CN108486038B - 一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及脂肪干细胞膜片，特别是一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用。属于组织工程与再生医学领域。该方法包括如下步骤：步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片；步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞；步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片。本发明利用细胞膜片培养基添加外源性因素(TGF‑β1，EGF，PDGF‑BB，17‑β雌二醇)复合子宫内膜细胞共培养，诱导人脂肪干细胞成膜，这个膜片培养体系，诱导成的膜片各上皮标记mRNA表达量上调，免疫荧光显示蛋白CK18表达阳性，提示部分干细胞向上皮细胞转化。这个体系诱导出的膜片在修复子宫内膜上皮方面更有效。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪干细胞膜片，特别是一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用。属于组织工程与再生医学领域。
背景技术
正常的子宫内膜分为基底层和功能层，功能层在雌孕激素的作用下发生周期性脱落，脱落后由基底层再生，如果基底层损伤，则子宫内膜功能层无法再生，胶原大量沉积，出现不可逆性瘢痕修复，造成宫腔粘连。
90％的宫腔粘连的发生与妊娠或者非妊娠时子宫遭受机械性损伤有关，其中与妊娠相关的清宫术是导致宫腔粘连的主因，世界卫生组织(WHO)统计，全球每年有4000万妇女进行人工流产，中国每年人工流产达1400万人次，排世界第一位宫腔粘连已经成为继发性不孕患者的最常见原因，占继发性不孕症发病原因的8％，它还可导致习惯性流产，试管婴儿植入失败等并发症，严重威胁我国育龄期妇女的生殖健康。
目前临床上治疗宫腔粘连的主要方法为宫腔镜下粘连松解术，术后放置宫内节育器等。但各种预防措施的效果均不尽如人意，治疗后粘连再形成的发生率在所有患者中约为3.1％～23.5％，重度患者中可达20％～62.5％。如果子宫内膜损伤面积过大或完全裸露，即使手术恢复了宫腔形态，内膜也很难再生，恢复功能。为了解决这一难题，生殖专家把目标转移到了目前的研究热点组织工程技术上,自从1993年细胞膜片技术发明以来，从最初昂贵的温度敏感培养基，发展到现在仅在完全培养基中加入活性因子即可诱导细胞重叠生长，从而获得由细胞、细胞外基质构成,为克服上述缺点带来希望。但是如何能有效防止子宫损伤后形成的宫腔粘连，能使细胞膜片具有促进组织再生机制，从而促进子宫内膜伤口愈合的功效目前还没有定论需要进一步研究。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的一种构建脂肪干细胞膜片的方法及应用，本发明这种方法是一种新的培养体系用于诱导人的脂肪干细胞形成脂肪干细胞膜片，这种方式诱导形成的膜片不仅含有大量的细胞外基质，同时诱导部分干细胞转化为上皮细胞，更利于修复人子宫内膜上皮组织。
本发明的技术方案是：一种构建脂肪干细胞膜片的方法，其特征是：该方法包括如下步骤：
步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片；
步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞；
步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片。
所述步骤1)脂肪干细胞：取脂肪组织20ml，用PBS清洗，眼科剪剪碎后加20ml的0.25％的Ι型胶原酶37℃恒温摇床消化60min；加入等量的含10％胎牛血清的ɑ-mem完全培养基终止消化，1000转5min离心，去上清，加10ml含10％胎牛血清的ɑ-mem完全培养基重悬接种在75cm2培养瓶中，48h后换液，脂肪干细胞生长融合达到瓶底面积的80％-90％时胰酶消化传代。
所述步骤2)子宫内膜细胞：取子宫内膜组织用无菌PBS反复冲洗，眼科剪剪去血污组织后，剪碎，加入20ml的0.25％Ι型胶原酶，37℃恒温摇床消化120min，加入等体积的含10％胎牛血清α-MEM完全培养液终止消化，用100目的筛网过滤，将滤液再次使用200目的筛网过滤，收集滤液1000r/min离心10min，弃上清，放入α-MEM完全培养液重悬，1000r/min，再次离心10min，弃上清，α-MEM完全培养液重悬，接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，24h后换液，洗去悬浮细胞碎片和杂质，得子宫内膜细胞。
所述步骤3)具体步骤为：将步骤1)的脂肪干细胞按照1*104/cm2密度接种在六孔板中，步骤1)的培养基更换为诱导培养液；孔板中放置transwell小室，小室滤膜孔径为0.8um，小室内按3×103个接种步骤2)子宫内膜细胞，每两天更换诱导培养基，连续培养两周，膜片形成。
所述子宫内膜细胞包括子宫内膜基质细胞和子宫内膜上皮细胞。
所述化学诱导的诱导培养基为诱导培养基为：由膜片培养基和上皮细胞诱导剂组成，其中，膜片培养基为gibco的ɑ-mem培养基添加10％的FBS和100um/ml维生素C；上皮细胞诱导剂为1ⅹ10-7mol/Lβ-雌二醇、10ng/ml TGF-β1、10ng/ml EGF和10ng/ml PDGF-BB。
该方法构建的脂肪干细胞膜片在制备子宫内膜上皮组织修复材料中的应用。
本发明的优点：本发明利用细胞膜片培养基添加外源性因素(TGF-β1，EGF，PDGF-BB，17-β雌二醇)复合子宫内膜细胞共培养，诱导人脂肪干细胞成膜，这个膜片培养体系，诱导成的膜片各上皮标记mRNA表达量上调，免疫荧光显示蛋白CK18表达阳性，提示部分干细胞向上皮细胞转化。这个体系诱导出的膜片在修复子宫内膜上皮方面更有效。
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。
附图说明
图1是本发明采用免疫荧光化学方法鉴定子宫内膜细胞鉴定图；
图2是本发明脂肪干细胞膜片形态学观察图；图2的A为镜下观察膜片中的细胞呈长梭形重叠生长，图2的B为成熟的细胞膜片；
图3是本发明构建脂肪干细胞膜片组织学形态图，其中，图3中的a为扫描电镜放大300倍观察细胞轮廓，图3中的b为扫描电镜放大5000倍观察细胞轮廓；
图4为免疫荧光化学方法鉴定不同处理后的ADSCs第1组和第2组的对照图；
图5为免疫荧光化学方法鉴定不同处理后的ADSCs第3组和第4组的对照图；
图6为ADSCs上皮细胞标记mRNA表达情况。
具体实施方式
实施例1
一种构建脂肪干细胞膜片的方法，包括如下步骤：
步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片；
步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞；
步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片。
实施例2
一种构建脂肪干细胞膜片的方法，包括如下步骤：
步骤1)选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片；所述脂肪干细胞：取脂肪组织20ml，用PBS清洗，眼科剪剪碎后加20ml的0.25％的Ι型胶原酶37℃恒温摇床消化60min；加入等量的含10％胎牛血清的ɑ-mem完全培养基终止消化，1000转5min离心，去上清，加10ml含10％胎牛血清的ɑ-mem完全培养基重悬接种在75cm2培养瓶中，48h后换液，脂肪干细胞生长融合达到瓶底面积的80％-90％时胰酶消化传代。将脂肪干细胞简写为ADSCs。
步骤2)将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞；所述子宫内膜细胞：取子宫内膜组织用无菌PBS反复冲洗，眼科剪剪去血污组织后，剪碎，加入20ml的0.25％Ι型胶原酶，37℃恒温摇床消化120min，加入等体积的含10％胎牛血清α-MEM完全培养液终止消化，用100目的筛网过滤，将滤液再次使用200目的筛网过滤，收集滤液1000r/min离心10min，弃上清，放入α-MEM完全培养液重悬，1000r/min，再次离心10min，弃上清，α-MEM完全培养液重悬，接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，24h后换液，洗去悬浮细胞碎片和杂质，得子宫内膜细胞。见图1，采用免疫荧光化学方法鉴定子宫内膜细胞显示：角蛋白CK18和波形蛋白Vimentin标记阳性，ERα标记表达阳性，PR标记表达弱阳性。证明上述分离培养的细胞为子宫内膜细胞。
步骤3)采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片；所述步骤3)具体步骤为：将步骤1)的脂肪干细胞按照1*104/cm2密度接种在六孔板中，步骤1)的培养基更换为诱导培养液；孔板中放置transwell小室，小室滤膜孔径为0.8um，小室内按3×103个接种步骤2)子宫内膜细胞，每两天更换诱导培养基，连续培养两周，膜片形成。Transwell小室膜上接种子宫内膜细胞，ADSCs接种于下层普通培养板，整个培养体系的培养液和可溶性因子可自由通过。
ADSCs使用细胞膜片诱导培养液连续培养10-14天后就可获得白色膜状的细胞膜片，镜下观察膜片中的细胞呈长梭形重叠生长(见图2A)，成熟的细胞膜片可用细胞刀轻轻刮下，具有一定韧性和弹性(见图2B)
见图3为扫描电镜观察，整个膜片表面光滑，图3中的a为放大300倍隐约可见细胞轮廓，图3中的b为放大5000倍能看到细胞与细胞之间连接成片的的胶原蛋白，以及膜片是由多层细胞叠加形成。
所述子宫内膜细胞包括子宫内膜基质细胞和子宫内膜上皮细胞。
所述化学诱导的诱导培养基为诱导培养基为：由膜片培养基和上皮细胞诱导剂组成，其中，膜片培养基为gibco的ɑ-mem培养基添加10％的FBS和100um/ml维生素C；上皮细胞诱导剂为1ⅹ10-7mol/Lβ-雌二醇、10ng/ml TGF-β1、10ng/ml EGF和10ng/ml PDGF-BB。
上述百分数均为质量百分比浓度。
比较例：
将不同的培养细胞及培养基进行比较(见表1)，表1中的对照培养液为5％FBS+DMEM，表1中的诱导分化培养液为本发明的诱导培养基；采用q-RT-PCR方法检测上述处理后5天的ADSCs的上皮细胞标记CK7，CK18，CK19，EMA mRNA表达，免疫荧光化学方法检测各组处理5天后的下层ADSCs角蛋白的表达见图4和图5。
表1
| 分组 | 培养细胞 | 培养基 |
| 第1组 | ADSCs | 对照培养液 |
| 第2组 | ADSCs | 诱导分化培养液 |
| 第3组 | ADSCs+子宫内膜细胞 | 对照培养液 |
| 第4组 | ADSCs+子宫内膜细胞 | 诱导分化培养液 |
ADSCs经过上述不同4组处理后，免疫荧光化学方法鉴定经过不同处理的ADSCs角蛋白表达：如图4所示，1、2组角蛋白CK18表达阴性；如图5所示，3、4组角蛋白CK18表达阳性但第4组诱导后的ADSCs形态更接近上皮细胞形态。如图6所示，q-RT-PCR方法检测ADSCs按上述处理5天后各组上皮细胞标记表达发现，CK18mRNA表达量在各组中呈依次表达上升，在第4组表达达到最高，且各组均有差异。CK7、CK19、EMA mRNA在2、3、4组表达量均比第一组表达升高，但后3组无差异。结果与免疫荧光结果一致，说明17β-雌激素，TGF-β1，EGF，PDGf-BB和共培养中的子宫内膜细胞分泌因子的共同作用在促进角蛋白的表达上作用最显著。
结论：1、ADSCs膜片高表达TGFβ1、FGF2、HGF、VEGF和Col1A1等促生长细胞因子，同样高表达OCT4、NANOG等干性基因。2、人ADSCs在一定的条件下体外可向子宫内膜上皮方向分化。外源性因素(TGF-β1，EGF，PDGF-BB，17-β雌二醇)和子宫内膜细胞分泌因子的联合作用下，其在促进ADSCs向子宫内膜上皮细胞方向分化的过程中作用最显著。
本发明利用膜片培养基添加外源性因素(TGF-β1，EGF，PDGF-BB，17-β雌二醇)复合子宫内膜细胞共培养，诱导人脂肪干细胞成膜，这个膜片培养体系，诱导成的膜片各上皮标记mRNA表达量上调，免疫荧光显示蛋白CK18表达阳性，提示部分干细胞向上皮细胞转化。该方法诱导出的膜片在修复子宫内膜上皮方面更有效。该方法构建的脂肪干细胞膜片能够在制备子宫内膜上皮组织修复材料中应用。
本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，在网上可以搜索到，这里不一一叙述。
Claims (4)
1.一种构建脂肪干细胞膜片的方法，其特征是：该方法包括如下步骤：
步骤1）选择脂肪干细胞作为种子细胞构建细胞膜片；
步骤2）将子宫内膜细胞用于诱导的共培养细胞；
步骤3）采用化学诱导和共培养的方式构建脂肪干细胞膜片；具体步骤为：将步骤1）的脂肪干细胞按照1×104/cm2密度接种在六孔板中，步骤1）的培养基更换为诱导培养基；孔板中放置transwell小室，小室滤膜孔径为0.8um，小室内按3×103个接种步骤2）子宫内膜细胞，每两天更换诱导培养基，连续培养两周，膜片形成；
所述子宫内膜细胞包括子宫内膜基质细胞和子宫内膜上皮细胞；所述化学诱导的诱导培养基由膜片培养基和上皮细胞诱导剂组成，其中，膜片培养基为gibco的ɑ-MEM培养基添加10%的FBS和100um/ml维生素C；上皮细胞诱导剂为1×10-7 mol/L β-雌二醇、10 ng/mlTGF-β1、 10 ng/ml EGF和10 ng/ml PDGF-BB。
2.根据权利要求1所述的一种构建脂肪干细胞膜片的方法，其特征是：所述步骤1）脂肪干细胞：取脂肪组织20ml，用PBS清洗，眼科剪剪碎后加20ml的0.25%的Ι型胶原酶37℃恒温摇床消化60min；加入等量的含10%胎牛血清的ɑ-MEM完全培养基终止消化，1000r/min离心5min，去上清，加10ml含10%胎牛血清的ɑ-MEM完全培养基重悬接种在75cm2培养瓶中，48h后换液，脂肪干细胞生长融合达到瓶底面积的80%-90%时胰酶消化传代。
3.根据权利要求1所述的一种构建脂肪干细胞膜片的方法，其特征是：所述步骤2）子宫内膜细胞：取子宫内膜组织用无菌PBS反复冲洗，眼科剪剪去血污组织后，剪碎，加入20ml的0.25%Ι型胶原酶，37℃恒温摇床消化120 min，加入等体积的含10%胎牛血清α-MEM完全培养液终止消化，用100目的筛网过滤，将滤液再次使用200目的筛网过滤，收集滤液1000r/min离心10min，弃上清，放入α-MEM完全培养液重悬，1000r/min，再次离心10min，弃上清，α-MEM完全培养液重悬，接种于6孔板中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，24 h后换液，洗去悬浮细胞碎片和杂质，得子宫内膜细胞。
4.一种权利要求1所述的构建脂肪干细胞膜片的方法构建的脂肪干细胞膜片在制备子宫内膜上皮组织修复材料中的应用。
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