KR20220019261A - 하이드로겔 마이크로입자의 조정 가능한 분해 - Google Patents

Abstract

이식(implantation) 부위에서 치료 세포 및/또는 조직(동종 또는 이종 세포 클러스터 포함)의 국소 전달 및 지속 방출을 위한 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자(non-alginate hydrogel microparticle). 상기 마이크로입자는 공유 가교결합된 비-알기네이트 중합체 화합물의 3차원 매트릭스 및 그 안에 포획된(entrapped) 치료학적 유효량의 세포 및/또는 조직을 포함하고, 상기 세포는 생존력이 적어도 약 50%이고 상기 마이크로입자는 크기가 약 30pm 초과이다. 이러한 마이크로입자를 함유하는 조성물 및 치료를 위해 이러한 마이크로입자를 사용하는 방법이 또한 기재되어 있다.

Description

하이드로겔 마이크로입자의 조정 가능한 분해

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 하이드로겔 마이크로입자의 조정 가능한 분해(TUNABLE DEGRADATION IN HYDROGEL MICROPARTICLES)라는 명칭으로 2019년 6월 7일에 출원된 미국 가특허출원 제62/858,578호의 우선권 이익을 주장하며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 생물학적 제제를 캡슐화하기 위한 하이드로겔 기반 마이크로입자, 및 하이드로겔 매트릭스의 물리적 및 화학적 특성을 조절하는 방법, 예를 들어, 마이크로입자에 대한 분해 프로파일을 증가 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다.

세포 마이크로캡슐화는 조직 공학 연구 및 재생 의학과 함께 당뇨병, 암, 심장병 및 면역 장애와 같은 질병의 치료에서 광범위한 잠재적 유용성으로 빠르게 확장되는 분야이다. 전통적인 알기네이트 미소구체(alginate microspheres)는 여전히 생체적합성이 불량하며, 좀 더 진보된 하이드로겔을 사용하는 마이크로캡슐화는 느린 겔화 속도로 인해 어렵다. 필요한 것은 다양한 하이드로겔 재료로 제조할 수 있는 비세포독성, 비에멀젼 기반 하이드로겔 마이크로입자이다.

이식(implantation) 부위에서 치료 세포 및/또는 조직(동종 또는 이종 세포 클러스터(cluster) 포함)의 국소 전달(localized delivery) 및 지속 방출(sustained release)을 위한 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자(non-alginate hydrogel microparticle)가 본원에 기술되어 있다. 상기 마이크로입자는 공유 가교결합된 비-알기네이트 중합체 화합물의 3차원 매트릭스 및 그 안에 포획된(entrapped) 치료학적 유효량의 세포 및/또는 조직을 포함하고, 상기 세포는 생존력(viability)이 적어도 약 50%이고 상기 마이크로입자는 크기가 약 30μm 초과이다. 예시적인 중합체 화합물은 분지형(branched) 또는 비분지형 히알루론산(hyaluronic acid), 분지형 또는 비분지형 작용화 히알루론산(functionalized hyaluronic acid), 분지형 또는 비분지형 작용화 폴리에틸렌 글리콜(functionalized polyethylene glycol), 히알루로난(hyaluronan), 피브린(fibrin), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 폴리락트산(polylactic acid), 폴리(L-락트산)(poly(L-lactic acid)), 폴리락트산-코-글리콜산(polylactic-co-glycolic acid), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 저속 겔화 중합체 전구체(slow-gelling polymer precursor)로부터 선택된다. 상기 매트릭스는 디티오트레이톨(dithiothreitol), 분지형 또는 비분지형 작용화 폴리에틸렌 글리콜, 디티올(dithiols), 에틸렌 글리콜 비스-머캅토아세테이트(ethylene glycol bis-mercaptoacetate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 비-알기네이트 중합체 화합물과 가교결합된 가교결합제를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 작용화 폴리에틸렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 디티올, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디비닐 설폰, 폴리에틸렌 글리콜 디말레이미드 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 매트릭스는 한 가지 유형의 공유 가교결합된 중합체 백본(backbone)을 포함하는 동종의 것일 수 있다(다른 중합체 유형의 추가 가교결합제를 포함하거나 포함하지 않음). 상기 매트릭스는 또한 고분자량(> 500kDA, 바람직하게는 > 100kDA) 및 저분자량(< 100kDA, 바람직하게는 < 50kDa) 중합체 전구체의 조합과 같은 2종 이상의 중합체 전구체의 혼합물 및/또는 2종 이상의 가교결합제의 혼합물을 포함하는 이종의 것일 수 있다.

복수의 이러한 마이크로입자를 포함하는 조성물이 또한 본원에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 또한 세포 또는 조직 로딩된 마이크로입자와 함께 분산된 복수의 "빈(empty)" 마이크로입자를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상이한 마이크로입자의 혼합물, 예를 들어, 분해성(degradable) 하이드로겔 마이크로입자와 내구성(durable) 하이드로겔 마이크로입자의 혼합물, 및/또는 상이한 크기의 마이크로입자(예를 들어, 복수의 더 큰 마이크로입자 및 복수의 더 작은 마이크로입자)의 혼합물, 및/또는 상이한 유형의 세포 및/또는 조직을 각각 함유하는 마이크로입자(예를 들어, 한 세트의 마이크로입자 내의 인슐린 생성 세포 및 또 다른 세트의 마이크로입자 내의 지지 줄기세포)의 혼합물을 포함한다. 2종의 상이한 유형의 입자를 단일 조성물로 혼합하는 대신 2종의 상이한 조성물을 조합하거나 공동 투여할 수도 있다.

또한, 상기 마이크로입자 및/또는 이러한 마이크로입자를 함유하는 조성물을 (단독으로 또는 원하는 경우 다른 유형의 치료 화합물과 조합하여) 투여함으로써 이식 부위에서 치료 세포 및/또는 조직의 국소 전달 및 지속 방출을 위한 다양한 방법이 본원에서 고려된다. 전형적으로, 상기 마이크로입자 또는 조성물은 치료를 위한 부위에 또는 그 근처(인접한)에 직접 주입(injecting)되거나 이식된다.

또한, 제형에 포함되는 마이크로입자의 다양한 파라미터 및/또는 공정 파라미터, 예컨대 중합체 전구체 분자량, 가교결합제 분자량, 가교결합제와 중합체 전구체의 비율, 가교결합제 가수분해, 가교결합 키네틱(kinetic), 가교결합 시간, 예를 들어, UV 노출 시간, 및 이들의 조합을 변경함으로써 마이크로입자의 분해 속도를 조정하기 위한 다양한 방법 및 기술이 본원에 기술되어 있다.

추가로, 본원에 기술된 실시양태는 관절에 다수의 빈 마이크로입자를 이식함으로써 관절 윤활 및/또는 관절액보충요법(viscosupplementation)을 위한 빈 마이크로입자의 용도를 고려한다.

특허 또는 출원 파일에는 컬러로 실행된 하나 이상의 도면이 함유되어 있다. 컬러 도면(들)이 있는 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 시 및 필요한 수수료 지불 시 특허청에서 제공할 것이다.
도 1은 하이드로겔 전구체 화합물의 공유 가교결합의 예를 도시한다.
도 2는 (A) 액적 형성, (B) 알기네이트 배스(bath)에서의 인큐베이션, (C) 알기네이트 쉘의 형성 및 비후화(thickening), 및 (D) 하이드로겔 코어의 가교결합에 이은 알기네이트 쉘의 제거에 의한 하이드로겔 마이크로입자의 생성을 포함하는, 마이크로입자 형성 공정을 도시한다.
도 3은 (A) 마이크로입자 주위의 알기네이트 쉘 및 (B) 알기네이트 쉘 제거 후의 하이드로겔 마이크로입자에 대한 이미지를 보여준다.
도 4는 (A) 췌도(islets)가 로딩된 구형 내구성 PEG 기반 마이크로입자, (B) 췌도가 로딩된 타원형 PEG 기반 마이크로입자, (C) 줄기세포가 로딩된 평평한 가장자리의 MeHA 기반 마이크로입자 및 (D) 줄기세포가 로딩된 타원형 MeHA 기반 마이크로입자의 이미지를 보여준다.
도 5는 세포독성 연구 결과 및 (A) 칼슘 농도와 노출 시간이 개의 췌도(canine islets)의 생존력에 미치는 영향, 및 (B) 광개시제 농도와 UV광 노출 시간이 세포 생존력에 미치는 영향을 보여준다.
도 6은 ThHA, MeHA, PEGDA 또는 AHA로 구성된 대표적인 마이크로입자 100개의 지름 및 이들의 양호한 단분산 프로파일의 그래프 플롯이다.
도 7은 형광 표지된 덱스트란이 PEGDA, ThHA 및 MeHA 하이드로겔 마이크로입자로 확산된 이미지를 보여준다.
도 8a는 시간 경과에 따른 잔류 마이크로입자 중합체 질량에 기초한 상이한 입자의 분해 그래프이다.
도 8b는 시간 경과에 따른 상이한 입자에 대한 Q 값(팽창 비율)의 변화 그래프이다.
도 8c는 시간 경과에 따른 입자 질량 손실에 기초한 상이한 입자의 분해 그래프이다.
도 9는 마우스에 이식 후 초기 연구 코호트 동안 각 그룹에 대한 평균 일일 혈당 수준의 그래프이다.
도 10은 짙은 적색 디티존(dithizone) 염색에 의해 표시된 바와 같은 생존력이 있는 (A) PEDGA, (B) MeHA, (C) PEDGA, 및 (D) 짙은 적색 디티존 및 녹색 칼세인(calcein)의 공동 염색에 의해 표시된 바와 같은 PEDGA 생존력에 대한 마우스의 IP 공간으로부터 마이크로입자의 회수 이미지를 나타낸다.
도 11은 PEGDA 마이크로입자를 이식한 후 섬유성 조직의 결핍을 나타내는 건강한 지방세포의 이미지를 보여준다.
도 12는 개에게서 매일 아침과 오후에 측정된 평균 비공복 혈당의 그래프이다.
도 13은 (A) 내구성 PEGDA 마이크로입자로 함께 클러스터링된 HEK293 세포, (B) 34일 후 PEGDA 마이크로입자에서 (A)로부터의 거의 변화하지 않는 세포의 형태 또는 세포 수, (C) 분해성 MeHA 마이크로입자에 분산된 HEK293 세포 및 (D) 34일 후 MeHA 마이크로입자에서 (C)로부터의 세포 증식의 이미지를 보여준다.
도 14는 (A) PEGDA 마이크로입자로부터 확산된 매우 적은 수의 HEK293 세포 및 (B) MeHA 마이크로입자로부터 확산된 많은 수의 살아있는 세포를 보여주는 수집된 폐 배지(spent media)가 있는 마이크로플레이트 웰의 이미지를 보여준다.
도 15는 누적 세포 방출 연구의 평균 데이터를 요약한 그래프이다.
도 16은 (A) PEGDA 마이크로입자에 캡슐화된 MSC, (B) MeHA 마이크로입자에 캡슐화된 MSC, (C) PEGDA 마이크로입자에 캡슐화된 췌도, (D) MeHA 마이크로입자에 캡슐화된 췌도 및 (E) AHA 마이크로입자에 캡슐화된 MSC의 이미지를 보여준다.
도 17은 PEGDA 및 AHA 마이크로입자에 캡슐화된 래트 인슐린종(insulinoma) 세포주에 대한 세포 생존력 그래프이다.
도 18은 PEGDA 또는 MeHA에 캡슐화되고 인슐린을 생성하는 기능적 췌도를 입증하기 위해 디티오존으로 염색된 췌도의 이미지를 보여준다.
도 19는 (A) 복부 대망(abdominal omentum) 내부 및 주위에 주입된 PEDGA 마이크로입자, (B) 첫 번째 개의 조직에 달라붙는 마이크로입자 및 (C) 입자의 "점착성"을 보여주는 두 번째 개의 조직에 달라붙는 마이크로입자의 이미지를 보여준다.
도 20은 (A) 근육을 통해 보이는 래트의 무릎 관절에서 청색으로 염색된 PEGDA 마이크로입자, (B) 무릎 관절낭(knee capsule) 영역에서 청색으로 염색된 PEGDA 마이크로입자를 보여주는 절개된 무릎 관절; 및 (C) 청색으로 염색된 PEGDA 마이크로입자가 무릎 관절에 처음 이식된 위치에 남아 있는 추가의 절개된 무릎 관절의 이미지를 보여준다.
도 21은 3개의 마이크로입자 그룹에 대한 외식된(explanted) 조직의 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색 이미지를 보여준다.
도 22는 대망 내 마이크로입자에 대한 이물질 반응(결핍)의 그래프이다.
도 23은 Q 값에 대한 하이드로겔 전구체 용액에 사용된 코어(백본) 중합체 종의 질량 분율 효과의 그래프이다.
도 24a는 가교결합제 농도의 증가가 더 낮은 Q 값을 초래하는 제형을 나타내는 그래프이다.
도 24b는 가교결합제 농도의 증가가 더 높은 Q 값을 초래하는 제형을 나타내는 그래프이다.
도 25a는 pH의 증가가 더 높은 Q 값으로 이어지는 제형을 나타내는 그래프이다.
도 25b는 pH의 증가가 더 낮은 Q 값으로 이어지는 제형을 나타내는 그래프이다.
도 26a는 가교결합제의 분자량 증가가 더 높은 Q 값으로 이어지는 제형을 나타내는 그래프이다.
도 26b는 가교결합제의 분자량 증가가 Q 값의 변화를 일으키지 않는 제형을 나타내는 그래프이다.
도 27a는 일정한 반응성 부위/그램을 갖는 코어 중합체 종의 분자량 변화가 Q 값에 미치는 영향의 그래프이다.
도 27b는 상이한 반응성 부위/그램을 갖는 코어 중합체 종의 분자량 변화가 Q 값에 미치는 영향의 그래프이다.
도 28a는 입자의 Q 값(팽창 비율) 및 지름에 대한 상이한 마이크로입자 제형에 대한 UV 가교결합 시간의 효과의 그래프이다.
도 28b는 MeHA 마이크로입자 Q 값에 대한 UV 가교결합 시간의 효과의 그래프이다.

본 발명은 치료 세포 및 조직의 국소 전달 및 지속 방출을 위한 하이드로겔 마이크로입자에 광범위하게 관련된다. 하이드로겔 마이크로입자는 이식된 세포를 생리학적 조건(생분해) 하에서 초기 분해 및 세척으로부터 보호하고, 수 시간 내지 수 주 또는 수 개월에 걸쳐 국소 또는 전신 영역으로의 상기 세포(및 치료 단백질 및 분자)의 방출 키네틱을 제어한다. 분해되도록 설계된 하이드로겔 마이크로입자는 수 일 또는 수 주에 걸쳐, 일반적으로 3개월 미만에 걸쳐 정상적인 생리학적 과정에 의해 결국 생체 내에서 분해된다. 이것은 전체 하이드로겔이 이 시간 프레임 내에 정상적인 생리학적 조건에 의해 분해되고 세척되어 이식된 영역에 실질적으로 하이드로겔이 남지 않음을 의미한다(미량의 겔 또는 중합체가 여전히 해당 영역에 남아 있을 수 있음을 이해해야 하지만, 일반적으로 이식된 세포에 대해 더는 캡슐화제 역할을 하기에 충분하지 않다). 또한, 일부 징후에서, 특히 관절에 이식된 경우, 마이크로입자는 관절 부위에서의 움직임 및 충격을 통해 기계적 분해를 받기도 하는 것으로 이해될 것이다.

하이드로겔 마이크로입자는 치료학적 유효량의 세포가 캡슐화되는 하이드로겔 매트릭스를 포함한다. 상기 세포는 진핵 또는 원핵일 수 있다. 원핵 세포의 예로는 박테리아와 고세균(archaea)이 있다. 진핵 세포에는 동물 세포, 식물 세포 및 곰팡이류가 포함된다. 상기 세포는 비증식성 또는 증식성일 수 있다. 증식 세포는 이식 전 및/또는 이식 기간 동안, 또는 분해 하이드로겔에서 방출된 후에 하이드로겔 내에 캡슐화된 초기 세포 수로부터 추가로 증식(증가)할 것이다. 비증식성 세포는 시험관 내에서 제한된 확장 능력이 있으며, 일반적으로 초기 세포 수에서 증가하지 않는다. 그러나 하이드로겔 마이크로입자의 유리한 조건으로 인해 캡슐화된 세포 사이에 최소한의 세포 사멸이 있고 하이드로겔에 의해 캡슐화된 비증식성 세포의 초기 세포 수도 눈에 띄게 감소하지 않는다. 하나 이상의 실시양태에서, 마이크로입자에 캡슐화한 후 세포의 초기 생존력은 전구체 용액에 포함된 출발 세포 집단의 생존력과 비교하여 캡슐화 후 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 95%의 생존력으로 유지된다. 다시 말해, 캡슐화 동안 세포 집단의 50% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 더욱 바람직하게는 20% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 90% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 세포 집단의 5% 미만이 캡슐화 과정 동안 손실된다. 이는 온화한 캡슐화 과정과 세포 배지 및 영양소가 저장 중에 마이크로입자로 확산되는 능력 때문이다. 다시 말해, 하나 이상의 실시양태에서, 마이크로입자는 확산 장벽이 낮다.

하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 전구체 용액에 포함된 세포 집단은 하이드로겔 전구체 용액 mL당 약 1백만 내지 약 5억 개의 세포, 바람직하게는 하이드로겔 전구체 용액 mL당 약 4백만 내지 약 3억 개의 세포를 포함할 것이고, 일부 실시양태에서 전구체 용액 mL당 약 500만 내지 약 1억 5000만 개의 세포를 포함할 것이다. 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 전구체 용액은 하이드로겔 전구체 용액 mL당 캡슐화될 세포, 세포 클러스터 또는 조직을 대략 15부피%로 포함할 것이다.

증식성 세포의 예는 줄기세포 및 활성화된 T-세포를 포함하는 반면, 비증식성 세포의 예는 췌도 및 분화된 신경 세포를 포함한다. 두 경우 모두, 세포(및 관련 세포 생성물)는 하이드로겔에서 국소 이식 영역으로 천천히 방출된다. 세포와 함께 분비될 수 있는 예시적인 세포 생성물은 신호전달 분자(signaling molecule), 치료 단백질, 소포(vesicle), 항체, 바이러스, 엑소좀(exosome) 등을 포함한다. 단백질 기반의 이러한 구성요소는 고유한 형태이거나 유전적으로 변형될 수 있다. 마찬가지로, 세포 생성물의 구성요소는 고유하거나 유전자 변형될 수 있다. 하이드로겔 마이크로입자는 세포가 다른 캐리어 또는 캡슐화되지 않은 세포와 비교하여 더 오랫동안 국소 이식 영역에 유지되도록 하고, 이식된 세포의 치료 효과를 향상시키기 위해 세포 및/또는 이의 신호 분자, 단백질 등을 상기 영역에 일시적이지만 지속 가능하게 방출하도록 한다. 세포 로딩은 사용된 세포의 크기 및 각 마이크로입자의 크기에 의존할 것이라는 것이 이해될 것이다. 하나 이상의 실시양태에서, 마이크로입자 부피의 50% 이하가 캡슐화된 세포, 세포 클러스터 및/또는 조직으로 구성되며, 바람직하게는 세포, 클러스터 및/또는 조직 로딩 범위는 마이크로입자 본체 부피의 약 10% 내지 약 20%이다. 일반적으로, 약 50 내지 약 1×10⁵개의 세포가 각각의 1-mm 마이크로입자에 캡슐화될 수 있고, 바람직하게는 약 100 내지 약 1×10⁵개가 각각의 1-mm 마이크로입자에 캡슐화될 것이다.

하나 이상의 실시양태에서, 마이크로입자는 이식일로부터 약 3개월(90일) 미만 이내에 결국 생체 내에서 분해되는 더 약한 하이드로겔로 형성되고, 본원에서 "분해성" 하이드로겔로 지칭된다(이는 하이드로겔이 궁극적으로 분해될 것이라는 것으로 이해됨). 본원에 사용된 "분해성" 하이드로겔 마이크로입자는 "지속 방출형(sustained-release)이지만 "급속 분해형(quick-degrading)" 또는 "단기형(short-term)" 하이드로겔로 정의되며, 이는 PBS에서 적어도 24시간 및 생체 내 이식될 때 3개월 이하 동안 자립(self-sustaining) 마이크로입자 본체를 유지할 것이다. 이러한 분해성 하이드로겔 마이크로입자는 또한 시험관 내 저장 조건(PBS 및 37℃)에서 약 6개월 이내에 와해 및 분해된다. 다시 말해, 하이드로겔 매트릭스는 6개월 미만의 "시험관 내 보관 안정성"을 가지며, 이는 PBS 중 37℃에서 보관할 때 6개월 이내에 저장 중에 가수분해되고 자립체(self-sustaining body)에서 분해되기 시작함을 의미한다. 하나 이상의 실시양태에서, 분해성 하이드로겔 마이크로입자는 150 초과, 바람직하게는 200 초과의 Q 값을 갖는 것을 특징으로 한다. 그러나 아래에 설명된 바와 같이, 가교결합 화학에 대한 추가 수정(예를 들어, 가수분해적으로 불안정한 가교결합제의 사용)은 낮은 Q 값(강한 초기 매트릭스)의 마이크로입자를 생성할 수 있지만, 이는 상당히 빠르게 분해되고, 그럼에도 분해성 하이드로겔 마이크로입자로 특성화된다.

이들 분해성 마이크로입자는 내구성 하이드로겔 마이크로입자에 관한 대안 실시양태와 대조된다. 이러한 내구성 하이드로겔 마이크로입자도 더욱 장기적인 적용의 경우 지속 방출형이지만, PBS 중 37℃에서 적어도 6개월 동안의 저장 조건에서 와해 또는 분해되지 않을 것이다. 다시 말해, 내구성 마이크로입자는 6개월 초과의 "시험관 내 저장 안정성"을 갖는다. 하나 이상의 실시양태에서, 내구성 하이드로겔 입자는 PBS 중 실온(27℃)에서 1년 이상 동안 상온 안정적이다(shelf-stable). 바람직하게는, 이러한 내구성 하이드로겔 마이크로입자가 이식될 때, 정상적인 생리학적 조건(식균작용, 분해, 흡착 등을 통한 이물질의 정상적인 생체 내 제거라고도 함) 하에서 적어도 3개월 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 6개월 동안 분해되지 않을 것이다.

어느 경우든, 하이드로겔 마이크로입자는 또한 미소구체, 마이크로비드 또는 하이드로겔 마이크로입자로 특징지어질 수 있다. 이들은 3차원 하이드로겔 매트릭스와 하이드로겔 매트릭스에 현탁, 포획 또는 캡슐화된 세포를 포함하는 개별 자체 지지체의 형태이다. 대상체(subject)에 이식하기 위한 지속 방출형 조성물이 또한 본원에 기술되어 있다. 지속 방출형 조성물은 약제학적으로 허용되는 전달 비히클(vehicle)에 현탁된 복수의 3차원 하이드로겔 마이크로입자를 포함한다.

마이크로입자를 형성하는데 사용하기에 적합한 하이드로겔 전구체 화합물은 하이드로겔 형성 중합체, 올리고머 및/또는 단량체를 포함하고, 그 자체로 가교결합을 통해 가교결합된 또는 네트워크 구조 또는 매트릭스(즉, "하이드로겔")를 형성할 수 있으며, 여기서 액체 및 세포는 생성된 겔화 구조 또는 매트릭스 본체의 간극 공간 또는 기공 내에 보유, 현탁, 포획 및/또는 캡슐화될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 하이드로겔 전구체 화합물은 바람직하게는 비-알기네이트 하이드로겔 전구체 화합물이다. 즉, 하이드로겔 전구체 용액은 바람직하게는 알기네이트 화합물, 즉 알기네이트, 알긴산 또는 이들의 염 또는 유도체에 기초한 화합물이 실질적으로 없다. 본원에 사용된 용어 "실질적으로 없는"은 부수적인 불순물이 발생할 수 있거나 제조 공정에서 잔류량/미량이 남을 수 있지만 성분이 조성물에 의도적으로 첨가되지 않음을 의미한다. 이러한 실시양태에서, 하이드로겔 전구체 용액 조성물은 이러한 성분을, 100중량%로 취한 용액의 총 중량을 기준으로, 약 0.05중량% 미만, 바람직하게는 약 0.01중량% 미만, 더욱 바람직하게는 약 0중량%로 포함한다.

하이드로겔 마이크로입자는 유리하게는 히알루론산(HA) 및 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA), 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드(PEGMAL), 다중 암(multi-arm) PEG, 히알루로난, 피브린, 키토산, 콜라겐, 헤파린, 폴리락트산(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리락트산-코-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 메타크릴산(MAA), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA), 폴리아크릴아미드(PAM) 세포외 기질, 및 이들의 작용화 변이체(예를 들어, 아크릴레이트화, 메타크릴레이트화, 티올레이트화 등) 또는 이들의 다중 암 변이체(예를 들어, 4-암 PEG, 8-암 PEG)와 같은 다양한 저속 겔화 중합체 전구체로부터 제조된다. 그러나 임의의 가교결합성 하이드로겔 전구체 화합물이 본 발명과 함께 사용하기에 적합할 것이며, 바람직한 화합물은 생체적합성 비-알기네이트 단일중합체 또는 공중합체, 특히 비-알기네이트 블록 공중합체뿐만 아니라 다른 유형의 가교결합성 단량체 및/또는 올리고머이다. 일반적으로, 전구체 용액에 포함된 중합체 전구체의 양은 50% w/w 미만일 것이다. 상기 양은 히알루론산과 같은 고분자량(≥ 500kDa, 바람직하게는 ≥ 100kDa), 다중치환된 중합체의 경우 약 1% 내지 약 50% w/w, 및 PEGDA 또는 PEGMAL과 같은 저분자량 중합체(< 100kDa, 바람직하게는 ≤ 50kDa)의 경우 약 5% 내지 약 50% w/w 범위일 것이다.

마이크로입자의 가교결합 프로파일은 전구체 화합물의 분자량뿐만 아니라 선택된 가교결합제, 가교결합 조건 및 가교결합 공정을 조절하여 조정할 수 있다. 예를 들어, 가교결합 동안 분자가 액적/코어에서 주변 환경으로 침출하는 능력을 제한함으로써 더 매끄러운 비드 표면 및/또는 더 강한 겔을 달성하기 위해 "더 단단한" 또는 더 빠른 가교결합이 일부 실시양태에서 바람직할 수 있다. 이는 전구체 종의 분자량을 증가(예를 들어, ~ > 40kDa)시키고/시키거나 가교결합 화학 또는 개시 방법을 조절하여 가교결합 시간을 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 그러나 이작용성 전구체 종(즉, PEGDA)의 분자량을 증가시키면 일반적으로 감소된 가교결합 밀도로 인해 더 확산된 겔이 생성된다. 추가로, 가수분해적으로 불안정한 가교결합제는 세포의 부위 내로의 이식을 용이하게 하기 위해 초기 Q 값이 작은 초기에 강한 마이크로입자를 생성하는 데 사용될 수 있다. 그러나 이러한 가교결합제는 정상적인 생리학적 조건에서 빠르게 분해되어 이식 부위로 페이로드(payload)를 빠르게 방출한다. 가교결합은 특정 하이드로겔 전구체 화합물에 따라 다양한 메커니즘에 의해 수행될 수 있다. 하나 이상의 실시양태에서, 코어/쉘 마이크로입자는 바람직하게는 용액에서 하이드로겔 매트릭스 가교결합제와 조합된다. 가교결합제는 알기네이트 쉘을 통해 코어/쉘 마이크로입자로 침출되어 하이드로겔 전구체 화합물의 겔화(가교결합)를 일으켜 3차원 하이드로겔 매트릭스를 형성한다. 가교결합제는 하이드로겔 전구체 화합물에 해당하지만 생성된 가교결합된 매트릭스 내에서 달성되는 가교결합의 속도 및 수준을 제어하기 위해 변경될 수 있다. 일반적으로, 마이크로입자를 형성하는데 사용되는 가교결합제의 양은 선택된 가교결합제 및 중합체 시스템에 따라 약 0.5mM 내지 약 30mM, 바람직하게는 약 1mM 내지 약 20mM, 더욱 바람직하게는 약 2mM 내지 약 15mM, 훨씬 더 바람직하게는 약 2.5mM 내지 약 10mM, 훨씬 더 바람직하게는 약 2.5mM 내지 약 5mM의 범위일 것이다.

적합한 가교결합제는 광개시 또는 열개시 가교결합제, 화학적 가교결합제, 예컨대 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 비닐-설폰, 디티올 등을 포함하며, 이들은 알기네이트 배스의 일부로서 포함될 것이다. 자가 가교결합 하이드로겔 전구체도 사용할 수 있다. 이러한 실시양태에서, IRGACURE® 2959(2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논) 또는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일-포스피네이트(LAP)와 같은 광개시제가 촉매로서 하이드로겔 전구체 용액에 포함될 수 있다. 광개시제는 알기네이트 배스에도 포함될 수 있다. 화학적 가교결합 시스템의 경우, 가교결합제는 전형적으로 알기네이트 배스에 제공된다. UV 개시 가교결합 시스템의 경우, 가교결합제는 주요 중합체(백본(backbone)) 종과 함께 알기네이트 배스 또는 하이드로겔 전구체 용액에 포함될 수 있다.

표 1은 적절한 가교결합제를 사용하여 하이드로겔을 형성하는 데 사용할 수 있는 다양한 백본 화학물질의 반응성 그룹의 예를 제공한다. 일부 반응은 UV광에 의해 시작되고 다른 반응은 화학적 반응이다.

추가의 예시적인 전구체 화합물은 비-알기네이트 다당류, 콜라겐/젤라틴, 키토산, 아가로스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 전구체 화합물은 다중 암 또는 단일 백본의 비분지형/선형 중합체 쇄를 갖는 분지형 중합체일 수 있다. 이들은 단백질, 약물 또는 효소를 하이드로겔에 부착하여 작용화됨으로써 세포 부착, 기능, 증식 또는 생존 능력을 제어할 수 있다. 특히 바람직한 하이드로겔 전구체 화합물은 히알루론산 또는 히알루론산/PEG 혼합물이다. 상기 전구체 화합물(들)은 또한 하이드로겔 제조 시에 전구체 화합물에 첨가된 다양한 화학 물질로 작용화될 수 있다. 이러한 화학 물질은 마이크로입자 밖으로의 단순한 확산을 위해 간극 공극에 캡슐화되는 것과는 대조적으로 하이드로겔 매트릭스에 결합된다. 예에는 작용화되어 가교결합제 또는 하이드로겔 백본과 반응할 수 있는 세포 지지제의 첨가가 포함될 수 있다. 급속 분해형 마이크로입자에서, 이들 제제는 그 안에 캡슐화된 세포 및 세포 생성물과 함께 국소 방출될 것이다.

다시, 바람직한 하이드로겔은 저속 겔화 하이드로겔이며, 이는 본원에서 사용된 바와 같이 겔 전구체 액적과 가교결합제를 함유하는 용액의 접촉 시 일반적으로 매끄럽고 일반적으로 구형 구조물을 형성하기에 불충분한 겔화 속도를 갖는 하이드로겔을 의미한다. 저속 겔화 하이드로겔은 일반적으로 가교결합제에 노출될 때 순간적으로(또는 거의 즉각적으로, 예를 들어, 5-10초 정도 이내에) 겔 액적을 형성하지 않는 것으로 간주된다. 생체적합성 하이드로겔은 하이드로겔의 지정된 최종 용도에 따라 특히 바람직하다. 본원 사용된 "생체적합성"은 생체 조직 또는 기질 내에 캡슐화된 세포에 해롭지 않은 것을 의미하며, 더욱 구체적으로는 생물학적으로나 바람직하지 않은 것이 아니므로 대상체에게 과도한 독성, 자극 또는 알레르기 또는 면역원성 반응 없이 투여할 수 있고, 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키지 않거나 그것이 함유된 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는다. 생체적합성 하이드로겔은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있는 바와 같이 대상체에서 임의의 불리한 부작용을 최소화하도록 선택될 것이다. 하이드로겔 전구체와 함께 포함될 수 있는 추가의 선택적 성분은 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 세포외 기질의 기타 성분 등과 이들의 합성 버전을 포함한다.

일반적으로, 마이크로입자를 제조하는 기술은 2015년 6월 3일에 출원된 미국 특허 제9,642,814호에 자세히 설명되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 상기 방법은 하이드로겔 전구체 화합물, 캡슐화될 세포, 및 용매 시스템에 분산되거나 용해된 2가 양이온(예를 들어, 칼슘, 바륨, 스트론튬 및 이들의 조합)을 포함하는 하이드로겔 전구체 용액을 제조하는 것을 포함한다. 2가 양이온은 하이드로겔 전구체 화합물과 함께 용매 시스템에 분산 또는 용해된다. 2가 양이온은 100%로 취한 용액의 총 부피를 기준으로 약 0.025몰/리터 내지 약 0.25몰/리터의 수준으로 용액에 포함되어야 한다.

하이드로겔 전구체 용액은 또한 임의의 하이드로겔 가교결합제, 촉매, 첨가제, 매질, 영양소, pH 완충제, 밀도 조절제, 점도 조절제 등을 포함할 수 있다. 그런 다음 하이드로겔 전구체 용액을 알기네이트와 합하여 하이드로겔 전구체 용액 주변에서 알기네이트의 겔화를 개시하여("인사이드 아웃" 겔화 공정을 통해) 코어/쉘 마이크로입자를 생성한다. 각각의 코어/쉘 마이크로입자는 하이드로겔 전구체 용액을 포함하는 액체 코어를 둘러싸는 알기네이트 쉘을 포함한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 이것은 일반적으로 (B) 예컨대 알기네이트 배스에 적하 또는 분무되는 전구체 용액의 액적을 생성/압출함으로써 알기네이트 배스에 (A) 전구체 용액을 적가하는 것을 포함한다. 상기 용액 중 알기네이트의 양은 다양할 수 있지만, 100%로 취한 용액의 총 부피를 기준으로 약 0.1% 내지 약 2.0% 중량/부피 범위일 수 있다. 일반적으로, 알기네이트 용액의 점도는 하이드로겔 전구체 용액의 점도보다 낮아야 한다. 알기네이트 용액의 점도는 알기네이트 농도 및 알기네이트 중합체의 평균 분자량(즉, 알기네이트 분자의 길이 또는 쇄 중 단량체 단위의 수)에 따라 달라지며, 쇄의 길이가 길수록 유사한 농도에서 더 높은 점도를 초래한다. 하나 이상의 실시양태에서, 알기네이트 용액의 점도는 실온(~20 내지 25℃)에서 약 1 내지 약 20cP, 바람직하게는 약 1 내지 약 4cP 범위일 것이다. 더욱 구체적으로, 하이드로겔 전구체 용액의 점도 대 알기네이트 용액의 점도의 비율은 실온에서 1보다 커야 한다. 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 전구체 용액의 점도 대 알기네이트 용액의 점도의 비율은 약 1:1 내지 약 1000:1이다. 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 전구체의 점도 비율은 약 20:1이다. 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 전구체 용액의 점도는 약 1 내지 약 500cP이고, 실온에서 약 40 내지 약 100cP가 특히 바람직하다. 알기네이트 배스의 pH는 약 6.2 내지 약 7.8, 바람직하게는 약 6.6 내지 약 7.4의 범위여야 한다.

(B)와 (C)에 도시한 바와 같이, 알기네이트 쉘은 안쪽에서 바깥쪽으로 형성되고 전구체 용액 액적으로부터 양이온이 침출됨에 따라 액적 주위를 두껍게 한다. 다시 말해, 액적에 양이온이 존재하면 배스 내의 알기네이트가 표면에 응집되어 액적 주위에서 가교결합된다. 다음으로, 액체 코어에서 하이드로겔 전구체 화합물의 겔화가, 예컨대 가교결합 및/또는 중합에 의해 개시되어 코어/쉘 가교결합된 마이크로입자를 생성한다. 각각의 코어/쉘 가교결합된 마이크로입자는 알기네이트 쉘 및 가교결합된 3차원 하이드로겔 매트릭스 및 포획된 세포를 포함하는 겔화 코어를 포함한다. 가교결합은 제조된 특정 전구체 용액에 따라 화학적으로 유도되거나, 열적으로 유도되거나, 광개시될 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 가교결합제는 알기네이트 배스에 포함될 수 있고 알기네이트 쉘을 통해 확산되어 코어에서 하이드로겔 마이크로입자를 가교결합할 수 있다. 대안으로, 코어/쉘 마이크로입자는 하이드로겔 마이크로입자 코어에서 가교결합을 개시하기 위해 UV 방사선 소스에 노출될 수 있다. UV 노출 시간은 약 1분 내지 약 10분, 바람직하게는 약 2분 내지 약 8분, 더욱 더 바람직하게는 약 2.5분 내지 약 5분 범위이다. UV 노출의 파장은 선택된 광개시제 및/또는 중합체 시스템에 의존할 것이지만, 일반적으로 약 100nm 내지 약 400nm, 바람직하게는 약 315nm 내지 약 400nm, 더욱 바람직하게는 약 365nm의 범위일 것이다.

알기네이트 유형 마이크로입자의 이온 결합과 달리, 본 발명의 마이크로입자는 도 1에 도시된 것처럼 하이드로겔 전구체 화합물의 공유 가교결합을 포함한다. PEGDA 예는 적색 이중선으로 표시된 반응성 부위를 갖는 PEG 백본(검은색 선)의 말단에 디아크릴레이트 화학을 보여준다. PEGDA 분자는 서로 가교결합하여 최종 하이드로겔 제형을 생성한다. 대조적으로, 반응성 그룹이 쇄(적색 이중선)에 분산되어 있는 MeHA 백본(청색 선)은 PEGDA와 공유 가교결합되어 있다(도 1). 이와 같이, 전구체 화합물은 가교결합 반응을 통해 최종 생성물에서 화학적으로 변경되어 가교결합된 하이드로겔 매트릭스를 생성한다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 매트릭스는 (예를 들어, 티올레이트화 HA의 경우) 티오에테르 및 에스테르 가교 결합을 함유하는 PEG 및 HA 중합체의 가교결합된 네트워크로 본질적으로 이루어진다(또는 이벤트로 이루어진다). 그러나 상기 매트릭스는 네트워크에 남아있는 미량의 미반응 전구체 화합물, 작용성 그룹 등을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 가능한 하이드로겔 매트릭스 및 가교결합의 다른 예는 표 1에 제공되어 있다. 이 목록은 예를 제공하지만 완전한 것은 아니다. 표 1에 나열된 화학 물질과 함께 사용할 수 있는 백본 분자의 예에는 키토산, 아가로스, 콘드로이틴 설페이트(Chondroitin Sulfate) 또는 분자 조합이 포함된다. 백본 사이에 형성된 결합에는 티오에스테르 + 에스테르, 티오에스테르 + 에스테르 및 베타 탄소 상의 메틸, 티오에테르 설폰 또는 티오에테르 석신이미드와의 화학 결합이 포함된다. 그러나 다른 화학 결합이 사용될 수 있다. 광(자유 라디칼) 결합에는 에스테르 + 에테르 또는 아미드 + 에테르가 포함될 수 있다. 가능한 조합이 사실상 무한하도록 활용될 수 있는 점점 더 복잡한 조합이 있다는 것을 이해할 것이다.

코어가 겔화되면 (예를 들어, 킬레이트제, 및/또는 기계적 교반, 예컨대 초음파 처리를 사용하여) 알기네이트 쉘을 제거하여 (D)에 도시한 바와 같이 자립 하이드로겔 마이크로입자 또는 마이크로비드 및 그 안에 포획된 세포를 생성한다. 즉, 알기네이트 쉘은 최종 생성물의 일부가 아니며 항상 마이크로입자를 사용하기 전에 제거된다. 생성된 하이드로겔 마이크로입자는 메쉬 스크린 또는 기타 장치를 사용하여 용액으로부터 수집될 수 있고, 원하는 경우 배지 또는 적절한 영양소에 헹구거나 이에 현탁될 수 있다. 다시 말하면, 생성된 분해성 하이드로겔 마이크로입자는 바람직하게는 실질적으로 알기네이트가 없다.

이 기술은 세포, 세포 클러스터, 조직, 이들의 조합 및 이들의 단편을 하이드로겔 마이크로입자에 포획/캡슐화하는 데 사용할 수 있다. 세포는 천연 유래 또는 새로 단리된 1차 세포, 배양 또는 확장된 세포, 확립된 세포주, 분화 또는 미분화, 조작 또는 유전적으로 변형된 세포 등일 수 있다. 세포 및 조직의 비제한적인 예는 췌도, 췌도 클러스터, 간세포, 줄기세포 및 관련 세포 및 조직뿐만 아니라 내분비 세포, 줄기세포 클러스터, 갑상선 클러스터, 부신 클러스터, 뇌하수체 클러스터 및 조직 공학 또는 세포 기반 치료를 위한 기타 3차원 세포 클러스터일 수 있다. 세포 유형 및/또는 조직 조합물이 또한 마이크로입자에 사용될 수 있다(예를 들어, 줄기세포와 조합된 1차 세포 유형). 마이크로입자는 또한 세포 유형에 따라 세포 유지 및 성장을 지원하는 세포 배양 배지의 하이드로겔 매트릭스 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 배지 성분은 혈청, 니코틴아미드, 항생제(페니실린, 암포테리신 B, 스트렙토마이신, 젠타마이신 설페이트), 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 글루타민 등), pH 완충제(중탄산나트륨), 무기염(나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 이온의 공급원), 탄소 공급원(포도당, 갈락토스, 과당, 말토스, 피루브산나트륨), 단백질 및 펩타이드(알부민, 트랜스페린, 피브로넥틴, 액티빈, 인슐린), 지방산 및 지질, 비타민(A, D, E, K, B, 니코틴아미드), 미네랄 및 미량 원소(아연, 구리, 셀레늄), 호르몬, 성장 인자 등 중 하나 이상을 포함한다. 완전 배지, 기본 배지 및 배지 구성요소는 상업적으로 입수할 수 있으며, 여기에는 이글 최소필수배지(Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM), 둘베코 수정이글배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM), RPMI-1640, 햄 영양소 혼합물(Ham's Nutrient Mixtures), 이스코브 수정둘베코배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), CMRL-1066 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

생성된 하이드로겔 매트릭스는 액체와 기체는 투과할 수 있지만 흐름이 없고 정상 상태에서 무결성을 유지하는 반강성 네트워크(semi-rigid network)인 것이 특징이다. 하이드로겔은 고체로 간주될 수 있으며 점도가 무한대에 가깝다고 설명할 수도 있다. 하이드로겔 매트릭스는 3차원 자립체이다. 자립체라는 용어는 하이드로겔 매트릭스가 일단 형성되면 외부 지지 구조 없이 그 형태를 유지하고, 단지 자체의 내부 힘 또는 중량으로 인해 변형되기 쉽지 않음을 의미한다. 자립체는 젤리, 퍼티 또는 페이스트처럼 유연하거나 영구적으로 변형되거나 유동성이 있지는 않지만 탄력성이 있어 매트릭스 본체가 힘을 받으면 일시적으로 무너지거나(temporarily yield) 변형될 수 있다. 다시 말해, 자립체는 약간의 압축 및/또는 구부림(flexing) 후에 리코일(recoil)하거나 형상(shape)으로 스프링 백(spring back)할 것이다 - 하이드로겔 매트릭스는 외부 압력 또는 힘의 충분한 가중 하에서 균열, 파손 또는 전단(shear)될 것으로 (또한 이후 회복될 것으로) 인식된다.

하이드로겔 마이크로입자는 코어-쉘 유형의 캡슐처럼 뚜렷한 쉘을 가지지 않고 비드 전체에 충전재를 고정하는 매트릭스 유형의 캡슐이다. 위에서 언급한 바와 같이, 하이드로겔 마이크로입자는 또한 자립체이다. 하나 이상의 실시양태에서, 생성된 마이크로입자는 형상이 실질적으로 구형이다. 유리하게는, 입자 크기는 선택된 액적 생성기의 능력에 따라 고도로 맞춤화될 수 있다. 하나 이상의 실시양태에서, 생성된 하이드로겔 미소구체 또는 마이크로입자는 평균(평균)(average(mean)) 최대 단면 표면-대-표면 치수(즉, 구형 또는 타원형 미소구체의 경우, 이의 지름)가 30μm 초과이고, 일부 경우에는 300μm 초과이다. 하나 이상의 실시양태에서, 생성된 하이드로겔 미소구체 또는 마이크로입자는 평균(평균) 최대 표면-대-표면 치수는 약 5mm 미만이다. 바람직하게는, 생성된 하이드로겔 미소구체 또는 마이크로입자는 평균(평균) 최대 표면-대-표면 치수가 약 2mm 미만, 더욱 바람직하게는 약 30μm 내지 약 2mm, 더욱 더 바람직하게는 약 50μm 내지 약 1.5mm, 더욱 바람직하게는 약 150μm 내지 약 1.5mm, 더욱 더 바람직하게는 약 300μm 내지 약 1.4mm이다. 일부 경우에, 약 30μm 내지 약 750μm 또는 500μm 크기 범위의 더 작은 마이크로입자가 형성될 수 있다. 참조의 편의를 위해, 이 단면 치수는 본원에서 단순히 마이크로입자의 "크기"로 지칭된다. 여하튼, 본 발명의 하이드로겔 마이크로입자는 나노크기가 아니며 나노입자 또는 임의의 다른 종류의 나노결정질 형태로 간주되지 않을 것이다.

하이드로겔 마이크로입자는 단기 치료 프로토콜이 급성 또는 만성 병태(condition)를 완화하는데 사용될 수 있는 이러한 병태에 대한 국소 치료에 특히 적합하다. 예로는 뼈 또는 연골 복구(예를 들어, 관절에서)를 위한 세포, 세포 클러스터 및/또는 조직의 국소 전달(예를 들어, 직접 주입) 및 숙주 면역 시스템으로부터 이식된 치료 세포, 세포 클러스터 및/또는 조직의 일반적인 보호가 포함된다. 마이크로입자는 캡슐화된 세포, 세포 클러스터 및/또는 조직을 짧은 기간(예를 들어, 수 일, 수 주, 최대 3개월)에 걸쳐 면역 시스템으로부터 보호하여 정상적인 생리적 과정에 의해 하이드로겔이 분해되고 세척될 때까지 치료 효과를 발휘한다. 전신 치료도 고려된다. 하나 이상의 실시양태에서, 마이크로입자는 소분자 치료제의 전달을 위한 것이 아니며 바람직하게는 이러한 약물이 (예를 들어, 세포 및 임플란트, 예컨대 면역억제제의 성공을 보장하기 위해) 활성제 또는 치료제 그 자체로서는 아니고 세포 지지 활성제로서 마이크로입자에 포함되는 정도를 제외하고는 이러한 약물이 없다.

치료 방법을 위해, 마이크로입자는 대상체에 투여하기 위해 적합한 전달 비히클에 현탁되거나 분산된다. 예시적인 전달 비히클은 생체적합성 액체 현탁액, 점성 용액, 퍼티, 페이스트 또는 마이크로입자가 분포된 겔을 포함할 것이고, 바람직하게는 투여될 세포, 세포 클러스터 및/또는 조직의 유지 및 성장을 지원하는 영양소 및 성분을 포함할 것이다. 세포 또는 조직 유형에 따라 추가로 보충될 수 있는 상기 기술된 바와 같은 세포 배양 배지가 바람직한 비히클이다. 식염수 또는 기타 완충 용액도 전달 수단으로 사용할 수 있다. 상기 방법은 일반적으로 환자에게, 예컨대 염증, 손상, 관절염, 퇴행 등의 위치에 치료적 유효량의 생성된 마이크로입자 조성물을 국소 투여하는 것을 포함한다(또는 이로 구성된다). 투여는 일반적으로 염증, 손상, 관절염, 퇴행 등의 부위에 또는 그 부근에 마이크로입자 조성물을 직접 주입하는 것을 포함한다. 유리하게는, 지속 방출형 마이크로입자 조성물은 치료적 유효 기간 동안 투여된 세포, 세포 클러스터 및/또는 조직을 국소 영역에 국한시켜 천천히 방출된 세포, 세포 클러스터 및/또는 조직 및/또는 이들의 세포 성분 또는 생성물이 국소 영역에서 방출되어 환자의 병태의 중증도를 완화하거나 감소시킨다. 본원에 사용된 용어 "치료적 유효"는 연구원 또는 임상의가 찾고 있는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하고, 특히 일부 원하는 치료 효과를 유도하는 양 및/또는 기간을 의미한다. 예를 들어, 하나 이상의 실시양태에서, 치료적 유효량 및 기간은 염증을 감소시키고 염증, 손상, 관절염, 퇴행 등의 부위의 치유를 개시하거나 촉진하는 것이다. 당업자는 병태가 완전히 근절되지 않고 부분적으로 개선되더라도 양 또는 기간이 치료적으로 유효한 것으로 간주할 수 있다.

필요한 경우 추가 주사 또는 주입을 통해 치료를 반복할 수 있다. 당업자는 치료 프로토콜이 특정 염증, 손상, 관절염, 퇴행, 병태 또는 치유 상태, 및 의사 또는 수의사 또는 연구원의 선호도에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 척수 손상 또는 퇴행성 질환의 회복과 같은 신경 회복은 병변 부위의 경막외강(epidural space) 또는 경막외(extradural) 공간에 미세캡슐화된 줄기세포를 주입하여 잠재적으로 치료할 수 있다. 분해성 하이드로겔 마이크로입자는 줄기세포가 환경과 직접 상호작용할 수 있도록 즉시 해당 영역으로 줄기세포를 방출하도록 설계되거나 더 오래 지속되도록(예를 들어, ~1-3개월) 설계된 분해성 마이크로입자는 줄기세포를 미세캡슐화하여 해당 영역으로 양성 성장 인자를 방출하면서 천천히 분해되어 아무것도 남지 않을 때까지 파괴 및 분해를 위해 세포를 방출할 수 있다. 마찬가지로, 심장마비 후 심장 회복은 미세캡슐화되어 손상 부위에 배치된 세포, 세포 클러스터 및/또는 조직으로부터 세포 또는 성장 인자의 국소 방출에 의해 개선될 수 있다. 또 다른 예로는 갑상선의 제거 또는 배제(abatement)로 흉터 조직이 존재하는 경우 목 또는 근/인접 부위에 미세캡슐화된 갑상선 세포, 세포 클러스터 및/또는 조직을 배치함으로써 갑상선 기능의 회복과 같은 호르몬 요법을 통한 비기능성 갑상선의 치료가 포함된다. 내구성 하이드로겔 마이크로입자의 추가 예에는 신경내분비 장애와 관련된 신경전달물질의 국소 전달, 치유되지 않는 골절 근처에 전달되는 골 촉진 인자의 방출, 울혈성 심부전을 치료하기 위한 심방 나트륨 이뇨 펩타이드와 같은 분자의 전신 방출, 혈우병 치료의 응고 인자의 방출, 또는 다양한 생물학적 활성 물질을 생성하는 조작된 또는 트랜스제닉(transgenic) 세포의 캡슐화가 포함된다.

하나 이상의 실시양태에서, "빈" 하이드로겔 마이크로입자는 또한 관절 윤활제 치료의 일부로서 투여될 수 있다. 다시 말해, 하이드로겔 자체의 존재는 입자 자체에 세포 또는 임의의 다른 활성제가 필요하지 않고 환자에게 치료적 완화를 제공한다.

본 발명의 조성물 및 마이크로입자의 특별한 이점은 이식될 때 알기네이트 또는 다른 유형의 마이크로입자와 비교하여 개선된 "점착성(stickiness)"이다. 즉, 마이크로입자는 생체 내 이식 부위에서 조직에 부착되거나 달라붙는 경향이 있으며, 이는 아래 실시예의 사진과 같다. 이는 이식 부위에서 세포, 세포 클러스터 및/또는 조직 및 이들의 세포 생성물의 국소 방출을 유지함으로써 치료 효과를 더욱 향상시킨다. 또한, 마이크로입자는 이식 부위에서 어떠한 염증 반응 및/또는 림프구 또는 콜라겐 고리 형성을 포함하는 어떠한 이물질 반응의 유도도 나타내지 않는다.

본 발명의 다양한 실시양태의 추가 이점은 본원의 개시 내용 및 하기 실시예를 검토할 때 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 기술된 다양한 실시양태는 본원에 달리 표시되지 않는 한 반드시 상호 배타적이지 않다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 일 실시양태에 기술되거나 묘사된 특징은 다른 실시양태에도 포함될 수 있지만 반드시 포함되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 특정 실시양태의 다양한 조합 및/또는 통합을 포함한다.

본원에 사용된 문구 "및/또는"은 2개 이상의 항목 목록에서 사용될 때 나열된 항목 중 임의의 하나가 단독으로 사용될 수 있거나 나열된 항목 중 2개 이상의 임의의 조합이 사용될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 조성물이 성분 A, B 및/또는 C를 함유하거나 배제하는 것으로 기술되는 경우, 조성물은 A만을 함유하거나 배제할 수 있거나; B만을 함유하거나 배제할 수 있거나; C만을 함유하거나 배제할 수 있거나; A와 B의 조합을 함유하거나 배제할 수 있거나; A와 C의 조합을 함유하거나 배제할 수 있거나; B와 C의 조합을 함유하거나 배제할 수 있거나; A, B 및 C의 조합을 함유하거나 배제할 수 있다.

본 기재 내용은 또한 수치 범위를 사용하여 본 발명의 다양한 실시양태와 관련된 특정 파라미터를 정량화한다. 수치 범위가 제공될 때, 그러한 범위는 그 범위의 하한값만 인용하는 청구항 한계뿐만 아니라 그 범위의 상한값만 인용하는 청구항 한계에 대해 문자 그대로 지원을 제공하는 것으로 해석되어야 함을 이해해야 한다. 예를 들어, 약 10 내지 약 100의 개시된 수치 범위는 "약 10 초과"(상한 없음)를 인용하는 청구항 및 "약 100 미만"(하한 없음)을 인용하는 청구항에 대해 문자 그대로 지원을 제공한다.

실시예

하기 실시예는 본 발명에 따른 방법을 제시한다. 그러나 이들 실시예는 예시의 목적으로 제공되며 그 안의 어떤 것도 본 발명의 전체 범위에 대한 제한으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다.

우리는 실시예에서 사용된 HA의 제형(들)이 3개월 미만의 기간에 걸쳐 분해된다는 것을 보여준다. 대조적으로, PEGDA의 제형은 더 내구성이 있다. 우리는 분해성 마이크로입자와 내구성 마이크로입자를 대조하여 이러한 방식으로 제조된 생성물의 특성을 비교한다. 이러한 비교에는 물리적 및 화학적 차이, 시험관 내 및 생체 내 안정성, 세포 형태, 최종 생성물 마이크로입자 내에서의 기능 및 이동, 및 생체 내 조직에 부착되어 신체 내 적용이 국소화되는 최종 생성물 마이크로입자의 능력이 포함된다.

실시예 1

내구성 하이드로겔 마이크로입자 대 분해성 하이드로겔 마이크로입자 최종 생성물의 물리적 및 화학적 차이

도입

세포 캡슐화의 개념은 1980년 Lim과 Sun에 의해 처음 대중화되었으며, 알기네이트 하이드로겔 마이크로입자에 내장된 췌도가 면역억제 없이도 단 몇 주 동안이라도 쥐의 당뇨병을 역전시킬 수 있음을 보여주었다. 이 초기 성공은 공정을 더 잘 이해하고 개선하기 위한 연구로 이어졌다. 이 분야에서 시간이 지남에 따라 큰 진전이 있었지만 알기네이트 미소구체는 악명 높게 계속 장기간의 생체 비호환성 문제가 있다. 그것의 한계에도 불구하고, 알기네이트는 독특하고 거의 즉각적인 가교결합 속도로 인해 세포 캡슐화를 위해 명확한 재료로서 지속적으로 선택되어 편리하고 입사 가능한 마이크로입자의 직접적인 제조를 가능하게 한다.

반대로, 다른 하이드로겔은 전형적으로 더 느린 가교결합 속도 때문에 벌크, 거시적 구조로만 제조할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜, 아가로스, 키토산 또는 히알루론산과 같은 대체 하이드로겔을 사용하여 미소구체를 생산하기 위한 일부 프로토콜이 개발되었다. 그러나 이러한 접근 방식은 비수성 용매에 대한 의존성과 열악한 공정 제어로 인해 일반적으로 세포 캡슐화 및 이식에 부적합한 오일 에멀젼 기술을 기반으로 한다.

세포 캡슐화의 응용 수와 정교화가 계속 증가함에 따라 첨단 생체 재료를 사용하여 편리하고 주입 가능한 생체 적합성 마이크로입자를 제조하는 능력이 확실히 유용할 것이다. 여기에서 2015년 6월 3일에 출원되고 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제9,642,814호에 기술된 코어-쉘 구형화(Core-Shell Spherification, CSS)라고 하는 하이드로겔 마이크로입자를 생성하는 새로운 방법이 테스트되었다. 이 방법은 알기네이트에 비해 겔화 속도가 훨씬 느린 하이드로겔과 함께 사용하도록 전략적으로 설계되어 다양한 화학적, 물리적 및 생리활성 특성을 가진 하이드로겔 마이크로입자를 생산할 수 있다. 추가로, 이 방법은 오일 에멀젼 기술을 사용하지 않으며 접근성, 규모 및 규정 준수를 더 용이하게 하기 위해 표준 GMP 준비 장비(GMP-ready equipment) 및 재료용으로 개발되었다. 우리는 두 가지 인기 있는 하이드로겔인 히알루론산(HA)과 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)를 사용하여 CSS를 통한 마이크로입자 생산을 시연한다.

방법

CSS 가교결합 절차의 세포독성

CSS 공정의 구성요소인 칼슘의 세포독성은 100mM 또는 200mM 염화칼슘, 10mM HEPES 완충액 및 20% PEGDA, MW 3,400Da(Laysan Bio, Inc.)를 포함하는 용액에 5분, 10분 또는 15분 동안 개의 췌도를 노출시켜 테스트하였다. 그룹을 또한 칼슘 단독의 효과를 평가하기 위해 PEGDA 없이 100mM 염화칼슘에 노출시켰다. 췌도는 캡슐화 과정과 관련된 높은 세포 로딩 밀도를 모방하기 위해 테스트 용액에서 약 5,000 IEQ/mL로 현탁하였다. 칼슘 노출 후 췌도를 보충된 CMRL 1066 췌도 배지로 두 번 세척한 다음 평가 전에 3시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 배양하였다.

프로피디움 아이오딘(propidium iodine) 염색과 형광 현미경을 이용하여 죽은 세포를 확인하였다. 형광 현미경 사진은 Cytation 5 이미징 다중 모드 판독기(Imaging Multi-Mode Reader)(Biotek Instruments, Inc, 531/647nm ex/em)로 캡처하였다. Adobe Photoshop을 사용하여 총 췌도 픽셀에 대한 적색(죽은) 픽셀의 비율을 계산하여 세포 사멸을 정량화하였다. 그룹당 25개의 개별 췌도를 분석하고 디티존 염색을 통해 췌도가 아닌 조직과 구별하였다. 결과는 평균 생존 세포 분율로 보고되고 매칭된 처리되지 않은 대조군(즉, 배양 배지에서 동일한 배치로부터의 췌도)의 췌도 생존력에 대해 정규화한다.

PEGDA 및 메타크릴레이트화 히알루론산(MeHA) 마이크로입자의 경우 광가교결합을 사용하였다. 따라서, 자외선(UV)과 광개시제의 독성에 대한 연구를 먼저 수행하였다. 개의 췌도를 0, 0.025 또는 0.05%(w/v)의 광개시제, IRGACURE® 2959를 함유하는 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS)에 현탁시켰다. 대략 50 IEQ를 24웰 플레이트의 웰에 로딩하고 3, 5 또는 10분 동안 장파장 자외선(UV) 빛을 조사하였다. 6인치 거리에서 PortaRay 400 UV 램프를 사용하여 플레이트를 조사하였는데, 이는 제조업체 데이터(Uvitron International)에 따라 대략 40mW/㎠에 해당한다. 노출 후, 췌도는 보충된 CMRL 1066 췌도 배지로 두 번 세척하였고 평가 전에 3시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 배양하였다. 프로피디움 아이오딘 염색을 통해 세포 사멸을 평가하고 이전 섹션에서 설명한 대로 정량화하였다.

MeHA 하이드로겔 마이크로입자의 제조

가교결합제의 무독성 수준이 결정되면 마이크로입자 생성을 시작하였다. 하이드로겔 마이크로입자 제조를 위한 CSS 공정의 일반적인 개략도는 도 2에 나와 있다. MeHA는 먼저 50:50의 물:DMSO 혼합물에서 트리에틸아민 및 tert-부틸 암모늄 브로마이드(Sigma)의 존재하에 5일 동안 HA(MW 1MDa, Lifecore Biomedical)를 50배 과량의 글리시딜 메타크릴레이트(Sigma)와 반응시켜 합성하였다. 그런 다음 MeHA를 2일 동안 탈이온수(DI)에 대해 투석한 다음 동결건조하였다. ¹H NMR(Avance AV-III 500, Bruker)을 이용하여 메타크릴레이트 양성자 대 메틸 양성자의 상대 피크 면적의 비율을 계산하여 메타크릴레이트화 정도를 54-72%로 측정하였다.

메타크릴레이트화 HA:PEGDA 중합체 블렌드(MW 3.4kDa, Laysan Bio, Inc)는 100mM 염화칼슘, 15mM HEPES 및 OptiPrep이 포함된 0.05%(w/v) IRGACURE® 2959(CosmoBioUSA, Inc.)를 함유하는 맞춤형 완충액(custom buffer)에서 2.5%:1% (w/w)로 제조하였다. 이 실시양태에서, 하이드로겔의 가교결합 밀도를 증가시키기 위해 가교결합제로서 MeHA 용액에 저농도의 PEGDA를 첨가하였다. 이 용액을 0.22마이크론 필터를 통해 통과시켰다. 전구체 용액의 점도는 실온에서 Cannon-Manning Semi-Micro 보정 유리 모세관 점도계로 측정하였다.

전구체는 자동화된 액적 생성기를 통해 300mM 만니톨, 0.1% Tween 20을 함유하는 0.15%(w/v) 알긴산나트륨(Protanal LF 10/60, FMC Corp.)의 교반 배스 내로 압출하고, 맞춤형 15mM HEPES 완충액을 사용하여 pH 7.6으로 조정하였다. MeHA 전구체의 경우, 0.05%(w/v) IRGACURE® 2959 개시제를 알기네이트 배스에 첨가하여 액적과 욕 사이의 IRGACURE®의 평형을 유지하고 액적에서 IRGACURE®의 침출을 최소화한다(가교결합을 줄일 수 있음). 1.5mm 동심 공기 노즐 내에 에어 제트 노즐 시스템 및 400마이크론 지름 내부 유체 노즐이 장착된 Buchi 395-Pro 캡슐화기(Buchi Corporation, Newcastle, DE)를 액적 생성에 사용하였다. 압축 질소를 사용하여 액적을 압출하였다. MeHA 액적은 하이드로겔 전구체 용액/액적 코어를 캡슐화하는 각각의 알기네이트 쉘을 갖는 코어-쉘 구조물을 형성하였다. 그런 다음 하이드로겔 전구체 용액/액적 코어에 장파장 UV광을 조사하여 MeHA 및 PEGDA의 자유 방사형 광가교결합을 시작하였다. 배스 중앙의 복사조도(irradiance)는 약 40mW/㎠(PortaRay 400, Uvitron International)였다. 코어-쉘 구조물에서 하이드로겔 코어의 완전한 가교결합을 보장하기 위해 전구체 용액의 압출 동안 및 압출 후 1분 동안 조사를 연속적으로 적용하였다. 다음으로 코어-쉘 구조물은 알기네이트 쉘을 용해시키기 위해 온화한 교반 하에 5분 동안 DPBS 중 25mM 시트레이트 완충제에 헹구었다. 생성된 마이크로입자는 강철 메쉬 스크린을 사용하여 수집하고 DPBS에 현탁시켰다. 50mM 시트레이트에서 5분 동안 두 번째 헹굼을 수행하여 알기네이트 쉘의 완전한 용해 및 제거를 보장하였다.

ThHA 하이드로겔 마이크로입자의 제조

ThHA 전구체는 용액 밀도를 조정하기 위해 100mM 염화칼슘 및 OptiPrep을 함유하는 맞춤형 완충액(CosmoBioUSA, Inc)에 1.2%(w/w)의 티올레이트화 HA(HyStem, Biotime Inc)를 용해시켜 제조하였다. 전구체 용액의 pH는 ThHA 마크로머의 디설파이드 가교를 감소시키기 위해 맞춤형 15mM HEPES 완충액을 사용하여 대략 7.0이 되도록 조정하였다. 용액 점도는 상술한 바와 같이 측정하였다. 코어-쉘 구조물이 상술한 바와 같이 생성되었다. 그러나 가교결합은 화학적 가교결합을 통해 달성되었다(MeHA 마이크로입자를 사용한 자유 라디칼 광가교결합). PEGDA 분자의 말단 아크릴레이트 그룹은 마이클 유형 첨가(Michael-type addition)를 통해 ThHA의 티올 그룹과 결합한다. 간단히 말해서, 전구체 용액은 ThHA 전구체 코어 및 알기네이트 배스와 접촉시 알기네이트 쉘을 갖는 코어-쉘 구조물을 생성하였다. 알기네이트 배스는 또한 가교결합제로 작용하는 0.4% PEGDA(MW 3.4 kDa, Laysan Bio, Inc)를 함유하였고 5분 동안 부드럽게 교반하였다. 배스와 하이드로겔 전구체 모두 가교결합제(예를 들어, PEGDA)를 함유할 수 있지만, 이 프로토콜에서는 바람직하게는 배스에만 포함된다. 가교결합은 알기네이트 쉘을 통해 코어로 더 작은 3.4 kDa PEGDA 분자의 확산을 통해 진행되었다. 이어서, 배스를 DPBS로 반으로 희석하여 용액 pH를 7.4로 감소시켰다. 교반을 추가 30분 동안 계속하여 코어 내에서 HA 전구체를 가교결합시켰다. 코어-쉘 구조물을 수집하고, 상술한 바와 같이 알기네이트 쉘을 제거하여 마이크로입자를 수득하였다.

PEGDA 하이드로겔 마이크로입자의 제조

PEGDA 하이드로겔 전구체 용액은 100mM 염화칼슘, 10mM HEPES 및 0.025%(w/v) IRGACURE® 2959를 함유하는 완충액에서 각각 18% 및 12%(w/w)의 PEGDA 3.4kDA 및 20kDa(Laysan Bio, Inc.)을 용해시켜 제조하였다. 이 용액을 0.22-마이크론 시린지를 사용하여 여과하고, 상술한 대로 점도를 측정하였다. 전구체는 MeHA 마이크로입자에 대해 0.025%(w/v) IRGACURE® 2959를 사용하여 교반된 알기네이트 배스 내로 압출하였다. MeHA 및 PEGDA 마이크로입자 제조를 위한 모든 용액은 초음파 처리에 의해 탈기된 물에서 제조하여 공지된 광가교결합 억제제 과잉 산소를 제거하였다. 코어의 가교결합을 달성하기 위해 코어-쉘 구조물을 상술한 바와 같이 조사하였다. 구조물을 상술한 대로 추가로 처리하여 알기네이트 쉘을 용해하고 하이드로겔 마이크로입자를 생성하였다.

AHA 하이드로겔 마이크로입자의 제조

먼저, 트리에틸아민 및 N-디메틸포름아미드(Sigma)의 존재하에 HA(MW 1MDa 또는 200kDa, Lifecore Biomedical)를 아크릴로일 클로라이드 및 글리시돌(TCI)과 5일 동안 반응시켜 AHA를 합성하였다. 그런 다음 AHA를 탈이온수(DI)에 대해 5일 동안 투석한 다음 동결건조하였다. ¹H NMR(Avance AV-III 500, Bruker)을 이용하여 아크릴레이트 양성자 대 메틸 양성자의 상대 피크 면적의 비율을 계산하여 아크릴레이트화 정도를 53-72%로 측정하였다. 그 다음 AHA 전구체 용액은 100mM 염화칼슘, 15mM HEPES 완충액 및 0.05%(w/v) IRGACURE® 2959를 함유하는 맞춤형 완충액에 아크릴레이트화 HA를 4%로 용해시켜 제조하였다. 전구체 용액을 0.22-마이크론 시린지를 사용하여 여과하고 점도를 상술한 대로 측정하였다. MeHA 입자의 경우 전구체를 교반된 알기네이트 배스 내로 압출하였다. 코어의 가교결합을 달성하기 위해 코어-쉘 구조물을 상술한 바와 같이 조사하였다. AHA 하이드로겔 마이크로입자를 수집하기 위해 상술한 바와 같이 시트레이트 완충제를 사용하여 알기네이트 쉘을 제거하였다.

하이드로겔 마이크로입자의 물리적 특성 및 크기 분포

Biotek Cytation 5 다중 모드 이미징 판독기를 사용하여 100개의 개별 마이크로입자의 이미지를 캡처하였다. PBS 중 다중 웰 플레이트에서 이미지화된 마이크로입자 및 이미지는 Adobe Photoshop으로 분석하여 각 마이크로입자 유형(N=100개의 마이크로입자)에 대한 평균 마이크로입자 지름 및 크기 분포를 결정하였다. 하이드로겔 마이크로입자는 건조 질량(mass)에 대한 팽창된 수화 질량의 비율인, 각 마이크로입자 유형에 대한 팽창 비율 "Q"를 측정하여 추가로 특성화되었다. 용해된 염을 제거하고 평형 팽창에 도달했는지 확인하기 위해 측정하기 전에 마이크로입자를 24시간 동안 과량의 탈이온수에 담갔다. 마이크로입자는 과도한 표면 수분을 제거한 다음 미리 칭량된 시계 접시(watch glass)에서 칭량하였다. 이어서, 마이크로입자를 60℃에서 밤새 건조하고 다시 칭량하여 건조 질량(N=3)을 얻었다.

마이크로입자의 확산 특성

이전에 발표된 절차에 따라 분자량이 10, 40, 70 및 500kDa(Invitrogen Molecular Probes)인 DPBS 중 FITC 표지된 덱스트란의 0.1mg/mL 용액에서 하이드로겔 마이크로입자를 밤새 인큐베이션하였다. 마이크로입자를 DPBS로 헹구고 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 통해 이미지화하여 프로브의 유출을 모니터링하였다(Olympus Fluoview 300). FITC-덱스트란 인큐베이션 용액에서 마이크로입자를 제거한 후 3분과 30분 사이의 설정 시점에서 현미경 사진을 캡처하였다.

기공 크기 계산

FEI Quanta 600F ESEM 기기에서 수행된 환경 주사 전자 현미경관찰법(ESEM)을 사용하여 빈 PEGDA 및 MeHA 마이크로입자를 검사하였다. 샘플은 SEM 챔버에서 온도가 6C로 설정된 냉각 단계의 물에 침지하였다. 그런 다음 챔버를 1000Pa로 비우고 상대 습도를 100%로 유지하였다. 이미지는 10,000X의 배율로 캡처하였다. 표준 SEM 이미지도 수집하였다. 이러한 이미지의 경우 샘플을 임계점 건조 또는 동결건조하고 10nm 백금으로 코팅하고 고진공 모드에서 동일한 ESEM 기기에서 5kV로 이미지화하였다. SEM 이미지는 1000X의 배율로 캡처하였다.

결과

코어-쉘 구형화 절차

하이드로겔 마이크로입자를 도 2에 요약된 CSS 방법을 통해 제조하였다. 이 공정은 알기네이트 배스에 닿을 때 알기네이트 쉘에 액적으로 포획된 천천히 경화되는 하이드로겔 전구체 용액(작용화 PEG 또는 HA)으로 시작하여 작용화 PEG 또는 HA가 경화되는 시간을 제공한다. 코어 마이크로입자 주위에 형성된 알기네이트 쉘은 동심원 고리-링크 형태를 특징으로 한다(도 3a). 후속적으로, 알기네이트 쉘이 제거되어 내부 코어 하이드로겔만 남게 된다(도 3b). 도 3b는 마이크로입자의 대부분이 구형인 형태를 나타낸다. 그러나 최종 생성물에는 다른 모양이 허용된다. 도 4는 허용 가능한 최종 생성물 특성의 추가 예를 제공한다. 도 4a는 완전히 구형인 개의 췌도 세포로 로딩된 더 느린 분해 프로파일의 더 내구성인(일명 오래 지속되는) PEGDA 기반 마이크로입자의 예를 제공한다. 도 4b는 췌도가 로딩되지만 길쭉한 형태; 3D 타원형 형태의 유사한 내구성 PEGDA 기반 마이크로입자를 도시한다. 도 4c는 왼쪽에 평평한 가장자리가 있는 줄기세포가 로딩된 더 빠른 분해 프로파일의 더 급속 분해형(일명 단기) MeHA 기반 마이크로입자를 도시한다. 도 4d는 같은 유형의 마이크로입자를 보여주지만 3D 타원형 형상이다. 눈물방울이나 달걀 모양과 같은 다른 관련 모양뿐만 아니라 이러한 모든 마이크로입자는 CSS 마이크로입자 최종 생성물의 기능적 예이다.

세포독성 연구

마이크로입자 제조 중 알기네이트 쉘이 여전히 존재하는 동안 코어의 겔화를 위해 가교결합이 필요하므로 쉘이 제거된 후에도 3차원의 자립 구조를 유지한다. CSS의 공정을 최적화하기 위해, 마이크로입자 제조 공정의 가교결합 구성요소를 새로 분산된 세포(개의 췌도)에 대한 세포독성 효과에 대해 평가하였다. 도 5a는 개의 췌도의 생존 가능성에 대한 칼슘 농도 및 노출 시간의 영향을 도시한다. 테스트된 세 가지 조건은 PEGDA가 있는 100 및 200mM 칼슘 또는 100mM 칼슘 단독이었다. 측정된 가장 짧은 노출 시간인 5분에서 세포독성의 유의한 차이가 어떠한 그룹에서도 관찰되지 않았다. 모든 그룹은 매칭된 처리되지 않은 대조군(배양 배지에서 동일한 배치의 췌도)과 비교하여 97.5% 초과의 생존력을 보였다. 그러나 5분 측정과 비교하여 각 후속 시점에서 200mM 칼슘 그룹에서 생존력의 현저한 감소가 나타났다. 200mM 칼슘 그룹의 생존력은 10분과 15분 모두에서 2개의 100mM 그룹보다 유의하게 낮았다. 10분 동안 100mM 그룹 모두에서 차이가 관찰되지 않았다. 그러나 15분에 PEGDA를 함유하는 100mM 그룹은 5분 및 10분 시점과 비교하여, 또한 15분에 PEGDA가 없은 100mM 그룹에 비교하여 생존력이 유의하게 감소하였다. 흥미롭게도, PEGDA가 없는 100mM 그룹에서 모든 시점에서 생존력의 유의미한 변화가 관찰되지 않았으며, 이는 대조군과 비교하여 15분에 97.6%가 생존하였다.

세포 생존력에 대한 광개시제 농도 및 UV광 노출 시간의 효과는 도 5b에 나와 있다. 개의 췌도를 0, 0.025 및 0.05%(w/v) 농도의 IRGACURE® 2959에서 3, 5 및 10분 동안 ~40mW/㎠의 장파장 UV 노출로 조사하고 세포독성을 평가하였다. 흥미롭게도, 광개시제(IRGACURE® 2959)를 함유하지 않은 그룹이 가장 높은 수준의 세포독성을 보였다. 0% 그룹의 생존력은 3분 노출 시간에 비해 5분과 10분에서 유의하게 낮았다. 추가로, 0% 그룹은 두 IRGACURE® 함유 그룹에 비해 5분 및 10분에 생존력이 현저히 낮았다. 0.025% 그룹과 0.05% 그룹 사이의 유일한 유의미한 차이는 10분에 있었고, 생존 세포 분율은 각각 94.5%와 87.2%였다.

하이드로겔 마이크로입자의 물리적 특성 및 크기 분포

새로운 CSS 플랫폼을 완전히 테스트하기 위해 HA와 PEGDA라는 두 가지 다른 출발 물질로부터 마이크로입자를 생성하였다. HA 생성은 CSS 플랫폼을 사용하여 화학적으로 가교결합된 하이드로겔과 광가교결합된 하이드로겔을 각각 평가하기 위해 티올레이트화 HA(ThHA)와 메타크릴레이트화 HA(MeHA)로 더 나눴다. 표 2는 가교결합 전과 후의 하이드로겔 제형의 물성, 평균 마이크로입자 지름 및 지름 범위를 나타낸 것이다.

겔 전구체의 전구체 질량 분율은 PEGDA의 경우 30%인 반면 ThHA 및 MeHA는 각각 1.2% 및 2.5% 용액으로부터 제조되었다. 높은 PEGDA 전구체 농도는 잘 형성된 마이크로입자를 형성하기에 적절한 용액 점도를 달성하는 데 필요하였다. 겔 제형 및 해당 전구체 점도는 표 2에 나와 있다. ThHA는 유일한 화학적 가교결합된 하이드로겔이었고 광 가교결합된 겔(MeHA 및 PEGDA)에 비해 가교결합에 훨씬 더 많은 시간(35분)이 필요하였다. 평균 지름은 MeHA 마이크로입자가 가장 컸고, PEGDA, ThHA 순이었고, ThHA는 다른 두 그룹보다 작았다. PEGDA 마이크로입자는 가장 낮은 평형 팽창 비율 "Q"를 나타냈는데, 이는 전체 하이드로겔이 더 조밀함을 나타낸다. 이것은 ThHA, MeHA, PEGDA 또는 AHA로 구성된 100개의 대표적인 마이크로입자의 지름을 플롯팅하고 특히 HA 물질에 대한 마이크로입자의 우수한 단분산성을 예시하는 도 6에 추가로 설명된다. ThHA 마이크로입자는 PEGDA 또는 MeHA보다 크기가 훨씬 작았고, 가교결합 전에 동일한 액적 생성 장비 및 파라미터를 사용하여 제조되었음에도 불구하고 PEGDA에 비해 지름 범위가 더 좁았다. 평균 MeHA 및 AHA 마이크로입자 지름은 4개 그룹 중 가장 컸다. 흥미롭게도, 췌도를 함유하는 PEGDA 입자는 약간 더 큰 평균 지름을 나타냈지만, 빈 PEGDA 마이크로입자에 비해 개선된 단분산도를 나타냈다(췌도가 있는 PEGDA의 경우 938μm[CV: 8.4%] 및 빈 PEGDA 마이크로입자의 경우 904μm[CV: 15.7%]).

마이크로입자의 확산 특성

도 7은 형광 표지된 덱스트란의 PEGDA, ThHA 및 MeHA 하이드로겔 마이크로입자로의 확산을 예시한다. 마이크로입자를 다양한 분자량의 형광 덱스트란에서 밤새 인큐베이션하고, 헹구고, 즉시 공초점 현미경으로 검사하여 덱스트란 침투 정도와 확산 특성의 척도로서 유출 속도를 평가하였다. 10kDa 프로브는 모든 마이크로입자를 관통할 수 있었다. 그러나 형광은 PEGDA 마이크로입자, 특히 구조물의 중심 근처에서 더 약했으며, 이는 둘 다 강한 형광을 나타낸 HA 마이크로입자에 비해 프로브의 더 낮은 침투율을 시사한다. 또한, 10kDa 프로브의 형광은 HA 그룹에서 빠르게 감소했으며, 헹구고 30분 후에는 없거나 거의 없었다. 대조적으로, 국소 형광은 30분에 PEGDA 그룹에서 여전히 관찰 가능했으며, 이는 다시 두 HA 겔에 비해 10kDa 프로브에 대한 더 높은 확산 장벽을 시사한다.

40kDa 프로브의 낮은 수준의 형광은 PEGDA 마이크로입자의 주변에서 감지되었지만 중앙에서는 거의 또는 전혀 신호가 관찰되지 않았으며, 이는 프로브에 대한 확산 장벽을 나타낸다(도 7). 더 큰 덱스트란(70 및 500kDa)은 PEGDA 마이크로입자에서 형광 신호를 거의 또는 전혀 나타내지 않았으며, 이는 이러한 프로브가 겔 매트릭스로 침투하는 것이 밤새 배양 기간 동안 무시할 수 있음을 시사한다.

ThHA 및 MeHA 마이크로입자는 평가된 모든 프로브에서 강한 형광을 나타내며, 이는 심지어 큰 분자에 대한 최소 확산 장벽을 시사한다. 또한, MeHA의 상대 형광 신호는 헹굼 직후 모든 프로브에 대해 ThHA에 비해 눈에 띄게 높게 나타났으며, 이는 프로브의 농도가 높을수록 확산 장벽이 훨씬 더 낮음을 시사한다. 이것은 ThHA 마이크로입자로 적당히 주입되지만 MeHA 마이크로입자에서 포화된 것으로 보이는 70kDa 프로브에 의해 가장 잘 예시될 수 있다. 모든 추가 연구는 각각 가장 큰 확산 장벽과 가장 작은 확산 장벽인 PEGDA 및 MeHA를 갖는 하이드로겔 제형에 초점을 맞췄다.

논의

우리는 세포 캡슐화 및 전달을 위한 하이드로겔 마이크로입자를 제조하는 새로운 방법을 개발하고 평가하였다. 세포 마이크로캡슐화를 위한 현재 방법은 빠른 겔화 속도 때문에 주로 알기네이트 구체를 기반으로 한다. 마이크로캡슐화에 사용되는 다른 하이드로겔에는 혹독한 오일 에멀젼 기술이 포함된다. 대신 CSS 방법은 다양한 하이드로겔 재료에 사용할 수 있으며 표준, 상업적으로 이용 가능한 GMP 준비 장비와 호환되며 췌도에 대한 세포독성이 최소화된다.

낮은 세포독성은 세포 캡슐화 전략에 중요한 기능이다. 따라서, 우리는 췌도에 대한 세포독성 효과에 대해 CSS 방법의 주요 구성요소, 특히 칼슘 함량 및 UV 노출을 평가하였다. 당연히 200mM 칼슘은 빠르게 세포독성을 나타낸다. 그러나 우리는 췌도가 고농축 및 점성 PEGDA 용액에서도 적어도 10분 동안 100mM 칼슘을 견딜 수 있음을 발견하였다. 40mW/㎠의 장파장(~365nm) UV광 노출은 최대 10분 동안 개의 췌도에 최소한의 세포독성을 보였다. 예상외로, 광개시제가 없는 그룹은 다른 유사한 연구와 달리 UV 노출 후 가장 많은 세포 사멸을 보였다. 그러나 이러한 다른 연구에서는 4-10mW/㎠ 사이의 훨씬 더 낮은 UV 강도를 사용했으며, 여기에서 사용된 광개시제 농도는 비교적 낮았다. 따라서, 우리의 실험에서 광개시제는 아마도 UV 광자의 우선적인 흡수를 통해 보호 효과를 제공했을 가능성이 있다. 그럼에도, IRGACURE® 2959를 함유하는 그룹에서 세포독성의 농도 의존적 증가가 여전히 관찰되었으며, 이는 이전에 발표된 연구와 일치한다.

동일한 400마이크론 노즐 시스템을 사용하여 제조되었음에도, 마이크로입자는 크기가 상당히 달랐으며 MeHA 비드는 ThHA 비드 지름의 거의 두 배이며, 이는 마이크로입자당 총 부피의 약 8배 차이에 해당한다. 그룹 간의 크기 차이는 제조 후 부피 팽창 역학의 차이의 결과일 가능성이 가장 높다. 하이드로겔 팽창은 여러 변수의 영향을 받지만 중합체의 초기(즉, 사전 가교결합된) 농도 및 제조 후 겔 내의 가교결합 밀도와 강한 상관관계가 있다. 더욱 구체적으로, 겔 중합체 매트릭스에 흡착된 용매 분자(예를 들어, 물)는 외부 압력을 가하여 겔을 확대(팽창)하게 하는 반면, 겔 매트릭스의 가교결합은 외부 팽창에 저항한다. 예를 들어, 초기 중합체 농도가 높고 가교결합 밀도가 낮은 하이드로겔은 제조 후 부피가 크게 팽창할 것으로 예상된다. 반대로, 중합체 농도에 대한 가교결합 비율이 높은 젤은 제조 후 팽창에 저항하는 경향이 있다. 우리 연구에서, ThHA 마이크로입자의 더 작은 최종 크기는 아마도 상대적으로 높은 가교결합 밀도와 결합된 낮은 초기 중합체 분율(1.2%)의 결과일 것이다. 제조 후 부피 팽창은 팽창 비율 "Q"(수화 질량/건조 질량)와 혼동되어서는 안 된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 특히, Q는 부피 팽창이 평형에 도달한 후의 최종 겔 구조를 설명하며, 여기서 낮은 Q 값은 일반적으로 더 강하고 더 조밀한 겔을 나타낸다. 따라서, 겔이 상당한 부피 팽창을 경험할 수 있지만 이 연구에서 PEGDA 마이크로입자의 경우인 것으로 보이는 비교적 낮은 Q 값을 여전히 가질 수 있다. 대조적으로, ThHA 마이크로입자는 PEGDA 마이크로입자에 비해 상대적으로 부피 팽창이 적었고(존재한다면) Q 값은 더 컸다. 또한, MeHA 마이크로입자는 초기 중합체 농도가 낮음(3.5%)에도 크게 팽창하고 Q 값이 높았는데, 이는 상대 가교결합 밀도가 매우 낮음을 나타낸다.

확산 특성은 마이크로입자 그룹 간에 상당히 달랐다. ThHA 및 MeHA 마이크로입자는 최대 500kDa 크기의 덱스트란 프로브에 대해 더 투과성이었으며 MeHA 마이크로입자는 세 그룹 모두에서 가장 높은 확산성을 갖는 것으로 나타났다. 반대로, PEGDA 입자는 MW 40kDa 이상의 덱스트란의 확산을 강력하게 제한하는 것으로 나타났다. 다양한 요인이 겔의 확산성에 영향을 미칠 수 있지만, 팽창 비율 "Q"(겔의 건조 질량에 대한 평형 수화 질량의 비율)는 하이드로겔의 투과성과 강한 상관관계가 있다. PEGDA, ThHA 및 MeHA 마이크로입자는 Q 값이 각각 17.3, 27.7 및 105.7이었다. 따라서, 마이크로입자에서 관찰된 덱스트란 프로브의 확산 거동은 해당 Q 값 및 측정된 표면 기공 크기와 일치한다.

실시예 2

내구성 하이드로겔 마이크로입자 및 급속 분해형 하이드로겔 마이크로입자 최종 생성물의 안정성

도입

내구성 하이드로겔 마이크로입자 대 급속 분해형 하이드로겔 마이크로입자의 설명은 마이크로입자의 물리적 구성 안정성에 따라 다르다. 세 가지 제형(PEGDA, MeHA 및 AHA) 간에 차이가 있는지를 결정하기 위해 시험관 내 및 생체 내 안정성 연구를 모두 수행하였다. CSS 공정은 다양한 속도로 분해되도록 하이드로겔의 세부 조정을 제공하지만, 다음은 더 빠르게 분해되는 하이드로겔에 비해 수 개월에서 수 년 동안 지속될 수 있는 두 개의 내구성 하이드로겔의 예를 제공한다.

방법

시험관 내 내구성 테스트

MeHA, PEGDA 및 AHA의 경우 수화된 마이크로입자 1.000g을 수집한 다음 1% 젠타마이신(gentamycin)이 함유된 10mM HEPES 완충 인산염 완충 식염수로 구성된 분해 완충액에 넣었다. 분해 용액을 pH 7.3 +/- 0.10으로 유지하였다. 용액 내 마이크로입자를 37℃에서 1, 3, 6주 동안 보관한 다음 수집하고 60℃에서 밤새 건조하여 분해 후 건조 질량을 얻었다. 분해 후 건조 질량은 질량 손실 백분율을 결정하기 위해 0일째에 마이크로입자의 건조 질량과 비교하였다. 또한, 분해와 함께 겔 강도를 평가하기 위해 각 시점에서 팽창 비율을 측정하였다.

생체 내 내구성 테스트

개의 췌도 분리

개의 췌도는 장기 기증에 대한 소유자의 동의와 함께 지역 동물 병원의 안락사 기증자로부터 지역적으로 얻은 췌장에서 분리되었다. 조달 및 분해(digestion) 프로토콜은 이전에 자세히 공개되었다. 기관의 제거 및 세척 후, 콜라게나아제 분해에 이어 밀도 구배 정제를 표준 공개 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 분리된 췌도는 공개된 표준 프로토콜에 따라 디티존 염색을 통한 정량화 목적을 위해 췌도 등가물 또는 "IEQ"로 변환되었다. 개의 췌도는 37℃ 및 5% CO₂에서 10% 소 태아 혈청, 2mM 글루타민, 10mM 니코틴아미드 및 1% 항생제-항진균 용액이 보충된 CMRL 1066에서 배양되었다.

캡슐화된 췌도 이종이식

당뇨병을 유도하기 위해 스트렙토조토신(streptozotocin)(STZ, 220-250 mg/kg)으로 처리된 면역결핍 NOD/SCID 마우스(NOD.CB17-Prkdc ^scid , Jackson Laboratory)를 CSS를 통해 캡슐화된 개의 췌도의 기능적 능력을 평가하는 데 사용하였다. 6마리의 마우스는 PEGDA에 캡슐화된 췌도를 투여받았고, 2마리의 마우스는 PEGMAL 내 췌도를 투여받았고(아래 합성 절차), 4마리의 마우스는 MeHA에 캡슐화된 동일한 용량의 췌도를 투여받았다. 대조군으로서 캡슐화되지 않은 췌도의 등가 용량으로 2마리의 마우스를 이식(IP)하였다. 연구 10주째에 MeHA 캡슐화된 췌도를 투여받은 모든 마우스는 고혈당이었고 캡슐화되지 않은 췌도 그룹과 함께 종료하였다. PEGDA 그룹의 4마리 마우스도 후속 조직학 연구를 위한 비교 역할을 위해 10주째에 종료하였다. 나머지 2마리의 PEGDA 마우스는 추가 6주 후에 종료하였다. 2마리의 PEGMAL 마우스에 대한 모니터링이 진행 중이다(이식 후 16주 이상).

췌도 캡슐화된 마이크로입자의 내구성 PEGDA 및 급속 분해형 MeHA 제형은 개의 췌도 세포가 전구체에 혼합된 것을 제외하고는 상술한 대로 제조하였다. 화학적으로 가교결합된(즉, 비-UV) 내구성 PEGMAL 제형은 상술한 ThHA 마이크로입자와 유사한 스킴에 따라 제조하였다. 간단히 말해, 25%(w/w) 8-암 40kDa PEGMAL(JenKemUSA) 및 개의 췌도로 구성된 하이드로겔 전구체를 0.25%(m/v) (BiochemPEG) 농도의 1kDa SH-PEG-SH 가교결합제를 함유하는 pH 6.6 알기네이트 배스로 압출하고 5분 동안 교반하였다. 5분 후, 가교결합 알기네이트 배스를 HEPES 완충 췌도 매질로 ~7.2의 최종 pH로 절반으로 희석하고 추가로 30분 동안 교반하여 하이드로겔 코어가 완전히 가교결합하도록 하였다. 기술된 대로 알기네이트 쉘을 제거하였다.

췌도 함유 마이크로입자를 18G 카테터(catheter)를 통해 마우스의 복강내(IP) 공간에 투여하였다. 췌도 용량은 마우스당 대략 4000개의 췌도 등가물이 정상 혈당을 유발하고 마우스로 이식된 개의 췌도의 이전 간행물과 일치함을 보여주는 이전의 용량 증가 연구를 기반으로 하였다. 혈당 수치는 모든 마우스에 대해 이식 후 14일 동안 매일, 그 후 격주로 측정하였다.

동물의 종료시(10주 및 16주), 췌도 함유 마이크로입자를 IP 공간에서 회수하고 평가를 위해 배양 배지에 두었다. 췌도 함유 마이크로입자를 인슐린의 존재를 검출하기 위해 디티존으로 염색하고, 외식 조직의 세포 생존력을 평가하기 위해 칼세인(살아 있는 세포) 및 프로피디움 요오다이드(아폽토시스/괴사 세포)로 염색하였다. 염색된 마이크로입자의 색상, 명시야 및 형광 이미지를 Cytation 5 이미징 다중 모드 판독기(Biotek Instruments, Inc.)를 사용하여 캡처하였다.

마이크로입자가 부착된 복막으로부터 췌장 및 조직 샘플을 제거하고 PBS로 옮기기 전에 10% 중성 완충 포르말린에서 밤새 고정하였다. 조직을 파라핀 블록에 끼워 넣고 염색을 위해 적절하게 절편화하였다. 헤마톡실린/에오신(H&E) 염색의 경우, 절편을 Clear Rite3 용액에 각각 3분 동안 3회 배치한 후 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하기 전에 후속 탈수 및 재수화 단계를 거쳐 연속적으로 파라핀을 제거하였다. 섹션을 물로 헹군 후 수돗물로 헹구면서 블루 시약(Blueing Reagent)을 적용하였다. 섹션을 최종적으로 100% 무수 알코올과 Clear Rite 3에 담가 색상 안정성을 개선하고 그에 따라 커버 슬립을 적용하였다. BioTek Cytation 5 세포 이미징 다중 모드 판독기에서 슬라이드를 검사하고 이미지를 캡처하였다.

캡슐화된 췌도 동종 이식물

최근에 당뇨병 진단을 받은 두 마리의 성견 수컷에게 내구성 PEDGA 또는 급속 분해형 MeHA(N=1/그룹)로 캡슐화된 개의 췌도 이식물을 투여하였다. 개의 췌도의 캡슐화는 이전에 설명한 프로토콜을 따랐다. 각각의 개는 카테터 직접 주입을 통해 복막으로 전달된 대략 60mL의 포장된 마이크로입자로 구성된 이식물을 투여받았다. 개는 이식 후 처음 20일 동안 매일 체중과 혈당에 대해 모니터링하였다.

결과

시험관 내 분해

MeHA, PEGDA 및 AHA 마이크로입자를 37℃에서 1, 3 또는 6주 동안 HEPES 완충 분해 용액에 넣은 다음 건조하여 건조 중합체 질량을 측정하였다. 분해 6주 후 MeHA 마이크로입자는 시작 질량의 24%만 유지한 반면 PEGDA와 AHA는 각각 37%와 53%를 유지하는 것으로 나타났다(도 8a). PEGDA는 상당한 양의 질량을 상실했지만(도 8c), 팽창 비율의 변화가 없는 것으로 주목되듯이 6주 동안 겔 강도를 유지하였다(도 8b). 대조적으로, MeHA 및 AHA 마이크로입자는 팽창 비율의 급격한 증가를 보여 마이크로입자가 분해됨에 따라 겔 강도의 현저한 감소를 나타냈다. PEGDA 기반 마이크로입자와 HA 기반 마이크로입자 사이의 겔 강도의 변화는 가교결합 밀도와 고분자 화학 모두에 기인할 수 있다. PEGDA 마이크로입자의 경우, 중합체 쇄는 HA 마이크로입자에 비해 더 높은 가교결합 밀도에서 여러 공유 결합을 통해 단단히 함께 유지된다. 또한, PEGDA 중합체 쇄는 소수성 부분의 일부 영역을 포함한다. 가교결합 밀도와 소수성 영역은 모두 마이크로입자로의 물 확산 속도를 마이크로입자 표면에서 발생하는 가수분해성 분해 속도보다 느리게 만든다. 당연히, 분해가 표면에서만 발생하면 내부 겔 네트워크가 손상되지 않고 겔 강도가 보존된다. 그러나 MeHA 및 AHA 마이크로입자에서 가교결합 밀도는 훨씬 낮고 중합체 화학은 PEGDA에 비해 더 친수성 구조를 생성한다. HA 마이크로입자의 더 낮은 가교결합 밀도와 친수성은 모두 마이크로입자로의 더 높은 물 확산 속도를 촉진하여 벌크 분해 메커니즘을 초래한다. 벌크 분해에서 물은 하이드로겔 네트워크 깊숙이 침투하여 겔 네트워크의 무결성을 손상시키는 가수분해성 분해를 초래한다. 이러한 유형의 분해는 AHA 마이크로입자가 분해 6주 후에 남아 있는 PEGDA보다 중합체 질량이 더 높은 이유를 설명할 수 있다. HA 마이크로입자에서 시간이 지남에 따라 겔 강도가 손실되는 것은 가수분해성 분해가 일어나고 있지만 분해 생성물이 아직 겔 네트워크 밖으로 확산되지 않았음을 나타낸다. 이 경우 중합체가 겔 네트워크 내부에 있지만 더는 하이드로겔 무결성에 기여하지 않기 때문에 남아 있는 중합체 질량으로 분해 정도를 정확하게 평가할 수 없다.

당뇨병 마우스에서 개의 췌도 로딩된 마이크로입자의 기능

PEGDA 또는 MeHA로 캡슐화된 개의 췌도를 당뇨병 NOD/SCID 마우스에 이식하였다. 대조군에는 캡슐화되지 않은 췌도를 이식하였다. 도 9는 이식 후 초기 연구 코호트 동안 각 그룹에 대한 평균 일일 혈당 수준을 보여준다. MeHA, PEGMAL 및 PEGDA 그룹의 모든 마우스는 이식 후 두 번째 주까지 정상 혈당이었다. 그러나 급속 분해형 MeHA 마이크로입자를 투여받은 동물은 외인성 인슐린 요법의 재도입에도 불구하고 점차적으로 고혈당 수준(이식 후 약 3주부터 시작)으로 돌아왔다. 이들 마우스를 대략 10-11주에 안락사시켰다. 내구성 PEGDA 및 PEGMAL 캡슐화된 췌도를 투여받은 마우스는 외인성 인슐린 없이 우수한 혈당 조절로 연구 기간 동안 정상 혈당을 유지하였다(PEGMAL 진행, 16주).

대조적으로, 캡슐화되지 않은 췌도를 투여받은 모든 마우스는 어떤 시점에서도 지속적인 정상 혈당을 달성하는 데 실패하였다. 이 마우스의 초기 평균 혈당은 이식 전 386±23mg/dL이었고 이식 당일 혈당은 494±61mg/dL이었다. 다른 두 그룹과 같은 부피의 췌도를 이식한 후, 동물 중 한 마리는 2일째에 혈당 수치가 한 번만 정상인 반면, 다른 마우스는 19-30일 동안 혈당 수치가 변동했지만 그 후로 연구의 나머지 기간 동안 일관되게 고혈당 수준으로 되돌아갔다.

부검 시, 마우스의 IP 공간에서 마이크로입자를 회수하였다. 그 결과를 도 10a 내지 d에 나타냈다. 췌도 함유 내구성 PEGDA 마이크로입자는 약 10주에 쉽게 회수되었지만 급속 분해형 MeHA 마이크로입자는 수가 적고 식별하기 어려웠다. 회수된 PEGDA 마이크로입자의 샘플은 IP 공동 전체에 무작위로 분산되어 투명하고 구조적으로 손상되지 않은 채로 발견되었다. 회수된 PEDGA 마이크로입자는 분해의 징후가 거의 또는 전혀 나타나지 않았으며(즉, 매끄러운 가장자리, 크기의 명백한 변화 없음, 기계적으로 안정), 이식된 세포는 여전히 마이크로입자 내에 포함되어 있었다(도 10a). 대조적으로, 급속 분해형 MeHA 마이크로입자는 모양이 변형되었고 지름이 작아져서 상당한 하이드로겔 분해를 나타냈다. MeHA 마이크로입자는 온전한 췌도를 함유하지 않는 것으로 보였다(도 10b). 나중 시점(16주)에 내구성 PEDGA 마이크로입자는 부검 시 계속해서 쉽게 회수할 수 있었다. PEGDA 마이크로입자 내의 췌도를 디티존, 칼세인 및 프로피디움 요오다이드(PI)로 염색하여 살아있는 기능성 췌도의 존재를 확인하였다.

이식 후 약 16주에 회수된 PEGDA 마이크로입자는 짙은 적색 디티존 염색에 의해 확인된 건강하고 생존 가능한 췌도를 포함하였다(도 10c). 동일한 췌도는 살아있는 세포에 대한 공통 지표인 녹색 칼세인으로 공동 표지되었다(도 10d). 일부 양성 PI 염색(적색; 아폽토시스/괴사 세포)이 관찰되었지만 일반적으로 회수된 마이크로입자의 표면에 부착된 것으로 보이는 비-췌도(즉, 디티존 음성) 조직에 국한되었다. 반대로, 췌도(디티존-양성 세포)는 PI(죽은 세포) 염색이 거의 완전히 없었다(도 10d).

내구성 PEGDA 마이크로입자는 간 및 복벽과 같은 조직에 부착되는 것으로 밝혀졌지만 일반적으로 부착되지 않고 공동에서 자유롭게 떠 있었다. 이식 부위의 조직학은 PEGDA 마이크로입자의 위치를 확인하였다. 조직학 처리 방법이 PEGDA 마이크로입자의 완전성을 파괴한 반면, 부착 부위에는 명백한 조직이 없었다. 도 11은 2개의 마이크로입자와 교차하는 건강한 지방세포를 도시하고, 마이크로입자의 위치는 짙은 선으로 표시하였다. 각 마이크로입자 위치의 중앙에 있는 청회색 필름은 처리 후 남은 하이드로겔이다. 대조적으로, MeHA 그룹의 조직학 섹션에서는 겔 물질을 확인할 수 없었다. PEGDA 그룹의 경우 마이크로입자-망막 경계면에서 섬유화가 일반적으로 부족하였다. PEGDA 처리된 마우스에서 정상화된 혈당값이 스트렙토조토신 처리 후 췌장 내에 남아 있는 내인성 췌도가 아니라 이식편 이식으로 인한 것임을 확인하기 위해 췌장의 조직학적 섹션에서 췌도의 존재를 검사하였다. 마우스당 6개의 췌장 섹션에서 단 하나의 췌도 유사 구조가 확인되었다(결과는 표시하지 않음).

두 마리의 당뇨병 개에 이식된 개의 췌도를 사용하여 유사한 연구를 완료하였다. 동물은 이식 전에 당뇨병이 있었고 정기적으로 외인성 인슐린을 투여받지 않았다. 한 마리는 내구성 PEGDA 마이크로입자로 캡슐화된 개의 췌도를 투여받았고, 다른 한 마리는 분해성 MeHA 하이드로겔로 캡슐화된 개의 췌도를 투여받았다. 도 12는 매일 아침과 오후에 측정한 평균 비공복 혈당을 나타낸다. 내구성 하이드로겔을 투여한 개는 서서히 정상 범위 내의 낮은 혈당 수준(실선)으로 되돌아갔고 실험 기간(8주) 동안 정상 수준을 유지하였다. 대조적으로, 급속 분해형 하이드로겔을 투여받은 동물은 이식 후 20일 이내에 서서히 완전한 당뇨병 병태로 복귀하였다(점선).

논의

흥미롭게도, 두 마우스 그룹 모두 마이크로입자의 IP 주입 후 정상 혈당을 달성한 반면, 이식 부위에서 동일한 용량의 캡슐화되지 않은 췌도는 정상 혈당을 달성하지 못했다. 동물 모델에는 면역이 손상된 마우스가 포함되어 있기 때문에 결과는 하이드로겔 매트릭스가 특히 IP 공동으로의 주입을 통한 이식의 맥락에서 더 나은 세포 기능과 생존을 촉진하는 물리적 지원 환경을 제공함을 시사한다. 이 결론은 고혈당증으로의 동시 복귀와 함께 시간 경과에 따른 MeHA 마이크로입자의 분해 관찰에 의해 더욱 확증되었다. 추가로, 구조적으로 더 강력한 PEGDA 및 PEGMAL 췌도 마이크로입자는 MeHA 그룹에서 고혈당증이 재발하기 전 이식 전후 기간에 MeHA 이식물에 비해 혈당 수준을 더 잘 제어하였다.

개를 대상으로 한 연구에는 두 마리의 동물만 포함되었지만, 그 결과는 면역이 저하된 마우스와 면역이 있는 개의 반응 차이를 대조하기 때문에 중요하다. 온전한 개의 면역 시스템을 사용하면 더 약한 하이드로겔(MeHA)이 더 빨리 분해되어 고혈당 혈당 수준으로 더 빨리 복귀한다. 결과는 분해성 하이드로겔 마이크로입자의 이러한 특정 제형이 종에 따라 생체 내 지속시간이 대략 수일에서 수주라는 것을 보여준다. 그러나 내구성 하이드로겔 마이크로입자는 적어도 2개월의 생체 내 지속 시간을 보여주었다.

실시예 3

내구성 마이크로입자 대 급속 분해형 마이크로입자 최종 생성물의 비드 내 증식

도입

세포 캡슐화제의 물리적 및 화학적 특성의 조작은 시험관 내 조직 공학 연구를 위한 강력한 도구가 되었다. 미세 환경의 기계적 및 화학적 특성은 다양한 세포 유형의 거동을 변경하는 것으로 알려져 있지만 가장 현저하게 줄기세포는 세포를 둘러싼 기계적 특성에 의해 영향을 받는다. 하이드로겔 내에서 계속해서 증식하는 줄기세포의 능력은 외상으로 인한 연조직 결함의 치료적 치료 또는 외과적 개입에 대한 이차적 치료를 위한 중요한 특성이다. 예를 들어, 근육 또는 피부 외상은 증식하는 줄기세포와 함께 국소적으로 전달된 마이크로비드의 이점을 얻을 수 있다. 이것은 마이크로입자에 있는 동안 세포 수가 계속 증가할 것이기 때문에 더 적은 양의 마이크로입자를 초래할 것이다. 그러나 모든 하이드로겔이 마이크로입자 내에서 세포가 증식하는 것을 허용하는 것은 아니다. 여기에서 우리는 급속 분해형 하이드로겔 마이크로입자가 마이크로입자 내에서 강력한 세포 증식을 허용한다는 것을 보여준다.

방법

인간 배아 신장 세포(HEK293)를 고 포도당 및 소 태아 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배양하였고 인큐베이터에서 5% CO₂와 함께 37℃로 유지하였다. 세포가 적절한 밀도에 도달하면 0.5% 트립신-EDTA를 2분 동안 첨가하여 배양 플라스크에서 세포를 분리하였다. 세포가 분리되면 성장 배지로 옮겼다. 하이드로겔 내에서 증식하는 세포의 능력을 테스트하기 위해 상술한 CSS 제조 공정을 사용하여 두 가지 유형의 하이드로겔 중합체, 즉 급속 분해형 MeHA 및 내구성 PEGDA를 마이크로입자로 제조하였다. 동일한 양의 중합체 전구체(1mL)를 동일한 수의 증식하는 인간 배아 신장 세포(HEK293; 4백만 개의 세포)와 혼합한 다음, 앞서 기술한 방법을 사용하여 마이크로입자를 형성하였다. 마이크로입자를 3주 동안 배양 조건 하에 보관하였다. 마이크로입자 내 세포의 증식을 평가하기 위해 BioTek Cytation 5 세포 다중 모드 판독기를 사용하여 34일 동안 이미지를 캡처하였다.

결과

마이크로입자의 제형화 시, 하이드로겔에 따라 세포 형태 및 마이크로입자 내 분포가 독특함을 주목하였다. 초기에, HEK293 세포는 내구성 PEGDA 마이크로입자에서 함께 클러스터링되었다(도 13a). 대조적으로, 동일한 밀도로 로딩된 동일한 세포는 분해성(MeHA) 마이크로입자에서 단일 세포로 남아 있었다(도 13c).

시간이 지남에 따라 PEGDA 마이크로입자의 형태나 세포 수에는 거의 변화가 없었다(도 13b). 대조적으로, 분해성 MeHA 마이크로입자 내의 세포는 배양 34일 후에 볼 수 있는 바와 같이 하이드로겔 내에서 증식하여 마이크로입자 내에 큰 클러스터를 생성하였다(도 13d). 클러스터는 MeHA 비드의 표면에서 돌출되거나 표면에 부착되는 것으로 보이지 않았지만 비드 매트릭스에 캡슐화된 상태로 유지되었다. 그러나 내구성 PEGDA 마이크로입자 내의 동일한 세포는 PEGDA 비드 내부에서 빠르게 증식하지 않거나 증식하는 세포 클러스터를 형성하지 않았다.

논의

최종 생성물 형태의 마이크로입자는 마이크로입자 내 세포의 증식을 차단하거나 허용한다. 여기에 제시된 데이터를 통해 우리는 내구성 하이드로겔이 세포 증식을 차단하는 반면, 더 부드러운 급속 분해형 MeHA 하이드로겔은 배아 세포의 상당한 증식을 허용한다는 것을 알았다. 또한, 사용된 제형에 따라 세포의 형태가 변경되었다. 이것은 증식하는 세포와 증식하지 않는 세포를 캡슐화할 때 중요할 수 있으며 CSS 기술을 사용하여 조정할 수 있다.

실시예 4

내구성 마이크로입자 대 분해성 마이크로입자 최종 생성물에서의 세포 이동

도입

일부 치료 사례에서, 세포 또는 그 생성물이 마이크로입자 밖으로 이동하는 것은 치료의 중요한 측면이다. 예를 들어, 내인성 줄기세포 또는 전구 세포는 정상적인 발달 동안 및 또한 뇌 손상 또는 질병과 같은 병리학적 조건 하에서 뇌로 이동하는 것으로 나타났다. 일부 연구에서는 원래의 줄기세포가 복구를 돕기 위해 손상 부위로 실제로 이동하거나 "혼(hone)"한다고 시사하였다. 그러나 대부분의 연구는 손상되지 않은 조직의 줄기세포 수를 측정하는 대조군이 있을 때 그러한 주장을 입증하는 데 실패하였다.

따라서, 세포가 조직의 복구를 돕기 위해서는 오랫동안 해당 부위에 국한되어야 한다. 캡슐화되지 않은 줄기세포를 한 영역에 배치하는 치료 관행은 세포가 작고 신속하게 해당 지역 밖으로 확산되거나 면역 시스템의 공격을 받기 때문에 어려움이 따른다. 따라서, 특정 영역으로 세포의 제어 방출을 허용하는 국소 접근은 큰 치료 이점이 있을 것이다. 여기에서 우리는 분해성 마이크로입자의 이러한 특성을 입증한다.

방법

세 가지 유형의 하이드로겔 중합체 MeHA, AHA 및 PEGDA는 상술한 CSS 제조 공정을 사용하여 마이크로입자로 제조하였다. 인간 배아 신장 세포(HEK293)는 고 포도당 및 소 태아 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배양하였고 인큐베이터에서 5% CO₂와 함께 37℃로 유지하였다. 래트 골수 줄기세포(rat bone marrow stem cell, rBMSC)를 고 포도당 DMEM, 소 태아 혈청 및 Glutagro에서 배양하였다. 세포가 적절한 밀도에 도달하면 0.5% 트립신-EDTA를 2분 동안 첨가하여 배양 플라스크에서 세포를 분리한다. 세포가 분리되면 성장 배지로 옮겼다. 동일한 양의 중합체 전구체(1mL)를 동일한 수의 HEK293 세포 또는 rBMSC(4백만 개)와 혼합하여 비드를 형성하였다.

마이크로입자로부터의 세포 이동의 양을 평가하기 위해, 규정된 시점에서 마이크로입자를 배지로부터 제거하고 스크린 상에서 세척하였다. 세척 매질 및 마이크로입자 주변의 매질을 수집하였다. 세포는 Cytation 5 이미징 다중 모드 판독기(Biotek Instruments, Inc.) 및 EVE 세포 계수기를 사용하여 계수하였다.

결과

도 14는 캡슐화 4일 후 개별 세포가 있는 세척 매질과 함께 수집된 폐 배지가 있는 웰의 전형적인 이미지를 제공한다. PEGDA 하이드로겔에 캡슐화된 HEK293 세포의 배지에서 소수의 세포가 계수되었고, 그 중 많은 세포가 사멸(적색)되었다(도 14a). 대조적으로, 분해성 하이드로겔은 도 14b에서 웰에 남겨진 많은 수의 살아있는 세포(녹색)에 의해 나타난 바와 같이 많은 수의 살아있는 세포의 방출을 허용하였다. 그러나 이러한 세포 수는 2주차에 축적된 세포 방출에 비해 작았다.

도 15는 누적 세포 방출에 대한 연구로부터의 평균 데이터를 요약한다. 배양 첫 6일 동안 비드에서 몇천 개의 세포만 방출되었다. 14일까지 급속 분해형 MeHA 마이크로입자에 의해 2천만 개 이상의 세포가 방출된 반면 내구성 PEGDA 비드에서는 220,000개의 세포만 방출되었다. 누적 21일까지 MeHA 비드는 3080만 개의 세포를 방출한 반면 PEGDA는 그것의 5% 미만을 방출하였다.

논의

결과로부터 내구성 마이크로입자 대 분해성 마이크로입자 밖으로 이동하는 증식하는 세포의 수에서 명확한 차이가 정의된다. 최종 마이크로입자 생성물은 마이크로입자에서 주변 조직으로 세포가 이동하도록 한다. 급속 분해형 제형은 내구성 하이드로겔보다 더 빠르고 더 큰 방식으로 그렇게 한다. 결과는 마이크로입자의 물리적 분해가 발생하기 전에도 세포를 국소 상처 부위로 이동할 수 있도록 하는 급속 분해형 하이드로겔의 유용성을 보여준다.

실시예 5

내구성 마이크로입자 대 급속 분해형 마이크로입자 최종 생성물의 생존력, 형태 및 기능

도입

내구성 또는 급속 분해형/단기 하이드로겔 제형에 대한 수많은 응용 프로그램이 있다. 마이크로캡슐화된 중간엽 줄기세포(MSC)가 쥐과 동물(murine)의 뒷다리 손상 모델에서 측분비 매개 치유를 극적으로 향상시켜, 캡슐화되지 않은 MSC에 비해 생존 및 혈관신생 촉진 활성을 증가시키는 것으로 문헌에서 입증되었다. 일단 캡슐화되면 세포는 생존력을 유지해야 하고 치료적으로 기능해야 한다. 캡슐화 매트릭스의 강성을 증가시키면 MSC 분화가 더 부드러운 물질을 사용하는 연골 경로에 비해 골형성 경로로 분화된다는 것이 입증되었다. 또한, 3D 콜라겐 하이드로겔에서 배양된 래트의 신경 세포는 동일한 물질에서 2D로 성장한 세포와 비교하여 더 나은 생존을 보였고 네이티브 신경망처럼 행동하였다.

방법

생존력 및 형태

상술한 CSS 제조 공정을 사용하여 두 가지 유형의 하이드로겔 중합체, 즉 급속 분해형(MeHA 및 AHA) 및 내구성(PEGDA)을 마이크로입자로 제조하였다. 동일한 양의 중합체 전구체(1mL)를 동일한 수의 마우스 MSC(1600만 개) 또는 인슐린종 세포(3000만개의 세포)와 혼합한 후 비드를 형성하였다. 비드를 2주 동안 배양 조건하에 보관하였다. 마이크로입자 내에서 배양될 때 세포의 생존력 및 기능은 각각의 제형에 대해 높았다. 일단 캡슐화되면, 마이크로입자 내 MSC 및 인슐린종 세포의 생존력은 형광성 생존력 염색을 사용하여 측정하였다. 칼세인은 세포막이 손상되지 않은 세포에만 들어갈 수 있기 때문에 살아있는 세포의 척도로 칼세인을 배지에 추가하였다. 죽은 세포를 식별하기 위해 배양 배지에 프로피디움 요오다이드를 첨가하였다. 형광단에서 30-60분 또는 인큐베이션한 후, 마이크로입자의 이미지를 Cytation 5 다중 모드 판독기(Biotek Instruments, Inc.)에서 수집하였다.

두 가지의 상이한 하이드로겔에 캡슐화된 비증식성 체세포 공급원(개의 췌도)을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 마이크로입자는 전구체에 혼합된 세포(췌도 또는 배양된 세포)와 함께 상술한 바와 같이 제조하였다. 개의 췌도의 경우 1.1X 농도의 전구체를 액적 생성 직전에 10:1 부피 비율로 개의 췌도의 슬러리와 혼합하였다. 췌도-마이크로입자의 제조는 폐쇄된 멸균 생물반응기 시스템에서 무균적으로 수행하였다.

완성된 마이크로입자는 인슐린의 존재를 감지하기 위해 디티존으로 염색하였고, 외식된 조직의 세포 생존력을 평가하기 위해 칼세인(살아있는 세포) 및 프로피디움 요오다이드(아폽토시스/괴사 세포)로 염색하였다. 염색된 마이크로입자의 색상, 명시야 및 형광 이미지는 Cytation 5 다중 모드 판독기(Biotek Instruments, Inc.)를 사용하여 캡처하였다.

결과

PEGDA 또는 MeHA에 캡슐화된 MSC는 도 16a 및 b에 도시된 바와 같이 높은 생존력을 나타냈다. AHA에서 유사한 결과가 나타났다(도 16e). 녹색 형광단은 칼세인으로 염색된 살아있는 세포를 나타낸다. 적색/황색 세포는 프로피디움 요오다이드로 염색된 죽은 세포를 나타낸다. 흥미롭게도, 세포는 단일 세포로 마이크로입자에 로딩되었지만, 내구성 PEGDA 겔에서 빠르게 함께 뭉친 반면, 분해성 MeHA 하이드로겔에서는 그렇지 않아 주로 단일 세포로 머물렀다. 제조 과정에서 세포의 형태를 모니터링한 결과 제조 후가 아니라 마이크로입자 제조 중에 세포가 클러스터링됨을 알 수 있었다.

개의 췌도를 사용한 연구에서 세포는 두 하이드로겔 마이크로입자 모두에서 높은 생존력을 보였다(도 16c - PEDGA 및 16d - MeHA). 이들은 인슐린 함량에 대해 염색에 의해 입증된 바와 같이 두 하이드로겔에서 계속 기능하였다. 췌도는 세포 클러스터로서 마이크로입자에 로딩되었다. 두 제형 모두에서 클러스터링 빈도나 클러스터 크기에는 변화가 없는 것으로 나타났다.

래트 인슐린종 세포주를 사용하여 유사한 결과를 얻었다. 도 17은 캡슐화 후 1일 이내에 특히 AHA에 캡슐화될 때 세포의 높은 생존력을 나타낸다. 다음 7일 동안 AHA의 세포 생존력은 약 50%로 떨어졌다. 대조적으로, PEGDA의 인슐린종 세포는 낮은 생존력으로 시작했지만 연구 전반에 걸쳐 평균값에 가깝게 유지되었다.

췌도 세포의 기능 테스트는 세포 내 인슐린 염색으로 수행하였다. 디티존 염색은 인슐린 생산의 표준 지표이다. 그것은 인슐린 양성 세포를 적갈색/갈색으로 염색한다. 도 18의 이미지는 캡슐화 약 1주 후에 내구성 PEGDA 마이크로입자 및 분해성 MeHA 마이크로입자 둘 모두에서 췌도의 인슐린 염색 양성을 나타내며, 이는 양 마이크로입자에 캡슐화한 후 인슐린을 계속 생산할 수 있는 능력을 나타낸다. 마우스 MSC와 달리 이러한 체세포 췌도 세포의 형태는 하이드로겔 제형에서 눈에 띄게 변하지 않았다.

실시예 6

내구성 마이크로입자 대 급속 분해형 마이크로입자 최종 생성물의 국소 세포 투여

도입

내구성 또는 급속 분해형 하이드로겔 제형을 위한 수많은 응용 프로그램이 있다. 마이크로캡슐화된 MSC가 쥐과 동물의 뒷다리 손상 모델에서 측분비 매개 치유를 극적으로 향상시켜, 캡슐화되지 않은 MSC에 비해 생존력 및 혈관신생 촉진 활성을 증가시키는 것으로 문헌에서 입증되었다. MSC 측분비 방출의 사용과 관련된 문제 중 하나는 캡슐화되지 않은 MSC가 손상 부위에 머물지 않고 신체에서 빠르게 제거된다는 것이다. 따라서, 점착성 하이드로겔을 사용한 캡슐화는 유리한 화합물을 분비할 수 있는 이식 영역에서 세포를 포획할 것이다. 우리는 마이크로입자의 내구성 또는 분해성 제형이 주변 조직에 달라붙고 해당 부위에 잔류하는 능력에서 차이를 보이는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.

방법

조직으로의 유착

즉각적인 조직 유착을 개의 대망으로의 이식 절차 동안 테스트하였다. 4마리의 개에게 개의 췌도를 함유하는 마이크로입자를 이식하였다. 이식 당일, 수술 전, 수술 중 및 수술 후에 체액 주입을 위한 두부 정맥 카테터를 포함하는 표준 수의학적 절차를 사용하여 동물을 마취시켰다. 외과 의사가 대망 덮개(omental veil)에 마이크로입자를 주입하였다. 어떠한 장 조직, 혈관, 결절 또는 림프관에도 들어가거나 손상되지 않도록 주의하였다. 총 10,000개의 췌도 등가물이 1mL의 하이드로겔 마이크로입자에 포함되었다. 췌도 함유 PEGDA 마이크로입자의 제조는 이전에 설명되어 있다. 대망을 복부로 부드럽게 되돌리고 복벽을 닫은 후 피내 봉합하여 피부를 봉합하기 전에 사진을 얻었다.

조직 유착의 또 다른 예는 래트의 무릎에 마이크로비드를 주입하여 입증하였다. 간단히 말해, PBS 중 100uL의 300마이크론 PEGDA 마이크로입자를 25G 바늘을 통해 스프라그-돌리 래트 무릎 관절의 관절낭으로 압출하였다. 압출하기 전에 관절 캡슐 내부 마이크로입자의 존재를 확인하기 위해 용액과 비드를 청색으로 염색하였다.

유착 조직의 조직학

건강한 스프라그-돌리 래트를 사용하여 급성 생체 적합성 및 복강 내 마이크로입자의 위치를 평가하였다(마이크로입자 제형당 N=2). 빈 마이크로입자는 이전에 기술한 절차에 따라 대망 주위에 이식하였다. 마이크로입자는 DPBS 중 현탁액으로 주사기를 통해 전달하였다. 대략 1mL의 느슨하게 채워진 마이크로입자가 래트의 대망 주위와 내부에 침착되었다. 마이크로입자 이식 후 10일 동안 래트를 모니터링하고 통증 마커 및 활동 수준에 대해 매일 점수를 매겼다.

복강 내 마이크로입자 위치의 결정 및 가능한 조직 이상에 대한 검사를 위해 이식 부위를 평가하기 위해 이식 후 14일에 래트를 희생시켰다. 조직 샘플을 수집하고 중성 완충 포르말린에 보존하고 파라핀에 넣고 7-마이크론 두께로 절단하였다. 섹션을 H&E로 염색하고 현미경으로 평가하였다.

결과

PEDGA 마이크로입자는 도 19a에 도시되고 방법 섹션에 설명된 바와 같이 복부 대망 내부 및 주위에 주입하였다. 매질의 마이크로입자를 대망 내부 및 주변에 주입한 직후, 대망을 수동으로 조작한 경우에도 마이크로입자가 조직에 달라붙는 것을 보여주는 이미지를 수집하였다. 도 19b 및 19c는 2마리의 상이한 개로부터의 결과를 예시하며, 둘 다 마이크로입자의 점착성 성질을 나타낸다.

염색된 PEGDA 마이크로입자를 래트 무릎에 주입하였다. 관절을 수동으로 조작한 후 관절을 절개하였다. 근육을 통해서도 마이크로입자의 청색이 보였다(도 20a). 추가 절개로 마이크로입자가 눈에 보였고 여전히 무릎 관절 내에 있는 것으로 발견된다(도 20b 및 c).

내구성 PEGDA 마이크로입자와 분해성 MeHA 및 AHA 마이크로입자(세포 없음)를 건강한 스프라그-돌리 래트에 이식하여 CSS 방법을 사용하여 생성된 마이크로입자의 안전성 및 생체 적합성을 주변 조직에 대한 위치 및 부착과 함께 평가하였다. 부검은 2주와 10주 후에 수행하였으며 복강 전체에서 급성 염증, 과도한 체액 또는 조직 이상 징후는 관찰되지 않았지만, 대망이 위벽에 봉합된 부분에서 일부 조직 유착이 확인되었다. 두 마이크로입자 제형은 대망에서 온전한 것으로 발견되었으며 시각적으로 반투명했으며 매우 얇은 필름과 같은 층으로 둘러싸인 것처럼 보였다. 소량의 마이크로입자가 간 표면에 유착된 것으로 확인되었다. 그러나 대부분의 마이크로입자는 대망에 유착되었으며 소수의 자유 부동 마이크로입자가 있었다.

3개의 마이크로입자 그룹에 대한 이식된 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색이 도 21에 도시되어 있다. 그룹 간 현저한 차이는 관찰되지 않았다. 마이크로입자는 일반적으로 손상되지 않았지만 조직학을 위한 조직 처리의 결과로 크기가 축소되고 일부 경우에는 부서지거나 변형된 것으로 나타났다. 마이크로입자는 일반적으로 주변에 얇은 세포층이 있는 것으로 나타났으며 종종 2개 또는 3개의 세포 두께를 가지며 빈 마이크로입자가 동물에 주입되었다는 점을 감안할 때 내부에는 모두 세포가 없었다. 대부분의 단일 마이크로입자는 정상적인 대망 조직으로 둘러싸여 있는데, 이는 다양한 제형의 마이크로입자에 대한 반응으로 염증 반응이 결여됨을 보여준다.

대망의 마이크로입자에 대한 이물질 반응의 정량화는 도 22에 나와 있다. 낮은 세포도와 높은 콜라겐 함량으로 확인된 섬유증 영역의 너비는 AHA에서 최소였으며 PEGDA 마이크로입자 주변에서는 더 높았다. 여전히, PEGDA 마이크로입자 주위의 섬유성 고리의 두께는 알기네이트와 같은 기타 하이드로겔 제형에 대해 보고된 것보다 여전히 작다. 유사하게, 림프구 영역은 AHA 마이크로입자에서 더 적었다. 림프구 영역은 마이크로입자 주위를 이동하는 세포 면역 세포로 정의되었다. 이들 역시 PEGDA 마이크로입자에 대해 더 높았지만 여전히 최소인 것으로 간주되었다(도 22).

논의

최종 생성물의 독특하고 유리한 특성은 내구성 또는 분해성 하이드로겔 매트릭스로 구성되었는지에 관계없이 점착성이라는 것이다. 이 점착성 특성으로 인해 주변 조직에 빠르게 부착되고 분해될 때까지 해당 영역에 유지된다. 복막강의 주변 조직에 부착된 췌도에 더하여 항염증 또는 치유 촉진 사이토카인을 방출하는 MSC 또는 기타 세포의 투여를 위한 점착성 하이드로겔의 사용은 신체의 다른 부위로의 재분배에 대한 걱정 없이 국소 영역으로 세포 인자의 장기간 전달을 위해 관절이나 다른 염증 조직에 주입할 수 있다.

실시예 7

하이드로겔 특성에 영향을 미치는 파라미터 조사

이 실시예에서는 다양한 파라미터의 서로의 관계와 생성된 하이드로겔 마이크로입자의 특성 및 특징에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해 다양한 파라미터를 조사하였다. 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 다양한 마이크로입자 특성은 원하는 특정 치료 프로토콜 및 결과에 대해 미세하게 조정되고 조절될 수 있다. 특히, 이들 파라미터 각각은 하이드로겔 마이크로입자 제조에서 역학적 요인이며, 이는 그 영향이 제형에 사용된 다른 성분의 양 또는 비율 및/또는 기타 공정 파라미터에 상대적임을 의미한다. 또한, 특정 파라미터의 수정이 반드시 생성된 하이드로겔의 비례적 변화를 산출하는 것은 아니다. 그러나 상이한 마이크로입자 제형 및 공정 파라미터의 미묘한 차이는 다른 원하는 결과 중에서 캡슐화할 세포 유형, 이식 위치, 및 치료 또는 예방할 병태에 따라 다양한 맞춤형 특징을 허용한다.

이러한 상이한 파라미터를 탐색하기 위해 팽창 비율(Q)은 마이크로입자의 상대적 분해 속도에 대한 프록시로 사용된다.

A. 코어 중합체 종의 질량 분율

질량 분율은 중합체 백본에 사용된 하이드로겔 전구체 용액에서 반응성 중합체 종의 질량에 의한 조성%를 나타낸다(예를 들어, 10g 전구체 용액 중 2.5g PEGMAL = 25% 질량 분율). 전구체 용액에서 반응성 중합체의 질량 분율을 조정하면 생성된 Q 값에 일관된 영향이 있다. 질량 분율이 낮을수록 Q 값이 크고 겔이 더 부드럽다. 이것은 다양한 다중-암 PEGMAL 종을 500Da PEG 디티올과 가교결합함으로써 설명된다. 이 실시예에서 가교결합제 농도는 알기네이트 배스에서 0.25% 질량 분율로 일정하게 유지되었다. 비반응성 PEG 종(PEG 8000)은 일정한 용액 점도를 유지하기 위해 더 낮은 질량 분율 그룹에 포함되었다. 결과를 도 23에 나타냈다.

B. 알기네이트 배스 내 가교결합 종의 농도

알기네이트 배스 내 가교결합제(예를 들어, PEG 디티올, DTT)의 농도는 생성된 하이드로겔 마이크로입자에 영향을 미친다. 그러나 하이드로겔 매트릭스에 대한 가교결합제의 관계는 너무 적거나 너무 많은 가교결합제가 배스 내에 있을 수 있기 때문에 간단하지 않다. 불충분한 가교결합제는 불충분하게 가교결합된 약한 겔을 생성한다; 그러나 너무 많은 가교결합제는 중합체 백본의 반응성 부위를 포화시켜 가교결합을 방지하고 약한 겔을 생성한다. 따라서, 이 파라미터는 백본에 사용되는 중합체 전구체의 양 및 유형과도 균형을 이루어야 한다.

1. 가교결합제 농도의 증가가 더 낮은 Q 값을 초래함.

이 실시예(코어 중합체 = 4-암 10kDa PEGMAL)에서는 가교결합제 농도(DTT)의 증가가 더 낮은 Q 값이 초래하였다. 이것은 가교결합제 농도가 코어 중합체 포화가 발생한 수준에 도달하지 않았음을 나타낸다. 결과를 도 24a에 나타낸다.

2. 가교결합제 농도의 증가가 더 높은 Q 값을 초래함.

이 실시예(코어 중합체 = 8-암 40kDa PEG-비닐설폰)에서는, 실시예 1에서 관찰된 것과는 대조적으로, 가교결합제(BMA, CAS 123-81-9) 농도의 증가가 초기에는 더 낮은 Q 값을 초래했지만 추가 증가는 더 높은 Q 값으로 이어졌다. 특히, 코어 반응성 그룹(비닐설폰)에 대한 가교결합제(티올)의 상대 몰 농도는 이전 실시예와 상이하였다. 따라서, 실시예 2의 조건은 코어 중합체 분자의 포화 및 이에 따른 비효율적인 가교결합을 유도하여 더 약한 겔 네트워크 및 더 높은 Q를 초래하는 것 같다. 결과를 도 24b에 나타낸다.

C. 알기네이트 배스 pH

티올-엔(thiol-ene) 반응은 환경 pH의 영향을 크게 받는다. 더 높은 pH 수준은 티올-엔 반응 역학을 극적으로 증가시킨다. 따라서, 알기네이트 배스의 pH를 조절하면 겔 가교결합의 역학 및 생성된 Q 값에 큰 영향을 미칠 수 있다.

1. pH의 증가가 더 높은 Q 값으로 이어짐.

이 실시예(코어 중합체 = 8-암 40kDa PEG-비닐설폰; 가교결합제 = BMA)에서는, 배스 pH의 증가가 더 높은 Q 값을 초래하였다. 결과를 도 25a에 나타낸다. 증가된 반응 속도는 코어 중합체와의 더 빠른 반응 및 궁극적으로 부분 포화를 유도하여 겔 네트워크가 약해지고 Q 값이 높아진다.

2. pH의 증가가 더 낮은 Q 값으로 이어짐.

이 실시예(코어 중합체 = 8-암 40kDa PEGMAL; 가교결합제 = 500Da PEG 디티올)에서는, pH의 증가가 더 낮은 Q 값을 초래하였다. 중합체와 가교결합제는 포화를 피하기 위해 균형을 이룬다. 따라서, 이 경우 pH가 증가하면 반응 속도가 빨라지고 가교결합이 더 효과적이다. 결과를 도 25b에 나타낸다. pH 증가에 비례한 Q 값의 증가는 실시예 1의 매우 급격한 증가에 비해 실시예 2에서는 상당히 미미하다. 따라서, Q 값에 대한 pH 효과의 방향과 크기 모두 가교결합제의 상대적인 양 및 코어 중합체 반응성 부위에 의해 크게 영향을 받는 것으로 보인다.

D. 가교결합 종의 분자량

가교결합 종의 분자량은 코어-쉘 구조물로의 확산 속도와 겔 네트워크의 가교결합 사이의 거리 모두에 영향을 미친다. 따라서, 가교결합 종의 MW 차이는 공정에 사용된 다른 파라미터에 따라 생성된 겔 마이크로입자의 최종 Q 값에 영향을 미칠 수 있다.

1. MW의 증가가 더 높은 Q 값을 초래함.

이 실시예(코어 중합체 = 8-암 40kDa PEG-비닐설폰)에서는, 가교결합 종의 MW를 154Da에서 500Da로 증가시키면 Q 값이 눈에 띄게 증가한다. 가교결합제 종의 몰농도는 두 제제 모두에서 10mM이었다. 결과를 도 26a에 나타낸다.

2. MW의 증가가 Q 값에 변화를 초래하지 않음.

이 실시예(코어 중합체 = 8-암 40kDa PEGMAL)에서는, 가교결합제의 증가된 MW가 생성된 겔의 Q 값에 명백한 차이를 나타내지 않았다. 가교결합제 MW 변화의 영향은 중합체 반응성 부위와 비교하여 사용되는 가교결합제의 상대적인 양을 조정하는 것으로 상쇄될 수 있다. 결과를 도 26b에 나타낸다.

E. 코어 중합체 종의 분자량

코어 중합체 종의 분자량은 중합체 그램당 반응성 부위가 보존된다고 가정할 때 가교결합제의 분자량보다 훨씬 더 예측 가능하게 Q 값에 영향을 미치는 것으로 보인다. 예를 들어, 8-암 40kDa PEGMAL과 4-암 20kDa PEGMAL은 그램당 동일한 수의 반응성 부위(말레이미드)를 갖는다. 그러나 아래 나타낸 바와 같이 40kDa 종은 동일한 상황에서 제조할 때 훨씬 더 강한 겔(낮은 Q 값)을 생성한다.

1. 일정한 반응성 부위/그램에서 코어 중합체의 MW 효과.

이 실시예는 세 가지의 사이드 바이 사이드(side by side) 비교를 사용하여 CSS에 의해 제조된 겔 마이크로입자의 Q 값에 대한 코어 중합체 분자량의 영향을 보여준다. 모든 제제에서, 동일한 질량 분율 및 반응성 부위/그램임에도 불구하고 코어 MW가 증가할 때 Q 값은 감소하였다. 코어 MW의 효과는 가교결합제의 농도가 감소함에 따라(및 크기가 증가함에 따라) 더욱 두드러진다는 점에 유의한다. 결과를 도 27a에 나타낸다.

2. 동일하지 않은 반응성 부위/그램에서 코어 중합체의 MW 효과.

이 실시예에서는 8-암 40kDa 또는 4-암 10kDa PEGMAL 코어 종으로 만든 마이크로입자를 비교한다. 코어 중합체 용액은 모든 경우에 10% 질량 분율이었다. 4-암 10kDa 종은 8-암 40kDa에 비해 반응성 부위/그램이 2배이지만, 잠재적 가교결합 밀도가 더 낮음에도 8-암 40kDa 마이크로입자는 4-암 10kDa 마이크로입자에 비해 Q 값이 더 낮다(즉, 더 강한 겔). 결과를 도 27b에 나타낸다.

F. UV 가교결합 시간의 영향

이 실시예에서는 다양한 UV 노출 시간에서 분자량이 다른 AHA 및 MeHA 미소구체를 생성하였다. 간략하게, 2.5% 1MDa 또는 200kDa AHA 또는 1MDa MeHA 용액(각각 1% 3.4kDa PEGDA 포함)을 상술한 바와 같이 교반된 알기네이트 배스 내로 적가 압출하고 2.5분, 5분 또는 7.5분 동안 UV광에 노출시켰다. 생성된 지름 및 하이드로겔 팽창 비율을 각 중합체 유형에 대해 정량화하였다. 결과를 도 28a 및 도 28b에 나타냈으며, 여기서 미소구체 지름 및 팽창 비율은 UV 노출 시간의 함수로서 변한다. 이러한 결과는 UV 노출 시간이 증가할수록 지름과 팽창 비율이 모두 감소함을 보여준다. 특히, 1MDa MeHA 하이드로겔 미소구체 팽창 비율은 UV광에 7.5분 노출된 후 팽창 비율이 각각 509.1 및 113.4인 5분에 비해 급격히 감소하였다. 이러한 경향은 각 중합체 유형 및 분자량에 대해 일정하며 UV 노출 시간의 변화를 통해 하이드로겔 내구성의 제어를 보여준다.

G. Q 값에 관계없이 가교결합 종의 가수분해 안정성에 의한 하이드로겔 분해의 잠재적 제어.

1. 가수분해적으로 더 불안정한 가교결합제로서의 BMA.

특정 가교결합제를 사용하여 마이크로입자에 대한 분해 프로파일에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 디티올레이트 가교결합제 분자인 BMA는 티올-엔 유형 하이드로겔의 가수분해 분해를 촉진하는 방법으로서 잠재적으로 활용될 수 있다.

DTT 또는 BMA에 의해 가교결합된 PEG-비닐 설폰으로 구성된 일련의 하이드로겔 마이크로입자를 제조하고 실온(~27℃)에서 DPBS에서 적어도 6개월 동안 50mL 폴리프로필렌 튜브에 보관하였다. 하기 표 3은 참고용으로 각 제제의 조성과 해당 팽창 비율을 나열한 것이다. 보관 6개월 후, 마이크로입자는 분해 징후에 대해 정성적으로 재검사하였다. 특히, BMA에 의해 가교결합된 모든 마이크로입자는 6개월 후에 완전히 분해되었다. DTT에 의해 가교결합된 것들은 6개월 후에 비교적 변화가 없는 것으로 나타났지만, 현재로서는 공식적인 특징화가 수행되지 않았다. 더욱이, 완전히 분해된 BMA 가교결합된 마이크로입자 중 2개는 이전에 이 표에 포함된 모든 마이크로입자 중 가장 낮은 Q 값을 나타냈지만, 더 높은 Q 값인 DTT 가교결합된 마이크로입자에 비해 여전히 완전히 분해되었다. 이 결과는 BMA 가교결합제가 초기에 매우 강한(낮은 Q) 마이크로입자를 생성하기 위한 유용한 도구가 될 수 있지만 DTT 또는 PEG 디티올에 의해 가교결합된 유사한 초기 강도의 다른 마이크로입자보다 훨씬 더 빨리 분해되는 마이크로입자를 생성하는 데 유용할 수 있음을 시사한다.

하기 표 4는 추가 디티올 종의 목록과 티올 그룹(들)의 해당 pKa를 제공한다. 티올-엔 반응으로 인한 결합의 가수분해 불안정성은 반응성 티올의 pKa와 상관관계가 있다. 따라서, 이들 종은 가수분해 불안정성 및 이에 따른 마이크로입자의 분해 속도를 제어하기 위해 티올-엔 반응 계획에서 화학적 가교결합제로 사용될 수 있다.

Claims (66)

1. 이식(implantation) 부위에서 치료 세포 및/또는 조직의 국소 전달(localized delivery) 및 지속 방출(sustained release)을 위한 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자(non-alginate hydrogel microparticle)로서, 상기 마이크로입자는 공유 가교결합된 비-알기네이트 중합체 화합물의 3차원 매트릭스 및 그 안에 포획된(entrapped) 치료학적 유효량의 세포 및/또는 조직을 포함하고, 상기 세포는 생존력(viability)이 적어도 약 50%이고 상기 마이크로입자는 크기가 약 30μm 초과인, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
2. 제1항에 있어서, 상기 마이크로입자는 크기가 300μm 초과인, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
3. 제1항에 있어서, 상기 중합체 화합물은 분지형(branched) 또는 비분지형 히알루론산(hyaluronic acid), 분지형 또는 비분지형 작용화 히알루론산(functionalized hyaluronic acid), 분지형 또는 비분지형 작용화 폴리에틸렌 글리콜(functionalized polyethylene glycol), 히알루로난(hyaluronan), 피브린(fibrin), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 폴리락트산(polylactic acid), 폴리(L-락트산)(poly(L-lactic acid)), 폴리락트산-코-글리콜산(polylactic-co-glycolic acid), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 저속 겔화 중합체 전구체(slow-gelling polymer precursor)로부터 선택되는, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
4. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 디티오트레이톨(dithiothreitol), 분지형 또는 비분지형 작용화 폴리에틸렌 글리콜, 디티올(dithiols), 에틸렌 글리콜 비스-머캅토아세테이트(ethylene glycol bis-mercaptoacetate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 비-알기네이트 중합체 화합물과 가교결합된 가교결합제를 추가로 포함하는, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
5. 제4항에 있어서, 상기 작용화 폴리에틸렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 디티올, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디비닐 설폰, 폴리에틸렌 글리콜 디말레이미드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
6. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 공유 가교결합된 작용화 히알루론산 및 작용화 폴리에틸렌 글리콜 전구체 화합물로 본질적으로 이루어진, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
7. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 자가 가교결합된 작용화 폴리에틸렌 글리콜 전구체 화합물로 본질적으로 이루어진, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
8. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 자가 가교결합된 작용화 히알루론산 전구체 화합물로 본질적으로 이루어진, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
9. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 공유 가교결합된 제1 및 제2 작용화 폴리에틸렌 글리콜 전구체 화합물로 본질적으로 이루어지며, 상기 제1 및 제2 작용화 폴리에틸렌 글리콜 전구체 화합물은 서로 상이한, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
10. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 공유 가교결합된 메타크릴레이트화 히알루론산 및 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 전구체 화합물로 본질적으로 이루어진, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
11. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 공유 가교결합된 티올레이트화 히알루론산 및 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 전구체 화합물로 본질적으로 이루어진, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
12. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 공유 가교결합된 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 및 폴리에틸렌 글리콜 디티올 전구체 화합물로 본질적으로 이루어진, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
13. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 공유 가교결합된 폴리에틸렌 글리콜 비닐 설폰 및 디티오트레이톨 또는 에틸렌 글리콜 비스-머캅토아세테이트 전구체 화합물로 본질적으로 이루어진, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
14. 제1항에 있어서, 상기 마이크로입자 부피의 50% 이하가 상기 세포 또는 조직을 포함하는, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
15. 제1항에 있어서, 상기 마이크로입자는 PBS 중 37℃에서 6개월 미만의 저장 안정성을 갖는, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
16. 제1항에 있어서, 상기 마이크로입자는 PBS 중 37℃에서 6개월 초과의 저장 안정성을 갖는, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
17. 제1항에 있어서, 상기 마이크로입자는 생체 내 이식될 때 3개월 미만 내에 분해되는 분해성(degradable) 마이크로입자인, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
18. 제1항에 있어서, 상기 마이크로입자는 생체 내 이식될 때 적어도 3개월 동안 분해되지 않을 내구성(durable) 마이크로입자인, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
19. 제1항에 있어서, 세포 배지 성분(cell media component)을 추가로 포함하는, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
20. 제1항에 있어서, 상기 세포는 비-증식성 또는 증식성인, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
21. 제1항에 있어서, 신호전달 분자(signaling molecules), 사이토카인(cytokines), 케모카인(chemokines), 치료 단백질(therapeutic proteins), 호르몬, 소포(vesicle), 항체, 바이러스, 엑소좀(exosomes) 등을 포함하는, 상기 세포와 함께 분비되는 세포 생성물을 추가로 포함하는, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
22. 제1항에 있어서, 상기 세포는 조작된(engineered) 세포 또는 트랜스제닉(transgenic) 세포인, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
23. 제1항에 있어서, 상기 세포는 복수의 응집된 세포의 클러스터(cluster)인, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
24. 제23항에 있어서, 상기 클러스터는 2종 이상의 상이한 유형의 세포를 포함하는, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
25. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 한 가지 유형의 공유 가교결합된 중합체 백본(backbone)을 포함하는 동종성인, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
26. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 고분자량 및 저분자량 중합체 전구체의 조합과 같은 2종 이상의 중합체 전구체의 혼합물, 및/또는 2종 이상의 가교결합제의 혼합물을 포함하는 이종성인, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
27. 제1항에 있어서, 상기 마이크로입자는 크기가 약 50μm 내지 약 5㎜인, 비-알기네이트 하이드로겔 마이크로입자.
28. 생체적합성 전달 비히클(biocompatible delivery vehicle)에 분산되거나 현탁된, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 복수의 하이드로겔 마이크로입자를 포함하는, 이식 부위에서 치료 세포 및/또는 조직 및/또는 세포 생성물의 국소 전달 및 지속 방출을 위한 조성물.
29. 제28항에 있어서, 크기가 약 30μm 초과이고 본질적으로 어떠한 세포 또는 조직도 없는 공유 가교결합된 비-알기네이트 중합체 화합물의 3차원 매트릭스를 포함하는 복수의 하이드로겔 마이크로입자를 추가로 포함하는 조성물.
30. 제28항에 있어서, 상기 복수의 하이드로겔 마이크로입자는 상기 생체적합성 전달 비히클에 분산되거나 현탁된 분해성 하이드로겔 마이크로입자와 내구성 하이드로겔 마이크로입자의 혼합물을 포함하는 조성물.
31. 제30항에 있어서, 상기 내구성 하이드로겔 마이크로입자는 인슐린 생산 세포 및/또는 조직을 포함하고, 상기 분해성 하이드로겔 마이크로입자는 줄기세포를 포함하는 조성물.
32. 제28항에 있어서, 상기 복수의 하이드로겔 마이크로입자는 제1 세포 및/또는 조직 유형을 포함하는 복수의 제1 하이드로겔 마이크로입자 및 상기 제1 세포 및/또는 조직 유형과 상이한 제2 세포 및/또는 조직 유형을 포함하는 복수의 제2 하이드로겔 마이크로입자를 포함하는 조성물.
33. 제32항에 있어서, 상기 제1 세포 및/또는 조직 유형은 인슐린 생산 세포 및/또는 조직을 포함하고, 상기 제2 세포 및/또는 조직 유형은 줄기세포 또는 글루카곤(glucagon) 생산 세포 및/또는 조직을 포함하는 조성물.
34. 제28항에 있어서, 상기 복수의 하이드로겔 마이크로입자는 제1 크기의 복수의 제1 하이드로겔 마이크로입자 및 상기 제1 크기와 상이한 제2 크기의 복수의 제2 하이드로겔 마이크로입자를 포함하는 조성물.
35. 제28항에 있어서, 상기 비히클은 생체적합성 액체 현탁액 또는 겔인 조성물.
36. 제28항에 있어서, 상기 비히클은 세포 배양 배지 용액 또는 겔인 조성물.
37. 제28항에 있어서, 상기 조성물은 카테터(catheter)를 통해 주입 가능하거나 이식 가능한 것인 조성물.
38. 제28항에 있어서, 치료학적 유효량의 상기 마이크로입자를 포함하는 조성물.
39. 제28항에 있어서, 상기 조성물은 퍼티(putty), 페이스트 또는 겔 형태인 조성물.
40. 제28항에 있어서, 상기 조성물은 액체 현탁액의 형태인 조성물.
41. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 복수의 마이크로입자 또는 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체(subject)의 이식 부위로 투여하는 것을 포함하는, 이식 부위에서 치료 세포 및/또는 조직의 국소 전달 및 지속 방출을 위한 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 투여는 상기 이식 부위 내 또는 근처에 상기 조성물을 주입(injecting)하는 것을 포함하는 방법.
43. 제41항에 있어서, 상기 주입은 관절 내 주입인 방법.
44. 제41항에 있어서, 상기 이식 부위는 대상체의 염증, 손상, 관절염, 퇴행(degeneration) 등의 영역인 방법.
45. 제41항에 있어서, 상기 이식 부위는 관절인 방법.
46. 제41항에 있어서, 상기 이식 부위는 샘(gland) 근처의 영역이고, 상기 마이크로입자는 상기 샘 근처의 호르몬과 같은 세포 생성물을 방출하는 방법.
47. 제41항에 있어서, 상기 이식 부위는 피막(capsular) 또는 생리학적으로 함유된 공간, 예컨대 심장 피막(heart capsule) 또는 신장 피막(kidney capsule)에 있는 방법.
48. 제41항에 있어서, 상기 이식 부위는 대상체의 대망(omentum) 또는 복막(peritoneum)인 방법.
49. 제41항에 있어서, 상기 이식 부위는 종양 내에 있거나 또는 종양에 인접한 방법.
50. 제41항에 있어서, 상기 이식 부위는 종양 절제 후 부위 내에 있거나 또는 부위에 인접한 방법.
51. 제41항에 있어서, 상기 이식 부위는 패혈증 부위인 방법.
52. 제41항에 있어서, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후 약 3개월 이내에 생분해되는 방법.
53. 제41항에 있어서, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후 적어도 6개월 동안 생분해되지 않는 방법.
54. 제41항에 있어서, 상기 이식 부위는 관절이고, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후 약 3개월 이내에 기계적으로 분해되는 방법.
55. 제41항에 있어서, 상기 이식 부위는 관절이고, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후 적어도 6개월 동안 기계적으로 분해되지 않는 방법.
56. 제41항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 이식 부위의 조직에 부착되어 치료 시간 동안 이식 부위에 이식된 세포를 유지하는 방법.
57. 제41항에 있어서, 상기 세포 및/또는 조직 및/또는 세포 생성물은 마이크로입자의 기공 및/또는 마이크로입자의 생분해를 통해 이식 부위의 국소 영역 내로 상기 마이크로입자로부터 서서히 방출되어 대상체 병태(condition)의 중증도를 경감 또는 감소시키는 방법.
58. 제41항에 있어서, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후 약 5일 이하 내에 생분해되는 방법.
59. 제41항에 있어서, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후 약 24시간 이내에 생분해되는 방법.
60. 제41항에 있어서, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후 약 1주 이내에 생분해되는 방법.
61. 제41항에 있어서, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후 약 1개월 이내에 생분해되는 방법.
62. 제41항에 있어서, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후 6개월 미만 이내에 생분해되는 방법.
63. 제41항에 있어서, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후에 생분해되고, 상기 생분해는 중합체 백본 가수분해를 포함하는 방법.
64. 제41항에 있어서, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후에 생분해되고, 상기 생분해는 가교결합제 가수분해를 포함하는 방법.
65. 제41항에 있어서, 상기 마이크로입자는 상기 투여 후에 생분해되고, 분해 속도는 중합체 전구체 분자량, 가교결합제 분자량, 가교결합제와 중합체 전구체의 비율, 가교결합제 가수분해, 가교결합 키네틱(kinetic), UV 노출 시간 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 파라미터를 변경함으로써 제어될 수 있는 방법.
66. 크기가 약 30μm 초과인 공유 가교결합된 비-알기네이트 중합체 화합물의 3차원 매트릭스를 포함하고 본질적으로 어떠한 세포 또는 조직도 없는 복수의 하이드로겔 마이크로입자를 관절 내로 도입하는 것을 포함하는, 관절의 통증을 감소시키고/시키거나 관절에 관절액보충요법(viscosupplementation)을 제공하는 방법.

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