KR20230119170A - 하이드로겔 마이크로입자 기반 윤활제 - Google Patents

하이드로겔 마이크로입자 기반 윤활제 Download PDF

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KR20230119170A
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메간 이. 해밀턴
스티븐 해링턴
카틱 라마찬드란
리사 스테노-비텔
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리카다, 엘엘씨
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Abstract

인간 또는 동물 대상체의 관절 또는 수술 부위에서 관절액 보충을 위한 방법이 이러한 유익한 성과를 달성하기 위한 특정 물질과 함께 개시된다. 상기 방법은 일반적으로 크기가 약 30 μm를 초과하고 어떠한 세포, 조직 또는 치료 화합물도 실질적으로 없는 다수의 다공성 점탄성 고체 하이드로겔 마이크로입자를 관절 또는 수술 부위에 도입하는 것을 포함한다. 인간 또는 동물 대상체의 관절 또는 수술 부위에서의 관절액 보충을 위한 키트도 개시된다. 상기 키트는 크기가 약 30 μm를 초과하고 어떠한 세포, 조직 또는 치료 화합물도 실질적으로 없는 다수의 다공성 점탄성 고체 하이드로겔 마이크로입자 및 이를 투여하기 위한 설명서를 포함한다.

Description

하이드로겔 마이크로입자 기반 윤활제
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 하이드로겔 마이크로입자 기반 윤활제(HYDROGEL MICROPARTICLE-BASED LUBRICANT)라는 명칭으로 2020년 12월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 일련번호 63/123,218의 우선권 이익을 주장하며, 그 전문은 참조로 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 관절 또는 외과용 윤활제로 사용하기 위한 다양한 하이드로겔로 제조된 완전 가교결합된 마이크로입자에 관한 것이다.
일반 미국 인구 중에서 관절 통증은 만성 통증 및 장애의 주요 원인이다. 증상을 관리하려는 시도와 함께 골관절염(OA)에 대한 설명이 고대 문서에서 발견되었지만 오늘날 환자들은 여전히 고통받고 있다. 연간 270억 달러가 넘는 비용에도 불구하고 OA 환자는 심지어 적극적인 치료를 받고 있음에도 만성 통증과 수면 부족으로 인해 치료에 만족하지 못하고 삶의 질이 좋지 않다고 보고한다. 만성 통증 및 연골 손실로 이어질 수 있는 관절 손상 또는 염증의 추가 원인에는 무혈관성 괴사, 골암, 갑상선 기능 저하증, 루푸스, 유육종증, 경피증, 외상 및 스테로이드와 같은 약물이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
관절 통증 및 연골 손실에 대한 현재의 치료 표준은 통증에 대한 약물 치료, 글루코코르티코이드 또는 히알루론산(HA)의 관절 내(IA) 주사, 그리고는 종국에는 수술, 전형적으로 관절 교체로 이루어진다. 자가 연골 세포 이식과 같은 새로운 치료법이 성공적인 기능적 성과를 가져왔지만 기증자 부위에 대한 필요성과 노인에서 연골 형성 잠재력 감소로 인해 방해를 받고 있다. HA는 관절 치료에 사용되는 가장 보편적인 주사제이며 희석 액체 용액, 반희석 용액 또는 일부 겔과 같은 거동을 나타내는 얽히거나 부분적으로 가교결합된 용액을 포함하는 여러 형식으로 사용 가능하다. 종종, 이러한 제품은 전형적으로 작은 게이지 바늘을 통한 주사에 적합한 액체의 유동성 형태이고 점성이 높지 않으며 어떤 종류의 반고체 거동도 나타내지 않음에도 불구하고 "하이드로겔"로 잘못 언급되고 있다.
HA를 투여하는 주 목적은 만성 관절 손상 동안 손실되는 윤활막 HA를 보충하는 것이다. 현재의 제품은 관절통에 약간의 경감을 제공하지만 관절에 들어가면 내인성 효소에 의해 빠르게 분해된다. 이러한 빠른 분해는 출발 물질이 가교결합되지 않았거나 부분적으로만 가교결합되어 최소한의 구조적 무결성을 초래한다는 사실에 기인한다. 또한, HA는 염증 조직에서 강화되는 내인성 히알루로니다제에 의해 자연적으로 분해된다. 저분자량 HA(10 내지 500 kDa)는 단 몇 시간의 반감기로 관절에서 빠르게 제거되는 반면, 고분자량 HA(>500 kDA)는 관절에서 최대 9일 동안만 지속된다. HA 및 기타 폴리머를 관절 윤활제 또는 외과용 윤활제로 사용하는 것이 인간 건강 및 수의과적 건강 분야 모두에서 널리 활용되고 있다.
요약
본 개시내용은 인간 또는 수의과적 적용에서 관절 통증 및 손상을 감소시키기 위한 관절 윤활제로서 관절의 관절 내 공간으로 전달될 수 있는 완전 가교결합된 점탄성 하이드로겔 마이크로입자를 사용하는 최초 접근법을 기술한다. 마이크로입자는 또한 이식된 의료 장치(예: 외과용 메쉬)와 주변 조직 사이의 마모 또는 마찰을 감소시키거나 진피 충전제(dermal filler) 등과 같이 윤활이 유익할 수 있는 다른 의료 또는 수의과적 응용 분야에도 사용될 수 있다.
현재의 비가교결합된 또는 부분 가교결합된 현탁액, 겔 또는 페이스트와 달리, 가교결합된 마이크로입자는 관절 또는 다른 이식 부위에 더 오랜 시간 동안 남아 있으므로 통증 완화 기간이 더 길고 관절 손상이 적다.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 실행된 도면이 하나 이상 포함되어 있다. 컬러 도면(들)이 포함된 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 시 필요한 수수료를 지불하면 특허청에서 제공할 것이다.
도 1은 관절이나 신체의 다른 부위에 윤활제로 주입될 수 있는 다양한 모양의 마이크로입자 이미지를 포함한다. A)는 구형 모양을, B)는 눈물 방울 모양을, C)는 타원형을, D)는 임의의 세관 모양을, E)는 혼합 모양을 나타낸다.
도 2는 물리적 응력 전후의 마이크로입자 이미지를 포함한다. A) 응력이 가해지기 전 메타크릴화 히알루론산으로 만들어진 마이크로입자는 상대적으로 일정한 모양을 가진다. B) 물리적 응력(소형 게이지 바늘 통과) 후 마이크로입자 크기는 작고 덜 규칙적이지만 여전히 고체 입자이다. C) 더 나은 이미징을 위해 형광 염료가 로딩된 아크릴화 히알루론산인 다른 하이드로겔의 경우도 마찬가지이다. 다시 입자는 초기에 크기와 모양이 일정하다. D) 바늘을 통과한 후 입자는 더 작은 조각으로 분해되지만 녹색 형광 염료를 통해 보이는 바와 같이 물리적 구조를 여전히 유지한다.
도 3은 가교결합된 입자로 만들 수 있는 다양한 크기를 설명하는 BioTek Cytation 5 Imaging Multi-Mode Reader에서 캡처한 현미경 이미지를 포함한다. A) 평균 직경 2040 + 21 μm, B) 평균 직경 1214 + 46 μm, C) 평균 직경 361 + 19 μm, D) 혼합 크기.
도 4는 마이크로입자를 만드는 데 사용할 수 있는 다양한 재료의 BioTek Cytation 5 Imaging Multi-Mode Reader에서 캡처한 현미경 사진을 제공한다 - 각 입자 유형에 사용된 재료는 도면에 표시되어 있다.
도 5는 상이한 마이크로입자 제형의 시간에 따른 팽윤비 변화의 그래프이다.
도 6은 2가지 예시적인 하이드로겔의 유변학적 특성을 기술한다: (A) PEGDA 및 (B) AHA.
도 7A는 초기 출발 화학에 기초한 마이크로입자의 상이한 확산 특성의 이미징을 나타낸다. AHA 마이크로구체(왼쪽)는 형광 덱스트란 프로브가 마이크로입자에 들어갈 수 있도록 하고 세척 후(3분)와 세척 후 30분이 지나도 여전히 덱스트란 프로브는 마이크로입자에 남아 있다. 대조적으로, PEGDA는 동일한 덱스트란 프로브를 마이크로입자로 거의 허용하지 않으며 세척했을 때 덱스트란 프로브가 마이크로입자의 외부 영역에만 들어갈 수 있었고 마이크로입자 코어로 확산될 수 없다는 것이 분명하다.
도 7B는 도 7A에 도시된 2개의 예시적인 하이드로겔 제형의 형광 배제 실험에 기초한 확산 특성의 그래프이다.
도 7C는 도 7A에 도시된 예시적인 이미지에 기초한 2개의 예시적인 하이드로겔 제형에 대한 상대 확산 속도에 기초한 확산 특성의 그래프이다.
도 8은 마이크로입자가 상보 분자와 가교결합화한 후에 어떻게 개질될 수 있는지의 한 예를 제공하는 개략도이다. 완전히 가교결합화된 마이크로입자는 여전히 표면에 결합되지 않은 반응성 그룹, 예를 들어, 티올(SH) 모이어티를 가지고 있다. 마이크로입자를 형광 연결된 PEG-말레이미드(MAL-CF350)에 노출시키면 말레이미드가 이용 가능한 티올 모이어티(SH)에 결합하고 마이크로입자는 왼쪽 이미지에 표시된 것처럼 형광을 발한다. 마이크로입자가 먼저 형광을 발하지 않는 PEG-말레이미드에 노출되면 표면 티올이 이제 해당 PEG에 결합되고 이후에 형광 PEG-말레이미드에 노출되면 왼쪽 이미지에 표시된 것처럼 형광이 나타나지 않을 것이다.
도 9는 2개의 상이한 배치로부터의 마이크로입자의 크기 분포(단분산도)를 나타내는 그래프를 포함한다.
도 10은 상이한 화학으로 제조된 마이크로입자의 37℃에서의 시험관 내 분해율의 예이다.
도 11은 체내에서의 위치 및 지속 시간을 추적하기 위해 하이드로겔이 형광 표지될 수 있음을 보여주는 이미지를 포함한다. A) 현미경 사진은 더 작은 입자 직경을 생성하는 절차를 사용하여 HA로 만들어진 마이크로입자를 보여준다. B) 현미경 사진은 직경이 더 큰 PEG로 만들어진 마이크로입자를 보여준다.
도 12는 마이크로입자 제형 중 하나의 생체 내 분해를 보여주는 그래프이다.
도 13은 건강한 래트의 장막 근처 또는 장막 내 다수의 상이한 마이크로입자 제형의 생체적합성을 보여주는 이미지를 포함한다.
도 14는 (A.) 비히클(vehicle) 대조군을 주사한 래트 무릎의 연골 결함 골관절염 동물 모델에서 증가된 연골 생성(빨간색) 및 관절 연골 표면의 개선된 평활도의 이미지를 (B.) 가교결합된 마이크로입자를 갖는 관절과 비교하여 포함한다. 화살표는 새로운 연골이 생성되어야 하는 관절의 위치를 가리킨다. 비히클 관절(A.)에는 표면에 새로운 연골이 없고 뼈 표면 아래에는 최소한의 연골만 있다. 또한 표면이 매끄럽지 않다. 대조적으로, 마이크로입자(B)를 받은 관절은 뼈 표면(화살표)을 따라 새로운 연골 영역과 더 매끄러운 표면을 가지고 있다.
도 15A는 대조군 비히클이 주사된 래트 무릎에서 내측 반월판 골관절염 동물 모델의 불안정화 후 생체 내 연구로부터의 이미지이다.
도 15B는 가교결합된 마이크로입자가 주사된 래트 무릎에서 내측 반월판 골관절염 동물 모델의 불안정화에서 증가된 연골 생성 및 관절 연골의 개선된 평활성을 나타내는 이미지이다(도 15A의 비히클 대조군과 비교됨).
도 16은 실온에서 4년 이상 동안 물에 저장한 후 이미지화한 티올화된 HA 마이크로입자의 현미경 사진으로, 마이크로입자에서 구조 손실이 없음을 보여준다.
도 17A는 액체 질소에서 동결되기 전의 마이크로입자(PEG-MAL)를 나타내는 BioTek Cytation 5 Imaging Multi-Mode, Reader에서 캡처한 현미경 사진이다.
도 17B는 액체 질소에서 동결 및 후속 해동 후의 PEG-MAL 마이크로입자의 이미지로서, 동결보존 프로토콜에 따른 온전한 마이크로입자를 보여준다.
상세한 설명
마이크로입자는 완전히 가교결합된 하이드로겔 폴리머 화합물(공유결합 또는 강한 이온성 가교결합)의 3차원 매트릭스(3-dimensional matrix)를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 심지어는 이로 이루어져 생성된 마이크로입자 바디는 다공성 점탄성 고체(하이드로겔)를 특징으로 하며 여기서 탄성 변형은 가역적이다(즉, 마이크로입자는 반강성이지만 마이크로입자가 로드(load)를 받으면 구부러질 수 있고 로드가 제거된 후 원래 모양으로 돌아갈 수 있도록 탄성이 있음). 마이크로입자를 형성하는 데 사용하기에 적합한 하이드로겔 전구체 화합물은 하이드로겔 형성 폴리머, 올리고머 및/또는 모노머를 포함하고, 그 자체로 공유결합 또는 강한 이온성 가교결합화를 통해 가교결합 또는 네트워크 구조 또는 매트릭스를 형성할 수 있으며, 여기에서 액체는 생성된 탄성 겔화 구조 또는 매트릭스 바디(하이드로겔)의 틈새 공간 또는 기공 내에 보유, 현탁, 포획 및/또는 캡슐화될 수 있다.
마이크로입자는 3차원 자립체(self-sustaining body)로서, 즉 일단 형태가 형성되면 외부 지지 구조물 없이도 특정 형태를 유지하며 자체 중량이나 중력만으로 인해 변형이나 크립이 쉽게 발생하지 않는다. 달리 말하면, 자립체는 젤리, 퍼티 또는 페이스트와 같이 영구적으로 변형되거나 유동적이지 않지만 탄성이 있어 매트릭스 바디가 힘을 받으면 일시적으로 항복하거나 변형될 수 있으며 파손되지 않는 한 힘을 제거하면 원래 모양으로 되돌아갈 것이다. 마이크로입자는 전형적으로 약 2,000 μm 미만, 바람직하게는 약 1,500 μm 미만이되 약 30 μm 초과, 바람직하게는 약 100 μm 초과의 표면 대 표면 치수(예를 들어, 대략 구형체의 경우 직경)를 가질 것이다. 하이드로겔 마이크로입자는 또한 마이크로구체, 마이크로비드 또는 하이드로겔 마이크로입자로 특징지어질 수 있다. 사용된 폴리머 시스템에 따라, 마이크로입자는 일반적으로 약 1,000 Pa 내지 약 2.5 MPa(메가파스칼), 보다 바람직하게는 약 10,000 Pa 내지 약 2 MPa, 보다 더 바람직하게는 약 25,000 Pa 내지 약 1 MPa, 보다 바람직하게는 약 50,000 Pa 내지 약 0.5 MPa 범위의 영 탄성 계수를 특징으로 할 수 있다. 탄력적인 탄성 성분을 가지고 있지만, 마이크로입자는 충분한 힘을 가하면 더 작은 조각으로 해체되거나 파괴될 수 있다; 그러나, 그러한 후속 조각은 더 작은 크기의 바디 또는 파편이기는 하지만 여전히 3차원 폴리머 매트릭스를 포함할 것이다. 즉, 하이드로겔 마이크로입자는 전단박화(shear thinning)되지 않으며, 용매 시스템에 따라 개별 매트릭스 바디의 팽윤이 발생할 수 있지만(즉, 액체가 매트릭스의 틈새 공간 또는 기공으로 이동함에 따라) 매트릭스 바디 자체가 용매 시스템에서 용해 또는 희석되기 쉽지 않다. 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 마이크로입자는 비가역적 하이드로겔로서 특징지어질 수 있으며, 즉 일단 해체되면 매트릭스 가교결합이 재형성되지 않거나 달리 회복 또는 자가 치유되지 않을 것이다.
마이크로입자를 형성하는데 사용되는 예시적인 폴리머 전구체 화합물은 알기네이트와 같이 강한 매트릭스를 형성하는 신속 겔화 천연 폴리머 뿐만 아니라 분지형 또는 비분지형 히알루론산, 분지형 또는 비분지형 관능화 히알루론산, 분지형 또는 비분지형 관능화 폴리에틸렌 글리콜, 히알루로난, 피브린, 키토산, 콜라겐, 폴리락트산, 폴리(L-락트산), 폴리락트-코-글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리비닐 알코올 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 저속 겔화 폴리머 전구체(slow-gelling polymer precursor)를 포함한다. 매트릭스는 디티오트레이톨, 분지형 또는 비분지형 관능화 폴리에틸렌 글리콜, 디티올, 에틸렌 글리콜 비스-머캅토아세테이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머 화합물과 가교결합되는 가교결합제를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 관능화 폴리에틸렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 디티올, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디비닐 설폰, 폴리에틸렌 글리콜 디말레이미드, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. (상이한 폴리머 유형의 추가 가교결합제가 있거나 없는) 일종의 공유결합으로(covalently) 가교결합된 폴리머 백본을 포함하는 매트릭스는 균질할 수 있다. 매트릭스는 또한 고(≥500 kDA, 바람직하게는 ≥100 kDA) 및 저(≤100 kDA, 바람직하게는 ≤50 kDa) 분자량 폴리머 전구체의 조합과 같은 2 이상의 폴리머 전구체의 혼합물 및/또는 2 이상의 가교결합제의 혼합물을 포함해 이질적일 수 있다. 일반적으로, 전구체 용액에 포함된 폴리머 전구체의 양은 50% w/w 미만일 것이다. 그 양은 고분자량(≥500 kDa, 바람직하게는 ≥100 kDa), 다치환 폴리머, 예컨대 히알루론산에 대해 약 1% 내지 약 50% w/w, 및 PEGDA 또는 PEGMAL과 같은 저분자량 폴리머(≤100 kDa, 바람직하게는 ≤50 kDa)에 대해 약 5% 내지 약 50% w/w의 범위일 것이다.
적절한 가교결합제와 함께 하이드로겔을 형성하기 위해 사용될 수 있는 상이한 백본 화학으로부터의 반응성 그룹의 예가 아래 표에 열거되어 있다. 일부 반응은 UV 광에 의해 개시되는 반면 다른 반응은 화학 반응이다.
추가의 예시적인 전구체 화합물에는 비제한적으로 비알기네이트 다당류, 콜라겐/젤라틴, 키토산, 아가로스 등이 포함된다. 이들 전구체 화합물은 다중 아암을 갖는 분지형 폴리머 또는 단일 백본의 비분지형/선형 폴리머 사슬일 수 있다. 시각적 관찰을 위해 염료를 부착하여 추가로 관능화될 수 있다. 특히 바람직한 하이드로겔 전구체 화합물은 히알루론산, 또는 히알루론산/PEG 혼합물이다. 전구체 화합물(들)은 또한 IFG-1(인슐린 유사 성장 인자-1), TGF-베타1(형질전환 성장 인자-베타1), BMP-2(골 형성 단백질-2), GDF-5(성장 분화 인자-5)을 포함해 연골원성 성장 인자와 같은 다양한 생물학적 실체로 관능화될 수 있다. 대조적으로, IL-10(인터류킨 10) 및 TNF-알파(종양 괴사 인자 알파)와 같은 항염증성 사이토카인이 추가될 수 있다. 하이드로겔 제조 시 IFN-감마(인터페론 감마)와 같은 면역 조절 사이토카인이 전구체 화합물에 추가될 수도 있다. 이러한 분자는 마이크로입자 외부로의 단순 확산을 위해 간질 공극에 캡슐화되는 것과 달리 하이드로겔 매트릭스에 결합될 수 있다. 대조적으로, 예를 들어 투과성을 증가시키거나 도 11에 나타낸 바와 같이 하이드로겔의 추적을 허용하기 위해 하이드로겔의 물리적 특성을 변경할 수 있는 나노입자를 포함한 비치료적 화학 물질이 전구체 화합물에 추가될 수 있다.
하이드로겔의 지정된 최종 용도에 따라 생체적합성 하이드로겔이 또한 특히 바람직하다. 본원에서 사용되는 "생체적합성"이란 생체 조직에 유해하지 않으며, 보다 구체적으로 과도한 독성, 자극 또는 알레르기 반응 또는 면역원성 반응 없이 대상체(subject)에게 투여될 수 있고 어떠한 바람직하지 않은 생물학적 효과도 일으키지 않거나 유해한 방식으로 상호 작용하지 않는다는 점에서 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 것을 의미한다. 생체적합성 하이드로겔은 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 대상체에서 임의의 부작용을 최소화하도록 선택될 것이다. 하이드로겔 전구체와 함께 포함될 수 있는 추가적인 선택적 성분은 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 세포외 매트릭스의 기타 성분 등(이의 합성 버전 포함)을 포함한다.
마이크로입자의 가교결합화 프로파일은 전구체 화합물의 분자량뿐만 아니라 선택된 가교결합제, 가교결합화 조건 및 가교결합화 공정을 조정함으로써 조절할 수 있다. 예를 들어, 가교결합 동안 소적(droplet)/코어로부터 주변 환경으로 침출되는 분자의 능력을 제한함으로써 더 매끄러운 비드 표면 및/또는 더 강한 겔을 달성하도록 하기 위해 일부 실시양태에서 "더 치밀한" 또는 더 빠른 가교결합이 바람직할 수 있다. 이는 전구체 종의 분자량을 증가(예: ~≥40 kDa)시키고/거나 가교결합화 화학 또는 개시 방법을 조정하여 가교결합화 시간을 줄임으로써 달성할 수 있다. 가교결합화는 특정 하이드로겔 전구체 화합물에 따라 다양한 메커니즘으로 수행될 수 있다.
일반적으로, 마이크로입자를 제조하는 한 가지 기술이 본원에 참조로 포함되는 2015년 6월 3일에 출원된 미국 특허 제9,642,814호에 상세히 설명되어 있다. 이 방법은 용매 시스템에 분산되거나 용해된 하이드로겔 전구체 화합물과 2가 양이온(예를 들어, 칼슘, 바륨, 스트론튬 및 이들의 조합)으로 구성된 하이드로겔 전구체 용액을 제조하는 단계를 포함한다. 2가 양이온은 하이드로겔 전구체 화합물과 함께 용매 시스템에 분산되거나 용해된다. 2가 양이온은 100%로 취해진 용액의 총 부피를 기준으로 약 0.025 몰/리터 내지 약 0.25 몰/리터의 수준으로 용액에 포함되어야 한다.
하이드로겔 전구체 용액은 또한 선택적인 하이드로겔 가교결합제, 촉매, 첨가제, 매질, 영양소, pH 완충제, 밀도 조절제, 점도 조절제 등을 포함할 수 있다. 이어, 하이드로겔 전구체 용액을 알기네이트와 결합하여 하이드로겔 전구체 용액 주위에서 알기네이트의 겔화를 개시하여("인사이드 아웃(inside out)" 겔화 공정을 통해) 코어/쉘 마이크로입자를 생성한다. 각 코어/쉘 마이크로입자는 하이드로겔 전구체 용액을 포함하는, 액체 코어를 둘러싸는 알기네이트 쉘을 포함한다. 이는 일반적으로 알기네이트 조에 적하 또는 분무되는 전구체 용액의 소적을 생성/압출하는 것에 의한 바와 같이 알기네이트 조에 전구체 용액을 적가하는 것을 포함한다. 용액 중 알기네이트의 양은 다양할 수 있지만, 100%로 취해진 용액의 총 부피를 기준으로 약 0.1% 내지 약 2.0% 중량/부피 범위일 수 있다. 일반적으로, 알기네이트 용액의 점도는 하이드로겔 전구체 용액의 점도보다 낮아야 한다. 알기네이트 용액의 점도는 알기네이트 농도와 알기네이트 폴리머의 평균 분자량(즉, 알기네이트 분자의 길이 또는 사슬의 모노머 단위 수)에 따라 달라지며, 사슬이 길수록 유사한 농도에서 점도가 더 높아진다. 하나 이상의 실시양태에서, 알기네이트 용액의 점도는 실온(~20 내지 25 ℃)에서 약 1 내지 약 20 cP, 바람직하게는 약 1 내지 약 4cP의 범위일 것이다. 보다 구체적으로, 알기네이트 용액의 점도에 대한 하이드로겔 전구체 용액의 점도의 비율은 실온에서 1보다 커야 한다. 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 전구체 용액의 점도 대 알기네이트 용액의 점도 비는 약 1:1 내지 약 1000:1이다. 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 전구체의 점도 비는 약 20:1이다. 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 전구체 용액의 점도는 약 1 내지 최대 약 500 cP이며, 실온에서 약 40 내지 약 100 cP가 특히 바람직하다. 알기네이트 조의 pH는 약 6.2 내지 약 7.8, 바람직하게는 약 6.6 내지 약 7.4 범위여야 한다.
알기네이트 쉘은 안쪽에서 바깥쪽으로 형성되고 양이온이 전구체 용액 소적으로부터 침출됨에 따라 소적 주위에서 두꺼워진다. 즉, 소적에 양이온이 존재하면 조 중의 알기네이트가 표면에 응집되어 소적 주위에서 가교결합된다.
다음으로, 액체 코어에서 하이드로겔 전구체 화합물의 겔화가 예컨대 가교결합화 및/또는 중합에 의해 개시되어 코어/쉘 가교결합된 마이크로입자를 생성한다. 하나 이상의 실시양태에서, 코어/쉘 마이크로입자는 바람직하게는 용액에서 하이드로겔 매트릭스 가교결합제와 결합된다. 가교결합제는 알기네이트 쉘을 통해 코어/쉘 마이크로입자로 침출되어 하이드로겔 전구체 화합물의 겔화(가교결합화)가 일어남에 따라 3차원 하이드로겔 매트릭스를 형성한다. 가교결합제는 하이드로겔 전구체 화합물에 따를 것이지만, 생성된 가교결합된 매트릭스 내에서 달성되는 가교결합화 속도 및 수준을 제어하기 위해 다양할 수 있다. 일반적으로, 마이크로입자 형성에 사용되는 가교결합제의 양은 선택된 가교결합제 및 폴리머 시스템에 따라 약 0.5 mM 내지 약 30 mM, 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 20 mM, 보다 바람직하게는 약 2 mM 내지 약 15 mM, 보다 더 바람직하게는 약 2.5 mM 내지 약 10 mM, 보다 더욱 더 바람직하게는 약 2.5 mM 내지 약 5 mM의 범위일 것이다.
각각의 코어/쉘 가교결합화 마이크로입자는 알기네이트 쉘 및 가교결합된 3차원 하이드로겔 매트릭스를 포함하는 겔화된 코어를 포함한다. 가교결합화는 제조된 특정 전구체 용액에 따라 화학적으로 유도되거나, 열적으로 유도되거나, 광개시될 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 가교결합제는 알기네이트 조에 포함될 수 있고 알기네이트 쉘을 통해 확산되어 코어에서 하이드로겔 마이크로입자를 가교결합 할 수 있다. 대안적으로, 코어/쉘 마이크로입자는 하이드로겔 마이크로입자 코어에서 가교결합화를 개시하기 위해 UV 방사원에 노출될 수 있다. UV 노출 시간은 약 1분 내지 약 10분, 바람직하게는 약 2분 내지 약 8분, 보다 바람직하게는 약 2.5분 내지 약 5분이다. UV 노출 파장은 선택된 광개시제 및/또는 폴리머 시스템에 따라 달라질 것이지만, 일반적으로 약 100 nm 내지 약 400 nm, 바람직하게는 약 315 nm 내지 약 400 nm, 보다 바람직하게는 약 365 nm 범위일 것이다.
적합한 가교결합제는 광- 또는 열-개시 가교결합제, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 비닐-설폰, 디티올 등과 같은 화학적 가교결합제를 포함하며, 알기네이트 조의 일부로 포함될 것이다. 자체 가교결합화 하이드로겔 전구체도 사용될 수 있다. 이들 실시양태에서, IRGACURE® 2959(2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논) 또는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일-포스피네이트(LAP)와 같은 광개시제가 촉매로서 하이드로겔 전구체 용액에 포함될 수 있다. 광개시제는 또한 알기네이트 조에 포함될 수도 있다. 화학적 가교결합화 시스템의 경우, 가교결합제는 전형적으로 알기네이트 조에 제공된다. UV 개시 가교결합화 시스템의 경우, 가교결합제는 주요 폴리머 (백본) 종과 함께 알기네이트 조 또는 하이드로겔 전구체 용액에 포함될 수 있다.
전구체 화합물이 가교결합 반응을 통해 최종 생성물에서 화학적으로 변경되어 입자 형태의 다공성 탄성 고체를 특징으로 하는 가교결합된 하이드로겔 매트릭스를 생성한다는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 매트릭스는 티오에테르 및 에스테르 가교결합 연결(bond)을 함유하는 PEG 및 HA 폴리머의 가교결합된 네트워크로 본질적으로 구성된다(또는 심지어는 이로 구성된다)(예를 들어, 티올화 HA의 경우). 그러나, 매트릭스는 네트워크에 남아 있는 미반응 전구체 화합물, 관능기 등을 미량 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 가능한 하이드로겔 매트릭스 및 가교결합의 다른 예는 실시예에 설명되어 있다. 이 목록은 예시를 제공하는 것으로 전부는 아니다. 사용될 수 있는 백본 분자의 예에는 키토산, 아가로스, 콘드로이틴 설페이트 또는 분자 조합이 포함된다. 백본 사이에 형성되는 결합은 티오에스테르 + 에스테르, 티오에스테르 + 에스테르 및 베타 탄소 상의 메틸, 티오에테르 설폰 또는 티오에테르 숙신이미드와의 화학 결합을 포함한다. 그러나 다른 화학 결합도 사용될 수 있다. 광 (자유 라디칼) 결합은 에스테르와 에테르 또는 아미드와 에테르를 포함할 수 있다. 가능한 조합이 사실상 무한하도록 활용될 수 있는 점점 더 복잡한 조합이 있음이 이해될 것이다.
일단 코어가 가교결합되면, 알기네이트 쉘을 제거하여(예를 들어, 킬레이트제 및/또는 초음파 처리와 같은 기계적 교반을 사용하여) 본원의 다른 곳에서 설명된 특성을 갖는 자립형 하이드로겔 마이크로입자 또는 마이크로비드를 생성한다. 즉, 알기네이트 쉘은 최종 제품의 일부가 아니며 마이크로입자의 사용 전에 항상 제거된다. 생성된 하이드로겔 마이크로입자는 메쉬 스크린 또는 기타 장치를 사용하여 용액으로부터 수집할 수 있고, 필요에 따라 매질에서 세척하거나 현탁시킬 수 있다.
다른 제조 방법에는 이중 에멀젼, 스프레이 및 압출이 포함된다. 제조 방법에 관계없이, 생성된 하이드로겔 매트릭스는 액체 및 기체에 투과성이지만 흐름을 나타내지 않고 정상 상태에서 무결성을 유지하는 반강성 네트워크인 것으로 특징지어진다. 하이드로겔 마이크로입자는 코어-쉘형 캡슐과 같이 뚜렷한 쉘을 갖는 것이 아니라, 비드 전체에 충전재를 보유하는 매트릭스형 캡슐이다. 위에서 언급한 바와 같이, 하이드로겔 마이크로입자는 자립체이기도 하다. 하나 이상의 실시양태에서, 생성된 마이크로입자는 모양이 실질적으로 구형이다(구형 바디는 반드시 완벽하게 원형일 필요는 없으며 타원형, 장방형, 난형 등일 수 있음이 인정된다). 유리하게는, 입자 크기는 선택된 소적 생성기의 능력에 따라 고도로 맞춤화될 수 있다. 하나 이상의 실시양태에서, 생성된 하이드로겔 마이크로구체 또는 마이크로입자는 평균 (중간) 최대 단면 표면 대 표면 치수(즉, 구형 또는 타원 마이크로구체의 경우, 그 직경)가 30 μm 초과이고, 일부 경우에는 300 μm를 초과한다. 하나 이상의 실시양태에서, 생성된 하이드로겔 마이크로구체 또는 마이크로입자는 약 5 mm 미만의 평균 (중간) 최대 표면-대-표면 치수를 갖는다. 바람직하게는, 생성된 하이드로겔 마이크로구체 또는 마이크로입자는 약 2 mm 미만, 보다 바람직하게는 약 30 μm 내지 약 2 mm, 보다 더 바람직하게는 약 50 μm 내지 약 1.5 mm, 보다 바람직하게는 약 150 μm 내지 약 1.5 mm, 보다 더 바람직하게는 약 300 μm 내지 약 1.4 mm 범위의 평균 (중간) 최대 표면-대-표면 치수를 갖는다. 일부 경우, 크기가 약 30 μm에서 약 750 μm 또는 500 μm 범위인 더 작은 마이크로입자가 형성될 수 있다. 특정 적응증에서는 단일 적용을 위해 다양한 범위의 크기를 생성하는 것이 유리할 수 있다. 다른 상황에서는, 제품이 보다 균일한 범위의 마이크로입자 직경을 갖는 것이 유리할 수 있다. 용이한 참조를 위해, 이러한 단면 치수는 본원에서 단순히 마이크로입자의 "크기"로 지칭된다. 어떤 경우에도, 본 발명의 하이드로겔 마이크로입자는 나노크기가 아니며 나노입자 또는 임의의 다른 종류의 나노결정 형태로 간주되지 않을 것이다.
마이크로입자의 내구성은 폴리머 전구체 질량 분율 또는 분자량, 가교결합제 분자량, 가교결합제와 폴리머 전구체의 비율, 가교결합제 가수분해, 가교결합 동역학, 가교결합 시간, 예를 들어 UV 노출 시간, 및 이들의 조합과 같은 제형 및/또는 가공 파라미터를 비롯한 마이크로입자의 다양한 파라미터를 변경하여 조정할 수 있다. 추가적인 하이드로겔은 2020년 6월 5일에 출원된 공동 계류 중인 PCT/US2020/036361에 설명되어 있으며, 그 전문은 참조로 본원에 포함된다.
본 마이크로입자는 소분자 치료제 또는 세포 또는 조직의 전달을 위한 것이 아니고, "빈(empty)" 것이며 - 즉, 그 안에 캡슐화되거나 그에 부착된 약물, 생물제제, 세포, 조직 또는 기타 치료 페이로드가 실질적으로 없다. 마이크로입자는 또한 실질적으로 금속이나 플라스틱이 없다. 본원에서 사용된 "실질적으로 없는"이란 용어는 제조 공정에서 부수적인 불순물이 발생할 수 있거나 잔류/미량의 성분이 남을 수 있지만 조성물에 성분을 의도적으로 첨가하지 않은 것을 의미한다. 이러한 실시양태에서, 하이드로겔 전구체 용액 조성물은 100 중량%로 취해진 용액의 총 중량을 기준으로 약 0.05 중량% 미만, 바람직하게는 약 0.01 중량% 미만, 보다 바람직하게는 약 0 중량%로 이러한 성분을 포함한다. 본원에서 고려되는 유일한 페이로드는 마이크로입자를 시각화하는 데 사용될 수 있는 염료 또는 기타 검출 가능한 라벨과 같이 본질적으로 비치료적인 것이다.
또한 약제학적으로 허용가능한 전달 비히클(delivery vehicle)에 현탁된 다수의 3차원 하이드로겔 마이크로입자를 포함하는 조성물이 본원에 기술된다. 생성된 관절액 보충요법제(viscosupplement)는 100 중량%로 취해진 관절액 보충요법제의 총 중량/부피를 기준으로 약 0.1% 내지 약 60% wt/wt, 바람직하게는 약 3% 내지 약 60% wt/wt의 마이크로입자를 포함할 것이다. 비히클은 바람직하게는 작은 게이지 바늘을 통하는 것과 같이 이식 부위에서 국부 전달(직접 주사)에 적합하도록 선택된다. 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 마이크로입자는 적합한 수성 비히클로 재구성되기 전에 건조 분말로서 동결건조되고 저장될 수 있다. 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 마이크로입자는 저장을 위해 동결 보존될 수 있으며 해동 시 매트릭스 품질 저하를 나타내지 않는다.
하나 이상의 실시양태에서, 관절액 보충(viscosupplementation) 방법이 본원에서 구상된다. 이 방법은 일반적으로 대상체의 이식 부위 내로 또는 그 근처에 다수의 하이드로겔 마이크로입자를 주입 또는 이식하는 것을 포함한다. 이식된 하이드로겔 마이크로입자는 이식 부위의 조직 사이에서 완충 작용을 제공하고/거나 마찰 또는 마모를 줄인다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 마이크로입자는 또한 이식 부위에서 대상체에게 유리한 생리학적 반응을 유도한다. 예를 들어, 마이크로입자는 이식 부위에서 염증 반응을 유도하지 않는 반면, 연골 생성 및/또는 생성된 연골의 품질(매끄러움) 증가와 같은 치유 증가를 촉진한다. 하나 이상의 실시양태에서, 본원에서 구상되는 방법은 관절에 다수의 마이크로입자를 도입함으로써 통증 감소 및/또는 관절에 관절액 보충요법을 제공하는 것을 포함한다. 마이크로입자는 연골 접촉을 방지하기 위해 연골 표면 사이의 구조를 유지하고 완충 작용을 하는 데 도움이 된다. 또한, 점탄성 특성으로 인해, 관절 및 로드 부하 중에 탄성 반응을 보여 로드를 흡수하고 연골 접촉을 방지하는 동시에 연골 표면이 낮은 마찰로 서로를 가로질러 이동(마이크로입자 바디의 매끄러운 외부 표면으로 인해)할 수 있음이 입증되었다. 이것은 결과적으로 이식 부위의 통증, 염증 및 추가 손상을 더욱 감소시킨다.
본 방법은 무릎, 둔부, 발목, 손목, 팔꿈치, 어깨, 발가락, 손가락 및 척추를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 인간 또는 동물 관절에 적용될 수 있다. 바람직하게는, 마이크로입자 또는 마이크로입자를 포함하는 조성물은 관절의 관절 내 공간, 보다 바람직하게는 관절의 활액포 부분에 도입된다. 관절은 OA에 영향을 받거나 OA가 발생할 위험이 있는 관절일 수 있다. 방법은 또한 마이크로입자를 외과용 윤활제로서 사용하는 것을 포함하며, 여기서 마이크로입자는 외과용 메쉬 등과 같은 외과 장치(surgical device)의 이식 부위 내 및/또는 주변 또는 기관(organ) 사이에 적용되어 주변 조직과의 마찰과 자극을 감소시킨다. 본 방법은 또한 상처 치유뿐만 아니라 진피 충전제로서의 마이크로입자의 용도를 포함한다.
치료 방법을 위해, 마이크로입자는 대상체에게 투여하기에 적합한 전달 비히클에 현탁되거나 분산된다. 예시적인 전달 비히클은 마이크로입자가 분포된 생체적합성 액체 현탁액, 점성 용액, 퍼티, 페이스트 또는 겔, 예컨대 합성 활액 및 비가교결합된/저농도 HA 액체 용액을 포함할 것이다. 식염수 또는 기타 완충 용액도 전달용 비히클로 사용될 수 있다.
보다 일반적으로, 본 방법은 환자의 염증, 손상, 관절염, 수술, 변성 등의 부위를 치료하기 위해 치료적으로 효과적인 양을 국소적으로 투여하는 것을 포함한다(또는 이로 이루어진다). 투여량(dosage)은 다양한 관절 또는 외과적 적용 및 치료할 환자의 크기/종에 따라 달라질 것이다. 인간의 무릎, 어깨, 척추 또는 천장 관절의 치료를 위한 주사 투여량의 예는 관절당 약 0.25 mL 내지 약 10 mL, 보다 바람직하게는 약 1 mL 내지 약 4 mL를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인간 둔부의 경우, 부피 범위는 관절당 약 0.5 mL 내지 약 15 mL, 또는 보다 바람직하게는 약 1 mL 내지 약 6 mL일 수 있다. 인간의 손 또는 발 및 발가락과 같은 기타 작은 관절에 적용하려면 관절당 약 0.01 mL 내지 약 2 mL 범위의 더 적은 용량이 필요할 것이다. 수의과적 적용에서, 말 관절은 구절, 무릎 또는 뒷무릎 관절에 대해 관절당 약 0.5 mL 내지 약 15 mL의 더 큰 부피가 필요할 것이다. 개와 고양이는 관절 적용을 위해 약 0.10 mL 내지 약 5 mL의 더 적은 용량이 필요할 것이다. 주사는 환자에 대한 투여 빈도를 줄이기 위한 것이지만 동일하거나 상이한 관절에 대한 반복적인 치료가 필요할 수 있는 것이 예상된다.
주입된 조성물은 좁은 크기 범위 내, 예를 들어 직경 700 내지 1000 mm의 마이크로입자의 단일 제형을 함유할 수 있다. 반대로, 조성물은 상이한 마이크로입자 크기를 갖는 제형의 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 상이한 시점에 분해되거나 상이한 강성 특성을 갖는 마이크로입자의 조합을 갖도록 상이한 하이드로겔 제형을 혼합하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 제1 특징(예를 들어, 크기 범위, 강성 및/또는 분해 프로파일 등)을 갖는 마이크로입자의 제1 집단 및 제2 특징(예를 들어, 크기 범위, 강성 및/또는 분해 프로파일 등)을 갖는 마이크로입자의 제2 집단을 포함하는 이종 마이크로입자의 조성물이 본원에서 구상되며, 여기서 제2 특성은 제1 특성과 상이하다. 이종 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 상이한 마이크로입자 제형을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 점탄성 마이크로입자는 가교결합되지 않거나 부분적으로만 가교결합된 점성 HA 또는 다른 점성 유체 관절 보충제(담체 비히클로서)와 혼합되어 적합한 치료 제형을 생성할 수 있다. 제품은 예를 들어 1:10 비율의 마이크로입자 대 부분적으로 가교결합된 HA와 같은 점성 유체 관절 보충제로 구성될 수 있다.
투여는 일반적으로 염증, 손상, 관절염, 수술, 변성 등의 부위 또는 그 근처, 예컨대 관절에 또는 조직 사이에 마이크로입자 조성물을 직접 주사하는 것을 포함한다. 유리하게는, 내구성 마이크로입자는 일반적으로 치료적으로 효과적인 기간 동안 국부 영역에 한정된다. 본원에서 사용되는 용어 "치료적으로 효과적인"이라는 용어는 연구자 또는 임상의가 추구하는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응, 특히 일부 소정 치료 효과를 이끌어낼 양 및/또는 기간을 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 실시양태에서, 치료적으로 효과적인 양 및 기간은 염증을 감소시키고 염증, 손상, 관절염, 변성 등의 부위의 치유를 개시하거나 촉진하는 것이다. 당업자는 상태가 완전히 근절되지 않고 부분적으로 개선되더라도 양 또는 기간이 치료적으로 효과적인 것으로 간주될 수 있음을 인정할 것이다.
필요한 경우 추가 주사 또는 주입을 통해 치료를 반복할 수 있다. 당업자는 치료 프로토콜이 특정 염증, 손상, 관절염, 수술, 변성, 병태 또는 치유 상태, 및 의사 또는 수의사 또는 연구원의 선호도에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다.
유리하게는, 하이드로겔 마이크로입자는 내구성이 있으며, 즉 37℃의 PBS(인산염 완충 염수)에서 적어도 6개월 동안의 보관 조건 하에 파괴 또는 분해되지 않는다. 즉, 내구성 있는 마이크로입자는 6개월을 초과하는 "시험관 내 저장 안정성"을 가진다. 하나 이상의 실시양태에서, 내구성 하이드로겔 입자는 현재 데이터가 마이크로입자의 보존 가능 기간이 4년을 초과함을 예시함으로써 실온(27℃)에서 1년 이상 동안 PBS에서 저장 안정성이다. 바람직하게는, 이러한 내구성 있는 하이드로겔 마이크로입자가 이식되는 경우, 이들은 정상적인 생리학적(식균작용, 분해, 흡착 등을 통한 이물질의 정상적인 생체 내 제거로도 알려짐) 조건 하에서 적어도 3개월, 보다 바람직하게는 적어도 6개월 동안 분해되지 않을 것이다. 따라서, 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 마이크로입자를 사용한 관절액 보충요법의 혜택이 단일 주사로 달성될 수 있으며, 장기간 효과가 유지된다. 즉, 이들 본 발명의 관절액 보충요법을 사용하는 치료 요법은 단일 치료 요법 동안 다중 주사를 필요로 하지 않을 뿐만 아니라, 기존 치료와 같이 매주 또는 매월 간격으로 하이드로겔 마이크로입자를 투여할 필요도 없다. 하나 이상의 실시양태에서, 하이드로겔 마이크로입자는 단일 주사로 투여되며, 이는 적어도 6주 동안, 일부 경우에는 적어도 10주 이상 동안 반복될 필요가 없다.
본 발명의 조성물 및 마이크로입자의 특장점은 이식 시 다른 유형의 마이크로입자와 비교하여 개선된 "점착성(stickiness)"이다. 즉, 마이크로입자는 이식 부위에서 생체 내 조직에 부착되거나 달라붙는 경향을 가지며 아래 실시예의 사진에서 볼 수 있다. 이것은 이식 부위에 국소 윤활을 유지함으로써 치료 효과를 더욱 향상시킨다. 또한, 마이크로입자는 이식 부위에서 염증 반응 및/또는 림프구 또는 콜라겐 고리 형성을 포함하는 어떠한 이물질 반응의 유도도 나타내지 않는다.
하기 표 A는 현재 시판되고 있는 HA 기반 관절 윤활제를 비교하고 이를 두 가지 버전의 본 발명의 마이크로입자(HA로 제조된 것과 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 제조된 것)와 비교하여 제공한다. 표는 고도의 가교결합화 및 크게 확장된 강성과 함께 최종 제품의 훨씬 더 높은 분자량을 보여준다. 강성은 체내 하이드로겔의 지속 시간과 관련된 가교결합제의 강도와 직접적인 관련이 있다. 강성 및 그에 따른 지속 시간은 본 발명의 마이크로입자에서 훨씬 더 크다.
외과 수술은 해당 부위에 섬유성 흉터가 형성되는 것을 방지하기 위해 종종 외과 개입의 내부 부위에 윤활제 배치를 필요로 한다. 이는 탈장 회복 또는 심박조율기 배치를 위해 메쉬를 사용하는 경우와 같이 장치를 장기간 유지하려는 의도로 신체에 삽입할 때 특히 중요하다. 수술 시 윤활제의 적용은 종종 흉터 형성을 억제하고 회복을 향상시킬 수 있다.
인간 관절 질환 및 외상 치료에서 가교결합된 마이크로입자에 대한 수많은 인간 적용 외에도, 수의과적 실습에서 제품에 대한 광범위한 적용이 있다. 여기에는 말의 절뚝거림과 개와 고양이의 관절 이형성증이 포함된다. 하기 표 B는 본 발명의 마이크로입자의 특성을 수의과 시장에서 판매되는 제품과 비교한 것을 요약한 것이다.
상기 표에 보고된 특성은 본 발명의 마이크로입자가 현재 이용가능한 제품에 비해 더 긴 기간 동안 더 높은 가교결합화 및 훨씬 더 큰 강성을 갖는다는 것을 입증한다.
본 발명의 다양한 실시양태의 추가 이점은 본원의 개시 내용 및 하기 실시예를 검토할 때 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 기술된 다양한 실시양태는 본원에 달리 표시되지 않는 한 반드시 상호 배타적이지 않다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 일 실시양태에 기술되거나 묘사된 특징은 다른 실시양태에도 포함될 수 있지만 반드시 포함되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 특정 실시양태의 다양한 조합 및/또는 통합을 포함한다.
본원에 사용된 문구 "및/또는"은 2개 이상의 항목 목록에서 사용될 때 나열된 항목 중 어느 하나가 단독으로 사용될 수 있거나 나열된 항목 중 2개 이상의 임의의 조합이 사용될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 조성물이 성분 A, B 및/또는 C를 함유하거나 배제하는 것으로 기술되는 경우, 조성물은 A만을 함유하거나 배제할 수 있거나; B만을 함유하거나 배제할 수 있거나; C만을 함유하거나 배제할 수 있거나; A와 B의 조합을 함유하거나 배제할 수 있거나; A와 C의 조합을 함유하거나 배제할 수 있거나; B와 C의 조합을 함유하거나 배제할 수 있거나; A, B 및 C의 조합을 함유하거나 배제할 수 있다.
본 기재 내용은 또한 수치 범위를 사용하여 본 발명의 다양한 실시양태와 관련된 특정 파라미터를 정량화한다. 수치 범위가 제공될 때, 그러한 범위는 그 범위의 하한값만 인용하는 청구항 한계뿐만 아니라 그 범위의 상한값만 인용하는 청구항 한계에 대해 문자 그대로 지원을 제공하는 것으로 해석되어야 함을 이해해야 한다. 예를 들어, 약 10 내지 약 100의 개시된 수치 범위는 "약 10 초과"(상한 없음)를 인용하는 청구항 및 "약 100 미만"(하한 없음)을 인용하는 청구항에 대해 문자 그대로 지원을 제공한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명에 따른 방법을 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시로서 제공되며 그 안의 어떤 것도 본 발명의 전체 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 됨을 이해해야 한다.
최종 하이드로겔 마이크로입자의 특성
가교결합된 마이크로입자는 코어 쉘 구형화, 에멀젼, 알기네이트의 압출, 패턴화 몰드 및 인쇄를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 제조 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 마이크로입자는 전형적으로 바늘을 통해 주사하거나 카테터를 통해 주입하기에 충분히 작을 것이다. 18 내지 25G 바늘을 통과할 수 있어 관절강이나 기타 체강에 쉽게 주입될 수 있도록 400 μm 이하에서 1,500 μm까지 포함할 수 있는 크기 범위의 마이크로입자를 제조하였다. 마이크로입자의 크기와 모양은 치료 목적에 맞게 변경될 수 있다. 도 1은 구형(도 1A), 눈물 방울(도 1B), 타원형(도 1C) 및 유기 대형 튜브 모양(도 1D)으로서의 마이크로입자의 예를 도시한다. 제품은 또한 튜브형, 직사각형 또는 기타 모양으로 형성될 수 있다. 또한, 도 1E에 도시된 바와 같이 혼합 모양체를 제조하여 동일한 제품에 사용할 수 있다. 입자는 전단과 같은 물리적 힘을 견딜 수 있다. 그렇지만, 과도한 힘을 가하면 더 작은 조각으로 분해되는데 뚜렷한 물리적 형태는 유지한다. 이는 물리적 경계와 뚜렷한 모양을 유지하지 않는 페이스트형 윤활 겔과 다르다. 도 2는 전단력에 노출되기 전(도 2A) 및 노출 후(도 2B)의 MeHA 마이크로입자를 나타낸다. 전단력에 노출되기 전(도 2C)과 노출 후(도 2D) 형광 프로브가 함침된 AHA 마이크로입자가 나타나 있다.
마찬가지로, 마이크로입자는 도 3에 도시된 바와 같이 평균 200 내지 2000 미크론의 광범위 크기로 생성될 수 있다. 큰 마이크로입자는 도 3A에, 중간 크기는 도 3B에, 작은 마이크로입자는 도 3C에, 혼합 크기는 도 3D에 도시되어 있다.
가교결합된 마이크로입자는 상이한 전구체 폴리머 및 가교결합화 방식을 이용함으로써 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 도 4는 티올화 히알루론산(ThHA), 폴리에틸렌 글리콜 디티올 말레이미드(PEG-Thiol Mal), 디아크릴레이트 폴리에틸렌 글리콜 폴리에틸렌 디아크릴레이트(PEGDA), 알기네이트, 폴리에틸렌 비닐 설폰 및 아크릴화 히알루론산(AHA)으로 제조된 마이크로입자의 몇 가지 예를 제공한다.
하이드로겔 마이크로입자는 유리하게는 히알루론산(HA) 및 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA), 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드(PEGMAL), 다중 아암(multi-arm) PEG, 히알루로난, 피브린, 키토산, 콜라겐, 헤파린, 폴리락트산(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리락트산-코-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 메타크릴산(MAA), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA), 폴리아크릴아미드(PAM) 세포외 기질, 및 이들의 관능화 변이체(예를 들어, 아크릴레이트화, 메타크릴레이트화, 티올레이트화 등) 또는 이들의 다중 아암 변이체(예를 들어, 4-아암 PEG, 8-아암 PEG)와 같은 다양한 저속 겔화 중합체 전구체로부터 제조될 수 있다. 그러나, 임의의 가교결합가능한 하이드로겔 전구체 화합물이 본 발명과 함께 사용하기에 적합할 것이며, 바람직한 화합물은 생체적합성 호모폴리머 또는 코폴리머, 특히 블록 코폴리머뿐만아니라 다른 유형의 가교결합가능한 모노머(monomer) 및/또는 올리고머(oligomer)이다.
최종 제품의 일부 화학적 버전에 대한 추가 특성이 표 1에 제공된다. 첫 번째 행은 가교결합 전 전구체 화학, 질량 분율 및 점도(50 내지 190cST 범위)를 포함한 다양한 전구체 특성을 나타낸다. 광개시 및 화학 반응(표 1)을 포함한 다양한 가교결합 메커니즘이 이용될 수 있으며, 이와 같은 상이한 가교결합 접근법은 표 1에 나타낸 바와 같이 경화하는 데 상이한 시간을 필요로 한다.
최종 마이크로입자는 0.39 내지 3.6% 범위의 매우 상이한 질량 분율과 28 내지 256 범위의 후속 Q 값(팽윤비)의 큰 변동을 가질 수 있다(표 1). 입자 크기의 평균 직경과 크기 범위도 397에서 1156까지 다양했으며 팽윤비와 관련이 있었다. 팽윤비는 일부 하이드로겔에 대해 시간 경과에 따라 변하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, AHA는 처음에 팽윤비의 현저한 증가를 보인 다음 추적한 42일에 걸쳐 계속 상승하였다(도 5). 대조적으로, PEGDA 마이크로입자는 같은 기간 동안 팽윤비가 변하지 않았다. 도 6에 도시된 상이한 하이드로겔의 유변학적 특성의 차이가 Q 값의 차이와 관련된다. 도면으로 입증된 바와 같이 두 하이드로겔 모두 E'가 E"보다 큰 것으로 입증되었으며, 이는 조성이 고체와 유사함을 나타낸다. 하이드로겔 마이크로입자의 확산 특성은 팽윤 및 유변학적 값과도 관련이 있다. 예를 들어, AHA 마이크로입자는 PEGDA 마이크로입자에 비해 더 높은 Q 값으로 더 확산된다(도 7).
상이한 가교결합 접근법 외에, 마이크로입자의 특성을 변경하기 위해 추가적인 화학적 변경이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 완전히 가교결합된 입자 내의 미반응 종이 도 8에 도시된 바와 같이 추가로 변형될 수 있다. 적용에 따라 입자와 주변 조직의 상호 작용을 변경하여 반응성을 낮추거나 더 높은 반응성으로 만들 수 있다. 이 예에서, 낮은 수준의 잔류 반응성 그룹은 보통 가교결합 후 하이드로겔 내에 존재한다. 이들 그룹은 필요에 따라 다운스트림 관능화에 활용될 수 있다. 이 예에서, 일관능성 PEG-말레이미드 "분자 캡"이 잔류 티올 그룹을 켄칭하는 데 사용된다. 실시예에서 볼 수 있듯이, 하이드로겔 구체를 분자 캡으로 처리하면 염료와 쉽게 결합하는 비처리 구체와 달리 말레이미드 공액 형광 염료의 결합을 성공적으로 차단하였다.
마이크로입자의 단일 배치는 좁은 범위의 직경 크기 또는 광범위한 크기를 가질 수 있으며 주어진 적용에 맞게 설계할 수 있다. 도 9는 2개의 상이한 하이드로겔 제형으로부터의 배치 단분산도의 차이를 도시한다.
시험관 내 분해 속도
이들 비가교결합된 형태의 HA와 대조적으로, 본 발명의 완전히 가교결합된 HA 마이크로입자는 시험관 내 반감기가 약 50일이었고, 반면에 폴리에틸렌 글리콜로 제조된 마이크로입자는 시험관 내에서 무기한 지속 기간을 가졌다(도 10). 이 실험에서 마이크로입자는 50일 동안 37℃ 및 10% 습도에서 유지되었다.
체내에서 마이크로입자의 분해는 히알루로니다아제와 같은 내인성 효소에 좌우된다. 예비 단계의 시험관 내 연구가 완전히 가교결합된 마이크로입자의 효소적 분해를 입증할 것이다. 생체 내에서 마이크로입자 분해를 모니터링할 수 있도록 하기 위해 형광성 마이크로입자를 개발하였다. SAMSA 플루오레세인을 도 11A에 나타낸 전구체 AHA 용액에 첨가하였다. 도 11B는 PEGDA 마이크로입자의 형광 표지화를 나타낸다.
Q 값이 더 높은 마이크로입자(AHA 마이크로입자)의 생체 내 분해율을 체중 부하 래트 무릎에서 모니터링하였다. 선택된 시점에, 무릎에서 나머지 마이크로입자에 대해 분석하였다. 도시된 바와 같이, 이 제형은 대략 6주에 생체 내에서 분해되었다(도 12). 그러나, 생체 내 분해 시간은 상이한 가교결합제, 가교결합화 밀도, 가교결합제의 길이 및 기본 폴리머 농도와 같은 적절한 화학적 변형에 의해 필요에 따라 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
마이크로입자의 생체적합성
마이크로입자의 생체적합성이 도 13에 예시되어 있으며, 여기서 하이드로겔 입자는 동일한 기술을 사용하여 PEGDA, ThHA 또는 AHA로 제조되었다. 마이크로입자를 래트에 복강내 주사하고 2주 후 손상되지 않은 하이드로겔 미립구가 여전히 해당 영역에서 발견되었다. 섬유화 영역(콜라겐 고리) 및 염증 반응(대식세포 및 림프구)을 2명의 맹검 기술자가 각 마이크로구체 주변의 4개의 다른 위치에서 측정하였다. 일부 마이크로입자를 둘러싼 곳에서 제한된 섬유화만이 발견되었다(도 13). 실제로, AHA 마이크로비드의 28.8%만이 주변 섬유화 영역의 징후를 보인데 반해, 보다 더 많은 PEGDA 비드가 약간의 섬유화를 보였다(표 2). AHA 마이크로입자 주변에 섬유화가 발견된 경우 이는 다른 성분으로 만들어진 입자보다 훨씬 작았다. 또한, 마이크로입자를 둘러싼 염증 세포의 영역폭을 측정하였다. PEGDA에 대해 샘플의 71% 및 AHA 마이크로입자에 대해 16%로, 소수의 샘플이 마이크로입자를 둘러싼 염증 세포의 징후를 보였고 해당 영역의 평균 폭은 미미하였다(표 2).
이물질 반응 PEGDA AHA
섬유화가 있는 구체의 % 92.4% 28.8%
존재하는 경우 섬유화의 폭 72.28 +/- 37.82 30.63 +/- 32.83
림프구성 반응이 있는 구체의 % 70.5% 16.3%
존재하는 경우 림프구 영역의 폭 56.93 +/- 83.52 26.01 +/- 76.81
골관절염 관절의 보호
골관절염을 관리하는 데 있어 마이크로입자의 효과를 검사하기 위해 관절염이 있는 래트에게 작은 AHA 마이크로입자를 주사하였다. 두 상이한 래트 골관절염 모델, 즉 내측 반월판(DMM) 불안정화 모델 및 관절 연골 결함 모델(CD)을 검사하였다.
CD 모델의 경우, 9-12주령의 수컷 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 래트를 무균 상태에서 직접 손으로 관절 연골에 손상을 입혔다. 슬개골 주위 내측 절개(medial parapatellar incision)를 통해 무릎 관절을 노출시키고 관절낭을 절개하였다. 슬개골을 측방으로 변위시키고 수술 동안 슬개건이 손상되지 않게 조심스럽게 보호하였다. 대퇴골의 슬개골 홈에 2.0 x 4.0 mm의 관절 연골 결손(CD)을 생성시켰다. 조직 파편을 생리 식염수로 헹구었다. 수술 후 관절의 안정성과 운동성을 유지하기 위해 무릎 관절 주위의 중요한 인대와 기타 인대를 보존하였다. 관절 연골 결손을 생성한 후 슬개골과 슬개건을 원래의 위치로 축소시켰다. 수술 후 무릎의 적절한 사용을 보장하기 위해 관절낭을 봉합해 닫았다.
DMM 모델의 경우, 9-12주령의 스프래그-다우리 래트를 해부 현미경 하에서 무릎 관절에 수술을 수행하기 전에 마취시켰다. 슬개골 주위 내측 절개를 통해 무릎 관절을 노출시키고 관절낭을 절개하였다. 수술 동안 슬개골과 슬개건이 손상되지 않도록 조심스럽게 보호하였다. 내측 반달정강 인대(medial meniscotibial ligament: MML)를 내측 반월판을 경골 고평부에 고정하였다. MML을 조심스럽게 노출시킨 후, 외과용 가위로 절단하여 내측 반월판을 불안정화하여 외상 후 골관절염을 유도시켰다. 수술 후 관절의 안정성과 운동성을 유지하기 위해 무릎 관절 주위의 중요한 인대와 기타 인대를 보존하였다. 관절낭을 닫고 피부를 봉합하여 닫았다.
수술 후 4주째에, 두 동물 모델(DMM 및 CD) 모두에 대해 하이드로겔을 오른쪽 무릎에 주입하고 비히클(PBS 단독)을 왼쪽 무릎(대조군)에 주입하였다. 마이크로비드 주사 후 6주 또는 12주에 동물을 안락사시키고 무릎 관절을 수확하여 조직학적 및 기타 실험실 분석을 위해 처리하였다.
수집된 이미지의 예는 마이크로비드 주입에 따른 개선을 보여준다. 도 14는 마이크로비드 또는 비히클의 주입 12주 후 골관절염의 CD 모델에 따른 래트 무릎의 예를 제공한다. 전체 무릎 섹션을 도 14에 나타내었으며, 여기에는 빨간색 화살표로 식별된 움푹 들어간 부분인 연골이 제거된 부위가 명확히 표시되어 있다. 비히클 대조군(도 14A)의 주사를 받은 무릎에서 관절 표면은 들쭉날쭉하고 관절 표면에 연골에 대한 염색(빨간색)이 없다. 검은색 화살표로 표시된 짙은 빨간색은 치료에 영향을 받지 않은 성장판을 나타낸다. 마이크로입자를 받은 래트에는(도 14B), 관절 표면에 빨간색 염색이 있었으며, 이는 관절 표면에 연골이 남아 있음을 나타낸다. 또한, 관절 표면은 비히클(흰색 화살표)에 비해 가장자리가 들쭉날쭉하지 않고 더 매끄러웠다.
DMM 래트 골관절염 모델의 고배율 이미지가 도 15에 도시되어 있다. 비히클 또는 마이크로비드 주사 6주 후, 동물을 안락사시키고 조직을 연골(빨간색)에 대해 염색하였다. 더 높은 배율에서, 비히클-주입 대조군에서는 연골 결여와 함께 관절의 거친 가장자리가 명백하다(도 15A). 또, 마이크로비드를 받은 무릎은 더 많은 연골 조직(빨간색 염색)과 더 매끄러운 가장자리를 가지고 있다(도 15B).
마이크로비드의 보존 가능 기간
비공식적으로, 눈에 띄는 물리적 특성의 열화 없이 4년 이상 PBS 중 실온에서 PEG 기반 하이드로겔 마이크로비드가 유지되었다. 도 16은 실온에서 4년 이상 동안 물에 저장된 후 이미지화된 티올화 히알루론산의 2개의 예시적인 이미지를 제공한다. 공식적으로, 마이크로구체를 동결 보존하고 해동 후 구조적 무결성을 확정하였다.
최종 가교결합된 제품을 저속 동결 프로토콜을 사용하여 마이크로입자의 물리적 특성의 화학에 부정적인 영향없이 동결시킬 수 있었으며 37℃에서 약 2분 동안 놓아 두어 해동하였을 때 마이크로입자는 구조 및 표면 토포그래피를 유지하는 것으로 나타났다. 도 17은 -80℃에서 동결 보존하기 전과 동결 보존 및 해동 후 크기, 모양 또는 미세 구조의 변화를 보이지 않는 마이크로입자의 사진을 도시한다.

Claims (32)

  1. 인간 또는 동물 대상체(subject)의 관절 또는 수술 부위(surgical site)에서 관절액 보충(viscosupplementation)을 위한 방법으로서, 크기가 약 30 μm를 초과하고 어떠한 세포, 조직 또는 치료 화합물도 실질적으로 없는 다수의 다공성 점탄성 고체 하이드로겔 마이크로입자(porous viscoelastic solid hydrogel microparticle)를 상기 관절 또는 수술 부위에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 관절 또는 수술 부위에 또는 그 근처에 주사되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 공유결합으로(covalently) 또는 이온적으로 가교결합된 폴리머 화합물(ionically crosslinked polymer compound)의 3차원 매트릭스(3-dimensional matrix)를 갖는 자립체(self-sustaining body)를 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 다공성 점탄성 고체 하이드로겔 마이크로입자는 마이크로입자의 적어도 2개의 상이한 집단을 포함하고, 여기서 마이크로입자의 제1 집단은 제1 특징을 갖는 다수의 마이크로입자를 포함하고, 마이크로입자의 제2 집단은 제2 특징을 갖는 다수의 마이크로입자를 포함하며, 상기 제1 특징은 상기 제2 특징과 상이한, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 관절 또는 수술 부위에서 또는 그 근처에서 조직 사이에 완충 작용을 제공하고/거나 마찰을 감소시키는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 이식 부위에서 대상체에게 유리한 생리학적 반응을 유도하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 염증을 유도하지 않는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 이식 부위의 관절에서 생성된 연골의 양 또는 품질을 증가시키는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 이식 부위에서 관절 내 마찰을 감소시키고 완충을 위해 로드-부하(load-bearing)에 대해 탄력적인 반응(resilient response)을 제공하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 무릎, 둔부, 발목, 손목, 팔꿈치, 어깨, 발가락, 손가락 또는 척추의 관절에 도입되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 관절의 관절 내 공간으로 주사되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 상기 관절의 활액포(synovial capsule) 부분으로 도입되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 상기 대상체의 외과 장치(surgical device)의 이식 부위 내 및/또는 그 주위에 도입되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 외과 장치는 외과용 메쉬(surgical mesh)인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 진피 충전제(dermal filler)로서 피하적으로 도입되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 상기 대상체의 기관(organ) 사이에 도입되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 적합한 전달 비히클(delivery vehicle)에 현탁되거나 분산되는, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 전달 비히클은 완충 식염수(buffered saline solution), 점성 용액(viscous solution), 퍼티(putty), 페이스트(paste) 또는 겔(gel)인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 이식 부위에 직접 주사되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 관절 또는 수술 부위에 주사하기 위해 사전 충전 주사기(pre-loaded syringe)에 조성물로 제공되는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 치료적으로 효과적인 기간 동안 상기 이식 부위에 머무르는(confined), 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 정상적인 생리학적 조건 하에서 적어도 3개월 동안 분해 없이 상기 이식 부위에서 유지되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 마이크로입자는 정상적인 생리학적 조건 하에서 적어도 6개월 동안 분해 없이 상기 이식 부위에서 유지되는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 또는 동물 대상체는 매 3개월, 바람직하게는 매 3 내지 6개월, 바람직하게는 매 6 내지 12개월의 간격으로 투여되는 상기 하이드로겔 마이크로입자의 반복 투여량(recurring dosage)을 받는, 방법.
  25. 크기가 약 30 μm를 초과하고 어떠한 세포, 조직 또는 치료 화합물도 실질적으로 없는 다수의 다공성 점탄성 고체 하이드로겔 마이크로입자, 및 이를 투여하기 위한 설명서를 포함하는, 인간 또는 동물 대상체의 관절 또는 수술 부위에 관절액 보충을 위한 키트(kit).
  26. 제25항에 있어서, 상기 다수의 다공성 점탄성 고체 하이드로겔 마이크로입자는 동결건조되고, 상기 키트는 투여 전에 상기 하이드로겔 마이크로입자를 재구성하기 위한 별도의 용기(container)에 생물학적으로 적합한 비히클(biologically compatible vehicle), 또는 상기 하이드로겔 마이크로입자를 재구성하기 위한 설명서를 추가로 포함하는, 키트.
  27. 제26항에 있어서, 빈 주사기(empty syringe), 및 재구성 후 상기 하이드로겔 마이크로입자를 상기 주사기에 로딩(loading)하기 위한 설명서를 추가로 포함하는, 키트.
  28. 제25항에 있어서, 상기 다수의 다공성 점탄성 고체 하이드로겔 마이크로입자는 용액에 패키징(packaging)되고, 상기 용액은 투여 및 이를 위한 지침을 위해 주사기에 사전-로딩된, 키트.
  29. 제25항에 있어서, 상기 다수의 다공성 점탄성 고체 하이드로겔 마이크로입자는 용액에 패키징되고, 상기 키트는 빈 주사기와 상기 투여 전에 상기 주사기를 로딩(loading)하기 위해 용기로부터 용액을 인출할 수 있도록 구성된 별도의 용기에 상기 하이드로겔 마이크로입자, 및 투여를 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  30. 관절 내 관절 표면 및 조직을 윤활 및 완충하는 것에 의한 바와 같이 인간 또는 동물 대상체의 관절 또는 수술 부위를 치료하는 데 사용하기 위한 관절액 보충요법제(viscosupplement)로서, 크기가 약 30 μm를 초과하고 어떠한 세포, 조직 또는 치료 화합물도 실질적으로 없는 다수의 다공성 점탄성 고체 하이드로겔 마이크로입자를 포함하며 인간 또는 동물 대상체의 관절 또는 수술 부위에 도입되도록 구성된, 관절액 보충요법제.
  31. 제30항에 있어서, 다수의 다공성 점탄성 고체 하이드로겔 마이크로입자는 약제학적으로 허용가능한 비히클에 분산되는, 관절액 보충요법제.
  32. 관절 내 관절 표면 및 조직을 윤활 및 완충하는 것에 의한 바와 같이 인간 또는 동물 대상체의 관절 또는 수술 부위를 치료하는 데 있어서의, 관절액 보충요법제의 용도로서, 상기 관절액 보충요법제는 크기가 약 30 μm를 초과하고 어떠한 세포, 조직 또는 치료 화합물도 실질적으로 없는 다수의 다공성 점탄성 고체 하이드로겔 마이크로입자를 포함하는, 용도
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