的中心轴重合。
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