CN107922923B - 脂肪细胞与巨噬细胞的三维共培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脂肪细胞与巨噬细胞的三维共培养，通过在包含前脂肪细胞与巨噬细胞的水凝胶支架中共培养前脂肪细胞与巨噬细胞，从而能够形成脂肪样组织，其可以在用于与脂肪组织相关的代谢性疾病治疗的研究及新药开发中应用。

Description

脂肪细胞与巨噬细胞的三维共培养方法
技术领域
本发明涉及脂肪细胞与巨噬细胞的三维共培养方法，是能够形成与三维地构成的生物体脂肪组织类似的结构体的细胞培养方法。
背景技术
在肥胖、糖尿病、动脉硬化等代谢性疾病(metabolic disease)治疗剂开发中，初期在体外(in vitro)显示出优异药效的药物在体内(in vivo) 动物实验中药效降低，从而给新药开发带来了很多困难。为了解决这样的问题，需要一种与生物体内模型(in vivomodel)类似的体外模型(in vitro model)，从药物开发初期阶段开始就能够预测正确的功效和毒性的。
由于在人类细胞和组织(tissue)等生物体内发生利用细胞与细胞之间的相互作用的生长与分化，因此具有复杂的三维结构。相反地，在实验室等中为了细胞或组织培养而使用的方法相当于二维培养，因此在研究生物体内组织的功能或组织中实际发生的反应方面存在很多困难。
为了研究生物体内组织中的反应及其功能，在组织工程或生命工程领域中正在活跃地进行利用三维支架(scaffold)的研究，并且移植三维人工组织支架而进行细胞分化机制、疾病治疗剂开发、组织再生等研究(韩国公开专利第10-2013-0119663号)。但是，三维支架也是人工制造的，而实际组织或器官之类的由细胞与细胞之间的相互作用构成的生物体内结构过于多样复杂，因此在用于形成组织之类的类似结构的技术上存在局限。
为了这种现有问题的解决和代谢性疾病的新药开发，本发明的发明人开发了彼此不同的细胞在如生物体内那样的三维环境中通过细胞与细胞之间的相互作用而显示出与脂肪组织类似的功能的培养方法。
发明内容
技术问题
本发明将两种以上的细胞共培养，通过细胞与细胞之间的相互作用而显示出与生物体内组织类似的功能，由此，开发了用于生物体内组织的基础研究和代谢性疾病治疗的药物功效筛选系统及新药。
技术方案
为了形成脂肪组织样结构体，本发明提供一种脂肪细胞与巨噬细胞的三维共培养方法，其中，包括以下步骤：准备前脂肪细胞、巨噬细胞和水凝胶均匀地混合而成的混合物；利用三维细胞-打印系统(three dimensional cell-printing system)，以上述混合物制造包含前脂肪细胞与巨噬细胞的水凝胶支架；以及利用培养液进行处理，使上述水凝胶支架中所包含的前脂肪细胞与巨噬细胞分化及增殖而形成脂肪组织样结构体。
本发明提供一种脂肪细胞与巨噬细胞的共培养方法，其中，水凝胶中所包含的巨噬细胞相对于前脂肪细胞的总数为1至10％(w/v)。
本发明提供一种脂肪细胞与巨噬细胞的共培养方法，其中，在前脂肪细胞、巨噬细胞和水凝胶均匀地混合而成的混合物中，水凝胶是包含藻酸盐、胶原和明胶的藻酸盐水凝胶。
本发明提供一种脂肪细胞与巨噬细胞的共培养方法，其中，在藻酸盐水凝胶中所包含的藻酸盐相对于混合物为2.0至4.0％(w/v)。
本发明提供通过脂肪细胞与巨噬细胞共培养方法而形成与脂肪组织类似的结构体后，对利用其的基因表达和蛋白质活性中的任一种以上进行检测而分析代谢性疾病的方法。
发明效果
根据本发明的脂肪细胞与巨噬细胞共培养方法能够在水凝胶支架内通过脂肪细胞与巨噬细胞的细胞与细胞之间的相互作用而形成具有与生物体内脂肪组织类似的功能的结构体。并且，在水凝胶支架内形成的脂肪组织类似结构体显示出与生物体内脂肪组织类似的基因表达和蛋白质活性，从而能够在用于与脂肪组织相关的代谢性疾病治疗的研究和新药开发中利用。
具体实施方式
图1表示利用三维细胞-打印系统制造的水凝胶支架。
图2表示水凝胶支架中的3T3-L1前脂肪细胞的增殖和细胞存活，在(A)中显示了以绿色荧光表示存活的细胞、以红色荧光表示死细胞的荧光图像，(B)是表示将1×105细胞/ml的浓度的3T3-L1前脂肪细胞与具有彼此不同的浓度的藻酸盐混合而制成结构体时的细胞的增殖程度的图表，(C)是表示以1×105细胞/ml的浓度将3T3-L1前脂肪细胞与具有彼此不同的浓度的藻酸盐混合而制成结构体时的细胞的增殖程度的荧光图像， (D)是在3％(w/v)藻酸盐支架中改变3T3-L1前脂肪细胞数而制造结构体时表示细胞增殖的图表，(E)是表示根据支架高度的3T3-L1前脂肪细胞增殖的图表，结果根据重复实验以平均±标准误差(S.E.M)表示(相对于第一天，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)。
图3的(A)、(B)是将水凝胶中的3T3-L1前脂肪细胞的分化以使用了BODIPY(硼-二吡咯亚甲基(boron-dipyrromethene))的荧光图像表示的图，比较了在3％藻酸盐浓度的水凝胶中分化的3T3-L1脂肪细胞 (adipocyte)，(C)比较了3T3-L1前脂肪细胞与3T3-L1脂肪细胞的G6PD 酶的活性差异，(D)表示与脂肪细胞分化(adipogenesis)和胰岛素抵抗性相关的代表性的基因变化，(E)表示与脂肪细胞分化和胰岛素抵抗性相关的代表性的蛋白质的表达差异，结果根据重复实验以平均±标准误差 (S.E.M)表示(相对于前脂肪细胞组，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)。
图4中的(A)中与前脂肪细胞比较而表示巨噬细胞在3％(w/v) 藻酸盐浓度的水凝胶支架中的细胞增殖，(B)是表示巨噬细胞在3％(w/v) 藻酸盐浓度的水凝胶支架中的生存程度的荧光图像，(C)中比较了与脂肪细胞分化和胰岛素抵抗性相关的代表性的蛋白质在混合了前脂肪细胞数的10％(w/v)浓度的巨噬细胞的共培养中的表达差异，(D)～(F)中比较了改变巨噬细胞浓度时脂肪细胞分化程度以及与脂肪细胞分化和胰岛素抵抗性相关的代表性的蛋白质在共培养中的表达差异，(G)～(I)显示了对于进一步细分巨噬细胞浓度时的与脂肪细胞分化和胰岛素抵抗性相关的蛋白质表达差异以及脂肪细胞分化程度的荧光图像。
图5的(A)表示在三维细胞共培养支架中与脂肪细胞分化和胰岛素抵抗性相关的蛋白质表达的变化，(B)通过葡萄糖摄取试验(glucose uptake)表示在三维细胞共培养支架中的对胰岛素抵抗性的变化率。
具体实施方式
下面，对本发明具体地进行说明。对本发明的说明和附图中，可以省却可能混淆发明的主旨的公知内容的记载。针对为了对本发明进行说明而没有另外定义的用语，应当解释为本领域技术人员通常能够理解的意思。
本发明涉及脂肪细胞(adipocytes)与巨噬细胞(macrophages) 的三维共培养方法及技术。
在本发明中，脂肪细胞与巨噬细胞的共培养方法是利用脂肪细胞与巨噬细胞的三维共培养方法，该方法包括如下步骤：准备前脂肪细胞、巨噬细胞和水凝胶均匀地混合而成的混合物；利用三维细胞-打印系统，以上述混合物制造包含前脂肪细胞与巨噬细胞的水凝胶支架；以及利用培养液进行处理，使前脂肪细胞分化为脂肪细胞并增殖，使得所述水凝胶支架中所包含的前脂肪细胞与巨噬细胞能够发挥与脂肪组织类似的功能。
在本发明的共培养方法中，为了在共培养时脂肪细胞的生存、分化、增殖、以及脂肪组织样结构体的形成，可以调节前脂肪细胞、巨噬细胞和水凝胶的混合物中所包含的巨噬细胞的浓度或细胞密度。在巨噬细胞为极微量或不存在的情况下，难以具有脂肪组织的功能；随着巨噬细胞的浓度增加，脂肪细胞的分化率就减少，随之发生在脂肪细胞中被表达而能够形成类似脂肪组织的特异基因表达减少、蛋白质活性减少等。
在本发明中，用于形成水凝胶支架的前脂肪细胞、巨噬细胞和水凝胶混合物中，前脂肪细胞的含量为1×105细胞/ml以上，优选为1×105细胞/ml至1×107细胞/ml，更优选为1×106细胞/ml至1×107细胞/ml。前脂肪细胞少于1×105细胞/ml时，增殖和生存不顺利，超过1×107细胞/ml时，可能掉到支架外部。
在本发明中，用于形成水凝胶支架的前脂肪细胞、巨噬细胞和水凝胶混合物中，相对于水凝胶支架中所包含的前脂肪细胞，巨噬细胞的含量可以为10％以下、10至5.5％、5.5至4.5％、4.5至3.5％、3.5至2.5％、2.5至1.5％、1.5至0.5％，优选为2.0至1.0％，更优选为1.2至0.8％(w/v)。例如，前脂肪细胞为1×105细胞/ml时，为了实现1.0至2.0％的巨噬细胞含量，可以将巨噬细胞细胞的含量调节到1×103细胞/ml至2×103细胞/ml 个以下。
根据本发明的一实施例，相对于用于生成水凝胶支架的前脂肪细胞，巨噬细胞的含量为1.0至2.0％(w/v)时能顺利进行脂肪细胞的分化，就像胰岛素抵抗性增加的结果那样，显示出与实际的脂肪组织类似的功能。
在本发明中，水凝胶(hydrogel)以细胞培养基、培养液或水作为溶剂且能够以聚合物链能够形成网络的方式水溶性高分子等形成化学性交联键或物理性地结合，从而能够形成三维水凝胶支架。在本发明中使用的水凝胶没有大的限制，优选地，可以使用胶原、壳聚糖、透明质酸、明胶，优选包含来自藻类(algae)的藻酸盐(alginate)。使用藻类基质(base) 的水凝胶的情况下，优选适宜地调节藻酸盐的含量，使得共培养脂肪细胞与巨噬细胞时在前脂肪细胞的分化期间以及之后的追加实验的进行期间水凝胶支架不溶解而维持。
在本发明中，藻酸盐水凝胶表示包含来自藻类的藻酸盐而制造的水凝胶。在藻酸盐水凝胶中，藻酸盐可以使用氯化钙之类的多价阳离子盐作为水溶性高分子电解质而形成交联键。藻类基质的水凝胶的情况下，相对于用于生成水凝胶支架的脂肪细胞、巨噬细胞和藻酸盐水凝胶混合物，藻酸盐的含量可以为大于2.5％、2至4％、2.5至4％、2.8至3.0％、3至4％、3.5至4％，优选为大于2.5％且小于或等于3.0％(w/v)，最优选为3.0％ (w/v)。藻酸盐的含量不充分的情况下，结构体的溶解度增加，藻酸盐的含量高的情况下，细胞的增殖和存活率可能减少。
根据本发明的一实施例，来自褐藻类的藻酸盐的含量为2.0％ (w/v)的情况下，脂肪细胞的生存和增殖非常活跃，但是在水凝胶支架中共培养脂肪细胞与巨噬细胞时相对地形态不能长久维持，应用于培养和研究时可能存在困难。另外，藻酸盐的含量为2.5％(w/v)和3.0％(w/v) 时，水凝胶支架的形态能够充分维持到形成脂肪样组织，还能够恒定地维持脂肪细胞的生存和增殖。另外，藻酸盐含量为3.5％(w/v)以上的情况下，水凝胶支架形态的持续力优异，但脂肪细胞的生存和增殖可能减少。
在本发明中，可以在水凝胶中进一步包含明胶和胶原，明胶和胶原的含量相对于前脂肪细胞、巨噬细胞和水凝胶混合物分别优选为5.0至 10.0％(w/v)，但并不限定于此。
在本发明中，用于形成水凝胶支架的将前脂肪细胞、巨噬细胞和水凝胶均匀地混合后的混合物是利用三维细胞-打印系统，通过用于制造水凝胶支架的机械的分配器而形成。
在本发明中，三维细胞-打印系统(3D cell-printing system)是为了生成立体结构的水凝胶支架而使用的系统。为了三维细胞-打印，可以通过具备x-y-z平台(stage)、分配器、注射器喷嘴(syringe nozzle)、压缩控制器和计算机系统的设备来进行。在本发明中通过三维细胞-打印系统而制造的水凝胶支架具有立体结构，可以进行与通常进行的培养基中的细胞培养这样的二维培养不同的三维细胞培养。水凝胶支架的结构可以根据混合物所包含的成分和浓度、通过编程的设计、细胞-绘图(Cell-Plotting) 时的压力和速度来适宜地形成。用于细胞共培养的水凝胶支架的支架图案和结构没有限制，但优选支架图案为正交方向且通过多层细胞-绘图来形成支架。
根据本发明的一实施例，优选如下制造水凝胶支架：支架图案以成为正交方向的方式进行编程和设计，形成0.2至0.3mm厚度的细胞-绘图的支架，使细胞-绘图的支架层叠，以2.0至3.0mm左右的厚度制造水凝胶支架。厚度可以为0.1至3.0mm、0.4至2.5mm、0.8至2.5mm、0.4 至2.5mm、0.8至2.5mm、1.2至2.5mm、1.6至2.5mm、0.4至2.0mm、0.8 至2.0mm、1.2至2.0mm，优选为0.2至0.3mm，更优选为1.6至2.0mm。进一步增加厚度的情况下，形成水凝胶支架时，位于最下方的细胞-绘图的支架层的结构可能会崩溃。不能恒定地维持水凝胶支架的结构的情况下，在共培养时可能减少细胞生存率、增殖和分化程度。水凝胶支架可以制成四边形形状且其宽度可以为10至30cm2、15至25cm2，优选为20至25cm2。
在本发明中，根据细胞-绘图制造水凝胶支架时，混合(细胞接种 (cellsseeding))的前脂肪细胞的数量优选调节为根据混合物或者水凝胶支架的设计而能够发生一定的增殖。
根据本发明的一实施例，与水凝胶混合的细胞数多时，随着培养时间的经过，增殖率上升，混合的细胞数优选为1×105细胞/ml以上，但并不限定于此。但是细胞数小于1×105细胞/ml时，有可能增殖无法顺利地进行。在本发明中，水凝胶支架是在共培养时细胞进行分化、增殖以及利用细胞与细胞之间的相互作用而形成类似组织的场所。在平面培养基之类的普通培养基中进行细胞培养的情况下，各个细胞只在特定部分进行细胞与细胞之间的相互作用，增殖方向为单向，通过分化和增殖增加细胞数的情况下，各个细胞能够进行细胞与细胞之间的相互作用的细胞也有限。另外，在细胞中分泌的多种代谢物质蓄积，形成不均衡的浓度梯度。因此，在体外(in vitro)二维培养细胞的情况下，细胞与细胞之间的相互作用不能诱导像在体内(in vivo)那样的相互作用，也难以形成与体内类似的结构体。
相反，根据本发明的水凝胶支架的情况下，脂肪细胞与巨噬细胞包含在立体结构的水凝胶支架中，各个细胞像生物体内的细胞那样向周围所有方向进行细胞与细胞之间的相互作用，增殖方向不是单向，通过分化和增殖而细胞数增加的情况下，各个细胞也能够持续地与周围细胞进行细胞与细胞之间的相互作用。另外，在细胞中分泌的多种代谢物质并不是蓄积在特定区域，可以像在生物体内那样向周围所有方向分泌，因此能够防止不均匀的浓度梯度。根据这种特征，共培养脂肪细胞与巨噬细胞时能够诱导像在体内那样的细胞与细胞之间的相互作用，由此能够形成像体内脂肪组织那样的功能类似的脂肪样组织。
根据本发明的一实施例，在普通培养基中培养前脂肪细胞 (preadipocyte)和脂肪细胞(adipocyte)的情况和在水凝胶支架中共培养脂肪细胞与巨噬细胞的情况下，显示出明显的生物体内脂肪组织的基因表达及蛋白质活性的差异，在水凝胶支架中以脂肪细胞与巨噬细胞共培养而形成的脂肪样组织显示出与在作为肥胖和糖尿病模型而众所周知的C57BL/6-DIO小鼠和C57BL/6Job/ob小鼠的生物体内脂肪组织中脂肪分化因子增加且胰岛素抵抗性增加类似的基因表达和蛋白质活性。
根据本发明制造水凝胶支架后，通过水凝胶支架中所包含的细胞的细胞与细胞之间的相互作用使细胞增殖和分化而形成类似组织。水凝胶支架中所包含的细胞的增殖和分化通过利用用于增殖或分化的培养液对水凝胶支架进行处理，从而培养液被吸收到水凝胶支架中而发生。通过水凝胶支架的多孔性立体结构而吸收的培养液可以均匀地对各细胞进行处理。
通过培养液处理，水凝胶支架中所包含的前脂肪细胞与巨噬细胞分化及增殖，脂肪细胞与巨噬细胞通过彼此的细胞与细胞之间的相互作用而显示出与脂肪组织类似的功能。
根据本发明而三维共培养的脂肪细胞与巨噬细胞形成脂肪样组织结构体，脂肪样组织的形成与否可以通过结构体中的与脂肪细胞分化和胰岛素抵抗性相关的蛋白质的表达程度差异以及葡萄糖摄取评价(glucose uptake)试验而得知。
根据本发明的一实施例，在水凝胶支架中通过脂肪细胞与巨噬细胞共培养而形成的脂肪样结构体的FABP4、FAS、ACC和PPARγ2之类的与脂肪细胞分化相关的标记蛋白质的表达增加，Akt磷酸化和GLUT4之类的与胰岛素抵抗性相关的标记蛋白的表达和活性程度减少。另一方面，在水凝胶支架中分别单独培养前脂肪细胞或脂肪细胞的情况下，与脂肪细胞分化和胰岛素抵抗性相关的标记蛋白的表达均增加。
用于实施发明的方式
下面，对用于实施本发明的优选实施例进行具体说明。但本发明不被下述实施例所限定或者利用实施例限定性地进行解释。
[实施例1]
以如下方法将脂肪细胞与巨噬细胞进行共培养而形成了脂肪样结构体。
前脂肪细胞与巨噬细胞培养及准备
准备作为前脂肪细胞的3T3-L1(#CL-173，ATCC)和作为巨噬细胞的RAW264.7(#TIB-71，ATCC)，利用包含10％胎牛血清(Invitrogen， Carsbad，CA，USA)、100μg/ml青霉素与100μg/ml链霉素(Invitrogen) 的混合物1％的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco'smodified Eagle's medium，Gibco)将细胞在37℃、5％CO2条件的培养用培养箱中进行培养。培养后用DPBS(杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水，Dulbecco's Phosphate- Buffered Saline，Gibco)进行清洗，添加0.2％胰蛋白酶-EDTA(trypsin- ethylenediaminetetraaceticacid,Invitrogen)2ml，在37℃、5％CO2培养箱中培养1分钟。然后，将细胞悬浮液(suspension)以1500rpm离心分离 2分钟，获得细胞沉淀物(pellet)而用于实验。
用于制造水凝胶支架的包含前脂肪细胞、巨噬细胞和藻酸盐水凝胶的混合物的制 造
将明胶500ul(Sigma-Aldrich)、胶原500ul(Sigma-Aldrich)和1×107个的前脂肪细胞以及1×105个的巨噬细胞均匀地混合后，用达尔伯克改良伊格尔培养基最终调节为9.7ml。在混合物中添加3mg的海藻酸钠 (Sigma-Aldrich)后迅速搅拌，从而准备用于制造3％藻酸盐水凝胶支架的混合物，为了制作三维支架，移至由200～300μm尺寸的喷嘴构成的分配器。为了顺利的细胞-打印，以1000rpm离心分离10秒钟而准备制作水凝胶支架。
采用与以上方法相同的混合物制造方法，明胶、胶原的量相同的情况下，使用达尔伯克改良伊格尔培养基制造前脂肪细胞、巨噬细胞和海藻酸钠的含量分别彼此不同的混合物。藻酸盐的含量分别调节为2、2.5、 3.0、3.5、4.0％，使得能够制造彼此不同浓度的水凝胶支架。另外，脂肪细胞的密度(接种密度(seeding density))用一次性血球计数板(hemocytometer-based cell counter,SKC Co.Ltd.,Seoul,Korea)进行计算，使细胞数分别为1×104、5×104、1×105、4×105、8×105和1×106细胞/ml，以便能够制造包含彼此不同的脂肪细胞的水凝胶支架。巨噬细胞相对于脂肪细胞分别调节为1、2、3、4、5、10％(w/v)，观察共培养脂肪细胞与巨噬细胞时随巨噬细胞浓度发生的变化。
使通过分配器制作的水凝胶支架迅速地与预先准备的5％氯化钙水溶液反应。此时，支架通过氯化钙处理而形成交联键。
利用三维细胞-打印系统的水凝胶支架的制造
制造利用了三维细胞-打印系统(3D cell-printing system)的水凝胶支架时，利用了具备x-y-z平台(stage)、分配器、注射器喷嘴(syringe nozzle)、压缩控制器和计算机系统的设备(3D生物支架绘图系统(3D Bio-Scaffold Plotting system),PROTek)。分配器是用于保持水凝胶的储藏罐，计算机系统调节压力、进料(feeding)速度、料股(strand)大小和支架的形状。细胞-绘图(cell-plotting)系统的速度为150mm/s。压力分别调节为650kPa。如果对分配器施加规定压力，则脂肪细胞、巨噬细胞和水凝胶混合物以三维支架形态在x-y-z平台进行细胞-绘图的支架以层状 (layer-by-layer)绘图而制造。支架图案以成为正交方向的方式进行设计而制造，层叠四边形(5×5cm)形状的细胞-绘图的支架，以厚度分别为 0.4、0.8、1.2、1.6、2mm的方式制造了包含前脂肪细胞与巨噬细胞的水凝胶支架。
所制造的水凝胶支架在包含100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素 (Invitrogen)和10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基中增殖1天并诱导细胞的稳定化，然后替换为经地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤、胰岛素处理的包含10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基来诱导分化。诱导分化后2天至3天后替换为经胰岛素处理的包含10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基，用胰岛素处理2天后，在包含10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基中根据实验目的培养1天至20天，进行对细胞生存、增殖、分化的分析。培养基最多2天换一次。
细胞生存及增殖分析
使用Live/Dead细胞分析试剂盒(Live/Dead cell assay kit, invitrogen)和荧光显微镜(TE2000-U,尼康)确认水凝胶支架中的细胞生存。用PBS清洗水凝胶支架，用钙黄绿素(calcein)和EthD-1( 溴乙啡锭二聚体(ethidium homodimer))在PBS中着色15分钟。着色后用PBS清洗两次，用荧光显微镜观察绿色(生存细胞，495～515nm)和红色(死细胞，495～635nm)荧光。细胞增殖使用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8(CCK-8),DojindoLaboratories)。将水凝胶支架在24孔 (well)培养板中用包含CCK-8 100μl的培养基1ml进行处理，在37℃培养4小时后，用微孔板分光光度计(BIORAD Inc.)测定450nm时的吸光度。
3T3-LI细胞增殖和生存在藻酸盐为2％时最活跃，但藻酸盐为2％时，水凝胶支架结构从约2周后开始变形或坍塌，不能维持形态。藻酸盐为2.5％时，细胞增殖和生存活跃，但从3周后开始水凝胶支架结构也同样变形或坍塌，不能维持形态。藻酸盐为3％时，细胞的细胞增殖和生存活跃，即使在4周以上的长时间也能够维持水凝胶支架的结构。藻酸盐为3.5％以上时，虽然能够长期持续维持水凝胶支架的结构，但细胞增殖和生存减少至肉眼能够确认的程度(图2的B、C)。
3T3-L1细胞数小于1×105细胞/ml时，增殖不能顺利进行(图2 的D)。另外，水凝胶支架的高度为2.0mm时，增殖率最高，超过3.0mm 时，水凝胶支架的下部结构在2周～3周之间变形或坍塌，不能维持形态。
所制造的支架中的脂肪细胞与巨噬细胞分化
对于水凝胶支架，利用包含20μg/ml胰岛素、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine)、1μM地塞米松(dexamethasone)的分化诱导培养基进行分化3天，替换为包含20μg/ml胰岛素的培养基，放置2 天，然后将细胞在普通培养基(maintainedmedium)中培养1天。
培养后，用BODIPY(硼-二吡咯亚甲基(boron-dipyrromethene)) (BODIPY 493/503,Invitrogen)使成熟的脂肪细胞的脂肪颗粒着色。着色之后，用PBS清洗两次，用荧光显微镜确认着色的脂肪颗粒，确认了均匀分布的脂肪颗粒(图3的A和B)。
培养后，利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)分析试剂盒(Glucose 6PhosphateDehydrogenase Assay Kit,abcam)在水凝胶支架中测定G6PD 酶活性，确认了在分化的脂肪细胞中活化的G6PD酶活性(图3的C)。
另外，使用Tri-reagent(TRIzol,Invitrogen)，从水凝胶支架内细胞中分离RNA，使RNA 2μg逆转录后，通过利用mRNA的实时PCR 的基因表达程度和免疫印迹(western blotassay)来确认蛋白质的活性。逆转录使用AccuPower RT PreMix(Bioneer Inc.,Korea)，全部引物设计利用引物3软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3/ )，它们的5'至3'序列示于表1。
基因表达程度及蛋白质活性确认结果，可知与脂肪细胞分化过程相关的转录因子以及与脂肪细胞相关的标记物PPARγ2、CEBP/αFABP4、 FAS、G3PD和GLUT4大量增加(图3的D、E)。
【表1】
基因 正向 反向
PPARγ2 ccctggcaaagcatttgtat gaaactggcacccttgaaaa
G3PD agagatgctcgccacagaat aaagggtctctggggtctgt
FABP4 catcagcgtaaatggggatt tcgactttccatcccacttc
GLUT4 ctccttctatttgccgtcctc ctgttttgcccctcagtcatt
FAS acatggtagctgccctcaag gcgcagtaccgtagaaggac
18S rRNA cggttctattttgttggt agtcggcatcgtttatggtc
确认形成了利用与巨噬细胞的共培养的脂肪组织样结构体
首先，确认了共培养时根据巨噬细胞的浓度的3T3-L1生存、增殖和分化能力。与巨噬细胞共培养时FABP4、GLUT4和PPARγ的表达减少10％左右。另外，确认了巨噬细胞的浓度越增加，FABP4、GLUT4的表达和G6PD活性程度越减少，并且可确认共培养脂肪细胞与巨噬细胞时，巨噬细胞的浓度为2％的情况下，FABP4增加，但GLUT4减少，巨噬细胞的浓度为3％的情况下，FABP4的活性也急剧减少，前脂肪细胞向脂肪细胞的分化急剧减少(图4的G至I)。
在前脂肪细胞的三维单独培养和分化中，与肥胖相关的ACC、FAS 和FABP4的表达增加且与胰岛素抵抗性相关的AKT的磷酸化以及GLUT4 的表达增加(图5的A)，在前脂肪细胞与巨噬细胞的三维共培养及分化的支架中，与前脂肪细胞的三维单独培养及分化的支架相比，没有显示出与肥胖相关的ACC、FAS和FABP4的表达差异，可以确认顺利地进行了向脂肪细胞的分化(图5的A)，与胰岛素抵抗性相关的AKT的磷酸化以及GLUT4的表达减少，可以在蛋白质水平上确认胰岛素抵抗性由巨噬细胞共培养所诱导。这与一般已知的如下结果显示出明显差异：前脂肪细胞的二维单独培养和分化中ACC、FAS和FABP4之类的与脂肪生成相关的因子的增加，与胰岛素抵抗性相关的AKT的磷酸化以及GLUT4之类的因子同时增加而胰岛素抵抗性不能提高。在利用了葡萄糖摄取评价试验试剂盒(
Figure GDA0002902882120000121
UK)的葡萄糖摄取(glucose uptake)试验结果(图5的B) 中也是与仅将脂肪细胞单独培养的支架相比，在巨噬细胞共培养的支架中确认了即使供给高浓度的胰岛素(1μg/ml)，根据减少的胰岛素抵抗性显著增加。
序列表
<110> 韩国化学研究院
<120> 脂肪细胞与巨噬细胞的三维共培养方法
<130> P15040500418
<160> 12
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（PPARγ2正向引物）
<400> 1
ccctggcaaa gcatttgtat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（PPARγ2反向引物）
<400> 2
gaaactggca cccttgaaaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（G3PD正向引物）
<400> 3
agagatgctc gccacagaat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（G3PD反向引物）
<400> 4
aaagggtctc tggggtctgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（FABP4正向引物）
<400> 5
catcagcgta aatggggatt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（FABP4反向引物）
<400> 6
tcgactttcc atcccacttc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（GLUT4正向引物）
<400> 7
ctccttctat ttgccgtcct c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（GLUT4反向引物）
<400> 8
ctgttttgcc cctcagtcat t 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（FAS正向引物）
<400> 9
acatggtagc tgccctcaag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（FAS反向引物）
<400> 10
gcgcagtacc gtagaaggac 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（18SrRNA正向引物）
<400> 11
cggttctatt ttgttggt 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（18SrRNA反向引物）
<400> 12
agtcggcatc gtttatggtc 20

Claims (5)

1.一种脂肪细胞与巨噬细胞的共培养方法，其中，包括以下步骤：
(a)准备包含前脂肪细胞、巨噬细胞和水凝胶的混合物；
(b)利用三维细胞-打印系统，以所述混合物制造包含前脂肪细胞与巨噬细胞的水凝胶支架；
(c)使用氯化钙在所述水凝胶支架中形成交联键；
(d)利用培养液对步骤(b)的所述水凝胶支架进行处理；和
(e)对步骤(d)的处理后的水凝胶支架进行培养，使所述水凝胶支架中所包含的前脂肪细胞与巨噬细胞增殖及分化而形成脂肪样组织，
其中，所述水凝胶为藻酸盐水凝胶，所述藻酸盐水凝胶还包括选自胶原、壳聚糖、透明质酸和明胶中的一种或两种以上，
其中，步骤(a)中的所述巨噬细胞的含量相对于所述前脂肪细胞的总数为1.0％至2.0％。
2.根据权利要求1所述的共培养方法，其中，所述水凝胶为包含藻酸盐、胶原和明胶的藻酸盐水凝胶。
3.根据权利要求2所述的共培养方法，其中，所述藻酸盐的含量相对于步骤(a)的混合物为2.0至4.0％(w/v)。
4.一种与脂肪组织相关的代谢性疾病的分析方法，其中，包括以下步骤：
(a)准备包含前脂肪细胞、巨噬细胞和水凝胶的混合物；
(b)利用三维细胞-打印系统，以步骤(a)的所述混合物制造包含前脂肪细胞与巨噬细胞的水凝胶支架；
(c)使用氯化钙在所述水凝胶支架中形成交联键；
(d)利用培养液对步骤(b)的所述水凝胶支架进行处理；
(e)对步骤(d)的处理后的水凝胶支架进行培养，从而使所述水凝胶支架中所包含的前脂肪细胞与巨噬细胞增殖及分化而形成脂肪样组织；以及
(f)检测步骤(e)的所述脂肪样组织中的基因表达和蛋白质活性中的一种以上，
其中，所述水凝胶为藻酸盐水凝胶，所述藻酸盐水凝胶还包括选自胶原、壳聚糖、透明质酸和明胶中的一种或两种以上，
其中，步骤(a)中的所述巨噬细胞的含量相对于所述前脂肪细胞的总数为1.0％至2.0％。
5.根据权利要求4所述的分析方法，其中，所述代谢性疾病为2型糖尿病。
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